IMMUNOLOGIA DEI TUMORI  ‐ VISCUM ALBUM L. E MODIFICAZIONE DELLA RISPOSTA BIOLOGICA        Dr. Andrea Basili

Società Italiana Medicina Antroposofica

IMMUNOLOGIA GENERALELa risposta immune protegge in modo dinamico il self da tutto ciò che  viene considerato inadeguato o aggressivo nei propri confronti.La risposta immune si distingue in naturale e acquisitaLa risposta naturale è costituita da specificità di membrana (pH, potenziale elettrico di membrana,permeabilità, espressione recettoriale) e coinvolge: mediatori solubili, complemento ,‐immunità umorale ‐granulociti neutrofili, monociti/macrofagi , basofili/mastociti, eosinofili, NK‐immunità cellulare naturale e specifica o acquisitaLa risposta acquisita è costituita dall’attivazione dei linfociti T‐B e dalla secrezione di immunoglobuline con induzione di citotossicità(ADCC) ‐ lisi cellulare e/o apoptosi o tolleranza immunologica.( Immunità umorale  e cellulo‐mediata acquisita)

Immunologia generale 2

Il sistema immunitario è un sistema cognitivo che permette all’organismo di interagire con l’esterno e con se stessoIl riconoscimento avviene attraverso: contatto di membrana, fagocitosi, digestione, individuazione dell’epitopo ed esposizione dello stesso sulla superficie cellulare e interazione con le cellule di riconoscimento

DANNO  DA STIMOLO BIOLOGICO,CHIMICO,FISICO

RISPOSTE INFIAMMATORIE ED IMMUNITARIENATURALI

FASE EFFETTRICECARATTERIZZATADALL’ATTIVAZIONEDI DIVERSIMECCANISMIDI REAZIONE

RICONOSCIMENTO IMMUNITARIO DEL DANNO BIOLOGICOIN ORGANI SPECIALIZZATIRISPOSTE IMMUNITARIE ADATTATIVE

I RECETTORI SOLUBILI del danno (da stimoli biologici, chimici, fisici) sono presenti nel sangue e nei liquidi biologici!

I recettori del danno (da stimoli biologici, chimici, fisici) sono:

RECETTORI SOLUBILIRECETTORI DI MEMBRANARECETTORI CITOPLASMATICI

CELLULE PRESENTANTI L’ANTIGENECellule altamente specializzate nel processare  antigeni patogeni e non. Dopo averli  individuati e catturati migrano nei linfonodi e li presentano sulla loro superficie ai linfociti T.Si dividono in mature e immatureDue precursori distinti mieloidi e linfoidi da cui derivano  CD1 che attivano i Th1 e CD2 che attivano Th2

APC

LINFONODO

APC

LINFONODO

HLA( Human Leucocyte Antigens)Regione posta sul braccio corto del cromosoma 6

Viene ereditata “en bloc” in maniera autosomicadominante

L’antigenicità specifica “privata” è detta epitopo

Codifica Ag( MHC) classe I ( HLA‐A‐B‐C e classe II DR‐DP‐DQ)

STRUTTURA DELLE MOLECOLE DIISTOCOMPATIBILITA

Le molecole MHC di classe I sono formate da tre catena α,  associate a  β2 microglobulinaLe molecole MHC di classe II sono formateda due catene α e due β. Sia le molecole MHC di classe I che di classe IIpresentano nella porzione più esterna, una tasca di legame in cui  viene alloggiato un peptide che funge da antigene associato.

• Importanza del ripiegamento mutuato da chaperonine per l’esposizione dell’ MHC

.

INTERAZIONI TRA MHC CLASSE I E TCR

Le molecole di classe I, insieme al peptide ad esse associato, vengono riconosciute dal TCR( recettore di membrana dei linfociti T) formando un complesso trimolecolareSono espresse da tutte le cellule e sono riconosciute dai linfociti T e BAssociano Ag provenienti dal comparto intracellulare (es.: virus)La parte invariante della molecola MHC  è legata invece dalla molecola CD8

INTERAZIONI TRA MHC CLASSE II E TCR

Gli Ag MHCII  sono espressi solo dai  B, monociti‐macrofagi, dalle APC e dai  T attivati.La loro espressione può essere stimolata da mediatori dell’infiammazioneI peptidi associati derivano da proteolisi di proteine di microorganismi processate dalle APC e presenti nel comparto extracelllulareLe molecole di classe II, insieme al peptide ad esse  associato, vengono riconosciute dal TCRLa parte invariante della molecola MHC è legata invece dalla molecola CD4

’.

