implication des levures du genre candida et des amibes
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THÈSE
Pour l'obtention du grade deDOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS
UFR de médecine et de pharmacieLaboratoire de chimie et microbiologie de l eau - LCME (Poitiers)
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)Secteur de recherche : Physiologie, biologie des organismes, populations et interactions
Présentée par :Vanessa Barbot
Implication des levures du genre Candida et des amibes libresdans le risque infectieux lié à l'eau - contexte des soins dentaires
Directeur(s) de Thèse :Christine Imbert, Marie Deborde
Soutenue le 30 octobre 2012 devant le jury
Jury :
Président Thierry Bergès Professeur des Universités, Université de Poitiers
Rapporteur Loïc Favennec Professeur des Universités, Université de Rouen
Rapporteur Martine Bonnaure-Mallet Professeur des Universités, Université de Rennes 1
Membre Christine Imbert Professeur des Universités, Université de Poitiers
Membre Marie Deborde Maître de conférences, Université de Poitiers
Membre Raymond Robert Professeur des Universités, Université d'Angers
Pour citer cette thèse :Vanessa Barbot. Implication des levures du genre Candida et des amibes libres dans le risque infectieux lié à l'eau contexte des soins dentaires [En ligne]. Thèse Physiologie, biologie des organismes, populations et interactions.Poitiers : Université de Poitiers, 2012. Disponible sur l'Intranet de l'Université de Poitiers <http://theses.univ-poitiers.fr>
THESE
Pour l’obtention du Grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
Faculté de Médecine et de Pharmacie (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
Ecole Doctorale : « Sciences pour l’environnement » Gay Lussac
Secteur de Recherche : Physiologie, Biologie des organismes, populations et Interactions
Présentée par :
Vanessa BARBOT
************************
IMPLICATION DES LEVURES DU GENRE
CANDIDA ET DES AMIBES LIBRES DANS LE
RISQUE INFECTIEUX LIE A L’EAU – CONTEXTE DES SOINS DENTAIRES
************************
Directrices de Thèse : Christine IMBERT et Marie DEBORDE
Soutenue le 30 octobre 2012 devant la Commission d’Examen
************************
JURY
Président : M. Thierry BERGES Professeur, Université de Poitiers Rapporteurs : Mme Martine BONNAURE-MALLET Professeur, Université de Rennes 1 M. Loïc FAVENNEC Professeur, Université de Rouen Examinateurs : M. Raymond ROBERT Professeur, Université d’Angers Mme Christine IMBERT Professeur, Université de Poitiers Mme Marie DEBORDE Maitre de Conférences, Université de
Poitiers
Thèse réalisée au Laboratoire d’Ecologie, Biologie des Interactions
EBI, UMR CNRS 7267
Equipe Microbiologie de l’Eau
Université de Poitiers, 6 Rue de la Milétrie, BP 199
86034 Poitiers cedex
Cofinancement
Ce projet a également bénéficié d’un soutien financier de l’IFRO (Institut Français de
Recherche en Odontologie) et des structures du CHU de Poitiers, nous les
remercions.
REMERCIEMENTS
« Le meilleur ami de ‘merci’ est ‘beaucoup’ » (M. Bouthot), et l’aboutissement de ce projet de
recherche étant lié à de nombreuses personnes, j’ai beaucoup de ‘merci’ à distribuer.
En premier lieu, je remercie les professeurs Jacques Frère et Didier Bouchon,
directeurs successifs du laboratoire LCME (Laboratoire de Chimie et de Microbiologie de
l’Eau) devenu récemment EBI (Ecologie, Biologie des Interactions), pour m’avoir accueillie
dans leur équipe et m’avoir permis de réaliser ce projet de recherche.
Je remercie également Yann Héchard, responsable de l’équipe Microbiologie de
l’Eau, pour sa gestion dynamique de l’équipe et son aide, directe ou indirecte, mais
indispensable.
Je tiens à remercier mes deux directrices de thèse, Christine Imbert et Marie
Deborde pour leur encadrement, leur présence, leur accompagnement continu, de près ou
de loin. Un merci particulier à Christine pour son écoute et son optimisme durant ces trois
années de recherche.
J’aimerai remercier les autres membres du jury : Martine Bonnaure-Mallet, Loïc
Favennec, Raymond Robert et Thierry Bergès pour avoir accepté de lire et de corriger
mon travail.
Je remercie tous ceux qui m’ont apporté leur expérience, leurs connaissances et qui
m’ont permis d’avancer dans ce projet de recherche : Jérôme Labanowsky (UMR CNRS
7285 Poitiers) pour les analyses de GC-MS, Nathalie Quellard et Béatrice Fernandez pour
les observations en microscopie électronique (Unité de pathologie ultrastructurale et
expérimentale ; Service d’anatomie et cytologie pathologique, CHU Poitiers), Virginie
Migeot pour les analyses statistiques (CHU Poitiers), Adriana Delwail (laboratoire LITEC,
plateforme ImageUp) pour les expériences de cytométrie en flux ainsi que le laboratoire
SR²B (Société de Recherche et de Réalisations Biotechnologiques) d’Angers dont fait partie
le Pr Raymond Robert, pour leurs conseils et leur participation aux marquages
immunocytochimiques.
Un grand merci à Nathalie Ranger et Karine Demangeau pour leur gestion efficace
de tout le côté logistique de l’équipe. Merci également à Alain, Christophe et Marie-Claude
pour leur aide quotidienne et indispensable.
Je remercie chaleureusement l’ensemble des techniciennes du service de
Parasitologie du CHU de Poitiers : Dominique, Michelle, Gyslaine, Marylène, Anne et
Sophie, ainsi que Nadine et Dominique au service de distribution. Merci également au Dr
Jacques Berthonneau, alias Mimile pour sa décoration particulière du bureau et sa
convivialité permanente. Un grand merci à Marie-Hélène Rodier, chef du service de
Parasitologie pour son accueil et surtout son aide précieuse. Merci à Anne Bousseau et
Amélie Robert pour leur participation au projet.
J’aimerai remercier les membres du CIMES (Cellule d’Initiation aux Métiers de
l’Enseignement Supérieur) et surtout Anne Brouard pour l’organisation des formations de
monitorat et Dominique Proudhon pour ses cours passionnants.
Merci à Charles Bodet et Nicolas Bellin pour m’avoir conseillée et encadrée durant
les TP de Bactériologie, rendant mon premier contact avec le domaine de l’enseignement
agréable et très motivant.
Merci également à mes stagiaires Armance et Jonathan, pour leur participation au
projet et leur motivation.
Un grand merci à Marion Girardot et Damien Costa pour leur amitié et l’ambiance
agréable qu’ils ont apporté dans le laboratoire du CHU.
Merci à Jean-Marc Berjeaud pour ses conseils et son optimisme, et merci à tous les
autres membres de l’équipe pour leur présence, leurs conseils divers et variés, sans oublier
leur participation volontaire pour les échantillonnages de salive. Un merci particulier à Aïcha
Gharbi pour m’avoir aiguillée et soutenue au début de ma thèse et à Julien Verdon pour
m’avoir initiée à la recherche et motivée à réaliser une thèse.
Enfin, un grand merci à mes parents Brigitte et Daniel, à toute ma famille pour leur
soutien et leurs encouragements, merci à tous mes amis, et plus particulièrement à Julien
et enfin Nicolas qui, en plus de son appui, m’a aidée à la réalisation de mon affiche de
thèse.
SOMMAIRE
Liste des abréviations 1
Liste des figures 2
Liste des tableaux 6
Introduction générale 7
Etude bibliographique 10
Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés 11
I. Les levures du genre Candida 11
1) Présentation 11
a) Taxonomie 11
b) Morphologie 11
2) Pathogénicité 12
a) Incidence et porteurs sains 12
b) Facteurs de pathogénicité 13
3) Adhérence et biofilm 14
a) Définition d’un biofilm 14
b) Etapes de formation d’un biofilm 15
c) Architecture 17
d) Régulation et QS 18
e) Résistances 18
4) Infections orales à Candida 19
a) Infections oropharyngées 19
b) Prévention 20
II. Les amibes libres 21
1) Présentation 21
a) Taxonomie 21
b) Morphologie 21
c) Environnement et prédation 23
d) ARB et endosymbiotes 24
2) Principaux genres amphizoïques 25
a) Acanthamoeba 26
b) Balamuthia 26
c) Naegleria 27
d) Sappinia 27
e) Vahlkampfia – Hartmannella 28
3) Infections amibiennes 29
a) Principales infections amibiennes 29
b) Modes de contamination 30
c) Traitements et prévention 31
Chapitre 2 : La salive 32
I. Généralités 32
1) Origine et formation 32
2) Caractéristiques et composition 33
a) Composants inorganiques 33
b) Composants organiques 33
3) Fonctions et applications 34
a) Goût 35
b) Protection et lubrification 35
c) Dilution et nettoyage 35
d) Barrière 36
e) Digestion 36
f) Réparation des tissus 36
g) Activité antimicrobienne 36
h) Diagnostic 36
4) Facteurs influents 36
a) L’hydratation 37
b) Le cycle circadien et rythme annuel 37
c) L’âge 37
d) Le sexe 37
e) Les stimuli 37
f) Les médicaments 37
g) Les infections 38
II. Micro-organismes et interactions 38
1) Flore commensale buccale 38
a) Flore bactérienne 38
b) Flore fongique 39
c) Interactions entre micro-organismes 39
2) Interactions des micro-organismes avec la salive 41
a) La salive favorise l’adhérence 42
b) La salive a une activité antimicrobienne 43
Chapitre 3 : Les units de soins dentaires 45
I. Définition et structure du circuit d’eau 45
1) Définition de l’unit de soins dentaires 45
2) Circuit d’eau de l’USD 46
II. Revues de la littérature 47
1) Revue nationale : Le Chirurgien Dentiste de France (2011) 48
2) Revue internationale : FEMS Immunology and Medical Microbiology
(2012) 57
Matériel et méthodes 67
Chapitre 1 : Milieux et réactifs 68
I. Le milieu de culture 68
II. Les micro-organismes 68
1) Souches utilisées 68
a) Souches de levures 68
b) Souches d’amibes libres 68
2) Culture et entretien 68
a) Culture des levures 68
b) Culture des amibes libres 68
3) Préparation des micro-organismes 71
a) Préparation des levures 71
b) Préparation des amibes libres 71
c) Préparation des surnageants de culture d’amibes libres 72
III. La salive 72
1) Obtention des échantillons 72
2) Préparation des salives 72
a) Salive centrifugée 72
b) Salive filtrée 72
c) Salive filtrée et traitée au DTT 73
d) Salive filtrée et chauffée 73
e) Salive filtrée et fractionnée 73
Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive 74
I. L’analyse de la salive 74
1) Préparation de la salive 74
2) Analyse par chromatographie 74
II. La survie dans l’eau 75
1) Survie des levures 75
a) Gamme de concentrations en salive 75
b) Préparation des suspensions 75
c) Suivi de la survie 75
d) Analyse de la viabilité 75
2) Survie des amibes libres 76
a) Gamme de concentrations en salive 76
b) Préparation des suspensions 76
c) Suivi de la survie 76
d) Analyse de la viabilité 76
Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures 78
I. Préparation des micro-organismes 78
II. Analyse de la viabilité 78
III. Observations microscopiques 79
1) Microscopie électronique à transmission 79
a) Préparation des cocultures 79
b) Fixation 1 79
c) Pré-enrobage 79
d) Fixation 2 79
e) Déshydratation 79
f) Inclusion en résine 80
g) Coupes et observations 80
2) Marquage immunocytochimique 81
a) Oxydation 81
b) Saturation 82
c) Anticorps primaire 82
d) Anticorps secondaire 82
e) Contraste 82
3) Microscopie électronique à balayage 82
a) Stérilisation des coupons 82
b) Préparation des cocultures 83
c) Fixation 83
d) Déshydratation 83
e) Dessiccation par méthode Point Critique 83
f) Métallisation et observations 84
IV. Analyse par cytométrie en flux 84
1) Cytométrie en flux : principe 84
2) Cytométrie en flux : application 85
a) Préparation des cocultures 85
b) Marquage par des fluorochromes 85
c) Analyse en cytométrie en flux 85
Chapitre 4 : Les traitements chimiques 86
I. Produits chimiques utilisés 86
II. Traitements des micro-organismes 87
1) Préparation des suspensions 87
a) Préparation des levures 87
b) Préparation des amibes libres 87
c) Préparation des cocultures 87
2) Traitements chimiques 87
3) Analyse de la viabilité 88
a) Analyse de la survie des levures 88
b) Analyse de la survie des amibes libres 88
Résultats et discussion 89
Chapitre 1 : Analyse de la salive 90
I. Objectif de l’étude 90
II. Chromatogramme obtenu par GC-MS 90
Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive 92
I. Survie des levures 92
1) Objectif de l’étude 92
2) Article : FEMS Microbiology Letters (2011) – Influence de la présence de
salive 92
3) Influence du type d’eau utilisée 97
4) Influence de la composition de la salive utilisée 98
a) Salive centrifugée VS salive filtrée 98
b) Salive filtrée VS salive DTT 100
c) Salive filtrée VS salive chauffée 102
d) Salive filtrée VS salives fractionnées 104
5) Influence de la température utilisée 106
II. Survie des amibes libres 110
1) Objectif de l’étude 110
2) Influence de la présence de salive 110
a) Sur la survie d’A. castellanii 110
b) Sur la survie de H. vermiformis 111
3) Influence de la température utilisée 112
Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures 114
I. Cocultures A. castellanii-Candida 114
II. Cocultures H. vermiformis-Candida 116
1) Article : Water Research (2012) – Interactions entre H. vermiformis et
Candida spp. 116
2) Influence de la température utilisée 125
3) Influence de la présence d’un surnageant d’amibes libres 126
III. Observations microscopiques 127
1) Microscopie électronique à transmission 128
a) Observations des cocultures en suspension 128
b) Marquage immunocytochimique 129
2) Microscopie électronique à balayage 131
IV. Cytométrie en flux 133
1) Analyse des suspensions de levures 134
2) Analyse des suspensions d’amibes libres 135
3) Analyse des cocultures 137
Chapitre 4 : Les traitements chimiques 139
I. Survie des microorganismes en mono-culture – Article en cours de soumission (2012) 139
II. Survie des microorganismes en cocultures 157
1) Viabilité des levures 157
2) Viabilité des amibes libres 159
Conclusion et perspectives 161
Références bibliographiques 166
- Liste des abréviations -
1
Liste des abréviations
Ag : Antigène
ARB : Amoeba-Resistant Bacteria
ATCC : American Type Culture Collection
DMSO : DiméthylSulfoxyde
DTT : DiThiolThréitol
ES : Elastomère de Silicone
FEMS : Federation of European Microbiological Societies
FSC : Forward Scatter
GC-MS : Gaz Chromatography – Mass Spectrometry
H2O2 : Peroxyde d’hydrogène
Ig : Immunoglobuline
IHEM : BCCM-IHEM, Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms
IP : Iodure de Propidium
MEB : Microscopie Electronique à Balayage
MEC : Matrice Extracellulaire
MET : Microscopie Electronique à Transmission
MOI : Multiplicity Of Infection
NaOCl : Hypochlorite de sodium
NNA : Non-Nutrient Agar
NPP : Nombre le Plus Probable
PIR : Porte-Instruments Rotatifs
PMA : Polymétacrylate
Ppm : parties par million
PRP : Protéines Riches en Proline
PVC : PolyChlorure de Vinyle
PYG : Peptone - Yeast extract - Glucose
PYNFH : milieu ATCC 1034 modifié
QS : Quorum-Sensing
SSC : Side Scatter
SVF : Sérum de Veau Fœtal
UFC : Unité Formant Colonie
USD : Unit de Soins Dentaires
VIH : Virus d’Immunodéficience Humaine
- Liste des figures -
2
Liste des figures
(Hors articles)
Figure 1 : Observations en microscopie électronique à balayage (MEB) des différentes
morphologies de C. albicans (Hawser and Douglas, 1994). 12
Figure 2 : Pourcentages des espèces de Candida retrouvées dans les candidoses
systémiques (entre 1991 et 2008). Le groupe « autres espèces » inclus C. lusitaniae, C.
krusei, C. guilliermondii, C. dubliniensis, et C. rugosa (Trofa et al., 2008). 13
Figure 3 : Représentation schématique des trois phases de développement d’un biofilm
de Candida spp. sur différents supports : PMA (polyméthacrylate) (a, b) et ES (élastomère
de silicone) (c, d). MEC : matrice extracellulaire (Chandra et al., 2001). 15
Figure 4 : Observations en MEB des différentes étapes de formation d’un biofilm de C.
albicans (1-5). * : blastospores, b : cellule en bourgeonnement, m : MEC, : hyphes
(Paulitsch et al., 2009). 16
Figure 5 : Images de microscopie confocale illustrant l’architecture en 3D d’un biofilm
mature de C. albicans (a, b). : hyphes (Chandra et al., 2001). 17
Figure 6 : Observations en MEB d’un biofilm de Candida spp. retrouvé sur la prothèse
dentaire d’un patient atteint de stomatite (A-C) (Ramage et al., 2004). 20
Figure 7 : Observations en microscopie optique de différents genres d’amibes libres :
Playtamoeba (A), Acanthamoeba (B, D et K), Vanella (C), Glaeseria (E), Hartmannella (F
et I), Naegleria (G et H) et Echinamoeba (J) (Thomas et al., 2008). 22
Figure 8 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a) et de kystes (b)
d’Acanthamoeba castellanii (x1000). n : noyau, cv : vacuole. (Visvesvara et al., 2007). 22
Figure 9 : Observations en microscopie électronique à transmission (MET) de la
phagocytose de Legionella pneumophila par Hartmannella vermiformis (A-D) et de sa
réplication à l’intérieur de l’amibe (E-F) (Greub and Raoult, 2003). 23
Figure 10 : Schéma du rôle des amibes libres en tant que réservoir et vecteur de
transmission de bactéries (Greub and Raoult, 2004). 25
Figure 11 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a) et d’un kyste (b) de
Balamuthia mandrillaris (x850) (Visvesvara et al., 2007). 26
Figure 12 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a), d’un flagellé (b) et
d’un kyste (c) de Naegleria fowleri (x1000). n : noyau et u : partie postérieure (Visvesvara
et al., 2007). 27
Figure 13 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (b), et de kystes (c) de
Sappinia diploidea (x1000). n : noyaux (Visvesvara et al., 2007). 27
- Liste des figures -
3
Figure 14 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (1), et d’un kyste (4) de
Hartmannella vermiformis. cv : vacuole (Smirnov and Michel, 1999). 28
Figure 15 : Kératite amibienne à Acanthamoeba (Scat et al., 1995). 29
Figure 16 : Encéphalite amibienne à Balamuthia (Schuster and Visvesvara, 2004). 30
Figure 17 : Schéma de la localisation des glandes salivaires majeures. 1 : glande parotide,
2 : glande sous-mandibulaire, 3 : glande sublinguale
(http://coproweb.free.fr/pagphy/physioan/ch5s1.htm; 04/08/2012). 32
Figure 18 : Les différentes fonctions de la salive (Crielaard, 2011). 34
Figure 19 : Schéma des interactions mutualistes entre C. albicans et Streptococcus
gordonii dans la cavité orale (a-e). QS : Quorum Sensing (Morales and Hogan, 2010). 41
Figure 20 : Schéma des différentes interactions entre la salive et les micro-organismes
oraux (A-D). K+ : potassium, exemple d’ions intracellulaires (Scannapieco, 1994). 42
Figure 21 : Adhérence de différentes souches de C. albicans sur un support de PMA, en
absence (A) ou en présence (B) de salive (Elguezabal et al., 2008). 43
Figure 22 : Effet de différentes salives sur la transition blastospores-hyphes de C. albicans
(Leito et al., 2009). 44
Figure 23 : Photographies de différentes parties de l’USD. (a) vue d’ensemble, (b) vue
intérieure du circuit d’arrivée d’eau (ici un réservoir interne), (c) le plateau supportant les
PIR, (e) le crachoir et le circuit d’évacuation d’eau (O'Donnell et al., 2006). 45
Figure 24 : Photographie de tubulures d’USD. (a) tubulure entière, (b) section de tubulure
(Porteous, 2010). 46
Figure 25 : Vue intérieure de l’USD : un réseau complexe de circulation d’eau (Wirthlin et
al., 2003). 46
Figure 26 : Section longitudinale d’une tubulure d’USD, recouverte de biofilm (Coleman et
al., 2007). 47
Figure 27 : Aérosols visibles, produits par une turbine d’USD lors d’un acte de soins
dentaires (Harrel and Molinari, 2004). 48
Figure 28 : Protocole de tyndallisation de bactéries. 71
Figure 29 : Inclusion des échantillons dans une résine époxy (A, B) (Unité de pathologie
ultrastructurale et expérimentale ; Service d’anatomie et cytologie pathologique, CHU
Poitiers). 80
Figure 30 : Coupes ultra-fines déposées sur des grilles de cuivre (A) et porte-échantillon
permettant l’insertion des grilles dans le MET (B) (Unité de pathologie ultrastructurale et
expérimentale ; Service d’anatomie et cytologie pathologique, CHU Poitiers). 81
Figure 31 : Schéma du principe de la cytométrie en flux (http://bentleyinstruments.com/
wp-content/uploads/2010/12/Somacount_FCM-300x254.jpg, 4/08/2012). 84
- Liste des figures -
4
Figure 32 : Chromatogramme de la salive filtrée, analysée par GC-MS (n=2). 91
Figure 33 : Survie de C. albicans dans l’eau distillée (A) et dans l’eau filtrée (B), en
présence de différentes concentrations de salive centrifugée (0, 2, 5 et 10% v/v) à 27°C
(n=2). 97
Figure 34 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau
filtrée en présence de 5% (v/v) de salive centrifugée ou filtrée à 27°C (n=2). 99
Figure 35 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau
filtrée en présence de 5% (v/v) de salive filtrée ou de salive DTT à 27°C (n=2). 101
Figure 36 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau
filtrée en présence de 5% (v/v) de salive filtrée (n=2) ou chauffée à 27°C (n=1). 103
Figure 37 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau
filtrée en présence de 5% (v/v) de salive filtrée, de salive <5 K ou <30 K à 27°C (n=2). 105
Figure 38 : Survie de C. albicans à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en
présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2). 107
Figure 39 : Survie de C. glabrata à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en
présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2). 108
Figure 40 : Survie de C. parapsilosis à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée
en présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2). 109
Figure 41 : Survie d’A. castellanii dans l’eau filtrée en présence de 2, 5 ou 10% (v/v) de
salive filtrée à 20°C (n=1). 111
Figure 42 : Survie de H. vermiformis dans l’eau filtrée en présence de 2, 5 ou 10% (v/v)
de salive filtrée à 20°C (n=2). 111
Figure 43 : Survie de H. vermiformis à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée
en présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2). 113
Figure 44 : Survie d’A. castellanii (A) (n=1) et de C. albicans (B) (n=2), en coculture dans
l’eau filtrée en présence de 2% (v/v) de salive filtrée, à 20°C. 115
Figure 45 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B) et C. parapsilosis (C), en coculture
avec H. vermiformis, dans l’eau filtrée avec 2% (v/v) de salive filtrée, à 20, 27 et 10°C
(n=2). 125
Figure 46 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B) et C. parapsilosis (C), en présence
de surnageant de culture amibienne ou de H. vermiformis, dans l’eau filtrée, à 20°C
(n=2). 127
Figure 47 : Observations en MET de C. albicans (A) et de H. vermiformis (B) en coculture
dans de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 24 h (C-D) et 168 h (E-F)
d’incubation à 20°C (n=2). 129
- Liste des figures -
5
Figure 48 : Observations en MET de C. albicans et de H. vermiformis en coculture dans
de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 72 h d’incubation à 20°C et marquage
immunocytochimique (A-D) (n=2). 130
Figure 49 : Observations en MEB de coupons de PVC incubés dans de l’eau filtrée,
après 72 h d’incubation à 20°C (A-B) (n=1). 131
Figure 50 : Observations en MEB de C. albicans et de H. vermiformis en coculture sur
coupons de PVC, dans de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 3 jours (A-B),
15 jours (C-D) et 42 jours (E-F) d’incubation à 20°C (n=1). 132
Figure 51 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de C. albicans après
72 h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de salive filtrée (v/v) à 20°C (n=2). 135
Figure 52 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de H. vermiformis
après 72 h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de salive filtrée (v/v) à 20°C (n=1). 137
Figure 53 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de C. albicans et de
H. vermiformis en coculture, après 72 h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de
salive filtrée (v/v) à 20°C (n=1). 138
Figure 54 : Survie de C. albicans en coculture avec H. vermiformis, dans l’eau filtrée, à
20°C et après 15 min de mise en présence de chlore (A), d’H2O2 (B) ou d’Oxygenal 6©
(C) (n=1). 158
Figure 55 : Survie de H. vermiformis en coculture avec C. albicans, dans l’eau filtrée, à
20°C et après 15 min de mise en présence de chlore (A), d’H2O2 (B) ou d’Oxygenal 6©
(C) (n=1). 160
- Liste des tableaux -
6
Liste des tableaux
(Hors articles)
Tableau 1 : Les trois principales fonctions des protéines de la salive (Rudney, 2000). 35
Tableau 2 : Espèces fongiques retrouvées dans la cavité orale de 20 individus sains
(Ghannoum et al., 2010). 40
Tableau 3 : Préparation du milieu PYG. 69
Tableau 4 : Préparation du milieu PYNFH (ATCC 1034). 70
Tableau 5 : Tableau statistique pour la méthode du NPP à 3 géloses par dilution
(http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalytical
ManualBAM/ucm109656.htm, 4/08/2012). 77
7
Introduction
générale
- Introduction générale -
8
La contamination microbienne des units de soins dentaires (USD) est connue et
étudiée depuis les années 1960. De nombreux travaux ont été menés depuis sans aboutir à
des solutions satisfaisantes. L’origine de cette contamination est multiple.
D’une part l’eau arrivant au sein de l’USD, provenant du réseau d’eau potable ou d’un
réservoir indépendant, peut transporter des micro-organismes qui vont coloniser le circuit
d’eau de l’USD, se déposer sur les parois des tubulures et y former un biofilm. Ce biofilm
pourra par la suite se décrocher, et ainsi contaminer l’eau délivrée aux patients par le biais
des porte-instruments rotatifs (PIR).
