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Facultat de biociències
Departament de Biologia cel·∙lular, Fisiologia i Immunologia 2013
Influencia del eje interleucina-‐10/p38 MAPK en el epitelio intestinal sobre la respuesta al
tratamiento con glucocorticoides en la colitis ulcerosa.
Memoria de la Tesis Doctoral presentada para optar al grado de Doctor en Biología celular por la Universitat Autònoma de Barcelona
Doctorante. Violeta Loren Moreno Director: Dr. Josep Manyé Almero Tutora: Dra. Rosa Miró Ametller
El Dr. Josep Manyé Almero, coordinador de la Unitat CIBER-‐EHD de recerca sobre la malaltia inflamatòria intestinal de l’Institut d’Investigació “Germans Trias i Pujol” de Badalona; i la Dra. Rosa Miró Ametller, catedràtica del departament de Biologia Cel·∙lular, Fisiología i Immunologia de la Universitat Autònoma de Barcelona, certifiquen que la tesi titulada: Influencia del eje Interleucina-‐10/p38 MAPK en el epitelio intestinal sobre la respuesta al tratamiento con glucocorticoides en la colitis ulcerosa realitzada per la Doctorant Violeta Lorén Moreno, reuneix els requisists científics necessaris per ser defensada davant d’un tribunal per optar al grau de doctor en Biologia Cel·∙lular.
Violeta Lorén Moreno Doctorante
Dr. Josep Manyé Almero Director
Dra. Rosa Miró Ametller Tutora
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Índice de contenidos
I. Abreviaciones ............................................................................................... 5 II. Índice Figuras ............................................................................................... 9 III. Índice Tablas ............................................................................................. 11 1. Función barrera y homeostasis intestinal .................................................. 15 1.1 Fisiología del epitelio intestinal. .............................................................. 15 1.1.1. Células del epitelio intestinal. .............................................................. 16 1.2. Función barrera en el epitelio intestinal ................................................. 18 1.2.1. Secreción de substancias anti-‐microbianas ......................................... 18 1.2.2. Relación de vecindad de las células epiteliales .................................... 23 1.2.3. Mecanismos moleculares de regulación de Tight-‐junction ................. 26 1.3. Sistema inmune de la mucosa gastrointestinal ...................................... 27 1.4. Regulación de la actividad inmunológica en la mucosa intestinal .......... 30 2. Fisiopatología de la enfermedad inflamatoria intestinal y de sus complicaciones. ............................................................................................. 35 2.1. Enfermedad Inflamatoria Intestinal. ....................................................... 35 2.1.1. Descripción y definición. ...................................................................... 35 2.1.2. Etiopatogenia ....................................................................................... 37 2.1.3. Epidemiología. ..................................................................................... 46 2.1.4. Tratamiento. ........................................................................................ 48 2.1.5. Complicaciones evolutivas y terapéuticas. .......................................... 53 3. Bases patológicas de la respuesta inadecuada al tratamiento con glucocorticoides ............................................................................................. 57 3.1. Glucocorticoides: Definición y sus acciones ........................................... 57 3.2. Mecanismos de acción de los Glucocorticoides ..................................... 58 3.2.1. Mecanismos genómicos. ..................................................................... 59 3.2.2.Mecanismos no genómicos. ................................................................. 62 3.2.3. Bloqueo de la actividad NF-‐kB 1 por los Glucocorticoides .................. 63 3.3. Glucocorticoides en la enfermedad inflamatoria intestinal. .................. 65 3.3.1. Consecuencia de la respuesta inadecuada a los esteroides en enfermedad inflamatoria intestinal ............................................................... 66 3.4. Fisiopatología de la corticorresistencia .................................................. 67
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3.4.1. Mecanismos de corticorresistencia ..................................................... 68 4. Antecedentes e hipótesis .......................................................................... 75 5. Objetivos .................................................................................................... 77 6. Métodos ..................................................................................................... 81 6.1. Evaluación de la apoptosis inducida por dexametasona en células T aisladas de sangre de controles sanos ........................................................... 81 6.1.1. Muestras y procedencia ...................................................................... 81 6.1.2. Aislamiento de linfocitos T de sangre periférica .................................. 81 6.1.3. Diseño experimental ............................................................................ 82 6.1.4. Valoración del grado de apoptosis en linfocitos CD4+ y CD8+, mediante citometría de flujo ......................................................................... 84 6.2. Estudios in vitro sobre monocapas de células Caco-‐2 confluentes. ....... 87 6.2.1. Muestras y procedencia ...................................................................... 87 6.2.2. Cultivo celulares sobre transwells y estimulaciones ............................ 87 6.2.3. Diseño experimental ............................................................................ 89 6.2.4. Medida de la Resistencia Eléctrica Transepitelial ................................ 90 6.2.5. Cuantificación de IL-‐8 mediante ELISA ................................................. 92 6.2.6. Extracción proteica y determinación de proteínas mediante Western blot .................................................................................................. 92 6.2.7. Inmunofluorescencia en células Caco-‐2 .............................................. 95 6.2.8. Expresión de genes mediante PCR en tiempo real .............................. 96 6.2.9. Microscopia electrónica de transmisión ............................................ 101 6.3. Estudios con biopsias procedentes de pacientes con colitis ulcerosa activa e individuos sanos ............................................................................. 103 6.3.1. Procedencia de las biopsias ............................................................... 103 6.3.2. Inmunohistoquímica en muestras de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal e individuos sanos ................................................... 104 6.3.3. Inmunofluorescencia en biopsias de pacientes con colitis ulcerosa y controles ................................................................................................... 105 6.4. Estudio estadístico ................................................................................ 107 7. Material ................................................................................................... 109 7.1. Reactivos utilizados .............................................................................. 109 7.2. Soluciones y medios de cultivo utilizados ............................................ 112 8. Resultados ............................................................................................... 117
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8.1. La estimulación prolongada vía TCR de la población CD3+CD4+ disminuye la inducción de apoptosis por dexametasona en comparación a un estímulo breve ..................................................................................... 117 8.2. La cooperación entre la interleucina-‐10 y los glucocorticoides refuerza la unión intercelular del epitelio intestinal ................................... 118 8.3. La fosforilación de la p38 MAPK constituye un elemento clave en las acciones sinérgicas entre la IL-‐10 y los glucocorticoides ............................ 120 8.4. La inhibición de la fosforilación de la p38 MAPK revierte la colaboración entre la IL-‐10 y los esteroides ................................................ 122 8.5. Fosforilación de la p38 MAPK en la mucosa intestinal de pacientes con colitis ulcerosa activa ............................................................................ 124 8.6. La IL-‐10 facilita la nuclearización de la p38 MAPK fosforilada en presencia de TNF-‐α y GCs ............................................................................ 125 8.7. Rastreo de los mecanismos implicados en el eje IL-‐10/p38 MAPK ....... 129 8.8. Efecto de la inhibición de p38 MAPK sobre las adherens junctions y los desmosomas .......................................................................................... 131 8.9. Determinación de los cambios de expresión de los receptores α de IL-‐10 y Glucocorticoides en la mucosa de pacientes con colitis ulcerosa activa ........................................................................................................... 134 9. Discusión .................................................................................................. 139 10. Conclusiones .......................................................................................... 149 11. Anexos ................................................................................................... 153 12. Referencias bibliográficas ...................................................................... 165
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Abreviaciones
AJ Uniones adherentes (del inglés Adherens Junctions) AkT Del inglés Protein kinasa B AP-‐1 Del inglés Activator protein -‐1 APCs Células presentadoras de antígeno (del inglés antigen-‐presenting
cell) ATP Del inglés Adenosine triphosphate BSA Albúmina sérica bovina (del inglés Bovine serum albumin) CBP Del inglés CREB binding protein CCR Cáncer colorectal CCR6 Receptor de la quimioquina 6 CDAI Índice de actividad en la enfermedad de Crohn ( del inglés Crohn’s
Disease Activity Index cDNA DNA complementario COX-‐2 Cyclooxygenasa-‐2 DMSO Dimetilsulfóxido DOC Na-‐deoxycolato DSS Dextrán sulfato sódico (del inglés Dextran sodium sulfate) EII Enfermedad inflamatoria intestinal ERK Del inglés Extracellular-‐signal-‐regulated kinases ES Error estándard FBS Suero fetal bovino (del inglés fetal bovine serum) GCR Receptor de glucocorticoides GCs Glucocorticoides GREs Elementos de respuesta a glucocorticoides (del inglés
glucocorticoid response elements) GWAS Del inglés Genome-‐wide association studies HDAC2 Del inglés Histone deacetylase 2 HKG Gen de referencia (del inglés Housekeeping gene) Hsp Proteína de choque térmico (del inglés Hot shock protein) iCAM Del inglés intercellular Adhesion Molecule IELs Linfocitos intraepiteliales (del inglés intraepithelial lymphocyte) IFN-‐γ Interferón-‐ gamma (del inglés gamma-‐interferon)
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Ig Inmunoglobulina IIQ Intervalo intercuartil IkB Inhibidor del NF-‐kB (del inglés inhibitor of NF-‐kB) IL Interleucina iNOS Sintasa del oxido nítrico (del inglés Inducible Nitric oxide
synthase) JNK Quinasa c-‐Jun N-‐terminal (del inglés c-‐Jun N-‐terminal kinase) MAPK Quinasas Activadas por Mitógenos (del inglés Mitogen-‐activated
protein kinase) MDR-‐1 Gen de resistencia a multidrogas (del inglés Multidrug resistance
gene) MET Microscopia electrónica de transmisión MHC Complejo Mayor de histocompatibilidad (del inglés Major
histocompatibility complex) MIF Factor de migración de macrófagos (del inglés Macrophage
migration inhibitory factor) MKP-‐1 Inhibidor de la MAP quinasas (del inglés MAPK phosphatase-‐1) MLC Del inglés Myosin light chain MLCK Del inglés Myosin light chain kinase MM Del inglés Master mix NEAA Aminoácidos no esenciales (del inglés Non-‐essential amino acids) NF-‐kB Factor nuclear-‐ kB (del inglés Nuclear factor-‐kappa B) NK Células Natural Killer (del inglés Natural killer cells) NKT Células T Natural Killer (del inglés Natural killer T cells) NOD Del inglés Nucleotide-‐binding oligomerization domain n.s. No significativo OCTN Del inglés organic cation transporter PBMC Célula mononuclear de sangre periférica (del inglés Peripheral
blood mononuclear cells) Pgp-‐170 Glicoproteína p-‐170 (del inglés P-‐Glycoprotein) PI3K Fosfoinositol 3 quinasa (del inglés Phosphoinositide 3-‐kinase) PKC Proteína quinasa C (del inglés Protein kinase C) p-‐TEFb Del inglés Positive transcription elongation factor RNAm RNA mensajero
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RT-‐qPCR PCR a tiempo real STAT Del inglés Signal transducer and activator of transcription SWI/SNF Del inglés Switch/Sucrose non fermentable TCA Ác. Tricloroacético (del inglés trichloroacetic acid) TCR Receptor de células T (del inglés T cell receptor) TEER Resistencia eléctrica transepitelial (del inglés Trans-‐epithelial
electrical resistance ) TEERf Resistencia eléctrica transepitelial final TEERi Resistencia eléctrica transepitelial basal TGF-‐β Del inglés Transforming growth factor beta Th Del inglés T helper cells TJ Uniones estrechas (del inglés Tight Junctions) TLR Del inglés Toll-‐Like receptor TNF-‐α Del inglés Tumor necrosis factor-‐ alpha Treg Células T reguladoras ufc Unidades formadoras de colonias vCAM Del inglés Vascular Adhesion Molecule vs Versus ZO Zonula Ocludens
NOTA: en esta tesis ninguna abreviación se ha incluido en los títulos principales.