E. Rolla - Osp. Mauriziano To

1° segnale CDR3‐MHC

2° segnale B7 ‐CD28 

LINFONODO

APCCellulaDendriticamatura

LINFOCITATh1 (Helper)

calcineurina N‐FAT

IL ‐ 2 gene

Linfocita  attivato  IL2 3°segnale 

NFKB

Ca++

CTLA-4inibitore

MIGRAZIONE DEI LINFOCITI ATTIVATI ATTRAVERSO MOLECOLE DIADESIONE E CHEMOTTATICHE

SOPPRESSIONE IMMUNOLOGICAazione dei T-reg

CD4+ CD25+, ma non soloProducono IL‐10 e TGF‐βEsprimono CTLA‐4 (CD152)Esprimono membri della famiglia dei TNF‐receptors: TNFRSF‐4, TNFRSF‐9, GITR‐18 (glucocorticoid induced TNF receptor)Esprimono il fattore di trascrizione per il gene Foxp3

I LINFOCITI I LINFOCITI NATURAL KILLER (NK)NATURAL KILLER (NK)

-sono chiamati anche LGL-sono CD3-/TCR-, CD16+ (FcγRIII), CD56+

Esprimono recettori d’adesione: integrine, CD2, CD56recettori a struttura iG-simile per citochine: IL-2R, IL-12R, IL-15R, IL-18R, IFN-αR, IFN-γRe recettori responsabili della citotossicità naturale a dominio lectinico

Precursori: midollo osseoEffettori: sangue periferico (5-15%),

milza (1-3% dei linfociti), organi non linfoidi: polmoni, fegato,

villi intestinali, decidua.

L.Moretta - Ist. Gaslini

LE CELLULE NK LE CELLULE NK ENTRANO IN GIOCO IN SITUAZIONI ENTRANO IN GIOCO IN SITUAZIONI DIDI ALTERATA ESPRESSIONE ALTERATA ESPRESSIONE DIDI HLAHLA--II

L.Moretta - Ist. Gaslini

Una ridotta espressione di MHC I sulle Una ridotta espressione di MHC I sulle cellule tumorali cellule tumorali ESCAPE dell’azione dei CTL,ESCAPE dell’azione dei CTL,ma intervento delle cellule NKma intervento delle cellule NK

LE CELLULE NK LE CELLULE NK ENTRANO IN GIOCO IN SITUAZIONI ENTRANO IN GIOCO IN SITUAZIONI DIDI ALTERATA ESPRESSIONE ALTERATA ESPRESSIONE DIDI HLAHLA--II

(L.Moretta - Ist. Gaslini)

EOSINOPHILS ENTERTAIN A CROSS-TALK WITH MAST CELLS, FIBROBLASTS AND ENDOTHELIAL CELLS

Schematic diagram of an eosinophil and its multifunctional effects

Gli effettori della risposta immune:CITOCHINE

Sono i mediatori chimici della flogosi di più recente identificazione Le citochine,hanno attività pleiotropica, agiscono dopo essere state secrete all’esterno e si legano a specifici recettori sulle cellule bersaglioMediano la risposta infiammatoria‐immunitaria.Il meccanismo è principalmente autocrino e paracrino

CITOCHINE ‐2Citochine di tipo I (o TH1) fornite di attività chemiotattica (chemochine)  che richiamano nel focolaio flogistico cellule NK, linfociti T CD4+ e CD8+ e macrofagi e determinano la formazione di un infiltrato linfomonocitarioUn eccesso di stimolazione da parte di questa classe di citochine può cronicizzare una reazione infiammatoria( IFN‐gamma,TNF–gamma, IL12)

CITOCHINE ‐3

Citochine di tipo II (o TH2) – attive sui linfociti B e sui granulociti e presiedono alla risposta infiammatoria di fase acuta.(IL1, IL2‐IL4‐IL5‐IL13, TNF alfa)

CITOCHINE : pleiotropismoIL1 e TNF stimolano secrezione surrenali, ipoespressione Th1, attività macrofagicaDHEA può antagonizzare effetti del cortisolo e stimolare Th1Prolattina stimola attività ThSomatostatina inibisce proliferazione linfociti Placche del PeyerAnsia stress alterazione ritmi circadiani influenzano attivazione NKVit D ( pleiotropismo) inibisce Th1 e viene prodotta dai macrofagi attivati, promuove Th2 sulle mucose