D’autre part, la contamination du circuit d’eau de l’USD peut être le résultat d’un reflux de
micro-organismes provenant de la bouche d’un patient. Durant un soin dentaire, les PIR en
contact avec la muqueuse buccale du patient peuvent être en effet contaminés par contact
direct ou par le biais des aérosols contenant des micro-organismes oraux. Ces derniers se
retrouvent donc dans le circuit d’eau de l’USD et peuvent s’intégrer au biofilm formé sur les
parois des tubulures, dans le cas d’un dysfonctionnement ou de l’absence de valves anti-
reflux au niveau des PIR.
De nombreux micro-organismes ont été isolés dans l’eau des USD, et parmi eux
certains peuvent être impliqués de façon directe et/ou indirecte en pathologie humaine.
Suivant les recommandations en vigueur en France, l’eau qui entre dans l’USD doit
respecter les critères de potabilité de l’eau destinée à la consommation humaine.
Cependant, il n’existe pas de législation concernant l’eau en sortie de l’USD, et le passage à
l’intérieur des tubulures potentiellement recouvertes de biofilm augmente la charge
microbienne de l’eau, exposant ainsi les patients et les praticiens à une eau pouvant être
contaminée. Pas ou peu de cas d’infections sont recensés. Toutefois quelques cas de
pathologies respiratoires ou encore de kératites amibiennes sont rapportés dans la
littérature ; un lien direct avec un acte de soin dentaire a dans ces cas plus ou moins été mis
en évidence. Ce risque infectieux ne représente peut-être pas un problème de santé
publique, mais il existe et concerne plus particulièrement les personnes fragiles ou
immunodéprimées, de plus en plus nombreuses (ex. : personnes âgées, fumeurs,
diabétiques, VIH+, …). Fournir un environnement exempt de micro-organismes pathogènes
durant un soin dentaire reste donc un objectif à atteindre.
Par ailleurs, de nombreux moyens de lutte contre cette contamination peuvent être mis
en œuvre tels que la filtration de l’eau, l’utilisation de désinfectants, la présence et l’entretien
des valves anti-reflux, ou encore la purge des flexibles. Malheureusement, ces
recommandations sont souvent mal connues et de ce fait insuffisamment suivies par les
praticiens. Ce manque d’information conduit à une prise de conscience insuffisante du
risque infectieux. C’est dans une démarche de prévention et de sensibilisation au risque
infectieux que ce projet de recherche a été initié.
- Introduction générale -
9
Les principaux objectifs de ce travail ont été de mieux connaitre le comportement de
micro-organismes d’intérêt pouvant être présents dans l’eau des USD, étudier les
interactions mises en jeu entre ces micro-organismes potentiellement pathogènes pour
l’Homme et ainsi mieux évaluer le risque infectieux lié à leur présence dans l’eau circulant au
sein de l’USD.
Les micro-organismes qui ont été choisis pour cette étude sont, d’une part, trois espèces de
levures appartenant au genre Candida, commensales et pathogènes opportunistes de
l’Homme, très fréquemment impliquées dans des infections nosocomiales. Suite à une
défaillance ou à l’absence de valves anti-reflux au niveau des PIR, elles peuvent se
retrouver à l’intérieur des tubulures de l’unit, accompagnées par un reflux de salive
provenant du patient, durant un soin dentaire.
D’autre part, des micro-organismes environnementaux issus du réseau d’eau potable ont été
étudiés : les amibes libres Acanthamoeba castellanii et Hartmannella vermiformis. Ces
protozoaires sont ubiquitaires dans l’environnement, peuvent être à l’origine d’infections
chez l’Homme et ont la capacité de servir d’hôte pour le développement intracellulaire de
certains micro-organismes potentiellement pathogènes (ex : Legionella pneumophila).
Enfin, dans un but de prévention et de lutte contre le risque infectieux que ces micro-
organismes peuvent représenter, l’efficacité de différents traitements chimiques
communément utilisés a été étudiée sur les différentes espèces de Candida et d’amibes
libres. De nombreux produits chimiques ont été développés pour la désinfection des USD,
ainsi que différentes méthodes de traitement. Selon le type d’USD et le fournisseur associé,
le traitement peut être réalisé avec l’utilisation de désinfectants de façon périodique ou
continue, ou encore en combinant plusieurs désinfectants. Les produits disponibles ne sont
que peu ou pas étudiés en termes d’efficacité contre des micro-organismes adhérés à des
surfaces ou de toxicité pour les patients. De plus, leur effet corrosif sur les matériaux n’est
pas toujours évalué. Dans cette étude, l’activité antimicrobienne de trois produits a été
analysée : le chlore (NaOCl), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et l’Oxygenal 6© (peroxyde
d’hydrogène avec des ions argent).
10
Etude
bibliographique
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
11
Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés
I. Les levures du genre Candida
1) Présentation
Les levures du genre Candida sont des organismes eucaryotes, d’une taille de 4 à 10
µm et qui se multiplient par bourgeonnement (Odds, 1988). Ce sont des micro-organismes
commensaux et pathogènes opportunistes pour l’Homme (Akpan and Morgan, 2002; Hube,
2004). Le commensalisme est une association entre deux organismes dont seul un
organisme (le commensal) tire profit sans pour autant nuire au deuxième (l’hôte). Candida
est principalement isolé dans les muqueuses telles que la cavité orale, le tractus gastro-
intestinal, le tractus uro-génital ou la peau (Ghannoum et al., 2010; Odds, 1988). Candida a
pour la première fois été isolé en 1884 dans l’expectoration d’un patient atteint de
tuberculose (Akpan and Morgan, 2002). Sous certaines conditions, par exemple un système
immunitaire fragilisé (VIH+, âge, chimiothérapie, …) ou une flore commensale réduite suite à
un traitement antibiotique, Candida peut devenir pathogène pour son hôte : on parle donc de
pathogène opportuniste.
a) Taxonomie
Les levures du genre Candida appartiennent au règne fongique, plus précisément au
phylum des Ascomycètes, à la classe des Saccharomycètes, à l’ordre des
Saccharomycétales et à la famille des Saccharomycétacées. Le genre Candida dénombre
plus de 300 espèces parmi lesquelles seule une minorité, dont C. albicans, C. tropicalis, C.
glabrata, C. krusei, C. parapsilosis et C. dubliniensis, se retrouve impliquée en pathologie
humaine (Akpan and Morgan, 2002). L’espèce la plus fréquente et de ce fait la plus étudiée
est C. albicans.
b) Morphologie
Candida est une levure dimorphique (Douglas, 2003), qui peut exister sous une forme
ovoïde unicellulaire, la blastospore (Figure 1) appelée encore « type levure » et sous une
forme filamenteuse pluricellulaire, l’hyphe, caractéristique des champignons (Figure 1). Une
troisième forme intermédiaire est retrouvée, le pseudo-hyphe. Les pseudo-hyphes
ressemblent à des blastospores allongées, restant attachées entre elles (Figure 1). Ces
formes cellulaires possèdent des propriétés différentes, notamment en terme de fonction ;
les blastospores seraient plus adaptées pour la dissémination et la survie commensale, alors
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
12
que les hyphes favoriseraient l’invasion et la pénétration des tissus (Cannon et al., 1995a).
La transition morphologique se fait en réponse à différents stimuli environnementaux
(Cannon et al., 1995a; Leito et al., 2009), tels que le pH, la température ou encore la
présence de nutriments.
Figure 1 : Observations en microscopie électronique à balayage (MEB) des différentes
morphologies de C. albicans (Hawser and Douglas, 1994).
2) Pathogénicité
a) Incidence et porteurs sains
Les levures du genre Candida sont isolées de la cavité orale de 20 à 75% de la
population générale, sans symptômes associés. En cas de dysfonctionnement du système
immunitaire de l’hôte, ces levures sont capables de développer leur caractère pathogène et
de causer une grande variété d’infections, nommées candidoses. Ces infections peuvent
être superficielles au niveau de la peau et des muqueuses, systémiques au niveau des
organes profonds (comme le foie ou les reins), ou encore septicémiques (Douglas, 2003;
Trofa et al., 2008). L’incidence des infections fongiques a fortement augmenté depuis les
années 1980, notamment dans le milieu hospitalier : les candidoses sont considérées
comme la quatrième cause d’infections nosocomiales (Trofa et al., 2008). Avec une mortalité
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
13
associée de plus de 45%, les infections à Candida spp. sont devenues un réel problème de
santé publique (Hawser and Douglas, 1994; Trofa et al., 2008).
C. albicans, C. parapsilosis et C. glabrata représentent plus de 80% des espèces
isolées en cas de candidoses nosocomiales ; C. albicans étant impliquée à elle seule dans
50% des cas (Figure 2) (Akpan and Morgan, 2002; Trofa et al., 2008).
Figure 2 : Pourcentages des espèces de Candida retrouvées dans les candidoses
systémiques (entre 1991 et 2008). Le groupe « autres espèces » inclus C. lusitaniae, C.
krusei, C. guilliermondii, C. dubliniensis, et C. rugosa (Trofa et al., 2008).
b) Facteurs de pathogénicité
L’ampleur de l’infection fongique dépend d’une part de facteurs liés à l’hôte dont :
-des facteurs intrinsèques tels que l’âge, le sexe ou un affaiblissement général de l’immunité
dû à certaines maladies comme le diabète, le VIH ou les cancers (Akpan and Morgan, 2002;
Daniluk et al., 2006).
-des facteurs extrinsèques tels que des traitements médicamenteux ou chirurgicaux. Une
antibiothérapie à long terme altère la flore microbienne commensale et favorise le
développement des candidoses, alors que les procédures invasives comme la pause de
cathéters ou de sondes offrent aux levures une porte d’entrée vers la circulation sanguine
(Akpan and Morgan, 2002; Daniluk et al., 2006; Trofa et al., 2008).
D’autre part, les levures du genre Candida possèdent un arsenal de facteurs de
pathogénicité ; leur combinaison conduira au développement d’une infection chez un hôte
affaibli. Les facteurs les plus importants sont :
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
14
-le dimorphisme,
-la sécrétion d’enzymes lytiques (ex : protéases, phospholipases), qui faciliteront le passage
des levures au niveau des tissus,
-l’adhérence, qui représente l’étape initiale de la colonisation des surfaces (vivantes ou
inertes).
3) Adhérence et biofilm
Les levures du genre Candida sont capables de se fixer aussi bien à des surfaces
vivantes, telles que les cellules épithéliales (buccales ou vaginales), les kératinocytes ou les
composants tissulaires (fibronectine, fibrinogène, …), qu’à des surfaces synthétiques
comme les plastiques (silicone, chlorure de polyvinyle (PVC), acrylique, …). L’étape
d’adhérence, initiatrice de la colonisation fongique, contribue à la formation d’un biofilm.
a) Définition d’un biofilm
La définition d’un biofilm a beaucoup évolué depuis ces 30 dernières années.
Actuellement, il est défini comme étant une communauté de micro-organismes attachés de
manière irréversible à un substrat (micro-organismes dits sessiles), ancrés dans une matrice
de substances polymériques extracellulaires (MEC) qu’ils ont sécrétées, et présentant un
phénotype modifié par rapport à leur équivalent planctonique (libres, en suspension)
notamment en termes de taux de croissance ou de transcription génique (Donlan and
Costerton, 2002). Le biofilm est un système biologique complexe, structuré et dynamique, et
représente la forme d’existence microbienne la plus répandue dans la nature (Baillie and
Douglas, 1999; Douglas, 2003). Le premier exemple reconnu de biofilm naturel est la plaque
dentaire (Douglas, 2003). Il a depuis été démontré qu’un nombre important d’infections
humaines étaient liées au développement d’un biofilm microbien (Douglas, 2003).
Les recherches sur les biofilms, après s’être longtemps focalisées sur les exemples
bactériens (Baillie and Douglas, 1999), commencent à se concentrer de plus en plus sur les
biofilms fongiques, et différents modèles d’étude in vitro commencent à se développer. C.
albicans, espèce la plus impliquée dans les infections, est souvent choisie comme modèle
de référence.
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
15
b) Etapes de formation d’un biofilm
La formation d’un biofilm fongique est un processus complexe se déroulant en
plusieurs phases dont 3 principales peuvent être distinguées : la phase précoce, la phase
intermédiaire et la phase de maturation (Figure 3) (Chandra et al., 2001).
Figure 3 : Représentation schématique des trois phases de développement d’un biofilm de
Candida spp. sur différents supports : PMA (polymétacrylate) (a, b) et ES (élastomère de
silicone) (c, d). MEC : matrice extracellulaire (Chandra et al., 2001).
-phase précoce : les levures, sous forme de blastospores, arrivent à proximité de la surface
et vont s’y associer (Figure 3) par l’intermédiaire de facteurs non-spécifiques (forces
électrostatiques, hydrophobicité de surface) et spécifiques (reconnaissance ligands-
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
16
récepteurs de surface). Cette étape, d’environ 11 h, est rapidement suivie par des divisions
cellulaires aboutissant à la formation de micro-colonies à la surface du support (Figure 4-1)
(Chandra et al., 2001; Paulitsch et al., 2009; Ramage et al., 2005).
-phase intermédiaire : lors de cette phase, les formes hyphes commencent à apparaitre, et
la matrice extracellulaire (MEC) est sécrétée (Figure 3). Cette étape se déroule entre 12 et
30 h après l’adhérence initiale des blastospores (Figure 4-2 ; 4-3).
Figure 4 : Observations en MEB des différentes étapes de formation d’un biofilm de C.
albicans (1-5). * : blastospores, b : cellule en bourgeonnement, m : MEC, : hyphes
(Paulitsch et al., 2009).
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
17
-phase de maturation : au cours de cette phase tardive (31 à 72 h), la matrice
polysaccharidique s’épaissit et englobe un réseau fongique (Figure 3) composé de
blastospores, d’hyphes et de pseudo-hyphes (Figure 4-4 ; 4-5). Au-delà de 72 h, une
quatrième phase débute, avec le détachement de levures seules ou en amas, se retrouvant
à l’état planctonique.
c) Architecture
Le biofilm fongique est décrit comme une structure bi-phasique tridimensionnelle
composée d’une couche basale de blastospores recouverte d’une couche plus ou moins
épaisse constituée de formes filamenteuses et de MEC (Figure 5) (Baillie and Douglas,
1999; Chandra et al., 2001; Paulitsch et al., 2009). La couche basale, peu épaisse (10-12
µm ; environ ¼ de l’épaisseur du biofilm) joue un rôle primordial dans la solidité de l’ancrage
du biofilm à la surface (Baillie and Douglas, 1999; Douglas, 2003). La couche plus externe,
composée d’hyphes et de MEC est beaucoup plus volumineuse (environ ¾ de l’épaisseur du
biofilm) et peut atteindre 450 µm d’épaisseur (Baillie and Douglas, 1999; Chandra et al.,
2001).
Figure 5 : Images de microscopie confocale illustrant l’architecture en 3D d’un biofilm mature
de C. albicans (a, b). : hyphes (Chandra et al., 2001).
Lors de la maturation du biofilm, des canaux aqueux se forment, permettant de faire circuler
les nutriments jusqu’aux couches profondes du biofilm et d’évacuer les déchets
métaboliques (Baillie and Douglas, 1999).
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
18
d) Régulation et QS
La formation d’un biofilm dépend de plusieurs facteurs dont d’une part des facteurs
environnementaux tels que la nature de la surface (rugosité, hydrophobicité). En effet les
surfaces lisses comme le silicone favorisent beaucoup moins le développement de biofilms
que des surfaces plus rugueuses telles que le PVC (chlorure de polyvinyle) (Douglas, 2003;
Hawser and Douglas, 1994). Les surfaces peuvent également être recouvertes d’un film de
conditionnement protéique qui favorisera l’adhérence des micro-organismes en apportant
des ligands supplémentaires et en modifiant les caractéristiques physiques et chimiques de
la surface (charge, hydrophobicité, …) (Donlan, 2002; Douglas, 2003). Dans l’exemple de la
formation de la plaque dentaire, les dents ou encore les surfaces acryliques des prothèses
dentaires sont rapidement recouvertes d’une fine couche de salive appelée pellicule
exogène acquise, et qui favorise l’adhérence des micro-organismes (Scannapieco et al.,
1995; Zijnge et al., 2010). Le pH du milieu environnant, ainsi que les nutriments et l’oxygène
disponibles vont également influer sur la formation du biofilm (Mukherjee et al., 2005).
D’autre part, de nombreuses études ont montré que les micro-organismes à l’intérieur des
biofilms présentaient un profil transcriptionnel très différent de celui de cultures
planctoniques (Chandra et al., 2001; Donlan, 2002). La voie de régulation génétique de la
formation des biofilms de C. albicans, complexe et récemment élucidée, ne sera pas
développée dans cette étude bibliographique.
Enfin, la communication intercellulaire, appelée « quorum-sensing » (QS), joue un rôle
important dans la formation et le maintien du biofilm (Podbielski and Kreikemeyer, 2004).
Les cellules sont capables de communiquer par le biais de molécules qu’elles sécrètent en
fonction de la densité cellulaire de la population. Une réponse physiologique et génétique est
initiée une fois que la concentration seuil en ces molécules est atteinte (Podbielski and
Kreikemeyer, 2004). Deux molécules ont été identifiées pour C. albicans : le tyrosol, qui
favorise la formation d’hyphes et de biofilm, et le farnesol qui exerce l’effet inverse
(Mukherjee et al., 2005; Ramage et al., 2005).
e) Résistances
Comparé à la croissance planctonique, le développement des micro-organismes au
sein d’un biofilm leur procure une meilleure survie. Englobés dans ce micro-environnement,
ils se retrouvent protégés contre de nombreuses agressions extérieures telles que les
variations de pH, de concentration en nutriments, la dessiccation ou encore la prédation
(Donlan, 2002). La croissance sous forme de biofilm permet une proximité entre micro-
organismes favorisant les échanges plasmidiques et les coopérations, aboutissant à une
forte augmentation de la résistance aux traitements antimicrobiens ou encore aux défenses
immunitaires de l’hôte (El-Azizi et al., 2004; Ghigo, 2001).
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
19
Les micro-organismes sessiles peuvent être mille fois moins sensibles à un traitement
antimicrobien que les cellules planctoniques (Chandra et al., 2001). Plusieurs mécanismes
de résistance ont été identifiés chez C. albicans (Douglas, 2003; Ramage et al., 2005), par
exemple :
-la présence de la MEC constitue une barrière diffusive et permet de ralentir l’accès des
molécules antifongiques aux couches profondes du biofilm,
-un état de croissance ralentie, dû à un accès parfois limité en nutriments, surtout dans les
couches les plus internes du biofilm, engendre des changements du métabolisme, et
notamment dans la composition de la membrane fongique,
-l’expression modifiée de certains gènes durant la formation du biofilm, telles que des gènes
codant pour des pompes à efflux qui se retrouvent alors surexprimées à la surface des
levures.
4) Infections orales à Candida
a) Infections oropharyngées
Une grande proportion de la population générale est colonisée par C. albicans au
niveau de la cavité buccale (Cannon and Chaffin, 1999), mais seulement une partie de ces
individus développeront une candidose orale. Le développement de l’infection est lié à divers
facteurs tels que l’âge de l’individu ou encore un état affaibli du système immunitaire ; ainsi
dans la population générale, 30-45% des adultes sont des porteurs sains, contre 75% en ne
considérant que les personnes ayant une prothèse dentaire (Daniluk et al., 2006), ou 95%
en ne considérant que les personnes atteintes du VIH (Akpan and Morgan, 2002). La
prothèse dentaire représente un support propice à l’adhérence de micro-organismes oraux
tels que les levures du genre Candida, sur lequel ils pourront plus facilement former un
biofilm (Figure 6), augmentant ainsi la possibilité de développement d’une infection orale.
Il existe de nombreuses formes cliniques de candidoses oropharyngées, dont les
principales sont (Akpan and Morgan, 2002; Bichot, 2012):
-la forme pseudomembraneuse ou « muguet » ; forme la plus commune, retrouvée surtout
chez des individus au système immunitaire fragile (nouveau-nés et personnes âgées), des
patients atteints de diabètes ou du VIH, sous chimiothérapie ou radiothérapie. Elle se
caractérise par l’apparition d’efflorescences blanchâtres, composées de cellules épithéliales
desquamées et de cellules fongiques, retrouvées au niveau des muqueuses buccales et
labiales, de la langue et du palais,
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
20
-la forme hyperplasique chronique, caractérisée par des lésions cutanées de la muqueuse
buccale et de la langue et fréquemment retrouvée chez les fumeurs,
-la forme atrophique chronique, ou « stomatite » ; retrouvée chez plus de 60% des individus
porteurs de prothèses dentaires (O'Sullivan et al., 2000), et caractérisée par des érythèmes
localisés au niveau de la prothèse,
-la glossite losangique médiane ; érythème en losange sur la langue atrophiant les papilles,
souvent associé au diabète et au tabac,
-la chéilite angulaire ou « perlèche » ; inflammation des commissures des lèvres, souvent
bilatérale et récidivante et associée à une carence en fer, en vitamine B12 ou une anémie.
Toutes ces infections entraînent un inconfort permanent au niveau buccal, des brûlures, une
altération de la sensation de goût et une nutrition compromise (Coco et al., 2008).
Figure 6 : Observations en MEB d’un biofilm de Candida spp. retrouvé sur la prothèse
dentaire d’un patient atteint de stomatite (A-C) (Ramage et al., 2004).
b) Prévention
Dés son introduction dans la cavité buccale, la prothèse dentaire se retrouve
recouverte de salive et représente un support idéal pour la formation inévitable de biofilms.
La prévention des candidoses orales commence par une bonne hygiène de la cavité
buccale ; un nettoyage quotidien des dents, de la langue et des prothèses dentaires est
fortement recommandé (Akpan and Morgan, 2002). De plus, certains facteurs favorisant le
développement de micro-organismes à la surface des prothèses comme le port prolongé
des prothèses ou encore pendant la nuit, peuvent être évités (Daniluk et al., 2006).
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
21
II. Les amibes libres
1) Présentation
Les amibes libres sont des protozoaires mobiles, organismes unicellulaires eucaryotes
se nourrissant par phagocytose, c’est-à-dire par ingestion d’autres micro-organismes. Les
amibes libres sont distinguées des amibes dites parasitaires ; la survie de ces dernières
dépend de la présence d’un hôte (Schuster and Visvesvara, 2004). Les amibes libres sont
capables de se développer et de se disséminer de façon autonome dans l’environnement.
a) Taxonomie
Les amibes libres sont classées dans l’embranchement des Amoebozoa des
protozoaires (Thomas et al., 2008). Le groupe des amibes regroupe une grande diversité
d’unicellulaires ayant des caractéristiques morphologiques et comportementales communes
(Loret and Greub, 2010). Plus de 11000 espèces ont été recensées, dont seule une minorité
est responsable d’infections chez l’Homme.
b) Morphologie
Les amibes libres ont une taille variable allant de quelques dizaines de micromètres à
plusieurs centaines (Figure 7).
Elles existent sous deux formes principales : le trophozoïte, forme végétative
métaboliquement active, qui est capable de se nourrir de micro-organismes, de se déplacer
et de se multiplier, (Figure 8-a) et le kyste, forme de résistance (Figure 8-b) (Greub and
Raoult, 2004; Thomas et al., 2008). Le kyste est de forme arrondie et est composé de deux
parois, l’endokyste et l’ectokyste (Greub and Raoult, 2004; Smirnov and Michel, 1999). Cette
structure explique la résistance élevée des kystes à de nombreuses agressions, telles que
les traitements chimiques ou les changements de température.
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
22
Figure 7 : Observations en microscopie optique de différents genres d’amibes libres :
Playtamoeba (A), Acanthamoeba (B, D et K), Vanella (C), Glaeseria (E), Hartmannella (F et
I), Naegleria (G et H) et Echinamoeba (J) (Thomas et al., 2008).
Lorsque les conditions de culture deviennent défavorables (manque de nutriments,
température ou pH non optimaux), les trophozoïtes sont capables de s’enkyster. Ce
processus est réversible ; le kyste pourra redonner un trophozoïte après désenkystement,
lorsque l’environnement redeviendra plus clément (Greub and Raoult, 2004).
Figure 8 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a) et de kystes (b)
d’Acanthamoeba castellanii (x1000). n : noyau, cv : vacuole. (Visvesvara et al., 2007).
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
23
c) Environnement et prédation
Les amibes libres sont des protozoaires ubiquitaires de l’environnement. Elles sont
retrouvées dans l’air, les sols, les eaux naturelles (lacs, rivières, mers) et les eaux
artificielles (systèmes de distribution, tours aéro-réfrigérantes, piscines, …) (Greub and
Raoult, 2004; Horn et al., 2000; Rohr et al., 1998; Wadowsky et al., 1991). Ces prédateurs
ont un rôle important au sein des écosystèmes qu’ils colonisent ; en se nourrissant de micro-
organismes, ils participent au maintien et au contrôle des populations microbiennes
(Hoffmann and Michel, 2001; Weekers et al., 1993). Les amibes libres sont capables de se
nourrir de bactéries, de champignons, de levures (Steenbergen et al., 2001), d’algues et
même d’autres protozoaires (Horn et al., 2000) par phagocytose (Figure 9A-D). Les
trophozoïtes ont tendance à mieux se déplacer sur les surfaces plutôt qu’en suspension, et
vont donc préférer les micro-organismes sessiles (Pickup et al., 2007) ; les biofilms
représentent une source idéale pour le grignotage des amibes (Huws et al., 2005; Pickup et
al., 2007). Par exemple, A. castellanii est capable de digérer 90 bactéries
sessiles/amibe/heure (Huws et al., 2005).
Figure 9 : Observations en microscopie électronique à transmission (MET) de la
phagocytose de Legionella pneumophila par Hartmannella vermiformis (A-D) et de sa
réplication à l’intérieur de l’amibe (E-F) (Greub and Raoult, 2003).