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Índice de figuras
Figura 1: Esquema de las capas del intestino. ............................................... 15 Figura 2: Esquema de las uniones intercelulares: uniones estrechas, uniones adherentes, desmosomas y uniones comunicantes. ....................... 23 Figura 3: Sistema GALT. ................................................................................. 28 Figura 4: Fenotipos de células Th CD4+. ........................................................ 31 Figura 5: Subtipos de células Treg. ................................................................ 33 Figura 6: Factores implicados en la aparición de la EII. ................................. 38 Figura 7: Posibles causas por lo que la microflora comensal desencadenaría la respuesta inflamatoria en los pacientes de EII. ............... 43 Figura 8: Teoría de la higiene. ....................................................................... 47 Figura 9: Mecanismos de acción genómicos de los GCs. ............................... 61 Figura 10: Sistema y principio de separación por selección negativa MACS para células T. ..................................................................................... 82 Figura 11: Esquema de estimulación y diseño experimental con células T estimuladas con CD3/CD28 y tratadas con o sin GCs y/o PD98059. ............. 84 Figura 12: Cuadrantes de identificación del grado de apoptosis mediante los marcadores Anexina V y 7-‐AAD por citometría de flujo. ......................... 85 Figura 13: Plots de citometria de flujo donde se valoran los marcadores fenotípicos de los linfocitos T, CD4 y CD8, además del grado de apoptosis mediante Anexina V-‐PE y 7-‐ADD. .................................................. 86 Figura 14: Detalle del sistema transwell usado para el cultivo de monocapas de células Caco-‐2. ....................................................................... 88 Figura 15: Diseño experimental de las estimulaciones con células Caco-‐2 ... 89 Figura 16: Detalle de la medida de TEER ....................................................... 91 Figura 17: Esquema del “sandwich” para la transferencia húmeda .............. 94 Figura 18: Imagen virtual de la electroforesis con chip de RNA .................... 98 Figura 19: Diseño experimental de recogida de biopsias en pacientes con EII y controles ........................................................................................ 104 Figura 20: Baremo de tinción nuclear para la p38 MAPK fosforilada .......... 105 Figura 21: Baremo de intensidad de marcaje para los receptores GCRα e IL10Rα en biopsias de pacientes con colitis activa ...................................... 106
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Figura 22: Variaciones en la apoptosis inducida por GCs en las células T sanguíneas en función del tiempo de estímulo. .......................................... 118 Figura 23: Incrementos de TEER en cultivos monocapas de células Caco-‐2 a las 48h de ser estimuladas o no con TNF-‐α ........................................... 119 Figura 24: Niveles de IL-‐8 en el sobrenadante basal a las 24h (A) y a las 48h (B) del cultivo celular. ........................................................................... 120 Figura 25: Representación de la búsqueda de mediadores moleculares implicados en la sinergia IL-‐10/GCs mediante western blot. ...................... 121 Figura 26: Influencia del bloqueo de la fosforilación de p38 MAPK sobre la TEER en monocapas de células Caco-‐2. 12¡Error! Marcador no definido. Figura 27: Efecto de la IL-‐10 y de la inhibición de p38 MAPK sobre la producción de IL-‐8 por parte de las células Caco-‐2 tratadas con TNFα y GCs. ............................................................... 1¡Error! Marcador no definido.3 Figura 28: Detección de p38 MAPK fosforilada en biopsias intestinales de pacientes con colitis ulcerosa activa ....................................................... 124 Figura 29: Disposición nuclear o periférica de de la p38 MAPK fosforilada en cultivos de células Caco-‐2 a 24h y 48h. .................................................. 126 Figura 30: Inmunotinción de p38 MAPK fosforilada en monocapas de células Caco-‐2 a 24h y 48h. .......................................................................... 127 Figura 31: Expresión de genes influenciados por la IL-‐10 vía fosforilación de la quinasa p38. ........................................................................................ 130 Figura 32: Resultados obtenidos mediante MET de las uniones paracelulares en las monocapas de células Caco-‐2. .................................... 131 Figura 33: Medias ± ES de las valoraciones de las tinciones por inmunofluorescencia para los GCRα e IL-‐10Rα, en muestras de mucosa cólica procedentes de pacientes con colitis ulcerosa activa, sensibles y refractarios al tratamiento con GCs. ........................................................... 134 Figura 34: Marcaje por inmunoflourescencia de GCRα e IL10Rα, en biopsias de pacientes con CU activa. ........................................................... 136 Figura 35: Detalle del patrón observado para la inmunoflourescencia de GCRα e IL10Rα, en pacientes con CU activa y sensibles al tratamiento con glucocorticoides. ................................................................................... 136
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Índice tablas
Tabla 1: Secuencias de los primers forward y reverse para la valoración por RT-‐PCR ................................................................................................... 100 Tabla 2: Composición y concentraciones de la MM para la RT-‐PCR ............ 100 Tabla 3: Condiciones de la PCR .................................................................... 100 Tabla 4: Medianas IIQ de edad, sexo, meses de diagnostico e índice de truelove-‐witts de los pacientes incluidos. .................................................... 103
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1. Función barrera y homeostasis intestinal
1.1.-‐ Fisiología del epitelio intestinal
La función principal del epitelio intestinal es la de abastecer de electrolitos, agua y nutrientes al cuerpo para su supervivencia. La mayor parte de esta función nutritiva, se lleva a cabo en el intestino delgado, el cual fisiológicamente está diseñado, mediante sus vellosidades y microvellosidades, para presentar una gran superficie de absorción. Así mismo, en el colon se absorbe la mayor cantidad de agua para la hidratación del cuerpo. A la vez, esta mucosa ejerce otras funciones donde se incluye la de barrera selectivamente permeable, tanto para nutrientes y fluidos, como de antígenos luminales (1) además de modular la respuesta inmunológica.
El epitelio está formado por diversos tipos celulares, cada uno con una función definida y distinta, que en cooperación con las demás capas del intestino (Figura 1), consigue llevar a cabo todas estas funciones.
FIGURA 1: Esquema de las capas del intestino. Fuente: www.saludalia.com/.../digestivo/gif/f158b2g.gif
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1.1.1.-‐ Células del epitelio intestinal
Los diferentes tipos celulares se distribuyen a lo largo de las vellosidades y criptas de Lieberkühn, entre los que se encuentran células progenitoras, enterocitos, células caliciformes, células de Paneth, células enteroendocrinas y células M. Las células migran por las vellosidades, siendo por lo general las de la parte basal las menos diferenciadas, mientras en la zona apical se da el fenómeno de anoikis, que es la muerte celular programada que se da en las células epiteliales del intestino. Este tipo de apoptosis supone un factor protector imprescindible para el mantenimiento de la homeostasis intestinal. Mediante el anoikis, el epitelio se desprende de células potencialmente patógenas por el acúmulo de actividad durante el ciclo (2).
• Células progenitoras
La renovación del conjunto celular se consigue gracias a la pluri-‐potencialidad de las células progenitoras. Se localizan en los laterales de la cripta y las células nuevas van diferenciándose y especializándose a medida que van migrando por la vellosidad, para adquirir las diferentes funciones de absorción y secreción.
• Enterocitos
Los enterocitos son el grupo celular mayoritario en el epitelio intestinal. Son células columnares polarizadas, con el borde apical en forma de organizadas microvellosidades, denominado “en cepillo”. Esta población celular está especializada en la absorción y transporte de iones, electrolitos y nutrientes. Pero también son capaces de secretar substancias antimicrobianas (3), presentar antígenos a través del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) I y II, reconocer bacterias y virus gracias a la expresión de receptores tipo Toll-‐like (TLR) y nucleotide oligomerization domain (NOD). Además producen citocinas y quimiocinas que influyen en la respuesta inmune subepitelial (4).