Patogenesi malattie autoimmuni↓ segnali tolerogeni dall’antigene

↑ segnali immunogeni dall’antigene

↓ costimolazione tolerogena

↑ costimolazione immunogena

Citochine e autoimmunitàImmunogene: IFN‐γ, IL‐12

Tolerogene: TGF‐β, IL‐10

Tolerogene/immunogene: IL‐2/7/15TNF‐α (CD‐40L e FasL)

E. Rolla - Osp.Mauriziano To

Proff. Tieri – Valensin ‐ Univ. Bologna

NEURO –ENDOCRINO ‐ IMMUNOLOGIA

II Clinica MedicaUniv.La Sapienza Roma

NEURO‐ENDOCRINO ‐IMMUNOLOGIA

II Clinica MedicaUniv.La Sapienza Roma

NEURO‐ENDOCRINO‐IMMUNOLOGIA: Produzione di ormoni da parte del linfocita

II Clinica MedicaUniv.La Sapienza Roma

NEUROENDOCRINOIMMUNOLOGIA

The recognition of the identity of ligands and receptors in the immune, nervous, and endocrine systems suggest a radically altered view of the immune systems impact on other tissues and organ systems, and vice versa.( Ferencik 1997 ‐ Bratisl LekListy)

NEUROENDOCRINOIMMUNOLOGIAThe Immune System our mobile brain?We have postulated that the immune system can serve as a sensory organ for external stimuli that cannot be detected by the nervous system. Thus, the immune system recognizes stimuli such as bacteria, viruses or tumors, whereas the nervous system detects classical sensory stimuli. ( Blalock ‐Smith Brain Behavior and Immunity2007)I globuli bianchi e le cellule cerebrali sono da considerare come facenti parte dello stesso elemento vivente solo che le cellule cerebrali sono meno vitali , non si muovono e non proliferano, da questo deriva la possibilità della coscienza (R. Steiner 1922)

DOMANDELa cellula percepisce l’ambiente e se lo fa qual è il suo organo di percezione?Il DNA  controlla se stesso  o sono le proteine effettrici a farlo?La membrana cellulare sede di continue up e down regolazioni  di strutture recettoriali,e di formazioni di proteine carrier e di sintesi di proteine effettrici può esserlo?Come comunica una cellula con un’altra dopo l’evento percettivo?L’organismo è un insieme di recettori posti sulla membrana cellulare che percepiscono la nostra identità in relazione all’ambiente ( membrana come occhio e orecchio del Sé)La nostra identità è allo stesso tempo finita e infinita

Proff. Tieri – Valensin ‐ Univ. Bologna

SISTEMA NEUROENDOCRINO E IMMUNITA

Sistema che permette di attivare per un periodo limitato nel tempo delle attività protettive autoconservative basate comunque su un complesso sistema di apprendimento‐abitudine‐convinzione di ciò che può minacciare la propria integrità. Se tale sistema rimane permanentemente alterato, viene inibita progressivamente la funzione di crescita e differenziazione, propria dell’organismo in salute

CONCLUSIONI 1Le tue convinzioni diventano i tuoi pensieriI tuoi pensieri diventano le tue paroleLe tue parole diventano le tue azioniLe tue azioni diventano le tue abitudiniLe tue abitudini diventano i tuoi valoriI tuoi valori diventano il tuo destino(  Mahatma Gandhi)

IMMUNOGENICITA DEI TUMORIAntigeni virali Antigeni oncofetaliAntigeni mutantiAlterazione delle strutture glicoproteiche di membranadown‐reg .delle molecole MHC I ( tumor escape)GENETICA DEI TUMORI ( determinismo)EPIGENETICA DEI TUMORI ( relazionale e dinamica)

IMMUNOTERAPIA DEI TUMORI

BASATA SUATTIVITA CELLULE LAK( NK E TCD8)STIMOLAZIONE DI IL2 MODIFICAZIONI CELLULE APCINDIVIDUAZIONE DI RECETTORI CHIAVE

BASI TEORICHE DI IMMUNOTERAPIA:1) apoptosi( chemioterapia)2) IL4 e GMCSF( attivazione  segnali  costimolazione)3) IL2 amplificazione risposta linfocitaria4) Anticorpi monoclonali

VISCUM ALBUM L.

ComposizioneCaratteristiche farmacologicheStudi in vitro‐Studi in vivo

COMPOSIZIONE

CLASSE ELEMENTI QUANTITA PERCENTUALE

DNA Molto elevata

PROTEINE >600 10‐25

‐glicoproteine Lectine >20,4 Gruppi 0,003‐0,6

‐tionina Viscotossine >6 0,1‐1

‐enzimi Sorbitolo deidrogenasi >1000

Peptidi Visconamide 1/spp coloratum ?