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
24
d) ARB et endosymbiotes
Certains micro-organismes ont développé la capacité de résister d’une part à la
prédation, en adoptant une forme morphologique plus indigeste (micro-colonies ou filaments
de grande taille), ou en augmentant leur mobilité pour échapper aux protozoaires (Matz and
Jürgens, 2005).
D’autre part certains micro-organismes sont capables de résister à la phagocytose, et de se
multiplier à l’intérieur des amibes (Figure 9E-F) (Brown and Barker, 1999; Greub and Raoult,
2003; Molmeret et al., 2005) : ils sont appelés ARB (amoeba-resistant bacteria) (Greub and
Raoult, 2004). Certains ARB sont des bactéries intracellulaires obligatoires, d’autres
facultatives et beaucoup d’entre eux sont pathogènes pour l’Homme (Greub and Raoult,
2004; Horn et al., 2000; Molmeret et al., 2005).
Les amibes libres sont considérées comme de véritables « Chevaux de Troie » du monde
microbien (Figure 10) (Brown and Barker, 1999; Molmeret et al., 2005) car elles peuvent
héberger dans leur cytoplasme, et surtout protéger des traitements et des conditions
défavorables de croissance, de nombreux micro-organismes potentiellement pathogènes
pour l’Homme (Kuchta et al., 1993; Rohr et al., 1998).
Les ARB se multiplient à l’intérieur de l’amibe et finissent par lyser la cellule hôte afin de se
disséminer dans l’environnement (Figure 10) (Greub and Raoult, 2004); l’exemple le plus
étudié jusqu’à présent est le cas de Legionella pneumophila, bactérie pathogène qui est
capable de se multiplier à l’intérieur de différentes espèces d’amibes libres (Figure 9E-F)
(Kuchta et al., 1993; Molmeret et al., 2005). Le développement intra-amibien de levures est
beaucoup moins étudié, cependant un exemple d’interaction levures-amibes a été démontré
avec le cas de Cryptococcus neoformans, capable de se multiplier dans le cytoplasme
d’Acanthamoeba castellanii (Steenbergen et al., 2001).
L’amibe joue le rôle de réservoir à bactéries mais également de terrain d’entrainement
(Molmeret et al., 2005) : capables de résister à la phagocytose des amibes, les bactéries
seront plus facilement capables de résister aux macrophages humains par exemple (Figure
10) (Greub and Raoult, 2004; Molmeret et al., 2005).
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
25
Figure 10 : Schéma du rôle des amibes libres en tant que réservoir et vecteur de
transmission de bactéries (Greub and Raoult, 2004).
D’autres ARB sont considérés comme étant des endosymbiotes ; l’endosymbiose est
définie comme une cohabitation harmonieuse de deux micro-organismes dans laquelle l’un
des partenaire se multiplie à l’intérieur de l’autre (Greub and Raoult, 2004). Environ 20% des
souches d’Acanthamoeba isolées de l’environnement abritent des endosymbiotes bactériens
(Molmeret et al., 2005).
2) Principaux genres amphizoïques
Les amibes libres amphizoïques sont des protozoaires ubiquitaires dans
l’environnement qui peuvent également vivre occasionnellement dans les tissus humains et
animaux en tant que parasites (Visvesvara et al., 2007). Ces amibes peuvent alors être
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
26
responsables d’infections. Quatre genres principaux ont été décrits (Schuster and
Visvesvara, 2004; Visvesvara et al., 2007).
a) Acanthamoeba
Isolé pour la première fois dans un échantillon de poussière, le genre Acanthamoeba
dénombre aujourd’hui plus de 24 espèces différentes réparties en trois groupes selon des
critères morphologiques des kystes (Gravel, 2009; Visvesvara et al., 2007). La principale
caractéristique du genre est la présence d’acanthopodes à la surface du trophozoïte (Figure
8-a) ; ces prolongements cytoplasmiques en forme d’épines permettent à l’amibe de
phagocyter ses proies. Le trophozoïte mesure entre 15 et 50 µm et le kyste entre 10 et 25
µm (Visvesvara et al., 2007). Les amibes du genre Acanthamoeba sont isolées dans une
grande variété d’habitats tels que les sols, les eaux de mer, les réseaux d’eau, les systèmes
de ventilation ou encore les appareils de dialyse (Hoffmann and Michel, 2001; Schuster and
Visvesvara, 2004). La double paroi du kyste leur permet de résister à des températures
extrêmes et même aux traitements de décontamination de l’eau (chloration ou filtration) ;
elles peuvent ainsi être retrouvées dans l’eau de distribution à une concentration de 1000 à
10000 amibes/L (Scat et al., 1995).
Ce genre amibien est particulièrement étudié car il est connu pour être capable d’héberger
dans son cytoplasme des bactéries pathogènes telles que L. pneumophila ou encore Vibrio
cholerae (Axelsson-Olsson et al., 2010; Kuchta et al., 1993; Laskowski-Arce and Orth, 2008;
Schuster and Visvesvara, 2004).
b) Balamuthia
Ce genre amibien, assez proche d’Acanthamoeba, a été isolé pour la première fois
dans les années 1980, chez un mandrill (babouin) ; d’où l’appellation de la principale espèce
de ce genre, B. mandrillaris (Visvesvara et al., 2007). Le trophozoïte est pléomorphique et
mesure entre 12 et 60 µm, alors que le kyste arrondi possède une paroi externe ondulée et
mesure environ 15 µm (Figure 11). Cette amibe est beaucoup moins étudiée et difficilement
isolée ; elle est principalement retrouvée dans les sols (Schuster and Visvesvara, 2004).
Figure 11 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a) et d’un kyste (b) de
Balamuthia mandrillaris (x850) (Visvesvara et al., 2007).
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
27
c) Naegleria
Cette amibe a la particularité de posséder, en plus des formes trophozoïte (10-25 µm)
et kyste (10 µm), une troisième forme flagellée d’environ 10-16 µm et très mobile (Figure
12). Le kyste possède une paroi assez fine et percée de pores, ce qui le rend beaucoup plus
fragile que d’autres genres amibiens.
Ce genre compte plus de 30 espèces mais la seule espèce pathogène est N. fowleri
(Schuster and Visvesvara, 2004; Visvesvara et al., 2007). Beaucoup moins ubiquitaire
qu’Acanthamoeba, Naegleria est isolée dans les sols et les eaux et peut survivre jusqu’à une
température de plus de 45°C (Gravel, 2009; Hoffmann and Michel, 2001; Visvesvara et al.,
2007).
Figure 12 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (a), d’un flagellé (b) et
d’un kyste (c) de Naegleria fowleri (x1000). n : noyau et u : partie postérieure (Visvesvara et
al., 2007).
d) Sappinia
Ce genre amibien, dont la principale espèce est S. diploidea, a été isolé des sols, des
eaux douces et de matières fécales animales. Le trophozoïte (40-80 µm) ainsi que le kyste
(15-30 µm) ont la particularité d’être diploïdes, c’est-à-dire d’avoir deux noyaux (Figure 13).
Un seul cas d’infection impliquant cette amibe a été recensé chez l’Homme (Schuster and
Visvesvara, 2004; Visvesvara et al., 2007).
Figure 13 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (b), et de kystes (c) de
Sappinia diploidea (x1000). n : noyaux (Visvesvara et al., 2007).
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
28
e) Vahlkampfia – Hartmannella
D’autres genres amibiens ont été isolés chez l’Homme et l’animal (cavité nasale,
muqueuses intestinale et vaginale, …), toutefois leur adaptation à la température du corps
humain ne signifie pas que ces amibes soient pathogènes (Mat Amin et al., 2004; Schuster
and Visvesvara, 2004). Parmi ces genres, certains tels que Vahlkampfia et Hartmannella ont
été isolés dans des cas de co-infections (Aimard et al., 1998; Aitken et al., 1996; Inoue et
al., 1998; Kinnear, 2003). Leur caractère de pathogènes opportunistes est depuis très
controversé (De jonckheere and Brown, 1998).
Le genre Hartmannella, dont la principale espèce est H. vermiformis, a été décrit pour
la première fois en 1967 (Page, 1967). Le trophozoïte est pléomorphique et mesure 20-30
µm (Figure 14), alors que le kyste, très arrondi et ayant une double paroi, mesure 10-15 µm
(Figure 14) (Smirnov and Michel, 1999). Ce protozoaire thermotolérant est principalement
retrouvé dans les milieux aquatiques, et peut survivre jusqu’à une température de 55°C
(Kuiper et al., 2006; Rohr et al., 1998). 71% des amibes retrouvées dans l’eau de réseau ou
des tours aéro-réfrigérantes appartiennent à l’espère H. vermiformis (Breiman et al., 1990;
Cateau et al., 2008). Cette amibe a même été retrouvée dans des circuits de
décontamination des eaux, après avoir résisté à différents traitements physiques et
chimiques (Hoffmann and Michel, 2001; Thomas et al., 2008). H. vermiformis, tout comme
Acanthamoeba, est capable de permettre à de nombreuses bactéries, dont certaines
pathogènes, de se développer à l’intérieur de son cytoplasme (Figure 9) (Axelsson-Olsson et
al., 2010; Cateau et al., 2008; Horn et al., 2000; Santic et al., 2011; Wadowsky et al., 1991).
Figure 14 : Observations en microscopie optique d’un trophozoïte (1), et d’un kyste (4) de
Hartmannella vermiformis. cv : vacuole (Smirnov and Michel, 1999).
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
29
3) Infections amibiennes
Les amibes libres sont associées à quelques infections chez l’Homme, surtout au
niveau du système nerveux central. Ces infections concernent principalement les personnes
immunodéprimées et fragiles, mais quelques cas ont été recensés chez des individus
immunocompétents (Schuster and Visvesvara, 2004; Visvesvara et al., 2007). Ces infections
sont rares mais graves, dû à un diagnostic assez difficile, à la rapidité du développement de
l’infection et surtout aux traitements problématiques ; les amibes libres sont résistantes à de
nombreux agents antimicrobiens et leur capacité d’enkystement les rend d’autant plus
difficile à éradiquer (Gravel, 2009; Thomas et al., 2009).
a) Principales infections amibiennes
-Kératite : La kératite amibienne est une infection aiguë de la cornée, caractérisée par une
inflammation, un œdème et une photophobie (Figure 15) (Schuster and Visvesvara, 2004).
Le premier cas de kératite amibienne a été recensé en 1973 et depuis, les cas sont de plus
en plus nombreux (Scat et al., 1995).
Figure 15 : Kératite amibienne à Acanthamoeba (Scat et al., 1995).
-Encéphalite granulomateuse amibienne : Cette infection, principalement causée par
Acanthamoeba et Balamuthia, occasionne une inflammation granulomateuse du
parenchyme qui se traduit par des hémorragies, des thromboses, des œdèmes et enfin des
nécroses tissulaires (Figure 16). Le sujet infecté présente des nausées, des fièvres, des
confusions, des déficits neurologiques ainsi que des léthargies (Visvesvara et al., 2007).
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
30
Figure 16 : Encéphalite amibienne à Balamuthia (Schuster and Visvesvara, 2004).
-Méningoencéphalite amibienne primitive : Cette méningite est fulminante et rapidement
fatale. L’amibe, qui traverse l’épithélium nasal, migre le long du nerf olfactif et se retrouve
directement dans le cerveau, où elle cause de nombreux dommages tissulaires, notamment
au niveau des espaces périvasculaires (Schuster and Visvesvara, 2004; Visvesvara et al.,
2007).
b) Modes de contamination
Le principal mode de contamination est le contact avec de l’eau contaminée (Centeno
et al., 1996; Hoffmann and Michel, 2001; Scat et al., 1995; Visvesvara et al., 2007) ; des cas
sont recensés parmi des pêcheurs, des agriculteurs ou simplement des baigneurs. 85% des
kératites amibiennes surviennent chez des individus porteurs de lentilles de contact (Scat et
al., 1995). En effet, certaines personnes utilisent à tort l’eau du robinet pour le lavage des
lentilles de contact. Cette eau de lavage peut alors être souillée (Aitken et al., 1996), et les
amibes peuvent ainsi se retrouver hébergées dans les boîtiers de lentilles de contact (Scat
et al., 1995). Acanthamoeba a été également montrée comme capable de résister aux
- Etude bibliographique – Chapitre 1 : Les micro-organismes étudiés -
31
solutions de nettoyage des lentilles (Thomas et al., 2009). Différentes espèces d’amibes
libres ont également été isolées de réseaux d’eau potable (20-30% des réseaux) ainsi que
dans l’environnement hospitalier (70% des échantillons provenant de douches ou de
réservoirs d’eau chaude) (Thomas et al., 2009). Les amibes libres possèdent une grande
résistance aux chocs thermiques ainsi qu’à certains désinfectants comme le chlore, ce qui
les rend très difficile à éradiquer à l’aide des traitements communs dans les réseaux d’eau
(Loret and Greub, 2010; Thomas et al., 2008; Thomas et al., 2009).
c) Traitements et prévention
Le traitement médical est souvent très peu efficace contre les formes
évoluées d’infections amibiennes ; le diagnostic doit être fait le plus tôt possible pour
augmenter les chances de guérison (Scat et al., 1995). Plusieurs antibiotiques sont efficaces
contre les formes trophozoïtes, mais n’ont qu’un effet statique sur les kystes ; tant que des
kystes survivent dans un foyer infectieux, l’infection peut subsister (Schuster and
Visvesvara, 2004). Une thérapie combinant plus d’un agent antimicrobien semble être la
solution de choix (ex : kétoconazole, fluconazole, pentamidine, amphotéricine B, rifampicine,
itraconazole, sulfadiazine, …) (Schuster and Visvesvara, 2004; Visvesvara et al., 2007).
Les infections amibiennes endommagent les tissus de l’hôte, ce qui rend le traitement
d’autant plus difficile à mettre en place ; la prévention reste la mesure la plus efficace (Mat
Amin et al., 2004). En ce qui concerne les patients immunodéprimés, les plus touchés par
les infections amibiennes, peu de méthodes de prévention sont établies (Visvesvara et al.,
2007). En revanche, pour le cas des porteurs de lentilles par exemple, le respect de règles
d’hygiène et de désinfection des lentilles s’impose (Scat et al., 1995).
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
32
Chapitre 2 : La salive
I. Généralités
La cavité buccale est une porte d’entrée, facile d’accès, reliant l’extérieur aux organes
plus profonds ; la muqueuse et le fluide buccal représentent donc une première barrière
indispensable et sont couramment exposés aux infections (Scannapieco, 1994). Le fluide
buccal est un mélange complexe de sécrétions produites par les glandes salivaires (salive),
de résidus alimentaires, de fluide gingival, de cellules épithéliales desquamées, de
bactéries, de transsudat, de la muqueuse orale, des substances issues des sécrétions
bronchiques ou nasales ainsi que de nombreux organites d’origine plasmatique (Bichot,
2012; Dodds et al., 2005). Seule la salive, qui participe essentiellement au maintien de la
santé bucco-dentaire et au bon déroulement de nombreuses fonctions orales, sera détaillée
dans cette étude bibliographique.
1) Origine et formation
Le terme salive regroupe en réalité un mélange de plusieurs fluides sécrétés par
différentes glandes salivaires. Deux catégories de glandes salivaires sont distinguées selon
leur taille : les glandes majeures et les glandes mineures (Dodds et al., 2005). Les glandes
majeures correspondent à la glande parotide (Figure 17-1), à la glande sous-mandibulaire
(Figure 17-2) et à la glande sublinguale (Figure 17-3). Les glandes salivaires mineures sont
présentes un peu partout dans la bouche, au niveau de la lèvre inférieure, des joues, de la
langue, … Leur nombre et leur localisation varient selon les individus (de Almeida et al.,
2008; Dodds et al., 2005).
Figure 17 : Schéma de la localisation des glandes salivaires majeures. 1 : glande parotide,
2 : glande sous-mandibulaire, 3 : glande sublinguale
(http://coproweb.free.fr/pagphy/physioan/ch5s1.htm; 04/08/2012).
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
33
La sécrétion salivaire est déclenchée par des stimuli qui peuvent être mécaniques (l’action
de mâcher), gustatifs ou olfactifs. D’autres facteurs peuvent affecter la sécrétion de salive
comme la douleur, certains médicaments ou encore des maladies locales ou systémiques
qui affectent les glandes salivaires (Humphrey and Williamson, 2001).
2) Caractéristiques et composition
L’Homme produit en moyenne entre 1 et 1,5 litres de salive par jour ; ce volume varie
notamment en fonction du type de stimulation ou encore du rythme circadien. Le volume
moyen de salive constamment présent dans la cavité buccale est de 1 mL (de Almeida et al.,
2008; Humphrey and Williamson, 2001). La salive est constituée à 99% d’eau, et les 1%
restants correspondent aux composés organiques et inorganiques. Le pH moyen de la salive
est compris entre 5,3 et 7,8 (Göcke et al., 2002; Humphrey and Williamson, 2001).
a) Composants inorganiques
Les constituants inorganiques de la salive sont des ions : hydrogène (donnant le
caractère acide à la salive), sodium, potassium, calcium, phosphates, halogènes (dont l’iode
et le fluor), ainsi que des métaux : fer, cuivre (de Almeida et al., 2008; Humphrey and
Williamson, 2001).
b) Composants organiques
Parmi les constituants organiques, des sucres, des facteurs de croissance, de
l’insuline, des cytokines, du cholestérol ou encore des cellules épithéliales peuvent être
retrouvés. Mais ce sont les protéines qui sont retrouvées majoritairement, quelques
protéines extrinsèques, provenant du sérum (immunoglobulines (Ig) et autres protéines du
système immunitaire) et représentant 20% des protéines totales de la salive, et surtout des
protéines intrinsèques, synthétisées par les glandes salivaires (Bichot, 2012; de Almeida et
al., 2008; Dodds et al., 2005; Göcke et al., 2002; Scannapieco, 1994) :
-l’alpha-amylase, qui participe à la digestion en dégradant les amidons alimentaires,
-la lipase, qui hydrolyse les lipides,
-le lysozyme, qui possède un pouvoir antimicrobien et représente environ 10% des protéines
totales,
-les mucines (16% des protéines totales), glycoprotéines qui participent à la lubrification de
la cavité buccale et participent à l’élaboration de la pellicule exogène acquise sur les dents
et la muqueuse, réceptrice potentielle de micro-organismes colonisateurs (O'Sullivan et al.,
1997),
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
34
-les protéines riches en proline (PRP) et les stathérines qui ont également un rôle de
lubrifiant et qui participent à la formation de la pellicule exogène acquise (O'Sullivan et al.,
1997),
-les cystatines, qui protègent les tissus buccaux contre les protéases à cystéine et
participent à la formation de la pellicule,
-les histatines, petites protéines riches en histidine qui ont des propriétés antimicrobiennes
et notamment antifongiques (Xu et al., 1991), et qui se retrouvent également dans la
pellicule acquise,
-la lactoferrine, protéine de transport du fer qui possède une activité antimicrobienne,
-les défensines, ayant également des activités antibactériennes, antifongiques et antivirales,
-les immunoglobulines sécrétoires, principalement les Ig A sécrétoires. Elles ont un rôle
antimicrobien.
3) Fonctions et applications
La salive est impliquée dans de nombreux processus tels que la digestion ou la
minéralisation, et possède de nombreuses fonctions de protection ou d’antimicrobien (Figure
18) (Bichot, 2012; de Almeida et al., 2008; Humphrey and Williamson, 2001).
Figure 18 : Les différentes fonctions de la salive (Crielaard, 2011).
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
35
Les composants salivaires sont dits amphifonctionnels, multifonctionnels et redondants
(Tableau 1), c’est-à-dire qu’une même molécule peut avoir différents rôles et que plusieurs
molécules peuvent être impliquées dans un même processus (Humphrey and Williamson,
2001; Rudney, 2000).
Tableau 1 : Les trois principales fonctions des protéines de la salive (Rudney, 2000).
a) Goût
La salive est hypotonique, c’est-à-dire que sa concentration en sodium est plus faible
que dans le plasma, ce qui permet aux papilles de percevoir les différents goûts (Humphrey
and Williamson, 2001).
b) Protection et lubrification
La salive, principalement grâce aux mucines, est capable de former une protection
séromuqueuse qui va lubrifier et protéger les tissus oraux des agents irritants et de la
déshydratation (de Almeida et al., 2008). Les mucines, glycoprotéines retrouvées en grande
quantité dans la salive, peuvent retenir de grandes quantités d’eau et former un gel visqueux
recouvrant les tissus de la cavité buccale (Humphrey and Williamson, 2001).
c) Dilution et nettoyage
Le flux salivaire, en moyenne de 0,1 mL/min, permet le nettoyage permanent de la
cavité buccale (Humphrey and Williamson, 2001). La salive élimine les résidus présents
dans la bouche tels que les micro-organismes non-adhérés, ou les débris cellulaires et
alimentaires (de Almeida et al., 2008).
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
36
d) Barrière
La salive module les processus de déminéralisation et de reminéralisation de l’émail
dentaire. En effet, elle constitue la première barrière contre la colonisation des tissus oraux
par d’éventuels micro-organismes pathogènes et est capable de neutraliser les acides
produits par ces micro-organismes qui attaquent l’émail (de Almeida et al., 2008; Silva et al.,
2012).
e) Digestion
Les enzymes salivaires, principalement l’alpha-amylase, sont impliquées dans la
première étape de la digestion ; ces enzymes dégradent les nutriments tels que l’amidon. La
salive favorise ainsi la formation et la lubrification du bol alimentaire, ce qui aide à avaler (de
Almeida et al., 2008; Humphrey and Williamson, 2001).
f) Réparation des tissus
La salive est capable d’accélérer le processus de coagulation, ce qui rend le temps de
saignement des tissus oraux plus court que pour les autres tissus (de Almeida et al., 2008).
g) Activité antimicrobienne
Comme mentionné précédemment (voir Etude bibliographique Chapitre 2
I. 2) b) Composants organiques), de nombreuses protéines salivaires exercent un rôle
antibactérien, antifongique et même antiviral (de Almeida et al., 2008; Rudney, 2000; Silva et
al., 2012).
h) Diagnostic
La salive, facile à prélever, représente une source non invasive d’informations.
L’analyse des composants de la salive pourrait permettre de renseigner sur différents
paramètres de l’état de santé d’un patient, tels que le statut émotionnel, hormonal,
immunologique ou nutritionnel, ou encore de doser certaines substances comme des
anticorps, des stéroïdes ou des drogues (de Almeida et al., 2008; Humphrey and
Williamson, 2001).
4) Facteurs influents
Différents facteurs, endogènes ou exogènes, peuvent influencer le flux salivaire ou
encore la composition de la salive d’un individu (Bichot, 2012; de Almeida et al., 2008;
Dodds et al., 2005).
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
37
a) L’hydratation
L’hydratation individuelle est le facteur le plus important qui interfère avec la sécrétion
de salive (Dawes, 1987; de Almeida et al., 2008). En cas de déshydratation, les glandes
salivaires stoppent la sécrétion de salive afin de conserver l’eau.
b) Le cycle circadien et rythme annuel
Le flux salivaire et la composition de la salive ne sont pas constants et varient chez un
individu en fonction de son cycle circadien. Ainsi, le flux salivaire est maximal en fin de
journée alors qu’il est réduit au minimum pendant le sommeil. De plus, la production de
protéines a lieu plutôt en fin de journée alors que celle de sodium ou de chlorure a lieu en
début de matinée (de Almeida et al., 2008; Edgar, 2004).
De même le rythme annuel influerait sur la sécrétion de salive ; par exemple en été, les
glandes salivaires sont moins productives qu’en hiver.
c) L’âge
Chez une personne âgée, il est courant d’observer une détérioration des glandes
salivaires ainsi qu’une xérostomie (sécheresse de la cavité buccale liée à une diminution du
flux salivaire) (de Almeida et al., 2008; Dodds et al., 2005). La composition en salive peut
également être altérée (Dodds et al., 2005).
d) Le sexe
Une différence de sécrétion salivaire a été notée entre les femmes et les hommes ; de
part la taille plus faible de leurs glandes salivaires et de leur profil hormonal, les femmes
produiraient moins de salive que les hommes (de Almeida et al., 2008; Dodds et al., 2005).
e) Les stimuli
Différents stimuli gustatifs et olfactifs (voir, sentir de la nourriture ou encore l’action de
mâcher) augmentent la production de salive. La consommation de tabac ou d’alcool a aussi
des conséquences sur la salive. D’autres paramètres comme la position du corps ou
l’exposition à la lumière auraient également un effet sur la sécrétion de salive (de Almeida et
al., 2008; Edgar, 2004). Ainsi une personne debout sécrète plus de salive qu’une personne
assise ou allongée ; de même l’absence de lumière diminue la production de salive de 30 à
40% (de Almeida et al., 2008).
f) Les médicaments
Différentes classes de médicaments ont un impact sur la production de salive. Par
exemple les antidépresseurs, les antihistaminiques ou encore les antihypertenseurs
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
38
réduisent le flux et altèrent la composition de la salive (de Almeida et al., 2008; Edgar,
2004). Certaines thérapies, notamment les radiothérapies qui endommagent les glandes
salivaires, vont modifier la sécrétion de salive (Dodds et al., 2005).
g) Les infections
Certaines maladies chroniques telles que le diabète, l’insuffisance rénale, l’anorexie, la
boulimie, certaines maladies psychologiques et certaines carences nutritionnelles vont
influer sur le flux et la composition salivaires (de Almeida et al., 2008; Dodds et al., 2005).
II. Micro-organismes et interactions
La salive intervient dans le maintien et la modulation de la flore buccale bactérienne et
fongique (Hoffman and Haidaris, 1993). Elle est également impliquée dans le processus de
formation de la plaque dentaire ; elle exerce une sélection aussi bien positive que négative
sur la colonisation bactérienne de la cavité buccale (Rudney, 2000; Scannapieco, 1994). Les
recherches sur les interactions entre la salive et les micro-organismes oraux donnent des
observations parfois contraires, qui montrent la complexité du rôle de la salive et de ses
constituants (principalement protéiques). Ces derniers, dits amphifonctionnels et
multifonctionnels (Tableau 1), aident à la fois pour la clairance des micro-organismes, par
exemple en les agrégeant pour mieux les éliminer, pour l’adhérence de certaines micro-
organismes aux surfaces de la cavité buccale (pellicule exogène acquise) mais également
pour la protection des tissus oraux en exerçant une activité antimicrobienne (Hoffman and
Haidaris, 1993; Rudney, 2000; Scannapieco, 1994). Ainsi, la fluctuation des concentrations
en certains de ces constituants peut influencer la balance écologique entre bonne santé et
infection orale (Scannapieco, 1994).