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• Células caliciformes
Se distribuyen a lo largo de toda la vellosidad, alternándose con el resto de las células epiteliales, tanto en el intestino delgado como en el grueso y el número aumenta en la parte distal del intestino. Estas células son las responsables de la secreción de las mucinas, componente del mucus intestinal. Las mucinas, se sintetizan en el retículo endoplasmático y en el aparato de Golgi, y son almacenadas en gránulos en el citoplasma de estas células. Su secreción viene estimulada por factores del ambiente, como infecciones bacterianas o como señales provenientes de la flora residente.
• Células de Paneth
Se localizan en la base de las criptas del intestino delgado y contienen gránulos citoplasmáticos, dónde se almacenan proteínas antimicrobianas, como defensinas, lisoenzima y fosfolipasa A2. La secreción de estos gránulos juega un importante papel en la respuesta inmune innata frente al contenido luminal, previniendo la proliferación de microorganismos. Las células de Paneth liberan los componentes de los gránulos citoplasmáticos, en respuesta de la exposición a bacterias o componentes bacterianos del lumen intestinal, probablemente a través de mecanismos relacionados con TLR y NOD (5).
• Células enteroendocrinas
Se encuentran a lo largo de todo del tracto gastrointestinal, situadas en las criptas de Lieberkühn. Su función principal es segregar hormonas y neuropéptidos, como la somastatina y la gastrina entre otros, al tejido conectivo en respuesta a cambios del medio externo.
• Células M
Son células epiteliales aplanadas, sin borde en cepillo y con la capa de glicocálix más fina. Se encuentran en la zona del epitelio que reviste el tejido linfoide de las placas de Peyer y que se denomina epitelio asociado al folículo de las mucosas. Están especializadas en la defensa del huésped frente al
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ambiente, por su capacidad de muestrear y presentar antígenos luminales a las células dendríticas del sistema inmune subepitelial. También ejercen un amplio abanico de funciones efectoras mediante la liberación de proteasas, histamina, heparina, mediadores lipídicos y citocinas pro-‐inflamatorias (6).
1.2.-‐ Función barrera en el epitelio intestinal
El tracto gastrointestinal contiene la mucosa de mayor superficie en el cuerpo humano, la cual se encuentra en continuo contacto con gran cantidad de antígenos procedentes tanto de la dieta, como de los microorganismos de la flora comensal. El hecho que la mucosa sea el lugar de contacto entre el medio externo y el tejido linfoide asociado a mucosa, hace necesario la existencia de mecanismos que impidan la penetración de substancias o moléculas nocivas del lumen hacia el interior de esta.
El concepto de barrera intestinal engloba factores tanto celulares como extracelulares, que en conjunto impiden la invasión de forma masiva de la mucosa por parte de antígenos nocivos, todo ello sin comprometer la absorción de nutrientes y fluidos vía paracelular como transcelular.
Dentro de los factores extracelulares que intervienen en la función barrera del intestino, encontramos el mucus intestinal, que crea una barrera que impide el contacto directo de las bacterias con el epitelio. Por otro lado, entre los factores celulares encontramos la monocapa de células epiteliales, incluyendo la membrana plasmática, el contenido intracelular y las uniones intercelulares (7, 8).
1.2.1.-‐ Secreción de substancias anti-‐microbianas
• Mucus intestinal: mucinas
A lo largo del tracto gastrointestinal se extiende una línea de mucus, con doble función: la primera como lubricante y la segunda, como la primera barrera física entre la mucosa intestinal y el contenido luminal. El mucus está
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formado principalmente por agua y glucoproteínas llamadas mucinas. Estas están formadas por oligosacáridos unidos a un núcleo proteico (9) y se han diferenciado dos tipos de mucinas, las ancladas en la membrana apical de células epiteliales y las secretadas, siendo estas últimas las que constituyen la película gelatinosa de la superficie de la mucosa.
El grado y patrón de glicosilación de las mucinas confiere al mucus la capacidad de ser resistente a la digestión de enzimas producidas por la flora residente, protegiendo así al epitelio de la degradación enzimática. También lo protege contra la adhesión de microorganismos luminales, mediante la inmovilización de estos en el interior de la película gelatinosa y por el recubrimiento de los sitios de unión bacterianos al epitelio por mucinas e Inmunoglobulina (Ig) A (10).
El papel de las mucinas en la protección del epitelio es importante, ya que cambios bioquímicos como en la longitud de las cadenas de oligosacáridos de las mucinas, se asocian a la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Estudios han demostrado que existe una disminución del grosor del mucus en pacientes con colitis ulcerosa, posiblemente asociado a una disminución en el número de células caliciformes (11, 12). En modelos experimentales la ausencia de la proteína principal en la composición del mucus, MUC2, se asocia al desarrollo de la colitis espontánea (13).
Embebidos en el mucus encontramos también Igs, defensinas, enzimas y unos pequeños péptidos llamados trefoils.
• Ig
Son proteínas anticuerpo muy específicas, producidas por células B de forma constitutiva en algunos casos y mayoritariamente en respuesta a antígenos. En su forma unida a membrana constituye el receptor de antígeno de la célula B. Existen varios isotipos: IgA, IgG, IgM, IgE e IgD.
La IgA es la clase predominante en las secreciones de las mucosas del organismo, como por ejemplo saliva, lágrimas, calostro y secreciones respiratorias, gastrointestinales y genitourinarias. En sangre se encuentra
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como una molécula monomérica y en forma dimérica en las mucosas. Su principal función es identificar antígenos e impedir que se adhieran a las mucosas, además de neutralizar toxinas y microorganismos infecciosos (14).
• Defensinas
Son pequeños péptidos de unos 29-‐45 aminoácidos, que realizan su función antimicrobiana mediante la creación de poros en la membrana celular de las bacterias, dando lugar a la lisis bacteriana. Se encuentran divididos en dos familias: α-‐ y β-‐defensinas. En humanos, existen 4 α-‐defensinas sintetizadas por neutrófilos y dos α-‐defensinas sintetizadas por las células de Paneth en el intestino delgado. Las β-‐defensinas en cambio, son sintetizadas por la mayoría de células epiteliales del intestino.
La función de la defensinas entéricas es mantener la esterilidad de las criptas, para ello cuentan con un amplio espectro antimicrobiano, siendo activas tanto frente a Gram positivas como frente a Gram negativas y también tienen la capacidad de lisar hongos y protozoos (15). La actividad de estas moléculas es inespecífica, es decir, no es necesario el reconocimiento entre receptor y diana. Algunas son producidas constitutivamente, mientras que otras son inducidas por citocinas pro-‐inflamatorias o productos bacterianos.
Además de la función antimicrobiana, las defensinas pueden actuar como señales las cuales inician, movilizan y amplifican la respuesta adaptativa. Esta acción se basa en la capacidad quimio-‐atrayente de células inmunes que poseen estas moléculas (16-‐18).
Dada su implicación en la homeostasis intestinal, una disminución de los niveles de α-‐defensinas se han relacionado con la predisposición a padecer enfermedad de Crohn ileal (19). Esta reducción se ha asociado con mutaciones en el gen NOD2 (20) o con una defectuosa activación de la vía de señalización Wtn/Tcf-‐4 (21,22). Pero existen otros estudios donde esta reducción se relaciona con una pérdida de células epiteliales debido a la inflamación (22).
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• El sistema del complemento
El sistema del complemento lo comprenden un conjunto de más 30 proteínas muy conservadas evolutivamente. A través de la interacción entre ellas y otras moléculas, se desencadenan cascadas proteolíticas que culminan en:
a) la eliminación de microorganismos, ayudando así al control de la infección. El complemento lisa a los organismos a través de la inserción de los complejos MAC (conjunto de proteínas del complemento) en la membrana celular, lo que facilita la eliminación de estos por opsonización y por reclutamiento de fagocitos (23).
b) la eliminación de células apoptóticas e inmunocomplejos (complejo antígeno-‐anticuerpo) para reducir la respuesta inflamatoria (24).
c) el desarrollo de respuestas inmunes adaptativas. Las proteínas del complemento interaccionan con receptores de células dendríticas, linfocitos B y T, regulando así la respuesta frente a antígenos, promoviendo la formación de anticuerpos y manteniendo la memoria inmunológica (24).
Se activa mediante tres vías diferentes : a) la vía clásica, dónde las proteínas del complemento reconocen las Igs unidas a su antígeno; b) la vía de la lectina, homóloga a la clásica pero independiente de Igs. La activación se hará a través de la unión de lectinas o proteínas llamadas ficolinas, con los azúcares y polisacáridos de la superficie bacteriana; y c) la vía alternativa, la cual se iniciará por el bajo nivel de hidrólisis del factor C3 del complemento. Las tres vías convergen en un punto en común, a partir del cual dará lugar a: i) la lisis celular por el complejo MAC, ii) creación de mediadores proinflamatorios llamados anafilotoxinas, que alertarán e iniciaran respuestas inmunológicas y por último iii) recubrimiento y eliminación de superficies marcadas por proteínas del complemento, llamadas opsoninas (25).
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• Lisoenzima
Proteína antimicrobiana presente en lágrimas, leche materna, saliva y secreciones gástricas. En el tracto gastrointestinal la secretan diferentes células: glándulas gástricas y pilóricas, glándulas de Brunner, células de Paneth, macrófagos y granulocitos (5). Es especialmente activa frente a bacterias Gram positivas, ya que su mecanismo de acción se basa en la rotura de los enlaces glucosídicos (los cuales estabilizan el peptidoglicano presentes en la pared bacteriana) resultando en la lisis celular.
• Fosfolipasa A2
Componente de los gránulos de las células de Paneth. Son proteínas de fase aguda, que actúan como mediadores inflamatorios. A través de su actividad enzimática hidroliza los enlaces éster de los fosfolípidos de las membranas celulares, liberando el ácido araquidónico, para la síntesis de prostaglandinas. Otra función que se les atribuye es la de agente anti-‐bacteriano mediante la hidrolisis de la membrana bacteriana, sobretodo de Gran positivas (26).