Aminoacidi Arginina >15 0,2‐12

Tioli o mercaptani Glutatione >3 0,5‐11

Amine Colina Acetilcolina 6 ?

Polisaccaridi Pectine,Arabinosidi,Galactani >6 10‐35

Zuccheri solubili Saccarosio >5 0,5‐5

Ciclitoli (polialcoli) Mannitolo,Pinitolo 5 0,5‐5

Lipidi Di‐Trigliceridi >10 20‐50

Fitosteroli Beta‐Sitosterolo >4 ?

Triterpeni Beta‐amyrina 5 ?

Flavonoidi Ramnazina >20

Fenilpropano Siringina >15

Composizione ‐2

Antistagionalità( fioritura invernale, stato vegetativo estivo)Diversità di distribuzione dei componenti nei rami foglie e vescicole Diversa concentrazione massimale in rapporto al periodo dell’anno( Dicembre) e della pianta ospite.(es. 10 mcg/g di ML1 del vischio di quercia a 800mcg/g di ML1 del vischio di frassino) Elevato contenuto in viscotossine in Giugno

ConclusioniSpecie vegetale con caratteristiche morfologiche biochimiche tali da poterla definire la pianta che maggiormente indirizza i suoi processi nel tempo e luogo sbagliati. Tale analogia con lo sviluppo della malattia tumorale( Steiner 1924 GA 319) la rende   adatta a contrastare la malattia stessa intesa come tentativo di costruire un organo al posto e nel tempo sbagliato.L’individuazione di un singolo principio attivo che riassuma tutta l’essenza terapeutica risulta, inadeguata per la necessaria cooperazione che singoli componenti possono fornire all’azione terapeutica . ( A. Scheffler Inst. Carl Gustav Carus 1996) 

FARMACOLOGIA DEL VISCHIOLECTINE ( ML1 ML2 ML3)VISCOTOSSINE ( polipeptidi con 3 ponti disolfuro isoforme  A1‐A2‐A3)FLAVONOIDI( acido jasmonico)FENILPROPANDERIVATIForma farmaceutica :estratto acquoso‐estratto fermentato)Azione citotossica e/o proapoptotica ( Lectine viscotossinepolisaccaridi flavonoidi)Immunomodulazione( Lectine polisaccaridi Pianta intera)Revulsivo e  proinfimmatorio( pianta intera)Cardiodepressivo ipotensivo( viscotossina)

LECTINE‐1Le ML1 e 2 sono glicoproteine inattivanti i ribosomi  (tipo RIP II)costituite da due catene polipeptidiche di cui una glicata( B).Si differenziano per P.M. compreso tra 50 e 63 kD. La ML1 è legata a galattosio e le ML2 e ML3 a N‐acetilglucosammina‐ La ML1 possiede maggiore attività antigenicaLectina legante la chitina ( cbML) di recente individuazione può sviluppare risposta anticorpale. Presente in misura minore in una fase preterapeuticarispetto agli Ab ML1‐3( KLEIN 2004)

LECTINE‐2Circa due settimane dopo la somministrazione s.c si osserva la comparsa di Ab ML( Ig G2 – IgG3) che si riducono dopo sospensione e il cui ruolo è ancora incerto ( sottoclassi IgG? Limitazione citotossicità? Formazione di immunocomplessi circolanti?  MARCATORE DI RISPOSTA UMORALE ( VON LAUE 2003)Il contenuto di ML varia a seconda dell’ospite di provenienza 54ng/mg VQ; 25ng/mg VM; 1.3ng/mg VP; 1 ng/mg VA che tuttavia nonsembra interferire con la capacità citotossica su linee cellulari tumorali mammarie e vescicali (EGGENSCHWILER 2007)

Da studi preliminari si rileva un basso T1/2 : 13’ esaminato in soggetti affetti da tumore ‐ In soggetti sani dopo la somministrazione di Viscum Fraxini 20 mcg/ml si raggiunge un picco di concentrazione 2 h con persistenza 2 sett dopo la somministrazione( HUBER 2007) 

LECTINE‐3In colture linfocitarie dopo alcuni minuti inducono attraverso un legame recettoriale un aumento del Ca++ intracellulare. Dopo 4 h si ha una lisi del membrana cellulare aumento dei ROI di molecole di attivazione mitocondiale addensamento della cromatina e attivazione delle caspasi e infine la frammentazione nucleare e l’apoptosi cellulare. Si osserva poi un aumento della IL4 segnale di attivazione Th2 associato ad apoptosi. Tali eventi sono attribuibili esclusivamente all’azione delle lectine e non degli altri componenti attivi.( BUSSING 2000 HARMSMA 2004 LAVASTRE 2004)Alle concentrazioni di 10 ng/ml e fino a 1 mcg/ml esplicano effetti citostatici su differenti linee cellulari tumoraliIn colture cellulari di monociti alla conc di 1 ng/ml up regolano l’m‐RNA inducendo proliferazione  e attivazione mediante secrezione di IL2 e IL 12 (HAJTO 1996)