1) Flore commensale buccale
a) Flore bactérienne
Dans la cavité orale, plus de 700 espèces microbiennes ont été isolées (Paster et al.,
2006; Zijnge et al., 2010) ; 400 sont spécifiquement retrouvées dans la poche parodontale
(l’espace entre les dents et les gencives), et 300 se trouvent dans d’autres sites tels que la
langue, les muqueuses ou encore les sites infectieux. Chez un individu donné, entre 100 et
200 espèces sont capables de cohabiter dans le micro-environnement buccal (Rudney,
2000; Thein et al., 2007), ce qui montre la grande diversité possible de la flore commensale
buccale de deux individus distincts (Paster et al., 2006). Parmi ces nombreux micro-
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
39
organismes oraux, beaucoup de bactéries sont retrouvées (streptocoques, staphylocoques),
dont certaines sont potentiellement pathogènes (ex : Porphyromonas gingivalis,
Streptococcus gordonii, Staphylococcus aureus) (Bamford et al., 2009; Morales and Hogan,
2010; Paster et al., 2006).
b) Flore fongique
De nombreuses espèces de levures et de champignons font également partie de la
flore commensale orale (Tableau 2) ; la majorité de ces espèces fongiques sont
environnementales et généralement peu pathogènes. On note ainsi la présence possible
d’Aspergillus spp., Cladosporium spp., Saccharomyces spp. ou encore de Penicillium spp.
Plusieurs espèces de Candida, dont certaines pathogènes opportunistes sont également
recensées (Tableau 2) (Ghannoum et al., 2010).
c) Interactions entre micro-organismes
Entre les micro-organismes de la cavité orale se mettent en place différentes
interactions mutualistes ou antagonistes, qui contribuent au développement de biofilm
polymicrobien (Bamford et al., 2009; Douglas, 2003; El-Azizi et al., 2004; Morales and
Hogan, 2010). Certaines espèces sont capables d’interagir physiquement ou
métaboliquement afin d’assurer leur croissance et leur survie au sein du micro-
environnement. La co-adhérence ou encore le QS inter-espèces sont les principaux
mécanismes d’interactions entre micro-organismes (Bamford et al., 2009).
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
40
Tableau 2 : Espèces fongiques retrouvées dans la cavité orale de 20 individus sains
(Ghannoum et al., 2010).
Un exemple bien étudié est celui de la co-adhérence entre Streptococcus gordonii et
Candida albicans (Figure 19) (Holmes et al., 1995; Morales and Hogan, 2010; O'Sullivan et
al., 2000) : S. gordonii est un colonisateur primaire, capable de s’accrocher aux molécules
salivaires adsorbées sur les surfaces (Figure 19-a) ; la surface bactérienne apporte ainsi des
sites de fixation potentiels supplémentaires pour les autres micro-organismes (Holmes et al.,
1995). Candida peut ensuite adhérer directement aux récepteurs protéiques de la salive ou
par l’intermédiaire d’interactions spécifiques avec des protéines de la surface de S. gordonii
(Figure 19-b). De plus, S. gordonii est également capable de sécréter des molécules de QS
qui inhibent l’effet négatif du farnesol sur la formation du biofilm fongique (voir Etude
bibliographique Chapitre 1 I. 3) d) Régulation et QS) (Figure 19-c). Enfin, S.
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
41
gordonii sécrète aussi des produits métaboliques qui pourront être utilisés par Candida pour
assurer sa croissance (Figure 19-d). Le biofilm mixte bactérien-fongique ainsi formé attirera
d’autres micro-organismes qui viendront adhérer à leur tour aux surfaces orales (Figure 19-
e) (Morales and Hogan, 2010).
Figure 19 : Schéma des interactions mutualistes entre C. albicans et Streptococcus gordonii
dans la cavité orale (a-e). QS : Quorum Sensing (Morales and Hogan, 2010).
2) Interactions des micro-organismes avec la salive
Les principales interactions possibles entre les constituants de la salive et les micro-
organismes, peuvent être séparées en quatre classes (Figure 20) (Scannapieco, 1994) :
-les micro-organismes (via leurs adhésines) peuvent se lier à des récepteurs, de façon
spécifique, sur les surfaces orales recouvertes de la pellicule salivaire (Figure 20-A),
-ces mêmes molécules réceptrices, en solution, peuvent se lier aux adhésines, parfois
même de plusieurs micro-organismes simultanément, favorisant ainsi l’agrégation et la
clairance de ces micro-organismes (Figure 20-B),
-certains composants salivaires sont toxiques pour les micro-organismes (ex : histatines)
(Xu et al., 1991). Ils peuvent s’insérer dans la membrane microbienne, former des canaux
par lesquels des ions intracellulaires (ex : le potassium K+) peuvent s’échapper, provoquant
la mort cellulaire (Figure 20-C),
-enfin, des composants de la salive peuvent être transportés dans le micro-organisme pour y
être métabolisés afin de produire de l’énergie (ex : acides aminés) ; dans ce cas la salive
devient une source de nutriments (Figure 20-D).
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
42
Figure 20 : Schéma des différentes interactions entre la salive et les micro-organismes
oraux (A-D). K+ : potassium, exemple d’ions intracellulaires (Scannapieco, 1994).
a) La salive favorise l’adhérence
La fine couche de salive qui recouvre les surfaces orales, appelée la pellicule exogène
acquise, composée principalement de protéines, favorise l’accrochage des micro-
organismes aux surfaces en offrant différents sites de fixation. Beaucoup d’études se sont
intéressées à la composition de cette pellicule (Göcke et al., 2002; Holmes et al., 2002;
Rudney, 2000; Scannapieco, 1994). Ainsi les mucines (Hoffman and Haidaris, 1993), les
PRP (Cannon et al., 1995b; O'Sullivan et al., 1997) ou encore les Ig A sécrétoires (San
Millán et al., 2000) sont reconnus par les adhésines bactériennes ou fongiques et permettent
l’adhérence des cellules.
Mais les interactions entre salive et micro-organismes sont beaucoup plus complexes.
En effet, de part leur amphifonctionnalité, les molécules salivaires sont à la fois capables de
favoriser l’adhérence et d’entraîner l’agrégation des micro-organismes en suspension, ce qui
favorisera leur clairance. De plus, certaines de ces molécules salivaires ont également une
action antimicrobienne. L’interaction salive-micro-organismes dépend également du micro-
organisme lui-même. Par exemple, l’effet de la salive sur l’adhérence de C. albicans a été
montré comme dépendant de l’état morphologique des levures (Figure 21) (Elguezabal et
al., 2008).
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
43
Figure 21 : Adhérence de différentes souches de C. albicans sur un support de PMA, en
absence (A) ou en présence (B) de salive (Elguezabal et al., 2008).
Sur ces graphiques, la souche de C. albicans représentée en noir est une souche produisant
uniquement la forme hyphe, celle en blanc est un isolat oral type « sauvage », et celle en
gris est un mutant déficient pour la filamentation (donc sous forme blastospores). Ainsi la
salive diminue l’adhérence des levures sous forme d’hyphes mais n’a pas d’effet sur les
levures sous forme blastospores (Elguezabal et al., 2008).
b) La salive a une activité antimicrobienne
Le rôle de la salive dans la défense de la cavité orale contre les micro-organismes est
loin d’être complètement élucidé. Certains composants ont une influence positive sur
l’adhérence, mais sous certaines conditions ; ils peuvent également favoriser la clairance
des micro-organismes. D’autre part, certains composants possèdent une activité
antimicrobienne directe ou indirecte. Le lysozyme, la lactoferrine, les Ig A sécrétoires ou
encore les histatines sont capables d’inhiber la croissance microbienne par différents
mécanismes altérant leur métabolisme (Elguezabal et al., 2008; Leito et al., 2009; Rudney,
2000; San Millán et al., 2000; Scannapieco, 1994; Ueta et al., 2000). Par exemple les
histatines inhibent la respiration mitochondriale ; l’histatine 5, fongicide, détruit C. albicans
- Etude bibliographique – Chapitre 2 : La salive -
44
sous forme de blastospores, alors que l’histatine 3, fongistatique, inhibe simplement la
filamentation des Candida spp. (Xu et al., 1991).
L’inhibition de la filamentation est l’un des principaux effets de la salive sur les levures ; les
histatines ou encore les stathérines, produites en majorité par la glande parotide, permettent
de bloquer les levures au stade blastospores et empêchent ainsi le développement de
biofilm fongique (Figure 22) (Leito et al., 2009). Les auteurs ont montré dans cette étude que
la salive totale (mélange des sécrétions des différentes glandes) ainsi que la salive parotide
inhibaient la filamentation de C. albicans, comparativement à un tampon salive (milieu de
culture utilisé, servant de témoin négatif) (Leito et al., 2009).
Figure 22 : Effet de différentes salives sur la transition blastospores-hyphes de C. albicans
(Leito et al., 2009).
Cependant, certaines levures du genre Candida, comme également d’autres micro-
organismes, sont capables de résister à l’action antimicrobienne de la salive, notamment par
l’intermédiaire de leurs facteurs de virulence (Bichot, 2012). Par exemple les protéases
aspartiques de C. albicans vont lui permettre de dégrader des protéines de défense de
l’hôte, telles que les histatines (Meiller et al., 2009).
- Etude bibliographique – Chapitre 3 : Les units de soins dentaires -
45
Chapitre 3 : Les units de soins dentaires
I. Définition et structure du circuit d’eau
1) Définition de l’unit de soins dentaires
Le terme d’unit de soins dentaires (USD) désigne l’équipement du cabinet dentaire qui
regroupe en un bloc la plupart des appareils nécessaires à la réalisation des soins dentaires
et de stomatologie (Figure 23): un fauteuil inclinable, un scialytique (éclairage médical fixé
sur un bras mobile), un crachoir, un bras mobile supportant un plateau doté de porte-
instruments rotatifs (PIR) tels que les turbines ou les seringues à air et à eau, une aspiration
chirurgicale, des circuits d’arrivée et d’évacuation de l’eau, … (Comité technique national
des infections nosocomiales et des infections liées aux soins, 2006; O'Donnell et al., 2005).
Figure 23 : Photographies de différentes parties de l’USD. (a) vue d’ensemble, (b) vue
intérieure du circuit d’arrivée d’eau (ici un réservoir interne), (c) le plateau supportant les
PIR, (e) le crachoir et le circuit d’évacuation d’eau (O'Donnell et al., 2006).
- Etude bibliographique – Chapitre 3 : Les units de soins dentaires -
46
2) Circuit d’eau de l’USD
L’USD est alimenté par le réseau d’eau potable ou par un réservoir indépendant,
interne au cabinet dentaire. L’eau circule à l’intérieur de l’USD via un réseau complexe de
longs tubes en polyuréthane ou en PVC, appelés tubulures, d’environ 2 mm de diamètre
(Figure 24) (Figure 25) (O'Donnell et al., 2011; Porteous, 2010).
Figure 24 : Photographie de tubulures d’USD. (a) tubulure entière, (b) section de tubulure
(Porteous, 2010).
Figure 25 : Vue intérieure de l’USD : un réseau complexe de circulation d’eau (Wirthlin et al.,
2003).
- Etude bibliographique – Chapitre 3 : Les units de soins dentaires -
47
II. Revues de la littérature
La problématique de contamination du circuit d’eau des USD est connue depuis les
années 60 (Blake, 1963; Sciaky and Sulitzeanu, 1962). Depuis, de nombreuses études se
sont intéressées :
-aux sources de contamination de l’USD ; les sources principalement étudiées étant l’eau du
réseau et la rétro-contamination par des micro-organismes provenant des patients et du
personnel dentaire (Pankhurst and Philpott-Howard, 1993; Rowland, 2003). Le
développement d’un biofilm à l’intérieur du circuit d’eau de l’USD est un phénomène
particulièrement étudié (Barbeau, 2000; Szymanska, 2003; Williams et al., 1993). Favorisés
par le micro-environnement de l’USD, les biofilms microbiens peuvent se former sur les
parois des tubulures (Figure 26).
Figure 26 : Section longitudinale d’une tubulure d’USD, recouverte de biofilm (Coleman et
al., 2007).
-aux contaminants environnementaux et pathogènes retrouvés dans l’eau des USD ;
différentes études se sont intéressées à la composition ainsi qu’à la concentration en
différents micro-organismes retrouvés dans les USD (Shearer, 1996; Szymańska, 2005;
Walker et al., 2000; Walker et al., 2004). Certains micro-organismes d’intérêt, tels que L.
pneumophila ou encore les mycobactéries ont été particulièrement ciblés (Atlas et al., 1995;
Schulze-Röbbecke et al., 1995).
-au risque infectieux potentiel pour les patients et le personnel dentaire. Les effets de
l’exposition des patients et du personnel dentaire à l’eau et l’air contaminés, aux aérosols
produits lors des soins (Figure 27), ainsi que les risques de contamination croisée ont été
étudiés (Barbeau, 2007; Castiglia et al., 2008; Pankhurst, 2010).
- Etude bibliographique – Chapitre 3 : Les units de soins dentaires -
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Figure 27 : Aérosols visibles, produits par une turbine d’USD lors d’un acte de soins
dentaires (Harrel and Molinari, 2004).
-aux méthodes de prévention et de décontamination des USD. Différentes méthodes
physiques et chimiques ont été développées depuis la découverte de la contamination des
USD ; de la technique la plus simple (purge des tubulures) aux désinfections chimiques
automatisées, de nombreuses études d’efficacité ont été réalisées sur ces méthodes (Abel
et al., 1971; Bagga et al., 1984; Fiehn and Henriksen, 1988; O'Donnell et al., 2006; Ozcan et
al., 2003; Schel et al., 2006). Toutefois il apparaît que ces procédés de désinfection des
USD ne sont pas toujours bien connus ou du moins sont souvent utilisés de façon inadaptée
par les praticiens, principalement du fait d’un manque d’information (Oosthuysen et al.,
2010; Robert, 2010).
Dans le but de faire un bilan des connaissances acquises en terme de contamination des
USD, du développement de biofilms dans les tubulures, et de décontamination des USD,
ainsi que d’augmenter la prise de conscience du risque infectieux lié à l’eau des USD, deux
revues de la littérature ont été rédigées et publiées en 2011 et 2012.
La première revue est parue dans la rubrique « formation continue » d’un journal à diffusion
nationale : Le Chirurgien Dentiste de France ; en effet cette revue est destinée aux
praticiens chirurgiens dentistes, dans le cadre de leur exercice quotidien. Certains aspects
ont été simplifiés afin de répondre à la demande de l’éditeur.
D’autre part une deuxième revue, plus complète, a plus récemment été publiée dans un
journal international à comité de lecture : Federation of European Microbiological Societies
(F E M S) - Immunology and Medical Microbiology.
1) Revue nationale : Le Chirurgien Dentiste de France (2011)
Cet article a été écrit dans le but de sensibiliser les praticiens dentistes au risque
infectieux existant dans leur milieu professionnel ; risque infectieux pour eux-mêmes ainsi
- Etude bibliographique – Chapitre 3 : Les units de soins dentaires -
49
que pour leurs patients, lié à l’exposition à de l’eau et de l’air contaminés. Dans cet article,
les données concernant le développement de biofilms ainsi que les méthodes de
décontamination ne sont pas très détaillées ; une vision générale de la problématique étant
suffisante pour le public visé.
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2) Revue internationale : FEMS Immunology and Medical
Microbiology (2012)
Cette deuxième revue, plus complète et précise que la version française, avait pour
objectif de synthétiser les connaissances scientifiques acquises au cours des dernières
années au sujet de la contamination et de la décontamination des USD ; la sensibilisation au
risque infectieux lié aux USD étant toujours le but visé.
Dans cette version, la partie désinfection a été plus développée, afin d’obtenir une vision
plus détaillée des différentes approches et méthodes utilisées pour la décontamination des
USD.
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Matériel et
méthodes
- Matériel et méthodes – Chapitre 1 : Milieux et réactifs -
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Chapitre 1 : Milieux et réactifs
I. Le milieu de culture
Afin de se rapprocher le plus possible des conditions retrouvées au sein de l’USD,
toutes les expériences de ce travail sont réalisées dans de l’eau de réseau filtrée sur
membrane 0,22 µm (Fisher Scientific Stéricup). De façon ponctuelle, pour des études
comparatives, certaines analyses sont également réalisées en eau distillée.
II. Les micro-organismes
1) Souches utilisées
a) Souches de levures
Trois espèces de levures du genre Candida sont utilisées :
-Candida albicans ; souche ATCC 3153.
-Candida glabrata ; souche IHEM 9556.
-Candida parapsilosis ; souche ATCC 22019.
b) Souches d’amibes libres
Deux genres amibiens sont choisis pour ce travail : Acanthamoeba et Hartmannella.
Une espèce de chacun de ces genres est utilisée :
-A. castellanii ; souche ATCC 30234.
-H. vermiformis ; souche ATCC 50802.
2) Culture et entretien
a) Culture des levures
Pour la culture et l’entretien des levures du genre Candida, le milieu gélosé Sabouraud
est utilisé supplémenté en chloramphénicol (Sabouraud GC, Fluka) afin d’éviter le
développement de contaminants bactériens. Les souches sont repiquées tous les mois et
incubées 24 h à 37°C puis à température ambiante. 48 h avant chaque utilisation, les
souches sont repiquées sur gélose et incubées à 37°C.
b) Culture des amibes libres
Pour la culture et l’entretien des amibes libres, deux milieux liquides sont utilisés :
- Matériel et méthodes – Chapitre 1 : Milieux et réactifs -
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-le milieu PYG (Peptone, Yeast extract, Glucose), composé de peptones (BD), d’extrait de
levures (BD) et de glucose (Sigma) (Tableau 3). Le milieu ainsi préparé est stocké à 4°C
jusqu’à utilisation. Afin d’éviter le développement de micro-organismes contaminants, des
antibiotiques sont ajoutés : pénicilline G (500 U/mL final) et streptomycine (2 µg/mL final).
Les antibiotiques sont stockés en aliquots à -30°C jusqu’à utilisation.
Ce milieu est utilisé pour les amibes du genre Acanthamoeba.
Tableau 3 : Préparation du milieu PYG.
-le milieu ATCC 1034 (ou milieu PYNFH modifié), composé de peptones (BD), d’extrait de
levures (BD), d’acide ribonucléique (Sigma), d’acide folique (Sigma), d’un tampon composé
de sels minéraux et de Sérum de Veau Fœtal (SVF) (Tableau 4). Le milieu ainsi préparé est
stocké à 4°C jusqu’à utilisation. Afin d’éviter le développement de micro-organismes
contaminants, des antibiotiques sont ajoutés : pénicilline G (500 U/mL final), streptomycine
(2 µg/mL final) et gentamicine (2,5 µg/mL final). Les antibiotiques sont stockés en aliquots à
-30°C jusqu’à utilisation.
Ce milieu est utilisé pour les amibes du genre Hartmannella.
- Matériel et méthodes – Chapitre 1 : Milieux et réactifs -
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Tableau 4 : Préparation du milieu PYNFH (ATCC 1034).
Les souches d’amibes libres sont repiquées une fois par semaine, dans leur milieu
liquide respectif, en flasque de culture de 25 cm² (Sarsted, USA) et incubées à température
ambiante. Cinq jours avant chaque utilisation, les amibes sont repiquées dans une nouvelle
flasque à partir de la souche stockée à température ambiante, et incubées à température
ambiante.
Afin de conserver les souches d’amibes libres à plus long terme, une cryoconservation est
réalisée (adaptation du protocole ATCC), dans du DMSO (Diméthylsulfoxyde) à 7,5% final.
Les cryotubes sont conservés à -80°C.
La culture des amibes libres est également réalisée, pour certaines expériences, sur
milieu gélosé NNA (Non-Nutrient Agar, gélose à 2% d’agar, Sigma) recouvert d’une fine
couche (environ 50 µL) d’Enterobacter tués par tyndallisation (Figure 28). Dans ce cas, un
volume d’amibes libres, déterminé selon l’expérience, est déposé au centre de la gélose.
Les géloses sont ensuite incubées à 37°C pour une durée maximale de 15 jours. Les
amibes, se nourrissant des bactéries étalées sur la gélose, se déplacent peu à peu sur la
- Matériel et méthodes – Chapitre 1 : Milieux et réactifs -
71
surface du milieu ; un front de migration, visible à l’œil nu, apparait à l’endroit où les amibes
se sont arrêtées.
Figure 28 : Protocole de tyndallisation de bactéries.
3) Préparation des micro-organismes
a) Préparation des levures
Pour chaque expérience, la préparation des suspensions de Candida spp. est réalisée
en dispersant quelques colonies de levures dans de l’eau filtrée, et en dénombrant les
levures par microscopie optique, sur cellule de Kova® (Hycor, Biomedical) ; la concentration
finale choisie est de 5.105 levures/mL d’eau.
b) Préparation des amibes libres
Pour chaque expérience, la préparation des suspensions d’amibes libres est réalisée
en éliminant le surnageant de culture des flasques et en récupérant les amibes adhérées à
l’aide d’un grattoir de cellules (Greiner Bio-one), dans de l’eau filtrée. Deux centrifugations
de 7 min à 300 g sont réalisées dans de l’eau filtrée, afin de laver les amibes et d’éliminer le
milieu de culture. Les amibes sont ensuite remises en suspension dans de l’eau filtrée et
dénombrées par microscopie optique, sur cellule de Kova® ; la concentration finale choisie
est de 5.105 amibes/mL d’eau.
- Matériel et méthodes – Chapitre 1 : Milieux et réactifs -
72
c) Préparation des surnageants de culture d’amibes libres
Pour la préparation des surnageants d’amibes, le surnageant de culture des flasques
est éliminé, et les amibes adhérées sont récupérées à l’aide d’un grattoir de cellules, dans
de l’eau distillée. Deux centrifugations de 7 min à 300 g sont réalisées dans de l’eau distillée,
afin de laver les amibes et d’éliminer le milieu de culture. Les amibes sont ensuite remises
en suspension dans de l’eau distillée et incubées 3 jours en flasque à température ambiante.
Après cette incubation, le surnageant de culture est récupéré et centrifugé 10 min à 800 g
afin d’éliminer les éventuelles cellules en suspension. Le nouveau surnageant est prélevé et
stocké à -80°C jusqu’à utilisation.
III. La salive
1) Obtention des échantillons
11 échantillons de salive totale, provenant de 11 donneurs volontaires sains, sont
collectés après rinçage de la bouche à l’eau distillée pour diminuer la charge bactérienne.
Les donneurs n’ont ni mangé, ni fumé au cours des deux heures précédant la collecte. Les
différents échantillons sont déposés sur glace ou à -80°C jusqu’à utilisation.
2) Préparation des salives
a) Salive centrifugée
Le même volume de chaque échantillon de salive est poolé, et le mélange ainsi obtenu
est centrifugé 15 min à 4000 g à une température de 4°C (Jin et al., 2004), afin d’éliminer les
éventuels débris cellulaires ou alimentaires. Le surnageant est récupéré et stocké en
aliquots à -80°C jusqu’à utilisation.
b) Salive filtrée
Pour certaines expériences, la salive est utilisée centrifugée et filtrée ; la filtration
permet d’éliminer les micro-organismes éventuellement présents dans le surnageant. Après
lavage par centrifugation (voir Matériel et méthodes Chapitre 1 III.2) a) Salive
centrifugée), la salive est filtrée sur membrane 0,22 µm (filtres pour seringue AC 30 mm 0,2
µm, Millipore) puis stockée à -80°C jusqu’à utilisation.
- Matériel et méthodes – Chapitre 1 : Milieux et réactifs -
73
c) Salive filtrée et traitée au DTT
Pour certaines expériences, la salive est utilisée centrifugée, filtrée et traitée au
dithiolthréitol (DTT) ; le DTT permet de dénaturer les protéines, en coupant les ponts
disulfures des acides aminés. Le mélange des différents échantillons de salive est mis en
présence de DTT à 2,5 mmol/L final, pendant 10 min sur glace avec une agitation douce. La
salive est ensuite centrifugée 15 min à 4000 g à une température de 4°C. Le surnageant est
récupéré et filtré sur membrane 0,22 µm (filtres pour seringue AC 30 mm 0,2 µm, Millipore)
puis stocké à -80°C jusqu’à utilisation.
d) Salive filtrée et chauffée
Pour certaines expériences, la salive est utilisée centrifugée, filtrée et chauffée ; le
traitement par chauffage permet de dénaturer certaines molécules thermosensibles telles
que les enzymes. Après lavage par centrifugation puis filtration (voir Matériel et
méthodes Chapitre 1 III.2) a) Salive centrifugée et b) Salive filtrée), la salive est
chauffée à 100°C pendant 30 min. Après refroidissement, la salive ainsi obtenue est stockée
à -80°C jusqu’à utilisation.
e) Salive filtrée et fractionnée
Pour certaines expériences, la salive est utilisée centrifugée, filtrée et fractionnée ; le
fractionnement sur membrane permet d’obtenir des filtrats contenant des molécules avec
une taille inférieure ou égale à la taille des pores de la membrane. Deux membranes sont
utilisées : 5 KDa et 30 KDa (Amicon Centriplus, Millipore). Après lavage par centrifugation
puis filtration (voir Matériel et méthodes Chapitre 1 III.2) a) Salive centrifugée
et b) Salive filtrée), la salive est fractionnée en déposant 5 mL sur les membranes filtrantes,
et en centrifugeant 2 fois 20 min à 3500 g (protocole Millipore). Les deux filtrats ainsi
obtenus, l’un composé de molécules ayant une taille < 5 KDa et l’autre une taille < 30 KDa,
sont stockés à -80°C jusqu’à utilisation.
Ainsi, pour les expériences suivantes, six salives différentes sont utilisées :
-la salive centrifugée.
-la salive centrifugée et filtrée (par la suite appelée « salive filtrée »).
-la salive centrifugée, filtrée et traitée au DTT (par la suite appelée « salive DTT »).