• Trefoils
Son pequeños péptidos ricos en cisteínas, que están altamente expresados en tejidos que presentan células productoras de mucus. Hasta la fecha se han descubierto tres factores de esta familia (Trefoil 1-‐3). Estos péptidos, los encontramos en la mucosa intestinal colocalizando con algunas mucinas. En estudios donde se usan diferentes modelos experimentales de EII, se ha observado un incremento de la expresión de estos factores después de la inducción y fase aguda de la enfermedad. Este hecho ha asociado estos péptidos a roles de protección y reparación del tejido intestinal, como función más relevante (27). También pueden jugar un papel como supresores tumorales como demuestran estudios genéticos (28) y se ha observado que pueden estar involucrados en la respuesta inmune, disminuyendo mediadores pro-‐inflamatorios como la sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) (29).
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1.2.2.-‐ Relación de vecindad de las células epiteliales
Las células del epitelio intestinal se relacionan estrechamente con sus adyacentes, mediante tres tipos uniones con diferente función cada una. Se distinguen uniones de oclusión donde encontramos las uniones estrechas, uniones de anclaje que pertenecen a este subgrupo las uniones de adhesión y desmosomas y uniones con función de comunicación que corresponden a las uniones comunicantes (Figura 2).
ZO-‐1
ZO-‐2/3
Ocludina/ClaudinaCingulina
Filamentos Actina-‐miosina
JAM-‐A
Desmocolina/Desmogleina Placoglobina/placofilina
Desmoplaquina
Filamentos Intermedios de queratina
E-‐Cadherina/Nectina βCatenina/AfadinaαCatenina
Uniones comunicantes
Uniones estrechas
Desmosomas
Uniones adherentes
FIGURA 2: Esquema de las uniones intercelulares: uniones estrechas, uniones adherentes, desmosomas y uniones comunicantes.
• Uniones estrechas o Tight Junctions (TJ)
La monocapa epitelial del intestino desempeña una función de barrera, tanto regulando el paso de substancias y fluidos hacia el interior del epitelio, como impidiendo la interacción entre patógenos y el sistema inmune de la mucosa. Implicadas en esta función se encuentran las TJ, que separan el medio externo del interno y actúan como barrera selectiva tanto de nutrientes y fluidos, como de microorganismos. Estas uniones las constituyen un
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conjunto de proteínas de membrana y citoplasmáticas (figura 2), localizadas en la parte latero-‐apical de la membrana de los enterocitos (30).
-‐Proteínas de membrana: en este subgrupo encontramos proteínas de la familia de las Claudinas, Ocludinas y la molécula de adhesión JAM-‐A, las cuales se encuentran unidas a proteínas citoplasmáticas. Este conjunto de proteínas, llevan a cabo la unión mecánica entre las membranas plasmáticas de dos células adyacentes. Concretamente la función de las claudinas es formar poros que determinan, mediante carga iónica, el paso paracelular de substancias (31-‐33).
-‐Proteínas citoplasmáticas: pertenecen a este subgrupo las proteínas de la familia de Zonula ocludens (ZO) y la cingulina. Estas establecen la unión entre las proteínas de membrana y los microfilamentos de actina y miosina del citoesqueleto de la célula.
• Uniones adherentes o Adherens Junctions (AJ)
La principal función de estas uniones es la de anclar una célula con la adyacente. Se sitúan por debajo de las TJ y se distribuyen uniformemente a lo largo de la membrana plasmática rodeando la célula en forma de cinturón. Las componen unas proteínas de membrana, que a través de moléculas adaptadoras citoplasmáticas, se anclan a los microfilamentos de actina del citoesqueleto. Junto con las TJ forman un complejo apical de uniones, que regulan la función barrera del epitelio. También son esenciales para una correcta polarización, diferenciación y proliferación celular (34).
-‐Proteínas de membrana: Lo constituyen proteínas de la familia de las cadherinas y por miembros de la familia de las nectinas. Las cadherinas se unen con sus homologas de la célula adyacente, anclando así una célula con otra. Mientras que las nectinas ejercen además, funciones de reclutamiento y agrupación de las cadherinas en las uniones nacientes.
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-‐Proteínas adaptadoras: son las responsables de unir las proteínas de membrana a los microfilamentos de actina. Dentro de este grupo las proteínas más representativas que podemos encontrar, son las de la familia de las cateninas.
• Desmosomas
Son las uniones más basales que encontramos, y tienen también función de adhesión de una célula con su adyacente. Este tipo de uniones son cruciales en tejidos sometidos a estrés mecánico, como la mucosa gastrointestinal entre otros. El conjunto de proteínas que forman estas uniones se dividen en tres regiones morfológicas:
-‐Región extracelular: En esta región encontramos glicoproteínas de la familia de las cadherinas, llamadas desmogleinas y desmocolinas.
-‐Placa densa externa: Se encuentra en el interior del citoplasma y la componen las colas de las glicoproteínas de la región extracelular unidas a proteínas de unión como, desmoplaquina, placoglobina o placofilina.
-‐Placa densa interna: Es la región donde se acomplejan las proteínas de unión con los filamentos de intermedios de queratina, formando el complejo de redes para la adhesión y distribución de las fuerzas mecánicas.
• Uniones comunicantes o Gap Junctions
Son dominios en la membrana plasmática lateral de la célula, compuestos por canales de comunicación que conectan el citoplasma de dos células adyacentes. Estos permiten un intercambio rápido de iones y pequeñas moléculas <1KDa, entre ellos mensajeros secundarios como el Ca++, AMP cíclico y el Inositol-‐3 fosfato (PI3). Este paso de moléculas genera una comunicación intercelular, necesaria para la proliferación, migración y diferenciación celular, y es un mecanismo esencial para el mantenimiento de la homeostasis tanto celular como del tejido (35).
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Los canales los forman hexámeros de unas proteínas llamadas conexinas. Aproximadamente unos 20 isoformas de conexinas han sido identificadas, que dotarán a los canales de una estructura especifica para una selección del paso de moléculas mediante carga y tamaño. La más abundante es la conexina 43 y es clave en la regulación de la comunicación a través de estos canales.
1.2.3.-‐ Mecanismos moleculares de regulación de las uniones paracelulares en el epitelio intestinal
Este tipo de uniones no son sistemas estáticos, sino que tienen la habilidad de alterar la permeabilidad intestinal en respuesta de los estímulos procedentes tanto del lumen como de la mucosa intestinal. Muchas de las vías de regulación de las TJ convergen en la fosforilación de la proteína myosin light chain (MLC) del anillo de actina-‐miosina. Citocinas como TNF-‐α y INF-‐γ dan lugar a un aumento de la quinasa MLC (MLCK) que fosforilará la MLC, dando lugar a la condensación de los microfilamentos de actina-‐miosina y reorganización de la ocludina, claudina o JAM-‐A, con la consecuente apertura de las uniones (36, 37). A su vez, la interleucina (IL) -‐1β mediará la fosforilación de MLC y disrupción de las TJ, a través de la vía de activación clásica del factor nuclear (NF) -‐kB, por la quinasa MEKK-‐1 (38).
En condiciones inflamatorias, la internalización por fenómenos de endocitosis de la ocludina altera la estructura y función de las TJ (39), aunque este proceso está implicado también en la regulación y renovación de estas proteínas (30).
Parece ser que el receptor TLR-‐2 está implicado en la regulación de la función barrera del intestino, mediante la vía Akt /PI3K. En un modelo in vivo con dextrán sulfato sódico (DSS), la estimulación del TLR-‐2 por ligando específico conllevará la preservación de la proteína ZO-‐1 y como consecuencia, de la función barrera intestinal (40).
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Otro de los mecanismos por los cuales pueden ser reguladas las TJ y AJ, es mediante fosforilación de las proteínas que las componen. La fosforilación de la ocludina mediada por la proteina quinasa C (PKC)-‐η determina la correcta localización y ensamblaje con la ZO-‐1, manteniendo así la función barrera paracelular (41). De igual forma, la fosforilación de claudinas por parte de PKC, mitogen-‐activated protein kinases (MAPKs) o Rho guanosina trifosfatasas, determinará la localización y función de estas proteínas (42). En relación a la modulación de las AJ, se ha observado que la activación de la quinasa Src induce la fosforilación y ubiquitación de la E-‐Cadherina (cadherina epitelial), produciendo la endocitosis de esta (43).
El cambio en la expresión de ciertas proteínas de las TJ, pueden afectar a la función barrera. Las citocinas IL-‐13 y IL-‐17, aumentadas en pacientes con EII, se han asociado a un aumento en la permeabilidad intestinal por el aumento en la expresión de la claudina-‐2 a través de la vía MAPK/Extracellular-‐signal-‐regulated kinase (ERK) (44, 45).
En la enfermedad de Crohn activa se ha observado un aumento de la proteína de las TJ claudina 2 y a la vez un descenso y redistribución de las claudinas 5 y 8 (99). La alteración de estas uniones se relaciona con el aumento de permeabilidad intestinal.
1.3.-‐ Sistema inmune de la mucosa gastrointestinal
Las mucosas ejercen de interfase entre el medio externo y el huésped, protegiéndolo de posibles invasiones por microorganismos patógenos. El sistema inmunológico de la mucosa del tracto gastrointestinal se denomina GALT (Figura 3). La respuesta inmunológica se lleva a cabo en dos compartimentos diferenciados funcionalmente que son los siguientes:
A) Compartimento Inductor: zona donde los antígenos luminales muestreados son expuestos a linfocitos T y B para su activación. En este subgrupo se encuentran las placas de Peyer, nódulos linfáticos mesentéricos y los folículos linfoides aislados.