LECTINE‐4

Proliferazione  in vivo di NK e Linfociti T attivati   con persistenza di rialzo rispetto alla base line per 6 settimane dopo il trattamento ( 15 ng/0.5ml) (DOHMEN 2004)Produzione di TNF, IL5 e conseguente eosinofiliaVQ>VP (  % Lectine) induce eosinofilia. Le viscotossinenon inducono modificazioni ematologiche ( HUBER 2006)Sovraespressione di molecole di adesione intracellulare ‐ICAM 1‐2 e VCAM ( BUSSING 2006)Antiangiogenesi in vitro( H. Heidecke 2005)

IMMUNOSOPPRESSIONE DOPO   CHIRURGIA: PREVENZIONE

Infusione preoperatoria di vischio( Iscador) riduce significativamente la soppressione di NK circolanti dopo intervento di chirurgia riduttiva in pazienti portatori di Kcolorettale e migliora il burst ossidativo nei granulociti neutrofili (  ENESEL 2005 BUSSING 2006 ‐SCHINK 2008)

IMPORTANZA DELLA DOSE INIZIALE E REATTIVITA

L’uso di Abnoba Viscum 20ng/ML/ml e 100mcg VT/ml, instillati nella neoformazione associati ad infusione e.v. e trattamento s.c intensivo, provoca una intensa reazione sistemica ( febbre) a risoluzione nelle 24‐48 h post e sembra poter essere una metodologia da applicare sitemicamente.( VON LAUE 2008)

Si è osservata una stretta relazione tra reazione locale e riduzione del pannel T linfocitario in corso di somministrazione di estratto di vischio ( Abietis). Maggiore entità della risposta locale peggiore funzionalità linfocitaria nei sei mesi di osservazione e peggiore qualità della vita( BUSSING 2008)

Ct NK

Tho

Mediatori di flogosiAPC

Th2CD4

Macrofago

IL2 –IL 4- IL5-TNF

Eo ECP,Ige

B linf AbML

IL12 INF gamma

TCD8

CONCLUSIONIThe evidence from RCTs to support the view that the application of mistletoe extracts has impact on survival or leads to an improved ability to fight cancer or to withstand anticancer treatments is weak. Nevertheless, there is some evidence that mistletoe extracts may offer benefits on measures of QOL during chemotherapy for breast cancer, but these results need replication. Overall, more high quality, independent clinical research is needed to truly assess the safety and effectiveness of mistletoe extracts. Patients receiving mistletoe therapy should be encouraged to take part in future trails.Medizinische Klinik 5, Arbeitsgruppe Biologische Krebstherapie, Prof.‐Ernst‐Nathan‐Str. 1, Nuernberg, Germany, D‐90419. horneber@klinikum‐nuernberg.de

CONCLUSIONIINDUZIONE: somministrazione  ad alte dosi in sede tumorale e per via sistemica. Successivamente dosi scalari fino a ricerca dose ottimaleSomministrazione in infusione preoperatoriaControllo risposta anticorpale( AbML1)Controllo reazione locale e febbrile 

MetanalisiAmong 23 identified studies evaluated for clinically relevant results, 12 studies showed one or more statistically significant, positive effect, another 7 studies showed at least one positive trend, 3 showed no effect and 1 had a negative trend. All studies, however, suffered from methodological shortcomings to some degree, and many of the studies are not conclusiveAs several reasonably well conducted studies indicate beneficial effects, further properly designed trials should be encouraged. Future controlled studies should take into account the methodological limitations and potential biases of these past mistletoe trials outcome measure ( KIENLE – PORTALUPI2003)

CONCLUSIONI FINALIIL vischio può essere un farmaco attivo attraverso  il sistema immunitario. Il sistema immunitario è un organo in movimento a difesa del sé.Il sé è ciò che ci caratterizza non solo come specie ma anche come individualità( “indivisi”) esistenti.La terapia con il vischio può essere considerata  a sèstante o essere inserita in una visione più ampia del concetto di terapia che porti noi e i pazienti a ritrovare il senso della propria vita che la malattia ha profondamente perturbato