-la salive centrifugée, filtrée et chauffée (par la suite appelée « salive chauffée »).
-la salive centrifugée, filtrée et fractionnée < 5 KDa (par la suite appelée « salive < 5 K »).
-la salive centrifugée, filtrée et fractionnée < 30 KDa (par la suite appelée « salive < 30 K »).
- Matériel et méthodes – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
74
Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive
I. L’analyse de la salive
1) Préparation de la salive
Un volume d’environ 100 mL, obtenu à partir d’un mélange de 11 échantillons de
salives (environ 10 mL de chaque échantillon), est centrifugé et filtré selon le protocole
précédemment décrit (voir Matériel et méthodes Chapitre 1 III. 2) Préparation
des salives). Le filtrat est ensuite lyophilisé à -55°C, jusqu’à obtention d’un résidu solide
(Lyophilisateur Christ). Le résidu est conservé à température ambiante jusqu’à utilisation.
2) Analyse par chromatographie
Le lyophilisat de salive obtenu est analysé par chromatographie gazeuse couplée à un
spectromètre de masse (GC-MS). L’échantillon lyophilisé est volatilisé par pyrolyse. Pour
cela, environ 1 mg de lyophilisat est disposé dans un tube en quartz de 100 µL ; le tube est
refermé à l’aide de laine de quartz. La pyrolyse est réalisée à l’aide d’un filament de platine
chauffé jusqu’à 650°C avec une vitesse de 20°C/ms (pyrolyseur Pyroprobe 2000, Chemical
Data Systems, Oxford). Le système de pyrolyse étant relié au port d’injection du
chromatographe (HP G1800A), les fragments de l’échantillon volatilisé sont directement
injectés dans la colonne capillaire de silice (DBWAX 30 m, 0,25 mm, J&W Scientific). Après
séparation sur la colonne (programme de température allant de 50 à 220°C en 3°C/min), les
fragments sont analysés par un spectromètre de masse de type quadripolaire (Hewlett
Packard) après ionisation par impact électronique à 70 eV.
Dans ces conditions, l’identification des principales molécules contenues dans la salive est
possible grâce à la base de données intégrée au logiciel du GC-MS.
- Matériel et méthodes – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
75
II. La survie dans l’eau
1) Survie des levures
a) Gamme de concentrations en salive
L’influence de la présence de différentes salives (voir Matériel et méthodes
Chapitre 1 III. 2) Préparation des salives) sur la survie des levures du genre
Candida dans l’eau est étudiée, en utilisant une gamme de 3 concentrations : 2%, 5% et
10% de salive (v/v).
b) Préparation des suspensions
Les suspensions de Candida spp., numérées et ajustées à 5.105 levures/mL d’eau
filtrée ou d’eau distillée, sont réparties dans les puits de microplaques de 96 puits (Costar®,
Fisher Scientific) ; le volume utilisé est déterminé en fonction du pourcentage final de salive
souhaité (v/v), le volume total final du puits devant être de 200 µL.
Pour chaque expérience, un témoin eau ainsi qu’un témoin salive sont réalisés en parallèle ;
le puits témoin eau contenant 200 µL d’eau filtrée, et le puits témoin salive contenant 200 µL
d’eau avec 5% de salive (v/v).
c) Suivi de la survie
Les microplaques sont incubées à 10, 20 ou 27°C selon les expériences. La survie des
levures est analysée après des temps d’incubation compris entre 0 et 360 h (soit une durée
totale de 15 jours).
d) Analyse de la viabilité
Après chaque temps d’incubation choisi, la survie des levures est analysée par
dénombrement des Unités Formant Colonies (UFC), méthode permettant de dénombrer les
levures viables sur milieu gélosé de Sabouraud + chloramphénicol. Pour cela, 50 µL des
puits testés sont dilués dans 450 µL d’eau filtrée. Les dilutions au 1/10e, 1/100
e et 1/1000
e
sont utilisées selon les conditions expérimentales, et étalées à hauteur de 100 µL sur
géloses Sabouraud + chloramphénicol. Les colonies sont dénombrées après 48 h
d’incubation à 37°C ; les résultats sont exprimés en log UFC/mL.
- Matériel et méthodes – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
76
2) Survie des amibes libres
a) Gamme de concentrations en salive
L’influence de la présence de salive centrifugée (voir Matériel et méthodes
Chapitre 1 III. 2) Préparation des salives) sur la survie des amibes libres dans l’eau
est étudiée, en utilisant une gamme de 3 concentrations : 2%, 5% et 10% de salive (v/v).
b) Préparation des suspensions
Les suspensions d’amibes libres, dénombrées et ajustées à 5.105 amibes/mL d’eau
filtrée, sont réparties dans les puits de microplaques de 96 puits ; le volume utilisé est
déterminé en fonction du pourcentage final de salive souhaité (v/v), le volume total final du
puits devant être de 200 µL.
Pour chaque expérience, un témoin eau ainsi qu’un témoin salive sont réalisés en parallèle ;
le puits témoin eau contenant 200 µL d’eau filtrée, et le puits témoin salive contenant 200 µL
d’eau avec 5% de salive (v/v).
c) Suivi de la survie
Les microplaques sont incubées à 10, 20 ou 27°C selon les expériences. La survie des
amibes libres est analysée après des temps d’incubation compris entre 0 et 360 h (soit une
durée totale de 15 jours).
d) Analyse de la viabilité
Après chaque temps d’incubation choisi, la survie des amibes libres est analysée
d’une part par dénombrement en microscopie optique (cellule de Kova®), en diluant 50 µL
des puits testés au ½ dans du bleu Trypan (Sigma) ; ce colorant vital permet de différencier
les cellules vivantes rejetant le colorant des cellules perméabilisées dans lesquelles le bleu
pénètre. Ainsi les cellules vivantes sont incolores tandis que les cellules mortes sont
colorées en bleu. Cette méthode permet d’obtenir la proportion d’amibes libres survivant
dans l’eau en présence ou non de salive ; les résultats sont exprimés en log amibes
vivantes/mL. Selon les expériences, la proportion de formes trophozoïtes et de formes
kystes peut également être déterminée.
D’autre part, pour certaines expériences, le dénombrement des amibes libres est réalisé
suivant une méthode statistique (d’après le protocole « Food and Drug Administration »,
USA) : la méthode du Nombre le Plus Probable (NPP). Une dilution au 1/100e des puits
testés est réalisée dans de l’eau filtrée, et étalée sur géloses NNA recouvertes
d’Enterobacter : trois géloses sont ensemencées avec 100 µL (dilution 1/10e), trois géloses
- Matériel et méthodes – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
77
avec 10 µL (dilution 1/100e) et trois géloses avec 1 µL (dilution 1/1000
e) de cette dilution. Les
9 géloses ainsi obtenues sont incubées à 37°C pour une durée maximale de 15 jours,
jusqu’à observation des fronts de migration. Les géloses sur lesquelles un front de migration
est visible sont notées positives, et les autres négatives. Le nombre de géloses positives
pour chacune des trois dilutions permet d’obtenir un code à trois chiffres : exemple, si les
trois géloses de la dilution 1/10e sont positives, deux géloses de la dilution 1/100
e, ainsi que
deux géloses de la dilution 1/1000e, le code obtenu serait 3.2.2.
Le code généré permet, à l’aide du tableau statistique (Tableau 5), d’avoir une estimation de
la concentration en amibes libres (exprimée en NPP/mL) avec un intervalle de confiance de
95%. Dans l’exemple ci-dessus, le code étant de 3.2.2, la concentration correspondante
serait de 210 NPP/mL (Tableau 5) dans la dilution initiale faite au 1/100e, soit une
concentration dans le puits de 2,1.104 NPP/mL.
Tableau 5 : Tableau statistique pour la méthode du NPP à 3 géloses par dilution
(http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalMan
ualBAM/ucm109656.htm, 4/08/2012).
- Matériel et méthodes – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
78
Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures
I. Préparation des micro-organismes
Des suspensions de levures et d’amibes libres sont préparées comme décrit
précédemment (voir Matériel et méthodes Chapitre 2 II. 1) b) et 2) b)
Préparation des suspensions), ainsi qu’une solution de surnageant de culture amibienne
(voir Matériel et méthodes Chapitre 1 II. 3) c) Préparation des surnageants de
culture d’amibes). Un rapport levures/amibes ou MOI (Multiplicity Of Infection) de 1 est choisi
; des volumes équivalents de levures (5.105/mL) et d’amibes (5.105
/mL) ou de surnageant de
culture amibienne, sont donc mis en présence.
Pour les cocultures, les amibes sont incubées en premier dans les puits de microplaques,
seules dans l’eau filtrée, pendant 2 h à la température souhaitée (10, 20 ou 27°C). Le même
volume de levures est ensuite ajouté, ainsi que de la salive à 2% (v/v) selon les
expériences ; le volume final dans les puits devant être de 200 µL.
Pour chaque expérience de coculture, un témoin eau ainsi qu’un témoin salive sont réalisés
en parallèle ; le puits témoin eau contenant 200 µL d’eau filtrée, et le puits témoin salive
contenant 200 µL d’eau avec 2% de salive (v/v). Un témoin amibes (suspension d’amibes
seulement) ainsi qu’un témoin levures (suspension de levures seulement) sont également
réalisés.
II. Analyse de la viabilité
La survie des levures et des amibes libres est analysée après des temps d’incubation
compris entre 0 et 360 h (soit une durée totale de 15 jours). Les microplaques sont incubées
à 10, 20 ou 27°C selon les expériences.
La viabilité des levures et des amibes libres est analysée comme décrit précédemment (voir
Matériel et méthodes Chapitre 2 II. 1) d) et 2) d) Analyse de la viabilité). Après
chaque temps d’incubation choisi, la survie des levures est analysée par dénombrement des
UFC. Les colonies sont dénombrées après 48 h d’incubation à 37°C ; les résultats sont
exprimés en log UFC/mL. La survie des amibes libres est analysée d’une part par
dénombrement en microscopie optique, sur cellule de Kova®, en présence de bleu Trypan ;
les résultats sont exprimés en log amibes vivantes/mL. D’autre part, pour certaines
expériences, le dénombrement d’amibes libres est réalisé par la méthode du NPP ; cette
méthode permet d’avoir une estimation de la concentration en amibes libres (exprimée en
NPP/mL) avec un intervalle de confiance de 95%.
- Matériel et méthodes – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
79
III. Observations microscopiques
1) Microscopie électronique à transmission
a) Préparation des cocultures
Les suspensions de levures et d’amibes libres sont préparées comme décrit
précédemment (voir Matériel et méthodes Chapitre 2 II. 1) b) et 2) b)
Préparation des suspensions). Un rapport levures/amibes de 1 est choisi. Une flasque de
culture de 25 cm² est préparée avec 50 mL de suspension d’amibes libres en eau filtrée et
incubée 5 jours à 20°C. 50 mL de suspension de levures en eau filtrée sont ensuite ajoutés
dans la flasque, ainsi qu’un volume déterminé de salive filtrée afin d’obtenir 2% final (v/v).
Cette coculture est ensuite incubée 24, 72 ou 168 h à 20°C.
b) Fixation 1
Le surnageant de culture est éliminé, et le tapis cellulaire est fixé rapidement par
immersion dans un volume de glutaraldéhyde à 2,5% (fixateur 1) pendant au moins 1 h à
température ambiante. Les cellules adhérées et fixées sont récupérées à l’aide d’un grattoir
de cellules, puis centrifugées 10 min à 400 g. Le fixateur 1 (contenu dans le surnageant) est
ensuite éliminé et remplacé par du tampon phosphate (v/v).
c) Pré-enrobage
Après quelques minutes, le tampon de lavage est à son tour éliminé et remplacé (v/v)
par du milieu gélosé Histogel® (LabStorage) chauffé à 60°C afin de le liquéfier. Après
homogénéisation puis centrifugation pendant 10 min à 3000 g, du tampon phosphate très
froid est ajouté par-dessus la gélose et le tout est stocké à 4°C pendant quelques heures,
jusqu’à solidification totale du bloc de gélose contenant le culot de centrifugation de la
coculture.
d) Fixation 2
Une seconde fixation est ensuite réalisée avec du tétraoxyde d’osmium à 1%; ce
composé étant capable de figer les phospholipides. L’échantillon est incubé pendant 1 h à
4°C en présence de ce fixateur 2, puis lavé en tampon phosphate.
e) Déshydratation
L’échantillon est ensuite déshydraté à l’acétone, par bains successifs en concentration
croissante :
-2 fois 1 min dans un bain à 50% acétone-50% eau distillée.
- Matériel et méthodes – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
80
-2 fois 5 min dans un bain à 70% acétone-30% eau distillée.
-2 fois 15 min dans un bain à 90% acétone-10% eau distillée.
-4 fois 15 min dans un bain à 100% acétone.
A ce stade, les prélèvements apparaissent durcis et colorés en noir.
f) Inclusion en résine
L’eau des tissus cellulaires est ensuite substituée par une résine époxy : l’araldite
(TAAB). L’échantillon est placé au fond d’une capsule en plastique et enrobé de résine
(Figure 29). La polymérisation dure quelques jours à 60°C.
Figure 29 : Inclusion des échantillons dans une résine époxy (A, B) (Unité de pathologie
ultrastructurale et expérimentale ; Service d’anatomie et cytologie pathologique, CHU
Poitiers).
g) Coupes et observations
Une fois les échantillons correctement durcis, les coupes microscopiques peuvent être
réalisées. D’une part, le pyramitome permet d’entailler la résine et de se placer au niveau de
l’échantillon, et d’autre part le microtome (couteau en verre) permet d’obtenir des coupes
semi-fines. Ces coupes sont colorées au bleu de toluidine et observées au microscope
optique, afin de vérifier la présence de l’échantillon analysé. Enfin, des coupes ultra-fines
sont réalisées à l’aide d’un couteau en diamant. Les différentes coupes ainsi obtenues sont
triées et récoltées sur des grilles en cuivre (Figure 30). Après au moins 1 h de séchage, les
coupes sont contrastées par de l’acétate d’uranyl (30 s) ainsi que des sels de plomb (4
min) ; ces deux composés permettant d’obtenir des nuances de gris. Les grilles, supportant
les échantillons, sont ensuite lavées à l’eau distillée, séchées, placées sur le porte-
échantillon (Figure 30), puis observées au microscope électronique à transmission (MET)
(Jeol 1010, Japan).
- Matériel et méthodes – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
81
Figure 30 : Coupes ultra-fines déposées sur des grilles de cuivre (A) et porte-échantillon
permettant l’insertion des grilles dans le MET (B) (Unité de pathologie ultrastructurale et
expérimentale ; Service d’anatomie et cytologie pathologique, CHU Poitiers).
2) Marquage immunocytochimique
Un marquage immunocytochimique des levures est réalisé pour certaines expériences.
Dans ce cas, les coupes ultra-fines sont déposées non pas sur des grilles en cuivre mais
des grilles en nickel, capables de mieux résister à l’étape d’oxydation.
a) Oxydation
Afin de nettoyer les coupes et de libérer au mieux les sites antigéniques, les grilles
sont oxydées dans du métapériodate de sodium à 5%, 30 min à température ambiante, puis
rincées dans de l’eau distillée.
- Matériel et méthodes – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
82
b) Saturation
Les sites non spécifiques sont bloqués en incubant les grilles 30 min à température
ambiante dans une solution tampon de sérum albumine à 3%.
c) Anticorps primaire
Les grilles sont ensuite séchées et trempées dans une solution d’anticorps primaire, le
tout est incubé en chambre humide afin d’éviter toute dessiccation, à 4°C pour une nuit.
L’anticorps utilisé est un Ig M de souris anti-Candida noté 3H8 (Marcilla et al., 1999 ; mis à
disposition par le laboratoire SR²B : Société de Recherche et de Réalisations
Biotechnologiques, Angers). La cible de cet anticorps est intrapariétale, c’est-à-dire localisée
dans la paroi des levures.
d) Anticorps secondaire
Les grilles sont lavées dans une solution de détergents (TRIS et Tween 20), afin
d’éliminer l’anticorps primaire non fixé à sa cible spécifique ; une dizaine de lavages de 5
min chacun est réalisée. Les grilles sont ensuite incubées avec l’anticorps secondaire 1 h à
température ambiante, en chambre humide. L’anticorps secondaire utilisé est un anti-Ig M
marqué à l’or colloïdal ; l’or colloïdal apparaissant au microscope sous forme de billes
noires, permettant de visualiser et de localiser la cible de l’anticorps primaire.
Les grilles sont ensuite rincées à l’eau distillée et séchées sur papier filtre.
e) Contraste
Juste avant observation, les grilles sont contrastées à l’acétate d’uranyl et aux sels de
plombs (voir Matériel et méthodes Chapitre 3 III. 1) g) Coupes et observations).
Les grilles sont lavées à l’eau distillée, séchées, puis observées au MET (Jeol 1010).
3) Microscopie électronique à balayage
a) Stérilisation des coupons
Afin de se rapprocher des conditions retrouvées à l’intérieur des USD, des coupons en
forme de disques d’environ 1,2 cm de diamètre et 0,3 cm de hauteur, en PVC (RD-128PVC ;
Biosurface Technologies Corp, USA), matériau très souvent utilisé pour la fabrication des
tubulures, sont utilisés pour étudier l’adhérence des levures et des amibes libres sur les
surfaces.
Les coupons sont stérilisés avant utilisation par trempage dans une solution d’éthanol à 70%
puis rinçage à l’eau distillée et séchage à la flamme.
- Matériel et méthodes – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
83
b) Préparation des cocultures
Les suspensions de levures et d’amibes libres sont préparées comme décrit
précédemment (voir Matériel et méthodes Chapitre 2 II. 1) b) et 2) b)
Préparation des suspensions). Un rapport levures/amibes de 1 est choisi. Pour cette
expérience, les amibes (1 mL) sont pré-incubées une nuit à 20°C dans des puits d’une
microplaque 24 puits (Nunc®, Fisher Scientific) au fond desquels ont été préalablement
déposés des coupons de PVC. Le même volume (1 mL) de suspension de levures en eau
filtrée est ensuite ajouté dans chaque puits, ainsi qu’un volume déterminé de salive filtrée
afin d’obtenir 10% final (v/v). Ces cocultures sont ensuite incubées pendant 3 à 42 jours à
20°C, afin de laisser les cellules adhérer à la surface des coupons de PVC.
c) Fixation
Le surnageant de culture est éliminé, et les coupons sont recouverts d’une solution de
glutaraldéhyde à 2,5% pendant au moins 1 h à température ambiante. Les cellules adhérées
et fixées sur les coupons sont ensuite lavées dans du tampon phosphate et rincées à l’eau
distillée.
d) Déshydratation
Les coupons sont ensuite déshydratés à l’acétone, par bains successifs en
concentration croissante :
-2 fois 1 min dans un bain à 50% acétone-50% eau distillée.
-2 fois 5 min dans un bain à 70% acétone-30% eau distillée.
-2 fois 15 min dans un bain à 90% acétone-10% eau distillée.
-1 fois 15 min dans un bain à 100% acétone.
Les coupons sont ensuite placés dans de petits paniers métalliques, trempés dans l’acétone
100% et placés dans la chambre remplie d’acétone de l’appareil à Point Critique (BalTec).
e) Dessiccation par méthode Point Critique
Les cellules adhérées aux coupons sont déshydratées en remplaçant l’acétone par du
CO2 gazeux, en plusieurs étapes :
-tout d’abord, la température est descendue sous 8°C afin d’obtenir du CO2 liquide, miscible
à l’acétone,
-l’acétone remplissant la chambre de dessiccation est alors remplacé progressivement par
du CO2 liquide,
-une fois la chambre vidée de l’acétone et remplie de CO2 liquide, la température est
augmentée jusqu’au Point Critique (31°C, 73 bars) ; ce point correspondant à la transition de
phase du CO2 : à ce stade, un mélange de CO2 liquide et de CO2 gazeux est obtenu,
- Matériel et méthodes – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
84
-le Point Critique est ensuite dépassé, et la température augmentée jusqu’à 42°C afin
d’obtenir une chambre de dessiccation remplie de CO2 cette fois gazeux : les cellules sont
ainsi déshydratées,
-le gaz est enfin retiré très lentement de la chambre de dessiccation pour conserver intactes
les structures cellulaires sous vide : la pression est pour cela descendue jusqu’à 0, en
gardant une température constante,
-les paniers métalliques contenant les coupons sont alors sortis de la chambre.
f) Métallisation et observations
Pour la métallisation, étape qui permet de rendre les échantillons conducteurs aux
électrons et donc observables au microscope électronique à balayage (MEB), les coupons
sont installés sur des petits plots métalliques, à l’aide d’adhésif conducteur et de colle
argentée. Ces assemblages sont disposés dans un métalliseur (BalTec) qui permet de
recouvrir les coupons d’une fine couche d’or, par bombardage des électrons dans une
atmosphère d’argon, sous vide (environ 5 min).
Une fois séchés, les coupons sont observés au MEB (Jeol JSM 840A, Japan).
IV. Analyse par cytométrie en flux
1) Cytométrie en flux : principe
La cytométrie en flux est une technique permettant de compter des cellules en
suspension dans un milieu. Les cellules sont présentées une à une devant une source laser
émettant une longueur d’onde précise qui va exciter les cellules. Les cellules excitées
diffractent la lumière ; cette diffraction est captée par un détecteur FSC (Forward Scatter)
(Figure 31), qui renseigne sur la taille des cellules.
Figure 31 : Schéma du principe de la cytométrie en flux (http://bentleyinstruments.com/wp-
content/uploads/2010/12/Somacount_FCM-300x254.jpg, 4/08/2012).
- Matériel et méthodes – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
85
D’autres détecteurs, tels que le détecteur SSC (Side Scatter) qui renseigne sur la
granularité des cellules, ou les détecteurs de fluorescence, captent la lumière diffractée avec
un angle plus important (90°) ou la lumière émise (fluorescence) (Figure 31). En utilisant
différents filtres optiques et différents fluorochromes, il est possible d’analyser de nombreux
paramètres. Le collecteur-analyseur de données convertit les données récoltées en valeurs
numériques et peut représenter plusieurs paramètres combinés sur un histogramme.
2) Cytométrie en flux : application
a) Préparation des cocultures
Les suspensions de levures et d’amibes libres sont préparées comme décrit
précédemment (voir Matériel et méthodes Chapitre 2 II. 1) b) et 2) b)
Préparation des suspensions), avec un rapport levures/amibes de 1. Pour cette expérience,
les amibes (1 mL) et les levures (1 mL) sont incubées dans des puits d’une microplaque 24
puits, avec un volume déterminé de salive filtrée afin d’obtenir 5% final (v/v). Ces cocultures
sont ensuite incubées 72 h à 20°C. En parallèle, un témoin levures seules ainsi qu’un témoin
amibes seules ont été réalisés dans les mêmes conditions.
b) Marquage par des fluorochromes
Le marquage fluorescent des cellules est réalisé à l’aide du kit de colorants BacLight®
(Invitrogen), contenant deux fluorochromes : le SYTO 9 et l’Iodure de Propidium (IP). Le
SYTO 9, fluorescent vert, capable de pénétrer dans toutes les cellules, colore l’ensemble
des cellules en vert, alors que l’IP, fluorescent rouge, capable de ne pénétrer dans les
cellules que si la membrane est détériorée, colore uniquement les cellules mortes en rouge
(Boulos et al., 1999; Mogoa et al., 2010).
1 mL de chaque échantillon est prélevé et mis en contact avec 1,5 µL/mL de chacun des
fluorochromes. Les échantillons sont placés 15 min à l’obscurité.
c) Analyse en cytométrie en flux
Après 15 min de marquage fluorescent, les échantillons sont placés sur le portoir du
cytomètre de flux (BD FACSCanto II, BD Biosciences, USA) et analysés sur 4 paramètres :
la taille (FSC), la granularité (SSC), ainsi que l’émission de fluorescence due au SYTO 9 et
celle due à l’IP. Les données sont collectées et analysées à l’aide du logiciel d’acquisition
BD FACSDiVa 6 (BD Biosciences, USA).
- Matériel et méthodes – Chapitre 4 : Les traitements chimiques -
86
Chapitre 4 : Les traitements chimiques
I. Produits chimiques utilisés
Toujours dans le but de reproduire les conditions se rapprochant de celles trouvées
dans les USD, trois produits chimiques, couramment utilisés dans les procédés de
désinfection des eaux et des USD, sont testés sur les différentes souches de levures et
d’amibes libres. Pour chacun des trois désinfectants, l’effet antimicrobien d’une gamme de
concentrations choisies est analysé :
-pour le chlore, utilisé sous forme d’hypochlorite de sodium (NaOCl, Sigma), quelques
études ont montré une efficacité très variable de ce désinfectant, qu’il soit utilisé en continu
ou en traitement périodique. Des temps de contact différents ainsi que des concentrations
allant de 1 à 50 ppm (parties par million ou mg/L) ont été testés (Fiehn and Henriksen, 1988;
Karpay et al., 1999).
-concernant le peroxyde d’hydrogène (H2O2, Sigma), ce désinfectant a été montré comme
agent antimicrobien et notamment antifongique, avec un temps de contact de 15 à 30 min et
une concentration de 0,25% pour un traitement périodique ; un traitement à 0,02% en
continu a également été étudié (Zanetti et al., 2003; Szymanska, 2006a).
-enfin, pour ce qui est de l’Oxygenal 6© (KaVo®), produit à base de 6% de H2O2 et d’ions
Argent (Ag), de même que le H2O2, ce désinfectant a été montré efficace pour le traitement
des USD, que ce soit en continu avec une dose de 0,02% ou en périodique à 0,25% (Schel
et al., 2006; Szymanska, 2006b).
Dans le cadre de l’étude, la viabilité des micro-organismes est étudiée 15 min après
l’ajout d’une dose choisie de désinfectant. De plus, les gammes de concentrations
sélectionnées sont :
-de 3 à 118 ppm (3 ; 6 ; 12 ; 26 ; 62 ; 118 ppm) pour le chlore,
-de 0,07% à 0,9% (0,07 ; 0,15 ; 0,3 ; 0,6 ; 0,75 ; 0,9%) pour le H2O2,
-de 0,05% à 2% (0,05 ; 0,1 ; 0,2 ; 0,5 ; 1 ; 2%) pour l’Oxygenal 6©.