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B) Compartimento efector: lugar donde se lleva a cabo la respuesta inmune por parte de las células efectoras. Dentro de este compartimento englobamos la lamina propria y el epitelio.
FIGURA 3: Sistema GALT. Fuente: Porporatto C.y cols. 2007 (46).
Las placas de Peyer son acumulaciones linfoides, que se dan con mayor frecuencia en el íleon distal y el colon, donde la flora es mayor. Están compuestos por folículos de células B y regiones interfoliculares de linfocitos T. También encontramos en estos agregados células dendríticas y macrófagos. El epitelio asociado a folículo se encuentra por encima de las placas de Peyer y es dónde se ubican las células M, involucradas en la función de transporte de antígenos luminales. Las células dendríticas de esta región, a través del MHC, presentan el antígeno a linfocitos T inmaduros tanto en las mismas placas de Peyer, como en los nódulos linfáticos mesentéricos, para luego desencadenar la respuesta inmune adaptativa pertinente.
Con respecto a la naturaleza de la respuesta inmune desencadenada a través de las señales de las células dendríticas, parece ser importante la localización anatómica de estas. En relación a esto, se ha observado que la presentación de antígeno en los nódulos linfáticos por parte de células dendríticas, es esencial para la tolerancia inmune. Esta presentación dirige los linfocitos T
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hacia el fenotipo regulador Foxp3+. Las células involucradas en esta acción,
son las dendríticas presentes en la lamina propria, con fenotipo CD103+ (47). También la vía de entrada de antígeno, ya sea a través de las células M o directamente a lamina propria, puede influenciar en favorecer una respuesta tolerogénica o bien una inflamatoria (48).
Las placas de Peyer representan también la mayor fuente de células B productoras de IgA, el desarrollo de las cuales está bajo influencia de señales provenientes de células dendríticas, de linfocitos T y por la producción local de citocinas como IL-‐10 y transforming growth facor (TGF) β (49). Estas células migraran posteriormente hacia la lamina propria en respuesta a quimiocinas como la CCL25 o CCL28, expresada por las células epiteliales del intestino delgado o colon respectivamente y una vez allí, madurarán convirtiéndose en células plasmáticas (50).
La lamina propria es tejido conectivo que se encuentra debajo de la capa epitelial en el tracto gastrointestinal. Lo atraviesan vasos sanguíneos y conductos linfoides, y es donde se encuentran gran cantidad de células de la inmunidad innata y adaptativa.
Los linfocitos T de la lamina propria son tanto CD4+ como CD8+. Producen
citocinas como interferón (IFN)-‐γ, IL-‐4 e IL-‐10, además de influir en la producción y secreción de IgA por parte de las células plasmáticas, por lo que representa un grupo heterogéneo de células efectoras y reguladoras (49).
Las células dendríticas de la lamina propria poseen una característica especial que les permite extender sus dendritas entre las células epiteliales sin comprometer la función barrera de la monocapa y muestrear e introducir antígenos luminales para presentarlos a células efectoras (51). La extensión de las dendritas está relacionada con la expresión del receptor CX3CR1, que reconoce la quimiocina CX3CL1 (52).
Otras células que se encuentran en la lamina propria son los mastocitos y eosinófilos. Aunque son más relevantes en la repuesta a infecciones, pueden participar en la respuesta inmune en el caso de que algún microorganismo
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cruce la barrera epitelial. Los mastocitos pueden interaccionar con el sistema nervioso entérico y modular así las respuesta inmune (49).
Las células T natural killer (NKT), combinan la capacidad citotóxica de células de la inmunidad innata, como las natural killer (NK), y características de linfocitos T, presentando receptores de ambos grupos. Una vez activadas, las NKT pueden regular varios tipos celulares como neutrófilos, NK o células B y dirigir hacia T helper (Th)1 o Th2 la respuesta linfocitaria, a través de uniones célula-‐célula y secreción de citocinas y quimiocinas. Dada la rápida involucración de sus funciones efectoras en la respuesta inmune, se consideran unas células cruciales tanto en la homeostasis como en la respuesta hacia patógenos y tumores (53).
El subconjunto de linfocitos que reside en el epitelio (IELs) es de fenotipo predominante CD3+CD8+. Estas células T se localizan en la parte basal de la monocapa, entre células adyacentes y su migración hacia este lugar viene dada por la interacción de las moléculas CCR9/CCL25 y CD103/E-‐cadherina (54). El desarrollo de los IELs es independiente de presentación de antígeno por parte del MCH y presentan el receptor de células T (TCR) γδ. Se ha sugerido que unos de los roles de estos linfocitos, es la de mantener la homeostasis del epitelio intestinal (55) y se les ha relacionado con respuestas protectoras frente a patógenos y en la vigilancia de procesos cancerosos (54).
1.4.-‐ Regulación de la actividad inmunológica en la mucosa intestinal
El reconocimiento de un patógeno por las células dendríticas o epiteliales, desencadenará todo un sistema de señalización intracelular activando células de la respuesta inmune innata (macrófagos y neutrófilos) que representará una lucha inmediata contra el agente invasor. Acto seguido, las células presentadoras de antígeno (APCs), sobretodo células dendríticas, captarán y procesarán los microorganismos patógenos y mediante los receptores MHC los presentarán a las células T y B inmaduras en los órganos linfoides secundarios, activando así la respuesta inmune adaptativa. Esta presentación antigénica promueve la diferenciación de las células T
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inmaduras hacia un fenotipo inflamatorio o hacia un fenotipo regulador, dependiendo de las citocinas secretadas por las APCs. Una vez activadas, estas células T presentan moléculas enterotrópicas (por ejemplo: la integrina α4β7 o CCR9) que harán que se dirigirán a la lamina propria intestinal para llevar a cabo sus funciones.
Los linfocitos Th, mayoritariamente CD4+, se caracterizan por secretar citocinas importantes en la lucha contra patógeno y la excesiva entrada de antígenos luminales a la lamina propria. Existen diferentes fenotipos Th (Figura 4), que se diferencian por el patrón de citocinas secretadas. Las células Th1 se diferencian en un ambiente donde predomina la IL-‐12. La activación del factor de transcripción T-‐bet producirá la secreción de IL-‐2, IFN-‐γ, IL-‐12 y factor de necrosis tumoral (TNF)-‐α. La IL-‐12 puede amplificar la respuesta Th1 mediante el aumento de IL-‐18 en las células T, que a su vez activará NF-‐kB y AP-‐1, que activarán la expresión de IFN-‐γ. Por otro lado, las células Th2 secretarán IL-‐4, IL-‐5, IL-‐10 e IL-‐13 por la acción del factor de transcripción GATA-‐3, mediada por la IL-‐4. Ambos fenotipos se regulan entre ellos, ya que el IFN-‐γ secretado por las Th1 inhibe la proliferación de las células Th2, y éstas a su vez secretan IL-‐10 que inhibirá la producción Th1 de IL-‐2 e IFN-‐γ.
Célula T CD4+
inmadura
Th1
Th2
Th17
IL-‐4GATA-‐3
IL-‐17A/FIL-‐21IL-‐22
IL-‐23R
IL-‐23
IL-‐4IL-‐5IL-‐10IL-‐13
IFN-‐γIL-‐2IL-‐12TNF-‐α
IL-‐10INF-‐γ
FIGURA 4: Fenotipos de células Th CD4+.
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Existe un subtipo de linfocitos T CD4+ que expresa el factor de transcripción RORγt que promueve la secreción de IL-‐17, llamadas células Th17. In vitro, la presencia de TGF-‐β, IL-‐6 e IL-‐1β, induciría la expresión de RORγt y a su vez la expresión de IL-‐17A, IL-‐17F e IL-‐21. Esta última induciría la expresión del receptor de IL-‐23 en este subtipo celular, que la presencia de IL-‐23 daría una expansión celular Th17. Bajo condiciones no inflamatorias existe una población, aunque escasa, de este tipo celular en la lamina propria del intestino, que su fenotipo puede estar mediado por las citocinas presentes en el ambiente intestinal. In vitro se ha demostrado que la presencia de TGF-‐β1 favorecería un fenotipo Th17 menos patogénico (56) y con mayor capacidad de producir IL-‐10.
El mantenimiento de la homeostasis es fundamental en la mucosa intestinal, donde una pérdida de la capacidad de mantener esta tolerancia inmunológica frente a antígenos intestinales innocuos, produciría una brecha en la función barrera del epitelio, desencadenando así una inflamación local con efectos deletéreos. Por esta razón, en este lugar existen una gran variedad de subtipos de células T con funciones reguladoras (Treg) (Figura 5) que juegan un papel fundamental en el control de la respuesta inflamatoria.
Las células reguladoras de fenotipo CD4+ se pueden dividir en dos subtipos según en su ontogenia: las que se originan en el timo (nTreg) desde los primeros días de vida y se caracterizan por la expresión de CD25 y el factor de transcripción Foxp3, y las que se originan en la periferia bajo la presencia de diferentes condiciones. Estas últimas se pueden subdividir en iTreg, Th3 y Tr1. Las células iTreg, también CD25+, expresan el factor de transcripción clave para el patrón regulador Foxp3, bajo la presencia de TGF-‐β e IL-‐2 (57). Las llamadas Th3, son un subtipo de células T reguladoras (CD25+ Foxp3+) que produce TGF-‐β y por ello, se ha sugerido que podrían ser las responsables del mantenimiento de las nTreg y de la inducción local de las iTreg (58). Por último, el subtipo regulador Tr1 requiere de la IL-‐10 para su diferenciación y función. Se caracterizan por ser negativas para el marcador CD25 y para el factor de transcripción Foxp3 y por secretar el patrón de citocinas IL-‐5, IL-‐10 y TGF-‐β (59).
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Además de estos subgrupos reguladores, existen unos menos convencionales como IELs CD8+ TCRαα o TCRγδ, linfocitos T CD8+ de lamina propria, y NKT (60).
Estudios recientes han propuesto que las células Treg Foxp3+ poseen cierta plasticidad o capacidad adaptativa, hecho que hace que bajo estímulos inflamatorios (TGF-‐β e IL-‐6 o IL-‐17) se diferencien en fenotipos efectores Th1 o Th17. El mayor grado de conversión de este subtipo celular se ha observado en el intestino, debido a que es un lugar donde se secretan grandes cantidades de estas citocinas y por el constante contacto con microorganismos (61).
TGF-‐β
IL-‐5IL-‐10TGF-‐β
CD4+CD25+Foxp3+
nTreg
CD4+CD25+Foxp3+
iTreg
CD4+CD25+Foxp3+
Th3
CD4+CD10+Tr1
Célula T CD4+
inmadura
Timo CD4+CD25+Foxp3+
nTreg
Célula T CD4+
inmadura
TGF-‐β
Periferia
FIGURA 5: Subtipos de células Treg.
Tal y como se ha ido vislumbrando, en el mantenimiento de la homeostasis intestinal juegan un papel crucial algunas citocinas. El TGF-‐β a parte de relacionarse con la inducción del fenotipo regulador en los linfocitos T, se ha asociado con la producción de IgA por parte de las células B limitando la penetración de bacterias comensales en el epitelio y la consecuentemente activación de respuestas inflamatorias. Por otro lado, la IL-‐10 juega un papel importante en la reducción del estrés del retículo endoplasmático en células
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epiteliales del intestino, mecanismo que se ha visto alterado en la EII (62). Por lo contrario, citocinas pro-‐inflamatorias como TNF-‐α e IL-‐6, se han asociado a la exacerbación de la respuesta inflamatoria, debido al éxito del tratamiento con anticuerpos anti-‐TNF-‐α en la EII (63,64) y en el caso de la IL-‐6, su bloqueo mejora la colitis en modelos animales (63). También la IL-‐23 se ha identificado como una citocina relevante en patologías intestinales crónicas como la EII. Asimismo estudios genéticos han asociado polimorfismos en el receptor de la IL-‐23 con una menor predisposición a padecer EII (65).
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2. Fisiopatología de la enfermedad inflamatoria intestinal y de sus complicaciones
2.1.-‐ Enfermedad inflamatoria intestinal
2.1.1.-‐ Descripción y definición
Bajo el término de EII, se engloban un conjunto de entidades patológicas que cursan con la inflamación del tubo digestivo. Su etiología es desconocida actualmente, aunque se le asocian factores ambientales y/o genéticos capaces de alterar la homeostasis como causa principal de su etiopatogénesis. Es de carácter crónico, alternando periodos de actividad denominados brotes o recidivas, con periodos de quiescencia o inactividad llamados fases de remisión.
La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, son las dos principales variantes de esta enfermedad. Aunque ambas afectan al tubo digestivo, y presentan otras características comunes, se trata de entidades fisiológica y patológicamente distintas.
La enfermedad de Crohn generalmente se da en el íleon y colon, aunque puede afectar de forma discontinua a cualquier parte del tubo digestivo, desde boca hasta el recto. La inflamación es con frecuencia transmural, es decir que afecta a todas las capas de la pared del tubo digestivo, de mucosa a serosa y asimétrica a lo largo de la circunferencia del tubo. Además, puede presentar un fenómeno denominado “envoltura grasa”, en el que la grasa mesentérica rodeará parcialmente el intestino. La afectación transmural puede ir asociada la aparición de complicaciones como estenosis (estrechamiento de la luz del intestino debido a la inflamación), fístulas (comunicaciones anormales entre partes del intestino y otras vísceras, pared abdominal o piel) y abscesos (perforaciones cubiertas como consecuencia de la adhesión de serosa inflamada y sana). En el estudio histológico la característica clave es la presencia de granulomas (agregaciones de células
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epiteloides, macrófagos y linfocitos). Mientras que otras características que comparte con la colitis ulcerosa son la presencia de infiltrado inflamatorio e irregularidades en la arquitectura de las criptas. En la enfermedad de Crohn también puede verse afectado el sistema nervioso entérico, con aparición de hipertrofia irregular e hiperplasia de las fibras nerviosas, así como alteraciones del cuerpo de las células neuronales y gliales de la submucosa y plexo mientérico.
Los síntomas de la enfermedad de Crohn son heterogéneos y con frecuencia incluyen diarrea durante más de 6 semanas, dolor abdominal y/o pérdida de peso. Otros síntomas incluyen el malestar general, la anorexia o la fiebre.
La colitis ulcerosa afecta a recto y colon exclusivamente. Habitualmente la inflamación empieza en recto y se extiende con un patrón de afectación continuo, de extensión variable, hacia el ciego y de forma simétrica en la circunferencia del tubo. Otra característica que la diferencia de la enfermedad de Crohn, es que la inflamación está confinada en la mucosa intestinal, lo que hace que excepcionalmente se encuentren fístulas o estenosis. Las características histológicas de la colitis ulcerosa son la presencia de anomalías en la arquitectura de las criptas (ramificaciones, disminución del número, irregularidades en tamaño, espaciado, orientación y forma de las criptas, e irregularidades de la superficie vellosa), anomalías en células epiteliales (depleción de mucina, por disminución de esta o de sus células productoras y metaplasia de células de Paneth) y aumento del infiltrado inflamatorio y células plasmáticas en la mucosa (66).
En el caso de la colitis ulcerosa, los síntomas típicos dependen de la extensión y gravedad de la enfermedad. Consisten en diarrea sanguinolenta, rectorragia, urgencia rectal, tenesmo y dolor abdominal, que junto con el malestar general, anorexia y fiebre son indicativos de un episodio grave (66).
No existe una regla de oro para el diagnóstico diferencial de enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, este debe establecerse mediante una combinación de historia clínica, evaluación clínica y signos endoscópicos e histológicos típicos de cada entidad. La catalogación en función de la extensión y la
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gravedad de la colitis ulcerosa es importante para el planteamiento terapéutico, por lo que existen clasificaciones como la de Montreal, Truelove y Witts o la de Mayo que ayudan a caracterizar el fenotipo inflamatorio para facilitar el manejo y el seguimiento del paciente (66). En la enfermedad de Crohn, los subtipos vienen dados por la clasificación de Montreal y índice de actividad en la enfermedad de Crohn (CDAI), importantes también para tratamiento y predicción de posibles complicaciones en la evolución de la enfermedad (67).
Otra manifestación patológica de la EII es la colitis indeterminada, que tras excluir la colitis infecciosa y otras posibles causas de colitis se la diagnostica como enfermedad intestinal crónica. Afecta exclusivamente al colon, pero ni por las características endoscópicas ni por el estudio histológico se puede considerar enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. La colitis indeterminada constituye una entidad propia de la EII, con un curso clínico complicado y cuyo tratamiento no es diferente a la enfermedad de Crohn y a la colitis ulcerosa (68).
A parte de los síntomas anteriormente detallados, cada entidad de la EII puede comportar una serie de complicaciones o manifestaciones extraintestinales presentes en un número importante de pacientes. Entre las más frecuentes se encuentran lesiones cutáneas (erytemanodosum, pyodermagangraenosum), de las articulaciones (artritis periferica, espondilitis anquilosante,...), oculares (uveitis e iritis), malabsorción, osteoporosis, etc. (69).
2.1.2.-‐ Etiopatogenia
La etiología de la EII actualmente desconocida, parece ser resultado de la interacción de factores genéticos y ambientales que provocaría una respuesta inmune descontrolada y excesiva frente a la microflora comensal del intestino del huésped, hecho que acabaría lesionando la mucosa intestinal del propio individuo.
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Disbiosis
Sistema inmune
Barrera epitelial
EII
Polimorfismos asociados a la susceptibilidad de padecer EII FIGURA 6: Factores implicados en la aparición de la EII. Adaptación de Mañé J. 2011 (70)
• Predisposición genética
En conjunto, estudios epidemiológicos que muestran una mayor incidencia de la EII en determinadas zonas y/o etnias (71), estudios de agregación familiar donde los pacientes tienen algún pariente de primer grado afectado con la misma enfermedad y estudios en gemelos, donde los monocigotos presentan una mayor concordancia en la aparición de la EII que dicigotos (72), han hecho patente el importante rol de los factores genéticos en la patogenia de la EII. Esta contribución se hace más evidente en la enfermedad de Crohn que en la colitis ulcerosa, aunque ambas se consideran enfermedades poligenéticas compartiendo algunos genes, siendo otros específicos de cada entidad.
Mediante los estudios genéticos de asociación se han podido implicar varios genes en la patogénesis de la EII. Una gran parte de las alteraciones genéticas que predisponen a padecer la EII suponen alteraciones en la inmunidad innata e inmunidad adquirida, que afectan a funciones biológicas como la autofagia y la función barrera intestinal.
-‐Mutaciones NOD2/CARD15
El gen CARD15 codifica para el receptor intracelular NOD2, que participa directamente en el reconocimiento de la microbiota tolerizando la relación del huésped con su ecosistema intestinal.
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Su ligando es el muramil dipéptido, que son fragmentos de degradación de los peptidoglicanos presentes en la pared bacteriana. Este receptor se expresa en células de Paneth y células presentadoras de antígeno.
Existen tres variantes alélicas de NOD2/CARD15 (Arg702Trp, Gly908Arg y frameshift deletion de Leu1007) claramente vinculadas con la susceptibilidad a padecer la enfermedad de Crohn (73), aunque tan solo están presentes en un 10%-‐20% de los pacientes de origen caucásico. Las tres mutaciones se encuentran en la región de unión a su ligando. La explicación más aceptada al hecho que estas mutaciones se relacionen con la enfermedad de Crohn, sería que NOD2 actuaría como regulador negativo de la vía TLR-‐2/NF-‐kB, disminuyendo así la producción de IL-‐12 y otras citocinas Th1 características de esta patología (74, 75). Existen otros estudios donde las mutaciones NOD2/CARD15 se traducen en una disminución de la expresión de α-‐defensinas por parte de las células de Paneth (19).