- Matériel et méthodes – Chapitre 4 : Les traitements chimiques -
87
II. Traitements des micro-organismes
1) Préparation des suspensions
a) Préparation des levures
Les suspensions de Candida spp. sont préparées (voir Matériel et méthodes
Chapitre 2 II. 1) b) Préparation des suspensions) et réparties dans les puits de
microplaques de 96 puits, en présence de 2% de salive filtrée (v/v) ; le volume final de
chaque puits étant de 200 µL.
b) Préparation des amibes libres
Les suspensions d’amibes libres sont préparées (voir Matériel et méthodes
Chapitre 2 II. 2) b) Préparation des suspensions) et réparties dans les puits de
microplaques de 96 puits, en présence de 2% de salive filtrée (v/v) ; le volume final de
chaque puits étant de 200 µL.
c) Préparation des cocultures
Dans le cas des cocultures, des volumes équivalents (rapport levures/amibes : 1) de
suspensions d’amibes libres et de levures sont répartis dans les puits de microplaques de 96
puits, en présence de 2% de salive filtrée (v/v) ; le volume final de chaque puits étant de 200
µL.
2) Traitements chimiques
Les microplaques sont incubées à 20°C. La survie des micro-organismes est analysée
après des temps d’incubation compris entre 0 et 360 h (soit une durée totale de 15 jours).
Pour chaque traitement chimique, à chaque temps d’incubation choisi, un volume déterminé
de désinfectant est ajouté dans le puits, afin d’obtenir la concentration finale voulue dans le
puits contenant déjà 200 µL de suspension microbienne. L’analyse de la viabilité est réalisée
15 min après l’ajout de désinfectant. En parallèle, pour chaque traitement et chaque temps
d’incubation, un témoin correspondant aux micro-organismes non traités est réalisé.
- Matériel et méthodes – Chapitre 4 : Les traitements chimiques -
88
3) Analyse de la viabilité
a) Analyse de la survie des levures
A chaque temps d’incubation choisi, 15 min après avoir appliqué le traitement
chimique, la survie des levures (en culture simple ou en coculture avec des amibes libres)
est analysée par dénombrement des UFC (voir Matériel et méthodes Chapitre 2
II. 1) d) Analyse de la viabilité).
Pour cela, 50 µL des puits testés sont dilués dans 450 µL d’eau filtrée, 15 min après le
traitement. Des dilutions au 1/10e, 1/100
e sont utilisées et étalées à hauteur de 100 µL sur
géloses Sabouraud + chloramphénicol. Les colonies sont dénombrées après 48 h
d’incubation à 37°C ; les résultats sont exprimés en log UFC/mL.
b) Analyse de la survie des amibes libres
A chaque temps d’incubation choisi, 15 min après avoir appliqué le traitement
chimique, la survie des amibes libres (en culture simple ou en coculture avec des levures)
est analysée par dénombrement en microscopie optique (cellule de Kova®) (voir Matériel
et méthodes Chapitre 2 II. 2) d) Analyse de la viabilité).
Pour cela, 50 µL des puits testés sont dilués dans 450 µL d’eau filtrée, 15 min après le
traitement, puis dilués au ½ dans du bleu Trypan. Les résultats sont exprimés en log amibes
vivantes/mL.
89
Résultats et
discussion
- Résultats et discussion – Chapitre 1 : Analyse de la salive -
90
Chapitre 1 : Analyse de la salive
I. Objectif de l’étude
La salive, très présente au niveau de la cavité buccale et souvent impliquée dans les
nombreuses pathologies orales, a plusieurs fois fait l’objet d’études de caractérisations
biochimiques. Diverses techniques ont été utilisées afin d’analyser de façons qualitative et
quantitative les différents constituants de la salive, notamment les différentes sécrétions des
glandes salivaires mais aussi et surtout la pellicule exogène acquise. Majoritairement, des
molécules protéiques, enzymatiques, des acides organiques, mais aussi des micro-
organismes ont été identifiés (Humphrey and Williamson, 2001; Scannapieco, 1994).
L’objectif de cette partie du travail a été de caractériser les principaux éléments
moléculaires présents dans la salive après centrifugation et filtration (voir Matériels et
Méthodes Chapitre 1 III. 2) Préparation des salives). Pour cela, une technique
utilisant la chromatographie gazeuse pour séparer les molécules, couplée à une technique
de spectrométrie de masse, pour identifier les molécules fragmentées, a été utilisée (GC-
MS).
II. Chromatogramme obtenu par GC-MS
Lors de l’analyse par GC-MS, la vitesse de décrochage des molécules de la salive
dépendait de leur affinité avec la colonne polaire : ainsi, les solutés plus polaires ont été
élués en premier, et les plus apolaires, plus longtemps retenus par la colonne, sont sortis en
dernier ; la tension de vapeur (pression de vapeur à laquelle une molécule sous forme
gazeuse est en équilibre avec sa phase liquide ou solide), paramètre lié à la température
utilisée lors de l’analyse, entrait également en jeu lors de l’élution des constituants salivaires.
Dans ces conditions, après séparation sur la colonne capillaire du chromatographe, les
différentes molécules sont apparues sur le chromatogramme sous forme de pics (dont la
hauteur, ou l’aire sous la courbe, est proportionnelle à la quantité de la molécule). L’abscisse
du chromatogramme correspond à leur temps de rétention (temps nécessaire pour les
décrocher de la colonne) en minutes, et l’ordonnée donne une abondance relative
(correspondant à la hauteur des pics) (Figure 32).
Le logiciel de base de données pour l’analyse des molécules, relié à l’appareil de GC-MS, a
permis l’identification des principaux pics (Figure 32). La nature la plus probable a alors été
proposée pour chacune des molécules observées. Ces molécules étaient principalement
- Résultats et discussion – Chapitre 1 : Analyse de la salive -
91
des protéines, des glucides, des composés aromatiques (à cycles carbonés complexes),
ainsi que des acides organiques.
Figure 32 : Chromatogramme de la salive filtrée, analysée par GC-MS (n=2).
D’après la base de données, la salive ne contenait que très peu de sucres ; une seule
molécule pouvant provenir de molécules glucidiques a été identifiée : l’acétamide (Figure
32). Quelques acides organiques, ainsi que quelques molécules aromatiques ont été
retrouvés, mais majoritairement, la salive analysée était composée de molécules
caractéristiques des protéines, telles que l’indole ou le toluène (Figure 32).
Les résultats obtenus étaient cohérents avec les données de la littérature (de Almeida et al.,
2008; Humphrey and Williamson, 2001; Gocke et al., 2002; Scannapieco, 1994; Yao et al.,
2001).
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
92
Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive
I. Survie des levures
1) Objectif de l’étude
Les levures du genre Candida ont déjà été isolées dans l’eau d’appareils de dialyse ou
encore dans l’eau des USD (Medeiros et al., 2008; Szymanska, 2005; Walker et al., 2000).
Dans le cas des USD, les levures, ainsi que d’autres micro-organismes oraux, peuvent se
retrouver refluées à l’intérieur du circuit d’eau, par le biais de valves anti-reflux défaillantes
ou absentes, accompagnées de salive (Barbeau et al., 1998; Ojajärvi, 1996). De plus, l’eau
de réseau alimentant ces dispositifs médicaux est le plus souvent filtrée.
L’objectif de cette partie du travail a donc été de vérifier la capacité de différentes
espèces de Candida à survivre dans un milieu très pauvre tel que l’eau de réseau filtrée,
ainsi que d’étudier l’influence de la présence de faibles concentrations de salive sur la survie
des levures.
2) Article : FEMS Microbiology Letters (2011) – Influence de la
présence de salive
Dans une première série d’expériences, qui ont fait l’objet d’une publication dans le
journal FEMS Microbiology Letters, la survie de trois espèces de levures du genre Candida
(C. albicans, C. glabrata et C. parapsilosis) a été analysée dans l’eau filtrée en présence de
0, 1, 5 ou 20% (v/v) de salive filtrée, à 27°C pendant 360 h d’incubation.
La viabilité des levures a été mesurée par dénombrement des UFC sur géloses Sabouraud
+ chloramphénicol, après 48 h d’incubation à 37°C.
Les résultats ont montré une influence dose-dépendante et espèce-dépendante : C.
parapsilosis semblait plus résistante que les deux autres espèces, qui ne survivaient dans
l’eau qu’en présence de salive. De plus, plus la concentration en salive était élevée, plus la
croissance des levures persistait dans le temps et pouvait être ainsi observée pendant les
360 h de l’expérience.
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
93
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
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- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
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- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
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- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
97
3) Influence du type d’eau utilisée
Des analyses complémentaires ont été réalisées afin de vérifier si l’eau de réseau
filtrée apportait ou non des éléments essentiels pour la survie des levures, tels que des sels
minéraux. Une comparaison a donc été faite entre la croissance des levures en présence de
salive centrifugée à différentes concentrations (0, 2, 5 et 10% v/v), dans de l’eau distillée
(Figure 33-A) et dans de l’eau de réseau filtrée (Figure 33-B) à 27°C ; seuls les résultats
pour C. albicans sont représentés sur la figure 33.
Figure 33 : Survie de C. albicans dans l’eau distillée (A) et dans l’eau filtrée (B), en présence
de différentes concentrations de salive centrifugée (0, 2, 5 et 10% v/v) à 27°C (n=2).
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
98
Les résultats, comparables pour les trois espèces de levures, n’ont montré aucune
différence marquée entre les deux eaux : l’eau de réseau filtrée n’apporte donc aucun
élément nutritif aux levures. L’augmentation de la survie des levures du genre Candida est
donc uniquement liée à la présence de salive.
4) Influence de la composition de la salive utilisée
Plusieurs traitements ont été effectués sur la salive, dans le but de déterminer plus
précisément quels constituants salivaires étaient à l’origine de l’augmentation de la survie
des levures. Au total, six salives différentes ont été testées sur les trois espèces de levures :
salive centrifugée, salive filtrée, salive DTT, salive chauffée, salive < 5 K et salive < 30 K
(voir Matériels et Méthodes Chapitre 1 III. 2) Préparation des salives).
a) Salive centrifugée VS salive filtrée
Initialement, la salive utilisée était uniquement centrifugée, et pouvait de ce fait
contenir quelques bactéries orales potentiellement à l’origine de contaminations sur les
géloses, lors du dénombrement des UFC de levures. La salive a donc été par la suite
utilisée centrifugée et filtrée. Afin de vérifier que l’étape de filtration ajoutée ne modifiait pas
l’effet sur la survie des levures préalablement observé avec la salive centrifugée à 27°C, une
étude comparative a été réalisée, avec les mêmes concentrations de chacune des deux
salives sur les trois espèces de levures (seule la concentration 5% de salive (v/v) est
représentée sur la figure 34).
Les résultats ont montré que l’effet de la salive filtrée sur la croissance de Candida spp. était
similaire à l’effet de la salive centrifugée. Après les 360 h de l’expérience, C. albicans
(Figure 34-A) et C. parapsilosis (Figure 34-C) ont vu leur croissance augmentée de 2 logs
UFC/mL, et C. glabrata (Figure 34-B) est passée de log 5 à log 6 UFC/mL, comparé au
témoin sans salive. La filtration sur membrane 0,22 µm n’a donc pas éliminé la ou les
molécule(s) de la salive active(s) sur la croissance des levures dans l’eau.
De plus, comme observé dans l’article (voir Résultats et Discussion Chapitre 2
I. 2) Article : FEMS Microbiology Letters (2011) – Influence de la présence de salive),
les résultats obtenus sur les trois espèces de Candida étaient similaires avec 2, 5 et 10% de
salive (v/v). Pour la suite des analyses, seules les concentrations de 2% et 5% de salive ont
été utilisées (v/v).
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
99
Figure 34 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau filtrée
en présence de 5% (v/v) de salive centrifugée ou filtrée à 27°C (n=2).
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
100
b) Salive filtrée VS salive DTT
La prolifération des levures étant tout aussi favorisée en présence de salive filtrée que
de salive centrifugée, et la salive filtrée n’étant pas chargée en micro-organismes
contaminants, pour la suite des analyses, la salive filtrée a été utilisée comme témoin
référence.
La salive a d’une part été traitée au DTT, agent capable de couper les ponts disulfures des
protéines contenant des acides aminés sulfurés, et générant leur dénaturation. L’étude
comparative de la survie des levures dans l’eau filtrée à 27°C en présence de 5% de salive
filtrée et de 5% de salive DTT (Figure 35) a montré que le traitement au DTT était sans effet
sur la survie de C. parapsilosis en présence de salive (Figure 35-C). En revanche, C.
albicans et surtout C. glabrata semblaient plus sensibles ; leur survie en présence de salive
DTT était plus faible qu’en présence de salive filtrée (Figure 35-A et B). Par exemple après
360 h d’incubation, la concentration de C. albicans en présence de salive DTT était de 4,3
logs, contre 6,8 logs UFC/mL en présence de salive filtrée (Figure 35-A).
Le fait de dénaturer certaines protéines salivaires pourrait diminuer les sources de
nutriments apportés aux levures par la salive. Cependant, les levures survivent toujours
mieux en présence de salive traitée au DTT qu’en absence totale de salive dans l’eau ;
même en dénaturant certaines protéines, la survie des levures reste très élevée
comparativement au témoin levures. L’effet de la salive sur la prolifération des levures dans
l’eau serait donc dû à l’action de plusieurs molécules différentes.
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
101
Figure 35 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau filtrée
en présence de 5% (v/v) de salive filtrée ou de salive DTT à 27°C (n=2).
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
102
c) Salive filtrée VS salive chauffée
La survie des levures dans l’eau à 27°C, a été comparée en présence de 5% de salive
filtrée et de 5% de salive chauffée 30 min à 100°C (Figure 36).
Comme observé dans le cas de la salive traitée au DTT, le traitement de la salive par la
chaleur n’a eu aucun effet dans le cas de l’espèce C. parapsilosis (Figure 36-C). Ces
résultats confirment l’hypothèse déjà émise : l’espèce C. parapsilosis est plus résistante que
les autres espèces de Candida testées. De même, le traitement de la salive à la chaleur n’a
pas d’effet significatif sur la survie de C. glabrata dans l’eau (Figure 36-B). En revanche, la
croissance de C. albicans est légèrement plus faible en présence de salive chauffée que de
salive filtrée non chauffée (diminution de plus de 1 log UFC/mL) (Figure 36-A).
Dans les deux cas, comme noté précédemment, les levures survivent toujours mieux
dans l’eau en présence de salive traitée par la chaleur qu’en absence de salive ; même en
dénaturant certaines molécules telles que des enzymes, la survie des levures reste très
élevée comparé au témoin levures. Ces résultats confirment l’existence dans la salive de
plusieurs molécules différentes favorisant la survie et/ou la prolifération des levures dans
l’eau.
De plus, il semblerait que les traitements exercés sur la salive aient une influence différente
sur la prolifération des trois espèces de Candida testées ; cela signifierait que les trois
espèces testées n’utilisent pas forcément les mêmes molécules salivaires comme source de
nutriments.
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
103
Figure 36 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau filtrée
en présence de 5% (v/v) de salive filtrée (n=2) ou chauffée à 27°C (n=1).
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
104
d) Salive filtrée VS salives fractionnées
La salive a été fractionnée sur membranes afin d’obtenir des filtrats contenant des
molécules ayant une taille inférieure à la taille des pores de la membrane. Un filtrat < 5 KDa
et un filtrat < 30 KDa ont ainsi été obtenus et leur effet sur la prolifération des levures dans
l’eau a été comparé à celui de la salive filtrée non fractionnée (Figure 37).
C. parapsilosis, une fois de plus, est l’espèce la plus résistante et la moins exigeante sur les
sources de nutriments disponibles ; la survie de C. parapsilosis est approximativement la
même en présence de salive filtrée et en présence de salive < 5 K ou < 30 K (Figure 37-C).
Pour C. albicans, la même observation que dans le cas de la salive traitée au DTT ou à la
chaleur peut être faite ici : la croissance de C. albicans est plus faible en présence de salives
fractionnées que de salive filtrée, en particulier pour les temps d’incubation ≥ 72 h (Figure
37-A). Toutefois cette croissance est toujours beaucoup plus élevée par rapport au témoin
levures. Par exemple à 168 h d’incubation, une concentration de levures de seulement 0,8
logs UFC/mL est retrouvée en absence de salive, contre : 4,7 logs en présence de salive < 5
K, 5,2 logs en présence de salive < 30 K et 6,1 logs en présence de salive filtrée.
Pour C. glabrata, l’effet est plus marqué : dès 48 h d’incubation, la survie des levures est
plus faible en présence de salives fractionnées qu’en présence de salive filtrée, jusqu’à une
diminution de plus de 2 logs UFC/mL à 168 h d’incubation (Figure 37-B). La croissance de
C. glabrata en présence de salives fractionnées devient même comparable à celle du témoin
levures, pour les temps d’incubation ≥ 72 h (Figure 37-B).
Ces résultats confirment que chaque espèce de Candida utilise plusieurs molécules
salivaires comme source de nutriments, et que les molécules utilisées peuvent être
différentes d’une espèce à l’autre. De plus, cette partie du travail montre que certaines des
molécules salivaires métabolisées par les levures ont une taille > 30 KDa, mais que la
plupart d’entre elles ont une taille < 5 KDa (Figure 37).
L’effet positif de la salive sur la croissance des levures du genre Candida dans l’eau de
réseau filtrée serait donc dû à plusieurs molécules, dont la plupart seraient de nature
protéique, au vue de la grande proportion des protéines entrant dans la composition de la
salive, résistantes au DTT et à la chaleur et auraient une taille moléculaire < 5 KDa.
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
105
Figure 37 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau filtrée
en présence de 5% (v/v) de salive filtrée, de salive <5 K ou <30 K à 27°C (n=2).
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
106
5) Influence de la température utilisée
La salive filtrée a été utilisée pour la suite des analyses, et dans un premier temps
pour tester l’influence de la température sur la survie des levures dans l’eau. A l’intérieur des
USD, la température moyenne est de 23°C ; toutefois selon le modèle de l’unit et les
conditions environnementales, cette température peut varier de 20 à 30°C (Coleman et al.,
2007; Pankhurst, 2003). Ainsi deux températures moyennes ont été choisies pour les
expériences : 20 et 27°C. De plus, une troisième température a été étudiée : 10°C. Cette
condition pourrait correspondre à un cas plus extrême pouvant être retrouvé à l’intérieur des
tubulures, par exemple en hiver, où l’eau stagnerait à une température plus basse, ou
encore en cas de réfrigération d’une partie du réseau de l’USD. La survie des trois espèces
de Candida a donc été analysée dans l’eau filtrée, après incubation à ces trois températures
pendant 360 h, en présence ou non de 2% de salive filtrée. Les résultats obtenus sont
présentés pour chaque température et pour chacune des espèces de levures (Figures 38,
39 et 40).
Dans le cas de C. albicans, comme observé précédemment, la présence de salive
permet une meilleure survie voire une prolifération des levures à 27°C (Figure 38-A), à 20°C
(Figure 38-B), ou à 10°C (Figure 38-C) ; la concentration en levures est en effet toujours
supérieure ou égale à celle de l’inoculum de départ (log 5 UFC/mL). En revanche, le témoin
levures réagit différemment en fonction de la température : à 20°C, la croissance des
levures est minimale et ralentie (on parle de dormance, ou de quiescence) (Figure 38-B), à
10°C elle semble tout aussi ralentie et diminue au cours du temps (Figure 38-C), enfin à
27°C, C. albicans ne survit pas plus de 48 h dans l’eau en absence de salive (Figure 38-A).
Ces résultats pourraient s’expliquer par le fait que 27°C étant une température relativement
optimale pour leur croissance, les levures consommeraient rapidement le peu de nutriments
trouvés dans l’eau et épuiseraient donc le milieu au bout de quelques heures d’incubation,
ce qui entrainerait leur mort. A 20°C, la température étant moins adaptée, le métabolisme
fongique serait de ce fait ralenti. Les levures consommeraient donc moins rapidement les
nutriments et survivraient, en faible concentration, mais plus longtemps qu’à 27°C. Le cas de
10°C est encore différent : cette température serait peut-être trop basse pour permettre la
survie fongique, même en mode quiescent, les conditions de culture dans l’eau étant déjà
drastiques. Ainsi, la concentration en levures diminue progressivement au cours du temps.
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
107
Figure 38 : Survie de C. albicans à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en
présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2).
Pour C. glabrata, la même observation a été faite : la température n’influence pas
l’effet positif de la salive filtrée sur la survie des levures dans l’eau ; C. glabrata est capable
de maintenir sa concentration entre log 5 et log 6 UFC/mL durant les 360 h de l’expérience
(Figure 39). C. glabrata semble moins sensible à la température que C. albicans : en
absence de salive, C. glabrata peut survivre aussi bien à 27°C (Figure 39-A), qu’à 20°C
(Figure 39-B) ou même à 10°C (Figure 39-C). Toutefois une baisse progressive de la
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
108
concentration en levures à 20°C et 10°C a été notée ; cette diminution s’explique de la
même façon que pour C. albicans.
Figure 39 : Survie de C. glabrata à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en
présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2).
Enfin pour C. parapsilosis, la température a peu d’influence sur l’effet de la salive
(Figure 40) : à 27°C et 20°C la concentration augmente de log 5 à log 7 UFC/mL après 360
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
109
h d’incubation (Figure 40-A et 40-B), alors qu’à 10°C la croissance est légèrement plus
faible et oscille entre log 5 et log 6 UFC/mL (Figure 40-C).
D’une manière générale, comparé au témoin levures, quelle que soit la température
utilisée, et ce pour les trois espèces de Candida testées, la présence de 2% (v/v) de salive
filtrée permet d’augmenter la survie des levures dans l’eau de réseau filtrée.
Figure 40 : Survie de C. parapsilosis à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en
présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2).
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
110
II. Survie des amibes libres
1) Objectif de l’étude
Les amibes libres, ubiquitaires de l’environnement et notamment des milieux
aquatiques, ont déjà été isolées de l’eau alimentant les USD (Michel and Just, 1984; Rohr et
al., 1998; Thomas et al., 2008; Trabelsi et al., 2010). Le premier objectif de cette partie du
travail a donc été de suivre la survie d’amibes libres de genres communément retrouvés
dans les eaux : Acanthamoeba castellanii et Hartmannella vermiformis. De plus, l’étude se
plaçant dans le contexte des USD, l’influence de la présence de faibles concentrations de
salive sur la survie de ces amibes dans l’eau a été étudiée. A partir des résultats
précédemment décrits sur les levures du genre Candida (voir Résultats et
Discussion Chapitre 2 I. 4) Influence de la composition de la salive utilisée et 5)
Influence de la température utilisée), la salive filtrée a été utilisée pour la suite des
expériences, et les amibes libres ont été incubées à 20°C.
2) Influence de la présence de salive
L’influence de la présence de salive filtrée sur la survie des amibes libres dans l’eau
est présentée sur les figures 41 et 42. Les résultats sont représentés sous forme
d’histogrammes avec en abscisse le temps d’incubation (en heures), et en ordonnée la
concentration en amibes viables (en log amibes/mL). Les amibes considérées comme
viables sont celles qui apparaissaient incolores en microscopie optique, après coloration au
Bleu Trypan.
a) Sur la survie d’A. castellanii
L’étude de la croissance d’A. castellanii dans l’eau de réseau filtrée, illustrée sur la
figure 41, a montré que ce genre amibien était capable de survivre durant les 360 h de
l’expérience, sans apport de nutriments. En effet, la concentration du témoin amibes était
maintenue entre log 5,5 amibes/mL (au début de l’expérience) et log 4,4 amibes/mL (après
360 h d’incubation) (Figure 41). L’addition de salive filtrée dans le milieu de culture, quelle
que soit la concentration utilisée (2, 5 ou 10% v/v), n’a pas modifié la croissance d’A.
castellanii (Figure 41) dans les conditions expérimentales.
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
111
Figure 41 : Survie d’A. castellanii dans l’eau filtrée en présence de 2, 5 ou 10% (v/v) de
salive filtrée à 20°C (n=1).
b) Sur la survie de H. vermiformis
Figure 42 : Survie de H. vermiformis dans l’eau filtrée en présence de 2, 5 ou 10% (v/v) de
salive filtrée à 20°C (n=2).
L’étude de la croissance de H. vermiformis dans l’eau de réseau filtrée, illustrée sur la
figure 42, a également montré que ce genre amibien, tout comme A. castellanii, était
capable de survivre durant les 360 h de l’expérience. La concentration du témoin amibes
était maintenue entre log 5,2 amibes/mL (au début de l’expérience) et log 3,9 amibes/mL
(après 360 h d’incubation) (Figure 42). L’addition de salive filtrée dans le milieu de culture,
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
112
quelle que soit la concentration utilisée (2, 5 ou 10% v/v), n’a pas modifié la croissance de
H. vermiformis (Figure 42) dans les conditions expérimentales.
3) Influence de la température utilisée
Tout comme pour les levures (voir Résultats et Discussion Chapitre 2 I. 5)
Influence de la température utilisée), l’influence de la température a été testée sur la
survie des amibes dans l’eau. Toujours dans le but de se rapprocher des conditions
retrouvées à l’intérieur des USD, les trois mêmes températures ont été choisies pour les
expériences : 10, 20 et 27°C. La survie des deux espèces amibiennes a été analysée dans
l’eau filtrée à ces trois températures, pendant 360 h, en présence ou non de 2% de salive
filtrée. Les résultats obtenus sont présentés sous forme d’histogrammes avec le temps
d’incubation (en heures) en abscisse et la concentration en amibes viables (en log
amibes/mL) en ordonnée ; seuls les résultats pour H. vermiformis, comparables avec ceux
obtenus pour A. castellanii, sont représentés (Figure 43).
Comme observé dans le paragraphe précédent, l’ajout de 2% de salive filtrée dans l’eau n’a
pas modifié la croissance des amibes (Figure 43). Cette observation est valable pour H.
vermiformis, mais également pour A. castellanii. De même, la température ne semble pas
avoir d’influence sur la survie des amibes ; que ce soit à 27°C (Figure 43-A), à 20°C (Figure
43-B) ou à 10°C (Figure 43-C), la concentration en amibes est restée constante, proche de
log 5 amibes/mL.
- Résultats et discussion – Chapitre 2 : Survie dans l’eau – Influence de la salive -
113
Figure 43 : Survie de H. vermiformis à 27°C (A), 20°C (B), et 10°C (C), dans l’eau filtrée en
présence de 2% (v/v) de salive filtrée (n=2).
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
114
Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures
Les amibes libres, et notamment les genres Acanthamoeba et Hartmannella, sont
capables d’héberger dans leur cytoplasme divers micro-organismes. De nombreux exemples
d’ARB sont connus et décrits dans la littérature ; le cas de L. pneumophila est le plus étudié
(Kuchta et al., 1993; Molmeret et al., 2005; Rohr et al., 1998). Les interactions amibes-
bactéries sont étudiées depuis de nombreuses années par différentes approches, tandis que
les interactions amibes-levures n’ont été envisagées que récemment. Dans l’article de
Steenbergen de 2001, par exemple, le développement d’une levure environnementale et
pathogène opportuniste pour l’Homme, Cryptococcus neoformans, a été étudié à l’intérieur
du cytoplasme d’A. castellanii. Les auteurs se sont également intéressés à l’interaction
potentielle entre cette amibe et C. albicans. Ils ont observé que C. albicans était digérée par
l’amibe, alors que C. neoformans était capable de survivre à l’étape de phagocytose et de se
développer dans le cytoplasme amibien (Steenbergen et al., 2001).
Dans le but de compléter les connaissances sur les interactions amibes-levures, dans
cette partie du travail, des cocultures, avec un rapport levures/amibes (MOI) de 1, ont été
réalisées pour les deux amibes libres : A. castellanii et H. vermiformis, et les trois espèces
de Candida. Les cocultures ont été effectuées dans de l’eau de réseau filtrée, avec ou sans
2% de salive filtrée, et incubées 360 h à 20°C. La concentration en levures est exprimée en
log UFC/mL et la concentration en amibes en log amibes/mL ; les résultats sont illustrés par
des histogrammes, présentant la concentration cellulaire en fonction du temps d’incubation.
I. Cocultures A. castellanii- Candida
Dans cette partie, des témoins amibes seules, levures seules, amibes avec salive
filtrée, ainsi que levures avec salive filtrée ont permis de confirmer les résultats du chapitre
précédent (voir Résultats et Discussion Chapitre 2 I. et II.) : dans ces
conditions, les amibes sont capables de maintenir leur concentration proche de l’inoculum
de départ, dans l’eau avec ou sans salive filtrée (Figure 44-A). En revanche les levures ne
survivent que difficilement dans l’eau durant les 360 h de l’expérience ; l’ajout de 2% de
salive filtrée (v/v) permet d’augmenter fortement leur prolifération (Figure 44-B).
Lors de la réalisation des cocultures, il a été montré que la présence de levures ne
modifiait que très peu le comportement des amibes dans l’eau, à part pour les temps 168 et
360 h d’incubation où leur concentration semblait diminuer (Figure 44-A). Toutefois ces
résultats n’ont pas pu être confirmés (n=1). D’une manière générale, les amibes libres A.
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
115
castellanii survivent de façon comparable dans l’eau de réseau filtrée, en présence ou non
de salive filtrée, et en présence ou non de C. albicans.
Figure 44 : Survie d’A. castellanii (A) (n=1) et de C. albicans (B) (n=2), en coculture dans
l’eau filtrée en présence de 2% (v/v) de salive filtrée, à 20°C.
En ce qui concerne l’influence de la coculture sur les levures, les résultats sont très
différents. En effet, la présence d’A. castellanii dans le milieu de culture impacte lourdement
sur la survie de C. albicans : la concentration en levures est nulle dès 24 h d’incubation en
présence d’amibes (Figure 44-B). L’ajout de 2% de salive filtrée à la coculture permet une
faible survie à 24 h, mais l’effet ne dure pas et la concentration devient nulle après 48 h.
Ces résultats confirment les travaux décrits dans l’article de 2001 qui ont montré que
A. castellanii était capable de digérer C. albicans (Steenbergen et al., 2001). Les résultats
présentés ici montrent que les levures sont digérées et tuées par A. castellanii après
seulement 24 h de coculture. La figure 44 ne présente que les résultats pour C. albicans, car
seule cette espèce fongique a été mise en présence d’A. castellanii.
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
116
II. Cocultures H. vermiformis-Candida
Au vue des résultats obtenus avec A. castellanii, les levures étant dégradées très
rapidement, l’étude des cocultures avec cette amibe ne correspondait pas exactement à
l’objectif de cette partie du travail : étudier les interactions amibes-levures. Une autre espèce
amibienne a donc été choisie : H. vermiformis. Cette espèce, beaucoup moins étudiée qu’A.
castellanii, est décrite comme étant moins pathogène (De jonckheere and Brown, 1998;
Kinnear et al., 2003).
1) Article : Water Research (2012) – Interactions entre H.
vermiformis et Candida spp.
Les trois espèces de Candida ont été cultivées en présence de H. vermiformis dans
l’eau filtrée, en présence ou non de 2% (v/v) de salive filtrée à 20 et 27°C : cette partie du
travail a fait l’objet d’un article actuellement en cours de publication dans la revue Water
Research. Les principaux résultats montrent que la présence d’amibes dans le milieu de
culture, tout comme la présence de salive, permet d’augmenter la survie des levures dans
l’eau. A l’inverse d’A. castellanii qui est capable de les dégrader rapidement, H. vermiformis
les aiderait à proliférer, ou du moins ne les empêcherait pas de se multiplier, durant les 360
h d’incubation, quelle que soit la température. Dans le but de visualiser les interactions entre
H. vermiformis et les trois espèces de Candida, des observations en microscopie
électronique à transmission ont été réalisées. Cette technique a permis de mettre en
évidence la capacité des amibes à interagir ainsi qu’à internaliser les levures. Cependant, la
prolifération des levures étant augmentée, cela montre que l’internalisation ne signifie pas
forcément digestion. De plus, une étude préliminaire de la survie des levures en présence de
surnageants d’une culture amibienne a montré que le contact avec les amibes ne semblait
pas nécessaire, mais était plus efficace pour favoriser la survie des levures.
Des analyses complémentaires à celles développées dans cet article ont ensuite été
réalisées : d’une part les cocultures ont été étudiées comparativement à 27, 20 et 10°C,
d’autre part la survie en présence de surnageant a été répétée (voir Résultats et
Discussion Chapitre 3 II.2) Influence de la température utilisée et 3) Influence
de la présence d’un surnageant d’amibes), et enfin les observations microscopiques ont
également été complétées (voir Résultats et Discussion Chapitre 3 III.).
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
117
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
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- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
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2) Influence de la température utilisée
Tout comme pour les levures (voir Résultats et Discussion Chapitre 2 I. 5)
Influence de la température utilisée) ou les amibes libres (voir Résultats et
Discussion Chapitre 2 II. 3) Influence de la température utilisée), l’influence de la
température d’incubation a été étudiée sur les cocultures amibes-levures, en présence de
salive filtrée (2% v/v) (Figure 45).
Figure 45 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B) et C. parapsilosis (C), en coculture
avec H. vermiformis, dans l’eau filtrée avec 2% (v/v) de salive filtrée, à 20, 27 et 10°C (n=2).
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
126
Comme observé pour les levures (Figures 38, 39, 40) et les amibes libres (Figure 43),
la température n’a pas d’influence sur la survie des levures du genre Candida dans l’eau en
présence de H. vermiformis et de salive filtrée (Figure 45 A-C). Quelle que soit l’espèce
fongique et quelle que soit la température, la concentration en levures reste égale ou
supérieure à la concentration initiale (log 5 UFC/mL).
Ces résultats démontrent que les levures du genre Candida sont capables de survivre en
présence d’amibes libres telles que H. vermiformis dans l’eau de réseau filtrée, en présence
d’une faible concentration de salive (2% v/v) aussi bien à 20°C qu’à 27°C ou encore 10°C,
pendant au moins 360 h. A l’intérieur des tubulures des USD, où la température moyenne
est comprise entre 20 et 30°C, les levures du genre Candida pourraient donc proliférer dans
le cas d’un reflux de salive ou encore d’une contamination de l’eau par des amibes libres. De
plus, même dans un cas plus extrême de température (10°C), la présence d’amibes libres
et/ou de salive permet de maintenir la croissance de Candida spp.
3) Influence de la présence d’un surnageant d’amibes libres
Dans le cadre de l’article rédigé pour le journal Water Research, une étude
préliminaire de la survie de C. albicans en présence d’un surnageant de culture de H.
vermiformis a été réalisée (voir Résultats et Discussion Chapitre 3 II. 1)
Article : Water Research (2012) – Interactions entre H. vermiformis et Candida spp.).
Celle-ci suggérait que C. albicans était capable de proliférer aussi bien en présence de
surnageant de culture amibienne qu’en présence de H. vermiformis : le contact avec les
amibes ne semblait donc pas nécessaire pour augmenter la survie fongique ; la présence de
débris amibiens ou encore de métabolites sécrétés par les amibes, contenus dans le
surnageant, permettait donc également une survie importante des levures dans l’eau,
comparé au témoin.
Afin de compléter et de vérifier ces résultats, des analyses supplémentaires ont été
réalisées : la survie des trois espèces de Candida en présence de surnageant de culture
amibienne a été étudiée sur 360 h d’incubation à 20°C et répétée au moins deux fois (Figure
46). Les résultats obtenus précédemment ont été confirmés : la croissance des levures,
quelle que soit l’espèce étudiée, est fortement favorisée dans l’eau contenant du surnageant
de culture amibienne. Cette augmentation de la survie est également observée en présence
d’amibes.
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
127
Ces résultats montrent que H. vermiformis, par contact direct et phagocytose, ou encore par
sécrétion de métabolites, est capable de favoriser la survie de Candida spp. dans l’eau
filtrée.
Figure 46 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B) et C. parapsilosis (C), en présence de
surnageant de culture amibienne ou de H. vermiformis, dans l’eau filtrée, à 20°C (n=2).
III. Observations microscopiques
Dans le cadre de la rédaction de l’article, les cocultures amibes-levures ont été
incubées 72 h à 20°C afin de visualiser les interactions par MET (voir Résultats et
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
128
Discussion Chapitre 3 II. 1) Article : Water Research (2012) – Interactions entre
H. vermiformis et Candida spp.). Ce temps d’incubation avait été choisi arbitrairement
pour illustrer les cocultures à un temps moyen et afin d’obtenir des quantités suffisantes de
micro-organismes observables. Ces observations microscopiques ont par la suite été
complétées, d’une part par d’autres expériences en MET avec des temps d’incubation de 24
h et de 168 h, à 20°C (Figure 47). D’autre part, en réalisant des observations des micro-
organismes en cocultures et adhérés à une surface PVC (Figure 49), tel qu’ils pourraient
l’être à l’intérieur des tubulures d’USD, après différents temps d’incubation à 20°C (de 3 à 42
jours) et observation au MEB (Figure 50).
1) Microscopie électronique à transmission
a) Observations des cocultures en suspension
Aux différents temps d’incubation (24, 72 et 168 h), les levures ont été observées sous
forme de blastospores, dont certaines se trouvaient en bourgeonnement (Figure 47-A) ; ce
détail montre bien que la présence de salive et/ou d’amibes libres favorise ou du moins
n’inhibe pas la prolifération de Candida. De même, H. vermiformis a été observée sous
forme de kystes (Figure 47-B) mais également de trophozoïtes (Figure 47-C, D, E et F),
quelle que soit le temps d’incubation, ce qui montre que les amibes libres survivent
naturellement dans les conditions de l’expérience.
Comme décrit dans l’article pour le cas d’une observation après 72 h d’incubation (voir
Résultats et Discussion Chapitre 3 II. 1) Article : Water Research (2012) –
Interactions entre H. vermiformis et Candida spp.), après 24 h ou même 168 h
d’incubation des cocultures, H. vermiformis est capable d’interagir (Figure 47-C et E) et
d’internaliser les levures du genre Candida (Figure 47-D et F). De plus, après 168 h, de
nombreux micro-organismes, provenant soit de l’eau de réseau, soit de la salive, soit du
cytoplasme des amibes (ARB ou endosymbiotes libérés), ont pu être observés dans le
milieu à proximité des levures et des amibes libres (Figure 47-E). Cependant, la présence de
ces micro-organismes, représentant une source potentielle de nutriments pour les
prédateurs que sont les amibes, n’empêche pas H. vermiformis d’interagir et d’internaliser
les levures (Figure 47-C, D, E et F).
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
129
Figure 47 : Observations en MET de C. albicans (A) et de H. vermiformis (B) en coculture
dans de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 24 h (C-D) et 168 h (E-F)
d’incubation à 20°C (n=2).
b) Marquage immunocytochimique
Afin de savoir si, en plus de pouvoir les héberger dans leur cytoplasme, les amibes
sont capables de digérer des micro-organismes de grande taille tels que les levures, un
marquage immunocytochimique des levures a été réalisé. Dans l’article, les résultats
obtenus par cette expérience ont été décrits, mais non illustrés (voir Résultats et
Discussion Chapitre 3 II. 1) Article : Water Research (2012) – Interactions entre
H. vermiformis et Candida spp.). Sur la figure 48 les billes d’or colloïdal se retrouvent
localisées sur les levures (Figure 48-A et B), principalement au niveau du cytoplasme, et par
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
130
endroits au niveau de la paroi. La cible de l’anticorps primaire utilisé (3H8) est cependant
intrapariétale, c’est-à-dire à l‘intérieur de la paroi fongique, et les billes d’or devraient donc
se retrouver principalement dans la paroi (Marcilla et al., 1999). L’explication pourrait être la
température d’incubation utilisée pour l’expérience (20°C) ; la molécule ciblée par l’anticorps,
intrapariétale dans des conditions de culture plus classiques (37°C par exemple), n’est peut-
être pas correctement transportée à la paroi dans les conditions expérimentales et se
retrouverait ainsi dans le cytoplasme. Toutefois, le marquage réalisé reste spécifique des
levures du genre Candida ; le marquage est bien ciblé sur les levures et non pas diffus dans
le milieu de culture. De ce fait, les résultats obtenus permettent bien d’affirmer que les
débris cellulaires, visualisés sur la figure 48-C et zoomés sur la figure 48-D, sont des levures
en cours de digestion dans une vacuole de H. vermiformis.
Les amibes libres H. vermiformis se nourrissent donc de levures dans les conditions
expérimentales utilisées, sans toutefois détruire la totalité de la population fongique, puisque
la prolifération de Candida spp. est augmentée en présence d’amibes libres.
Figure 48 : Observations en MET de C. albicans et de H. vermiformis en coculture dans de
l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 72 h d’incubation à 20°C et marquage
immunocytochimique (A-D) (n=2).
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
131
2) Microscopie électronique à balayage
Les cocultures amibes-levures ont ensuite été réalisées sur des coupons de PVC,
dans l’eau de réseau filtrée avec 10% de salive filtrée (v/v) ; une concentration plus forte en
salive, et donc en nutriments, a été choisie pour les expériences de MEB afin de faciliter
l’adhérence des micro-organismes à la surface PVC, tout en restant dans des conditions
pouvant être retrouvées dans les USD. D’une part les coupons de PVC, incubés seuls dans
l’eau de réseau filtrée, 72 h à 20°C, ont été observés en MEB (Figure 49) : ces coupons
apparaissent comme étant des surfaces très rugueuses, très irrégulières (Figure 49-A) et de
ce fait propices à l’adhérence microbienne. De plus, des cristaux de sels minéraux,
probablement de calcium et provenant de l’eau de réseau, ont été retrouvés déposés sur les
surfaces PVC (Figure 49-B) ; de tels dépôts favorisent également l’adhérence.
Figure 49 : Observations en MEB de coupons de PVC incubés dans de l’eau filtrée, après 72
h d’incubation à 20°C (A-B) (n=1).
C. albicans et H. vermiformis ont été cocultivées sur ces coupons de PVC, dans l’eau
avec 2% de salive filtrée (v/v), à 20°C pendant 3, 15 et 42 jours avant d’être observées en
MEB (Figure 50).
Après 3 jours d’incubation, quelques amibes et quelques levures étaient visibles, adhérées à
la surface PVC (Figure 50-A). Des interactions entre ces micro-organismes, comme observé
en MET (voir Résultats et Discussion Chapitre 3 III. 1) Microscopie
électronique à transmission), ont été observées (Figure 50-B) : sur cette image, une
levure sous forme de blastospore est englobée par une amibe (trophozoïte). Après 15 jours
d’incubation, les levures se sont multipliées, de nombreuses blastospores sont adhérées au
PVC, certaines sont même en cours de bourgeonnement (Figure 50-C). La surface du
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
132
coupon étant déjà très irrégulière (Figure 49-A), les « filaments » observés autour des micro-
organismes sont soit des rugosités du PVC, soit de la matrice polysaccharidique.
Figure 50 : Observations en MEB de C. albicans et de H. vermiformis en coculture sur
coupons de PVC, dans de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 3 jours (A-B), 15
jours (C-D) et 42 jours (E-F) d’incubation à 20°C (n=1).
Dans le biofilm fongique nouvellement formé, de nombreuses bactéries sont visibles (Figure
50-C) ; ces bactéries proviennent soit de l’eau de réseau ou de la salive et auraient résisté à
l’étape de filtration (mais c’est peu probable), soit du cytoplasme des amibes (dans le cas
d’endosymbiotes ou d’ARB libérés). Tout comme après 3 jours d’incubation, des interactions
amibes-levures sont visibles (Figure 50-D) : des blastospores se retrouvent sur un amas de
trophozoïtes, dont un, ayant une extrémité allongée, semble avoir formé un pseudopode.
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
133
Enfin après 42 jours d’incubation à 20°C, le biofilm microbien s’est développé, une matrice
extracellulaire épaisse est visible, ainsi que de nombreuses levures, toujours sous forme de
blastospores et en cours de bourgeonnement (ce qui montre que les conditions de culture
sont assez favorables pour leur croissance) (Figure 50-E et F). En revanche, les amibes, qui
se retrouvent agglomérées avec les levures dans le biofilm, ont une morphologie différente.
Leur forme est plus arrondie et leur surface semble ridée, plissée (Figure 50-E et F), ce qui
correspond certainement à des amibes enkystées.
IV. Cytométrie en flux
La cytométrie en flux est une technique permettant d’analyser des cellules en
suspension, en fonction de divers paramètres dont la taille et la granularité. L’utilisation de
fluorochromes vitaux, tels que le Syto 9 ou l’IP, permet d’obtenir une proportion de cellules
vivantes et de cellules perméabilisées. Cette technique a été envisagée pour l’analyse des
cocultures, afin de remplacer les techniques classiques de microbiologie, plus lourdes
(dénombrement des UFC). Les résultats présentés ici ne sont qu’une étude préliminaire de
faisabilité de cette technique appliquée à des populations microbiennes complexes (mélange
de levures, de trophozoïtes et de kystes). Dans un premier temps, les outils d’analyse du
logiciel ont été élaborés par analyses des témoins amibes et levures (avec salive filtrée 5%
v/v). Cette étape a permis de localiser sur les graphiques les fenêtres d’analyse
correspondant aux différentes populations cellulaires (Figures 51, 52 et 53). Ainsi, cinq
fenêtres ont été déterminées : la fenêtre P1 correspondant à la population totale contenue
dans l’échantillon, P2 représentant les levures, P3 et P4 les amibes et P7 correspondant aux
cellules marquées à l’IP, et donc perméabilisées (considérées comme non viables) (Boulos
et al., 1999 ; Mogoa et al., 2010).
Les figures 51, 52 et 53 illustrent les résultats obtenus. Le graphique A montre
l’enregistrement des données SSC et FSC : chaque point représente une cellule
enregistrée, toutes les cellules étant réparties sur le graphique selon leur taille (FSC, en
abscisse) et leur granularité (SSC, en ordonnée). Ainsi, par exemple, des cellules de grande
taille et de faible granularité se situent vers le bas, à droite du graphique, et des cellules de
petite taille avec une forte granularité sont vers le haut, à gauche du graphique. Le
graphique B indique la fluorescence émise par l’IP : les cellules non marquées à l’IP (avec
une membrane intacte) sont à gauche, et les cellules IP+ à droite (fenêtre P7).
Lors des premiers essais, un double marquage avec l’IP et le Syto 9 avait été réalisé,
mais aucun résultat exploitable n’avait été obtenu : les spectres d’émission des deux
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
134
fluorochromes se chevauchant, l’interprétation des fluorescences verte et rouge des cellules
était impossible. Par la suite, seul l’IP a été utilisé afin d’obtenir la proportion de cellules non
perméabilisées.
1) Analyse des suspensions de levures
La suspension témoin levures (C. albicans) a été analysée par cytométrie en flux après
72 h d’incubation à 20°C dans de l’eau filtrée en présence de 5% de salive filtrée (v/v). Ce
témoin a permis de localiser les fenêtres P1 et P2 (Figure 51-A). Sur ce graphique, deux
populations sont visibles : une population ayant une petite taille et une faible granularité, et
une autre population, plus nombreuse, avec une taille plus importante et une faible
granularité. Les cellules de plus petite taille, moins nombreuses, correspondent certainement
à des débris contenus dans la salive. La population choisie pour représenter les levures (P2)
comptabilise environ 83% des cellules enregistrées par le cytomètre (Figure 51-A).
Le deuxième graphique montre que la grande majorité des levures ont survécu après
72 h d’incubation dans l’eau à 20°C en présence d’une faible concentration de salive : en
effet environ 89% des cellules sont non marquées à l’IP (Figure 51-B).
Ces résultats sont cohérents avec ceux précédemment décrits, obtenus par suivi de la
viabilité des levures en suspension et dénombrement des UFC (voir Résultats et
Discussion Chapitre 2 I.).
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
135
Figure 51 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de C. albicans après 72
h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de salive filtrée (v/v) à 20°C (n=2).
2) Analyse des suspensions d’amibes libres
Un témoin amibes, cultivé dans les mêmes conditions que le témoin levures, a ensuite
été analysé par cytométrie en flux et a permis de confirmer l’emplacement de la fenêtre P1,
ainsi que de localiser les fenêtres d’analyse P3 et P4 (Figure 52-A) : ces fenêtres
correspondent à des populations présentes dans chaque échantillon d’amibes étudié. La
population P3 possède une taille assez faible et une granularité élevée et variable. La
population P4 possède une taille beaucoup plus importante et une granularité assez faible.
Les données trouvées dans la littérature concernant la taille des amibes du genre
Hartmannella (Smirnov and Michel, 1999), ainsi que les différentes observations
microscopiques qui ont pu être faites au cours de ce travail, suggèrent que la population
ayant la plus petite taille (P3) correspondait aux amibes sous forme kystes, et la population
de plus grande taille (P4) correspondait aux amibes sous forme trophozoïtes. D’une manière
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
136
générale, la suspension d’amibes libres est beaucoup plus hétérogène que celle des
levures : les points représentant les cellules enregistrées sont beaucoup plus éparpillés sur
le graphique (Figure 52-A). Les débris venant de la salive, visualisés dans la suspension de
levures (Figure 51-A), sont ici inclus dans la population de kystes (P3), ce qui entraîne un
premier biais dans les résultats. Malgré tout, l’analyse du graphique permet de dire qu’après
72 h d’incubation à 20°C, environ 42% des amibes sont enkystées, et environ 34% sont
sous forme trophozoïtes (Figure 52-A).
L’analyse de la fluorescence émise par l’IP (Figure 52-B) donne un résultat assez
inattendu : seulement 19% des amibes libres n’auraient pas intégré l’IP, ce qui signifie
qu’environ 81% des amibes auraient une membrane perméabilisée. Dans un article de 2010,
des suspensions d’Acanthamoeba ont été analysées par cytométrie en flux, et 25% des
cellules étaient IP+ après 72 h d’incubation dans du milieu PYG (Mogoa et al., 2010). Cette
différence peut s’expliquer par le fait que pour l’étude décrite dans cet article, les amibes ont
été incubées dans un milieu riche, donc plus propice à leur survie, expliquant un meilleur
taux de cellules non perméabilisées. H. vermiformis, en culture dans l’eau filtrée, n’est pas
dans un milieu optimal pour sa croissance et survit assez mal. Cependant, les résultats
décrits dans le chapitre précédent (voir Résultats et Discussion Chapitre 2 II.)
montraient que les amibes étaient capables de survivre pendant 360 h en présence de
salive. Les résultats obtenus ici par cytométrie en flux signifieraient que seules 19% des
amibes survivent après 72 h d’incubation (Figure 52-B). Toutefois, la population
majoritairement retrouvée en P7 (IP+) est la population P3 correspondant aux kystes, alors
qu’une grande partie des trophozoïtes (en violet) n’est pas marquée à l’IP. Cela pourrait
signifier que le marquage à l’IP n’est pas significatif des amibes perméabilisées, et
marquerait tous les kystes, viables ou non ; ce qui représenterait un autre biais dans les
résultats.
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
137
Figure 52 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de H. vermiformis après
72 h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de salive filtrée (v/v) à 20°C (n=1).
3) Analyse des cocultures
Enfin, les paramètres d’interprétation des résultats ayant été fixés, les cocultures ont
pu être analysées par cytométrie en flux (Figure 53). Ainsi, d’après les fenêtres P2, P3 et P4
déterminées à l’aide des témoins, après 72 h d’incubation des cocultures environ 22% des
amibes seraient sous forme trophozoïtes et 38% sous forme kystes ; 55% de la population
totale étant représentées par les levures (Figure 53-A).
Cependant, les fenêtres P2 et P4 se superposent (Figure 53-A) : les levures et les
trophozoïtes de H. vermiformis ont une morphologie assez proche, et les cellules ne peuvent
pas être correctement différenciées par cytométrie en flux. De plus, le marquage à l’IP
n’étant pas interprétable de façon satisfaisante, seule la fluorescence des levures a été
observée (Figure 53-B) : 80% des levures ne sont pas marquées à l’IP.
- Résultats et discussion – Chapitre 3 : Les cocultures amibes libres-levures -
138
Ces résultats confirment ceux obtenus précédemment par analyse de la viabilité en
coculture et dénombrement des UFC (voir Résultats et Discussion Chapitre 3
II.).