-‐Mutaciones en genes implicados en la autofagia
La autofagia es un proceso por el cual componentes intracelulares son encapsulados en autofagosomas y degradados por lisosomas. Se cree que también está implicado en la degradación y limitación de patógenos una vez entran en la célula, por lo que es lógico pensar que mutaciones que afecten a factores importantes de este proceso, puedan resultar en una disminución de la eliminación de microorganismos nocivos y una consecuente infección permanente.
Recientes estudios han asociado al riesgo de padecer enfermedad de Crohn polimorfismos en genes implicados en el proceso de autofagia (ATG16L1 y IRGM). La variante alélica 300A del gen ATG16L1 se ha asociado a una pérdida de función de la proteína ATG16L1, esencial para la autofagia, favoreciendo así la entrada
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de patógenos al interior de la célula (76). Estas alteraciones podrían suponer un defecto en el primer intento de eliminación de patógenos intracelulares que se compensaría con una excesiva respuesta Th1 en la lamina propria. Lo que constituye un componente exclusivo de los pacientes con enfermedad de Crohn (77).
Anomalías morfológicas y funcionales en las células de Paneth se han asociado también a la pérdida de función del gen ATG16L1, tanto en modelos murinos como en enfermos de Crohn. La deficiencia de la proteína ATG16L1 conlleva una disminución en el número de gránulos e irregularidades en el proceso de exocitosis, en estas células (78).
La implicación de la autofagia en la inmunidad adaptativa se ha demostrado en estudios donde células que expresan el MHC-‐II usan este proceso para presentar antígenos a las células T CD4+. Trabajos en ratones con mutaciones en genes de la autofagia como ATG5 muestran que la proliferación y supervivencia de los linfocitos T CD4+ dependen de este proceso (79).
-‐Mutaciones en gen IL23R
Estudios GWAS (Genome-‐wide association studies) han podido identificar varios polimorfismos en el gen IL23R que se han asociado tanto a la enfermedad de Crohn como a la colitis ulcerosa. Uno de estos polimorfismos, Arg381Gln, parece que protege de la susceptibilidad a padecer enfermedad de Crohn (65). La causa por el que este polimorfismo confiere protección al desarrollo de la enfermedad no se ha esclarecido todavía, aunque podría ser debido en parte, al hecho de que este receptor se expresa en el subtipo de células T efectoras Th17. Este subtipo de células T se encuentra muy elevado en la mucosa inflamada de los pacientes con EII y aunque producen IL-‐17, IL-‐22 e IL-‐21, necesitan de la IL-‐23 para su expansión y diferenciación hacia un fenotipo
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más agresivo (80). De hecho, en ausencia de IL-‐23, las células Th17 pueden ejercer funciones reguladoras que correlacionaría, en parte, con su capacidad de producir IL-‐10 (81).
-‐Mutaciones en componentes de la integridad epitelial
La importancia de la integridad de la barrera epitelial para el buen mantenimiento de la homeostasis intestinal, se ha hecho evidente tanto en pacientes con enfermedad de Crohn y en sus parientes de primer grado (82), como en modelos experimentales que desarrollan colis espontánea (p.ej.: animales deficientes para IL-‐10) (83), donde se ha descrito un incremento en la permeabilidad intestinal.
Estudios genéticos en enfermos de Crohn con mutaciones en el gen CDH1 que codifica para la proteína de las uniones adherentes E-‐Cadherina, muestran un aumento de la permeabilidad intestinal y una localización singular en el citoplasma (84). El haplotipo de las mutaciones de genes localizados en el locus IBD5, que codifican para los transportadores catiónicos orgánicos OCTN1 y OCTN2, además de variantes del gen que codifica para la guanilato quinasa DLG5 se han asociado a la susceptibilidad para la enfermedad de Crohn, probablemente por introducir cambios en la estructura del epitelio (85, 86). Dos polimorfismos exónicos (C3435T y G2677T/A) en el gen MDR-‐1 (gen de resistencia a multidrogas 1), asociado con la susceptibilidad a padecer colitis ulcerosa, también tiene un papel clave en la eliminación de toxinas de las células epiteliales intestinales (87).
Hasta aquí se han descrito las mutaciones más conocidas y contrastadas hasta la actualidad que se asocian a la EII. Pero existen muchos otros genes candidatos para la predisposición a padecer EII. Estos son genes que codifican para citocinas relevantes en la EII como la IL-‐10 (IL10), INF-‐γ (INFG) y de la subunidad p40 común en las IL12 e IL23 (IL12B), de factores involucrados en la quimiotaxis y activación de los macrófagos (MST1), del
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receptor de la quimiocina 6 (CCR6), del transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3), de la superfamilia del TNF (TNFSF15), del HLA clase II (HLA-‐DRB1), de mucinas (MUC3A y MUC19), etc (88-‐90).
• Microflora comensal
La microbiota comensal se adquiere a partir del momento del nacimiento e irá colonizando el lumen intestinal con más de 1000 especies bacterianas diferentes. En la edad adulta se alcanzarán densidades desde 103-‐105 unidades formadoras de colonias (ufc) /mL en estómago e intestino delgado, hasta 1012-‐1014 ufc/ml en el colon (91, 92). En conjunto el material genético de la flora comensal, denominado microbioma, representaría unas 100 veces el número de genes del genoma humano (93).
En ausencia de enfermedad, la flora comensal y el húesped mantienen una relación de simbiosis. Mientras el intestino crea el ambiente idóneo en temperatura y nutrientes para el crecimiento de la microflora, las bacterias facilitan la digestión y absorción de nutrientes inaccesibles para el húesped, impiden la colonización de bacterias patógenas y favorecen un buen desarrollo tanto del epitelio como del sistema inmune (94, 95). Sin embargo, existen evidencias de la implicación de la interacción anómala entre húesped-‐bacterias comensales en el inicio y patogénises de la EII. Esto se fundamenta en estudios experimentales murinos en los cuales la presencia de flora es necesaria para la aparición de colitis espontánea o inducida (96). Además existen evidencias clínicas como la serología positiva contra especies bacterianas del lumen (ASCA, pANCA, anti-‐OmpC), aumento en la virulencia de Escherichia coli (E.Coli) en enfermedad de Crohn, polimorfismos en moléculas para el reconocimiento bacteriano (NOD2, TLR2) asociados a aparición de EII, etc (92).
Se han descrito varias teorías sobre el papel de la microflora en la patogénesis de la EII (Figura 7).
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FIGURA 7: Posibles causas por lo que la microflora comensal desencadenaría la respuesta inflamatoria en los pacientes de EII: A) por un microorganismo patógeno; B) Disbiosis en la microflora intestinal; C) Incremento de la exposición de los antígenos luminales a sistema inmune del intestino; y D) Pérdida de la tolerancia por parte del huésped frente a
bacterias autólogas. Fuente: Sartor RB., y colsl. 2008 (92).
La existencia de un patógeno bacteriano como causa de la aparición de la enfermedad parece poco probable, ya que estudios con Mycobacterium avium paratuberculosis llegan a conclusiones contradictorias y dispares (97). La disbiosis reportada en estudios con pacientes de EII podría ser la causa de la patogénesis. En estos estudios se ha observado un incremento en el número de Enterobacteriaceae (como E. Coli) y una disminución de los Firmicutes (Clostridium sp) en muestras intestinales de pacientes con EII (98). Además este desequilibrio puede comprometer la fisiología normal del intestino, por la disminución en la producción de butirato como fuente de energía de los enterocitos. Otra causa de la patogenia podría ser el
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incremento de la exposición antigénica al sistema GALT debido a defectos en la barrera intestinal (p.ej.: aumento en la expresión de la Claudina 2 (99)), o en los mecanismos de eliminación bacterianos (p.ej.: disminución de la producción α-‐defensina 5 (19). Sin embargo, la razón podría ser la pérdida de tolerancia del sistema inmune del huésped frente a la microflora comensal, ya sea por la incapacidad de las células epiteliales y células APCs de minimizar la respuesta inflamatoria contra microflora autóloga o a una disfunción en la producción de IL-‐10 y TGF-‐β por parte de las células Treg (92).
• Desequilibrio del sistema inmunitario
El principal reto del sistema inmunitario en el intestino es mantener la homeostasis, respondiendo ante potenciales patógenos a la vez que tolera la relación del huésped con la microflora intestinal y antígenos procedentes de la dieta. Entre los factores que posiblemente intervienen en la rotura de la homeostasis encontramos alteraciones en la función barrera del epitelio intestinal y/o en las células del sistema inmune intestinal (macrófagos, células dendríticas, células T y B...).
Defectos en la barrera epitelial debido al aumento en la permeabilidad intestinal (100) y distorsiones en la producción del moco que recubre la monocapa celular del epitelio (101), ambos descritos en la EII, hacen que antígenos luminales entren en contacto con el sistema inmunitario de la lamina propria desencadenando así una respuesta inflamatoria.
En la primera línea de defensa contra los patógenos encontramos a la inmunidad innata, que a través de receptores que reconocen patrones conservados de bacterias, actúan eficazmente contra la invasión patógena. Entre estos receptores encontramos a los TLRs en la membrana plasmática y en endosomas, y los intracelulares, NODs (102,103). Mediante la estimulación con su ligando específico, estos arman una respuesta adecuada y eficaz para la eliminación del agente nocivo. Sin embargo, el mal funcionamiento de estos receptores o en algún nivel de sus vías de señalización, podría desencadenar una activación inadecuada de la inmunidad adquirida, exacerbando así la respuesta inflamatoria.