Figure 53 : Résultats de cytométrie en flux (A-B) d’une suspension de C. albicans et de H.
vermiformis en coculture, après 72 h d’incubation dans de l’eau filtrée avec 5% de salive
filtrée (v/v) à 20°C (n=1).
La cytométrie en flux permet d’obtenir des résultats reproductibles mais complexes à
analyser, surtout dans les conditions expérimentales de ce travail (présence de débris de
salive, cocultures de cellules à morphologie proche, fluorescence plus ou moins spécifique
de l’IP).
La méthode ainsi mise au point a montré trop de limites pour être utilisée pour l’analyse des
cocultures amibes-levures, et a donc abandonnée pour la suite des travaux au profit de la
microscopie et des techniques plus classiques de culture. Son utilisation aurait nécessité
des mises au point complémentaires sans toutefois garantir des résultats exploitables, étant
donné la complexité des populations analysées.
- Résultats et discussion – Chapitre 4 : Les traitements chimiques -
139
Chapitre 4 : Les traitements chimiques
Depuis quelques années, la désinfection des USD fait l’objet de nombreuses études,
et différentes méthodes ont été mises au point (O’Donnell et al., 2011) : la méthode la plus
simple et la moins onéreuse reste la purge des tubulures. Un simple rinçage des tuyaux
avec une eau distillée a été montré comme diminuant la charge microbienne de l’eau
circulant dans l’USD, mais seulement de façon transitoire, et surtout n’ayant aucun effet
satisfaisant sur le biofilm résident à l’intérieur du circuit d’eau de l’USD (Cobb et al., 2002).
De nombreux traitements chimiques, périodiques ou continu, ont été élaborés et proposés
par différents fournisseurs d’USD. Tous les produits et les protocoles proposés n’ont pas ou
peu été étudiés en termes d’efficacité. De même, peu de recherches ont été réalisées
concernant les problèmes de corrosion ainsi que les effets à long terme (tels que la
recolonisation par des micro-organismes) sur le circuit d’eau des USD. De plus, une grande
variabilité des résultats obtenus est observée selon la dose du produit utilisé, les micro-
organismes étudiés, le temps de traitement, ou encore la présence de biofilm et de matières
organiques qui peuvent dénaturer le produit et ainsi diminuer son efficacité (Fiehn and
Henriksen, 1988; Karpay et al., 1999).
Trois désinfectants, communément utilisés dans le traitement des réseaux d’eau et
retrouvés pour la désinfection des USD ont été choisis pour ce travail : le chlore, le H2O2 et
l’Oxygenal 6©. Ces trois produits ont déjà été étudiés pour le traitement des USD, mais dans
des conditions différentes de celles utilisées dans cette étude expérimentale (Szymanska,
2006a; Szymanska, 2006b; Zanetti et al., 2003). La survie après mise en présence avec ces
désinfectants a été étudiée pour trois espèces de Candida (C. albicans, C. glabrata et C.
parapsilosis) et pour l’amibe libre H. vermiformis en mono-culture ou coculture dans l’eau de
réseau filtrée additionnée de 2% de salive filtrée (v/v).
I. Survie des microorganismes en mono-culture – Article en cours de soumission (2012)
La survie des micro-organismes choisis a dans un premier temps été étudiée après 1,
24, 48, 72, 168 ou 360 h d’incubation à 20 ou 27°C dans de l’eau de réseau filtrée
additionnée de 2% de salive filtrée (v/v), et 15 min après la mise en présence avec
différentes doses des trois désinfectants choisis : 3 à 118 ppm pour le chlore, 0,07 à 0,9%
pour le H2O2 et 0,05 à 2% pour l’Oxygenal 6©. Les résultats obtenus ont fait l’objet de la
rédaction d’un article récemment soumis pour publication.
- Résultats et discussion – Chapitre 4 : Les traitements chimiques -
140
Les principaux résultats ont montré que les amibes libres résistaient assez bien aux
trois désinfectants, certainement grâce à leur capacité d’enkystement. En ce qui concerne
les levures, le chlore n’était efficace qu’avec de fortes doses (> 26 ppm). Dans les conditions
testées, le H2O2 ne présentait aucune action antifongique significative. Enfin, l’Oxygenal 6©
semblait être le plus efficace contre Candida spp. : dès 0,05% et quelle que soit la dose
utilisée, une forte diminution de la viabilité des levures a été observée. Seule l’espèce C.
parapsilosis, déjà notée dans les chapitres précédents comme étant plus résistante que les
deux autres espèces, était capable de mieux résister à la présence d’Oxygenal 6©.
- Résultats et discussion – Chapitre 4 : Les traitements chimiques -
141
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157
II. Survie des microorganismes en cocultures
Dans le chapitre précédent sur les cocultures amibes-levures, les résultats obtenus ont
permis de constater que C. albicans était capable d’interagir avec H. vermiformis : les
levures ont été retrouvées à l’intérieur du cytoplasme des amibes libres (voir Résultats
et Discussion Chapitre 3 II.). Le genre Hartmannella est connu comme ayant la
capacité d’héberger différents micro-organismes dans son cytoplasme (Greub and Raoult,
2004; Kuchta et al., 1993; Rohr et al., 1998), et surtout comme pouvant les protéger contre
diverses agressions extérieures telles que des traitements chimiques. Ainsi, dans une étude
de 2005, les auteurs ont montré que L. pneumophila était plus résistante au chlore dans un
milieu contenant des amibes libres : une réduction de 2,09 log bactéries/mL était observée
en absence d’amibes libres et de seulement 0,74 log bactéries/mL en présence de H.
vermiformis (Donlan et al., 2005).
Dans cette dernière partie du travail, l’activité antimicrobienne des trois désinfectants
sélectionnés (chlore, H2O2 et Oxygenal 6©), en utilisant les mêmes doses que
précédemment, a été testée sur C. albicans en coculture avec H. vermiformis, dans l’eau
filtrée et additionnée de 2% de salive filtrée (v/v), à 20°C. Il s’agit d’une étude préliminaire
qui nécessiterait d’être répétée afin de confirmer les hypothèses émises ci-après.
1) Viabilité des levures
La figure 54 illustre la survie des levures 15 min après traitement au chlore (Figure 54-
A), au peroxyde d’hydrogène (Figure 54-B) ou à l’Oxygenal 6© (Figure 54-C) ; les
graphiques montrent la concentration en levures cultivables sur géloses (en log UFC/mL) en
fonction du temps d’incubation avant le traitement chimique. En comparant ces résultats
avec ceux obtenus pour les levures en mono-culture (voir Résultats et Discussion
Chapitre 4 I.), des observations différentes peuvent être faites pour chacun des
traitements.
Des doses de 3 et 6 ppm de chlore n’ont pas ou peu d’effet sur C. albicans, une dose de 12
ppm a une activité variable au cours du temps et une efficacité moins forte pour des temps
d’incubation plus longs (Figure 54-A). Seules les concentrations ≥ 26 ppm ont une activité
antifongique quasi-totale quelque soit le temps préalable d’incubation des micro-organismes
dans l’eau : ces résultats sont similaires à ceux obtenus pour les levures en mono-culture.
Dans les conditions expérimentales, la présence des amibes libres n’a donc pas d’influence
sur la sensibilité de C. albicans vis-à-vis du chlore.
- Résultats et discussion – Chapitre 4 : Les traitements chimiques -
158
Figure 54 : Survie de C. albicans en coculture avec H. vermiformis, dans l’eau filtrée, à 20°C
et après 15 min de mise en présence de chlore (A), d’H2O2 (B) ou d’Oxygenal 6© (C) (n=1).
De même que pour le traitement au chlore, 15 min après la mise en présence avec
différentes doses de H2O2, les levures survivent assez bien, qu’elles aient été cultivées en
présence ou non d’amibes libres. La concentration en levures cultivables était de log 4
UFC/mL en mono-culture, alors qu’en coculture avec H. vermiformis, cette concentration est
d’environ log 3 UFC/mL, quelle que soit la dose de H2O2 utilisée et quel que soit le temps
d’incubation (Figure 54-B) ; cette sensibilité légèrement augmentée en présence d’amibes
libres reste à confirmer (n=1).
- Résultats et discussion – Chapitre 4 : Les traitements chimiques -
159
En revanche, des résultats bien différents ont été obtenus pour le traitement à l’Oxygenal 6©
en présence et en absence d’amibes libres. En mono-culture, C. albicans ne montrait qu’une
faible survie à partir de 48 h d’incubation et seulement pour l’utilisation de faibles doses de
désinfectant (≤ 0,1%) ; moins de 1 log UFC/mL ne survivaient 15 min après la mise en
présence avec des doses ≥ 0,2%. La présence d’amibes libres dans le milieu aiderait les
levures à résister à l’Oxygenal 6© : en effet, après seulement 24 h d’incubation avec H.
vermiformis, C. albicans est capable de résister aux plus fortes doses de désinfectant
testées dans ce travail (1% voire 2%) (Figure 54-C). De plus, cette résistance est visible
durant toute l’étude, même après 360 h d’incubation ; les levures sont capables de maintenir
leur concentration à environ log 3 UFC/mL (Figure 54-C).
2) Viabilité des amibes libres
La figure 55 montre la survie de H. vermiformis 15 min après traitement au chlore
(Figure 55-A), au peroxyde d’hydrogène (Figure 55-B) ou à l’Oxygenal 6© (Figure 55-C) ; les
graphiques présentent la concentration en amibes libres (en log amibes/mL) en fonction du
temps d’incubation avant le traitement chimique. En comparant ces résultats avec ceux
obtenus pour les amibes en conditions de mono-culture (voir Résultats et Discussion
Chapitre 4 I.), il semblerait que H. vermiformis résiste mieux aux désinfectants en
présence de levures.
D’une part, sur les trois graphiques le témoin (amibes seules, non traitées) a une
concentration constante (environ log 5 amibes/mL) au cours du temps (Figure 55). Les
doses de chlore < 12 ppm n’ont que peu d’effet sur les amibes, et seules les doses ≥ 62
ppm sont efficaces contre H. vermiformis après des temps d’incubation longs (168 et 360 h)
(Figure 55-A). En mono-culture, une faible concentration d’amibes survivantes était notée
tout au long de l’étude, quelle que soit la dose de chlore utilisée. En coculture, les amibes
libres survivent à plus forte concentration mais à des doses plus faibles de chlore ; la dose
de 118 ppm les éradiquent dès 24h d’incubation en coculture (Figure 55-A).
L’efficacité du peroxyde d’hydrogène a été modérée sur les amibes libres en mono-culture ;
une concentration d’environ 2 logs amibes/mL subsistant durant les 360 h de l’étude et ce
quelle que soit la dose de H2O2 utilisée. En coculture avec C. albicans, la concentration en
amibes est restée constante (entre log 5 et 6 amibes/mL) quels que soient la dose du
traitement et le temps d’incubation (Figure 55-B) ; la présence de levures semble permettre
à H. vermiformis de mieux résister à l’H2O2. Cependant, cette expérience n’ayant pu être
réalisée qu’une seule fois (n=1), cette hypothèse reste à confirmer.
- Résultats et discussion – Chapitre 4 : Les traitements chimiques -
160
Figure 55 : Survie de H. vermiformis en coculture avec C. albicans, dans l’eau filtrée, à 20°C
et après 15 min de mise en présence de chlore (A), d’H2O2 (B) ou d’Oxygenal 6© (C) (n=1).
De même que pour le chlore, seules les fortes doses d’Oxygenal 6© (1 et 2%) montrent un
effet sur la viabilité des amibes libres (Figure 55-C). La présence des levures favorise la
résistance des amibes ; H. vermiformis survit mieux, à plus forte concentration mais pour
des doses plus faibles en désinfectants.
161
Conclusion et
perspectives
- Conclusion et perspectives -
162
Durant ce travail de recherche, quatre axes principaux ont été abordés, en lien avec
les conditions de développement microbien retrouvées au sein des units de soins dentaires :
la composition de la salive, la survie des levures du genre Candida dans l’eau de réseau
filtrée, les interactions amibes libres-levures et l’activité antimicrobienne de traitements
chimiques contre ces micro-organismes.
Dans une première partie, nous avons pu amorcer une analyse qualitative des
molécules composant la salive. Les résultats ont montré que la salive ne contenait que peu
de glucides et, à l’inverse, de nombreuses protéines.
Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à l’influence de la présence
de salive sur la survie de différentes espèces de Candida et d’amibes libres dans l’eau.
D’une part nous avons pu constater que les levures survivaient difficilement dans l’eau de
réseau filtrée, mais que la présence de traces de salive (dés 2% v/v) permettait une
prolifération fongique potentiellement élevée. Un effet espèce-dépendant a également était
démontré ; C. parapsilosis est une espèce plus résistante que C. glabrata ou C. albicans.
D’autre part, nous avons confirmé que les amibes libres testées, Acanthamoeba castellanii
et Hartmannella vermiformis, étaient capables de survivre dans l’eau, et nous avons montré
que l’ajout de salive ne modifiait pas leur viabilité.
En se plaçant dans le contexte de la contamination des USD, les amibes libres et les
levures du genre Candida sont susceptibles de cohabiter dans l’eau de réseau circulant
dans les tubulures. Nous avons donc réalisé des cocultures entre amibes libres et levures,
afin d’observer d’éventuelles interactions entre ces espèces microbiennes. Ainsi, nous avons
montré que A. castellanii était capable d’inhiber la croissance de C. albicans, dés 24 h de
coculture, probablement en les digérant par phagocytose. En revanche, nous avons pu
mettre en évidence des interactions plus favorables entre H. vermiformis et les trois espèces
de Candida. Les résultats de dénombrement d’UFC sur géloses ont montré une prolifération
des levures augmentée en présence d’amibes libres, et les résultats de microscopie
électronique ont permis de visualiser une internalisation des levures par H. vermiformis.
Cette internalisation était parfois suivie d’une digestion des levures : certaines étaient
retrouvées fragmentées à l’intérieur de l’amibe. Mais la plupart des Candida apparaissaient
intactes à l’intérieur de vacuoles. De plus, nous avons testé l’effet d’un surnageant de
culture amibienne sur la survie des levures, et observé que la prolifération fongique était
augmentée aussi bien en présence d’amibes libres qu’en présence de leur surnageant de
culture ; H. vermiformis, par contact direct ou par sécrétion de métabolites serait donc
capable de favoriser la prolifération de Candida dans l’eau de réseau filtrée.
Enfin, dans une dernière partie, toujours en se plaçant dans des conditions proches de
celles retrouvées dans les USD, nous avons testé l’efficacité de trois traitements chimiques
- Conclusion et perspectives -
163
(le chlore, le H2O2 et l’Oxygenal 6©) sur les différentes espèces de Candida choisies pour ce
projet, et sur H. vermiformis. Les résultats ont montré des activités antimicrobiennes
différentes pour chaque produit utilisé : le chlore était très efficace contre les levures et les
amibes libres, mais seulement à fortes doses (> 26 ppm) ; le H2O2 ne montrait que peu
d’effet sur les micro-organismes dans nos conditions expérimentales ; et enfin l’Oxygenal 6©
s’est avéré être le plus efficace, avec une forte inhibition de la croissance des levures même
à faible dose (0,05%).
Ces résultats viennent compléter les connaissances déjà acquises en ce qui concerne
le risque infectieux lié à l’eau des USD et la décontamination du circuit d’eau : le reflux de
salive et de micro-organismes oraux peut engendrer le développement, à l’intérieur des
tubulures, de germes potentiellement pathogènes pour l’Homme. La salive, favorisant la
survie des levures du genre Candida dans l’eau, peut également permettre la prolifération
d’autres micro-organismes, en particulier d’origine orale, et le développement de biofilm
dans le réseau d’eau de l’USD. De plus, certaines amibes libres, comme H. vermiformis,
provenant du réseau d’eau, peuvent héberger certains micro-organismes, les aider à
survivre dans un milieu pauvre tel que l’eau de l’USD et même les protéger contre des
traitements physiques ou chimiques. Ces observations montrent l’importance de la
surveillance de la contamination de l’eau des USD et surtout l’utilisation de méthodes de
prévention efficaces contre ces contaminations. Enfin, les résultats obtenus pour l’activité
antimicrobienne de désinfectants chimiques contre Candida spp. et H. vermiformis
confirment la variabilité d’efficacité de tels traitements selon les conditions
environnementales (température, milieu, micro-organismes présents, développement de
biofilm), et soulignent la nécessité d’utiliser plusieurs méthodes combinées pour la
désinfection et l’entretien des USD ; un traitement chimique seul ne suffit pas, et doit être
complété d’un traitement physique tel que la purge des tubulures.
Certaines études présentées dans ce mémoire sont préliminaires et ne permettent de
ce fait qu’une analyse approchée. Des travaux complémentaires pourraient donc être
envisagés : portant d’une part sur les conditions expérimentales utilisées, toujours dans le
but de se rapprocher au mieux des conditions de l’USD, et d’autre part sur l’analyse de
l’activité antimicrobienne des désinfectants.
Dans ce travail, les micro-organismes ont été étudiés cultivés dans de l’eau de réseau
filtrée, il pourrait être intéressant de faire ces expériences dans de l’eau directement
prélevée d’USD. De même, les expériences pourraient être élargies à d’autres espèces de
Candida déjà isolées d’USD, ou encore d’autres espèces d’amibes libres du genre
Hartmannella. De plus, les cocultures amibes-levures n’ont été faites que pour C. albicans.
Or, C. glabrata et C. parapsilosis ont montré un comportement différent, notamment au
- Conclusion et perspectives -
164
niveau de leur consommation en nutriments ou encore de leur résistance aux traitements, et
pourraient réagir différemment en coculture avec H. vermiformis.
Ensuite, des analyses supplémentaires pourraient être envisagées pour continuer
l’identification des molécules de salive favorisant la survie des levures dans l’eau. Pour cela,
les résultats de GC-MS pourraient être exploités au niveau quantitatif : les aires des pics,
calculées par rapport à l’aire totale du chromatogramme, donneraient une proportion relative
(semi-quantitatif) pour les différentes molécules identifiées. Une autre possibilité serait de
réaliser des gammes d’étalonnage pour chaque molécule, mais la contrainte majeure pour
une telle analyse est de disposer d’étalons purs pour chacun des composés. Une analyse
des molécules de la salive, non pas fragmentées comme en GC-MS, mais entières en
chromatographie liquide, couplée à une spectrométrie de masse ou encore une analyse UV,
pourrait permettre d’identifier les composants de la salive. Les protéines pourraient être
séquencées, les glucides et les lipides dosés par méthodes colorimétriques par exemple. De
plus, la grande majorité des composants de la salive étant protéiques, des analyses plus
ciblées sur les protéines pourraient permettre d’identifier plus précisément quelle(s)
molécule(s) permet(tent) la survie des levures dans l’eau. Ainsi les protéines pourraient être
fractionnées par électrophorèse en deux ou trois dimensions, par exemple SDS-PAGE, et
les différentes fractions pourraient être testées indépendamment sur la survie des levures
(Cannon et al., 1995b).
Les expériences de survie des micro-organismes dans l’eau en mono-culture ou
coculture ont été faites en microplaques, directement sur le revêtement polystyrène des
puits. Les études étant conduites généralement pendant 360 h, les micro-organismes
n’étaient certainement pas homogènes, et se trouvaient probablement pour certains à l’état
planctonique et pour d’autres à l’état sessile ; dans le cas de ces durées prolongées, un
biofilm a donc pu initier son développement. Il serait de ce fait intéressant de comparer les
résultats obtenus dans les conditions « polystyrène » avec ceux obtenus en utilisant par
exemple des surfaces PVC (coupons), et de mieux analyser l’état et l’organisation des
micro-organismes dans ces conditions respectives. Ainsi, la survie dans l’eau, l’influence de
la salive et même l’efficacité des traitements pourraient être testés en condition plus proches
des USD.
Enfin, les expériences en microplaques (sur revêtement polystyrène ou sur coupons
PVC) représentent des conditions statiques ; contrairement aux conditions retrouvées dans
les USD, les micro-organismes sont cultivés dans une eau non renouvelée, et sans
agitation. Réaliser ces expériences avec un modèle dynamique, mimant le fonctionnement
de l’USD (circulation intermittente de l’eau, longues périodes de stagnation, …) permettrait
de mieux comprendre ce qui peut se passer à l’intérieur de l’USD. L’utilisation d’un CDC
réacteur correspondrait bien à un tel projet (Amoussou et al., 2005; Donlan et al., 2005;
- Conclusion et perspectives -
165
Donlan et al., 2004) : ce dispositif permet de suivre des micro-organismes cultivés dans un
milieu renouvelé, sous agitation, sur des coupons de PVC par exemple, et surtout, à l’aide
d’une pompe programmable, avec une circulation d’eau contrôlée ; un contrôle de la
température pourrait également être envisagé.
D’autre part, les travaux concernant l’efficacité des désinfectants doivent être
complétés. Les gammes de doses choisies pour les différents produits peuvent être élargies,
afin de trouver par exemple une dose efficace pour le H2O2. L’autre paramètre pouvant être
modifié est le temps de mise en présence : la viabilité pourrait être étudiée non pas 15 min
après l’ajout de désinfectant mais 30 min par exemple. De plus, afin de compléter les
données sur l’efficacité des désinfectants, un dosage résiduel des produits (ex : le chlore)
pourrait être réalisé à différents moments avant l’analyse de la viabilité des micro-
organismes. En effet, la présence de matière organique liée à la salive doit certainement
consommer le désinfectant et inhiber son activité antimicrobienne ; le dosage du résiduel
permettrait de connaitre plus précisément le temps de contact entre les micro-organismes et
le désinfectant. Comme précisé dans le paragraphe précédent, l’activité antimicrobienne
pourrait être comparée sur des micro-organismes planctoniques et sessiles, adhérés à des
surfaces PVC par exemple. En ce qui concerne l’Oxygenal 6©, étant très efficace contre les
levures du genre Candida, il serait intéressant de le tester contre d’autres micro-organismes
de la cavité orale, par exemple Streptococcus gordonii. L’efficacité des traitements pourrait
également être testée à plus long terme : la viabilité des micro-organismes pourrait être
vérifiée plusieurs jours après l’arrêt du traitement, afin de constater ou non une éventuelle
recolonisation.
D’autres méthodes d’analyse pourraient aussi être envisagées afin d’étudier l’efficacité
de désinfectants, non pas avec des techniques classiques de microbiologie, mais avec par
exemple de la cytométrie en flux. Un marquage à l’IP permettrait de suivre la viabilité des
cellules au cours de traitements (Mogoa et al., 2010). Il resterait à régler le problème de
différenciation entre levures et amibes libres rencontré lors de ce travail, dans le cas des
cocultures : un marqueur, spécifique d’une population (levures ou amibes), serait à utiliser.
La microscopie électronique pourrait également être utilisée afin de visualiser des éventuels
changements morphologiques engendrés par la présence de désinfectants (Mogoa et al.,
2010). Enfin, d’autres méthodes d’analyse de la viabilité des amibes libres pourraient être
testées : par exemple la technique Alamar Blue (McBride et al., 2005), qui permet une
différenciation des cellules mortes et vivantes par coloration des puits de culture.
Ces perspectives d’analyses permettraient de compléter ce travail réalisé dans le but
d’enrichir les connaissances sur le risque infectieux lié à l’eau des USD.
166
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RESUME
La contamination microbienne des units de soins dentaires (USD) est connue depuis les années 60. L’eau circule à l’intérieur des USD dans des conditions favorables au développement d’un biofilm (faible débit, nature des surfaces, stagnation). Ce biofilm, réservoir de micro-organismes potentiellement pathogènes, peut représenter un risque infectieux pour les patients et le personnel dentaire exposés à l’eau et aux aérosols générés lors des soins dentaires, en particulier s’ils sont immunodéprimés.
Des micro-organismes provenant de l’eau, tels que les amibes libres, peuvent être retrouvés dans ce biofilm. Des protozoaires ubiquitaires de l’environnement du genre Acanthamoeba ou Hartmannella, connus comme pathogènes opportunistes chez l’Homme (kératites, méningo-encéphalites) et ayant la capacité de servir d’hôte pour le développement intracellulaire de certains microorganismes pathogènes (ex : Legionella pneumophila), ont en effet été isolés dans l’eau des USD.
D’autre part, des micro-organismes provenant de la cavité buccale d’un patient peuvent également se retrouver dans le système d’eau des USD, en même temps que des traces de salive et/ou de sang, suite à un dysfonctionnement ou un mauvais entretien des valves anti-reflux des porte-instruments rotatifs. Les levures du genre Candida sont des commensaux du tube digestif humain, pathogènes opportunistes notamment responsables d’infections oro-pharyngées, et parfois retrouvées dans les USD.
Ce travail a consisté d’une part en l’étude de la capacité de deux amibes libres : A. castellanii et H. vermiformis, ainsi que de trois espèces de Candida : C. albicans, C. glabrata et C. parapsilosis, à survivre dans l’eau, en présence ou non de salive. Les résultats montrent une influence dose-dépendante et espèce-dépendante de la salive sur la survie des trois levures, et aucun effet sur la viabilité des amibes. Des interactions ont pu être mises en évidence entre amibes libres et levures : A. castellanii est capable d’internaliser puis de digérer les trois espèces de levures, induisant leur élimination rapide, indépendamment de la présence de salive. En revanche, H. vermiformis permet la survie et la prolifération de Candida spp. dans l’eau, même en l’absence de salive.
Enfin, dans une démarche de prévention et de lutte contre le risque infectieux lié à l’eau des USD, l’efficacité de différents traitements chimiques communément utilisés : le chlore (NaOCl), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et l’Oxygenal 6©, a été étudiée sur les différentes espèces de Candida et d’amibes libres. Ces traitements montrent une efficacité variable : le chlore requiert l’utilisation de concentrations élevées (>26 ppm) et peu compatibles avec l’usage courant des USD. Le H2O2 ne présente pas d’activité significative dans les conditions testées (de 0.07% à 0.9% v/v). En revanche, l’Oxygenal 6© apparaît le plus efficace pour l’éradication des levures du genre Candida et des amibes libres dans l’eau (dès 0.05%).
Mots-clés : risque infectieux – Candida – amibes libres – interactions microbiennes – salive – units de soins dentaires – eau