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Es sabido que las células T CD4+ juegan un importante rol en el inicio y formación del proceso inmunopatogénico en la EII y que su capacidad para promover y perpetuar la inflamación en el intestino es dependiente de la producción de un determinado perfil de citocinas (104). Tradicionalmente la enfermedad de Crohn se ha asociado a una activación de linfocitos Th-‐1, con producción mayoritaria de grandes cantidades de INF-‐γ y TNF-‐α asociados a los factores de transcripción T-‐bet y STAT1. En cambio, en la colitis ulcerosa está incrementada la producción de IL-‐5 e IL-‐13 por parte de células Th2. En este caso, la respuesta Th2 esta mediada por células NKT que no expresan el receptor clásico de células NK (105). Recientemente, se ha descubierto otro subtipo de células T llamadas Th17, con niveles altos en la mucosa inflamada de los pacientes con EII (80). Varios estudios han mostrado que la producción de citocinas Th17 (IL17, IL-‐21, IL22) exacerbarían la inflamación característica de la EII promoviendo respuestas Th1 (106).
El subgrupo de células Treg diferenciadas gracias a las acciones del TGF-‐β y ácido retinoico (107), se encuentran involucradas en la tolerancia del intestino por su función inmunosupresora mediante la producción de IL-‐10 y TGF-‐β. Parece ser que la homeostasis en el intestino reside en el equilibrio entre las acciones pro-‐inflamatorias Th1, Th2 y Th17, y las antiinflamatorias de la subpoblación Treg. Un desequilibrio en detrimento de las Treg daría lugar a la inflamación intestinal (90, 108, 109). En cualquier caso, la rotura del ciclo celular favoreciéndose la resistencia a la apoptosis de las células T CD4+ de la lamina propria se ha vinculado a la etiología de la enfermedad de Crohn (110).
• Factores de riesgo externos
Entre los factores de riesgo a padecer la colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn también se han encontrado diferencias. Entre los más relevantes destaca el hábito de fumar como factor de riesgo a padecer enfermedad de Crohn mientras que en la colitis ulcerosa parece tener un efecto protector. Algo similar pasa con el hecho de haber sufrido una apendicetomía. Enfermedades infecciosas infantiles, el consumo de antiinflamatorios no esteroideos y anticonceptivos orales, el sexo del paciente o la dieta, no muestran una clara relación a sufrir EII (71). En cualquier caso, las evidencias
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anteriores sugieren que estas dos enfermedades son fisiológica y patológicamente diferentes, a pesar de poseer características moleculares y genéticas comunes.
2.1.3.-‐ Epidemiología
Dado el desconocimiento de la etiología de la EII y la implicación de los factores ambientales en la aparición de esta, el estudio de la evolución de la incidencia y la prevalencia por regiones geográficas, podrían esclarecer algunas claves de las posibles causas de la enfermedad.
A pesar de la heterogeneidad de estos estudios debido a diferencias en las características poblacionales, el acceso a los servicios médicos, los criterios diagnósticos, el avance en los procedimientos y medios diagnósticos, etc., se han observado diferencias geográficas considerables en la incidencia de la EII y cambiantes en el tiempo, lo cual corroboraría que un factor ambiental participaría, junto con una predisposición genética, en el desarrollo de la misma.
Tradicionalmente, se ha reportado la existencia de un gradiente Norte-‐Sur con incidencias mayores en el Norte de Europa y Norte de América, mientras que en el sur de Europa, Asia, América del sur y África las incidencias eran inferiores (71). Pero esta distinción geográfica parece estrechar distancias partir de los años 90, ya que a partir de entonces se ha registrado un aumento en la incidencia en los países con ratios históricamente bajos (111, 112). Todo esto hace pensar en una relación entre la incidencia de la enfermedad y el nivel de desarrollo e industrialización de los países (112). La industrialización y la urbanización de estas regiones emergentes estarían asociadas a cambios en contacto con los microbios (Teoría de la higiene, Figura 8), en los hábitos de vida, sanidad, exposición a la polución, etc. los cuáles, se creen implicados como potenciales factores de riesgo en la EII (113).
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FIGURA 8: Teoría de la higiene
La literatura sugiere que la hipotesis de la higiene y su asociación con una menor exposición a los microbios durante la infancia probablemente jugarían un papel clave en el desarrollo de enfermedades inflamatorias como la EII. En edades tempranas de la vida las prácticas higienicas de países más desarrollados podrían sobreprotejer del contacto con agentes infecciosos comunes, que se creen necesarios para una buena maduración del sistema inmunológico y en el establecimineto del equilibrio entre respuestas Th-‐1 y tolerancia. Este hecho haría que más tarde, en el transcurso de la vida de un individuo, el contacto con agentes infecciosos desencadene una respuesta inflamatoria inadecuada (114, 115).
Relacionado con lo anterior, algunos trabajos donde se valoran aspectos relacionados con la raza o etnia de los pacientes, describen una gran incidencia de la EII en personas de raza caucásica y judía. Aunque esta se ha visto incrementada recientemente en la población hispana y asiática con incidencia tradicionalmente más baja (116). Algunos estudios demuestran diferencias entre etnias independiente de la región geográfica, como se observa en un estudio hecho en EEUU donde afroamericanos e hispanos desarrollan con más frecuencia diferentes subtipos de enfermedad de Crohn (117), dando soporte a la predisposición genética para el desarrollo de la EII. No obstante, existen datos de un aumento de la incidencia de EII en aquellos individuos que emigran de regiones con incidencia baja (p.ej. Asia) a otras con una más elevada (p.ej. Inglaterra) (118).
En cifras, los últimos estudios sitúan globalmente la incidencia de la colitis ulcerosa entre 0.5-‐24.5/105 habitantes y 0.1-‐16/105 habitantes para la enfermedad de Crohn, con una prevalencia mundial de la EII de 396/105 habitantes (111, 112).
En España la incidencia en 2003 para la enfermedad de Crohn oscilaba entre 0.4-‐5.5 casos y para la colitis ulcerosa 2-‐8 casos por cada 105 habitantes y año, existiendo gran variabilidad según las regiones geográficas (119). En estudios posteriores en las regiones de Navarra y Madrid se observaron
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valores de 5.7 y 7.92 casos para la enfermedad de Crohn y para la colitis ulcerosa 11.47 y 7.47 casos/105 habitantes, respectivamente (120, 121). Estos resultados junto con los de estudios retrospectivos en estas y otras regiones españolas, parecen reflejar una tendencia al alza de ambas incidencias.
2.1.4.-‐ Tratamiento
La EII es una enfermedad crónica de la que no se conoce su etiología con precisión y no se dispone de terapia curativa actualmente. Lo que hace que muchos pacientes vivan con una carga importante de síntomas a pesar del tratamiento médico, con la esperanza de que pronto se descubra la etiología de la enfermedad y surjan tratamientos curativos.
La edad de la aparición de la enfermedad comprendida entre la adolescencia y la primera madurez, también es la etapa de la vida más productiva tanto personalmente como socialmente, lo que conlleva un coste tanto para el paciente como para el sistema de salud y la sociedad. Este hecho hace imprescindible medidas y estudios que revelen la etiología de la enfermedad para la búsqueda de nuevos tratamientos curativos, como para su prevención.
El tratamiento actual de los pacientes con EII es dependiente de varios factores como la localización y la gravedad. Sin embargo, la complejidad de la enfermedad de Crohn hará que en la decisión terapéutica se tengan en cuenta otros aspectos como la posibilidad de la existencia de abscesos, perforaciones o estenosis que requieren un manejo especial. La terapia es de forma secuencial con prioridad a tratar la fase aguda de inflamación, seguido del mantenimiento de la remisión. Las directrices convencionales defienden un uso “set-‐up” del tratamiento, usando inicialmente aquellos fármacos menos potentes e ir progresando a más en caso de fallo terapéutico. Sin embargo, de investigaciones recientes en enfermos de Crohn surge la idea de una estrategia “top-‐Down”, donde se iniciaría el tratamiento con fármacos potentes para acelerar la remisión y mejorar la evolución de la enfermedad (122).
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Los objetivos principales del tratamiento médico son el de obtener el equilibrio entre la máxima eficacia (inducción de la remisión, prevención de la recidiva, mejora de la calidad de vida y obtención de la curación de la mucosa) y el mínimo riesgo (menores efectos secundarios derivados del tratamiento y reducción de las complicaciones de la enfermedad).
El tratamiento actual de los pacientes con EII comprende el uso de antiinflamatorios (aminosalicilatos y corticoides), inmunomoduladores (análogos de tiopurinas, metotrexato, ciclosporina) y agentes biológicos.
• Corticoides:
A pesar de tener disponibles otros tratamientos, los glucocorticoides (GCs) son el principal agente terapéutico en el tratamiento de la enfermedad de Crohn activa y de brotes moderados a graves de colitis ulcerosa. En cambio no es aconsejable su uso para tratamientos prolongados de mantenimiento, debido a sus efectos adversos y por su escasa eficacia en mantener la remisión.
El esteroide de elección es la prednisolona a dosis de 1mg/kg/día. La administración intravenosa produce una mejora en los síntomas rápidamente, con la máxima eficacia a los 6-‐8 días de tratamiento. Si no mejoran los síntomas (en aproximadamente un 20% de pacientes no lo hace) se cambiará al tratamiento con inmunosupresores o infliximab.
Una vez los síntomas del paciente han mejorado, la prednisona se disminuye gradualmente entre 5-‐10 mg por semana, hasta alcanzar una dosis diaria de 15-‐20 mg. A partir de aquí se disminuye entre 2.5 y 5 mg a la semana hasta interrumpir totalmente el tratamiento. Se trata de disminuir el tiempo de retirada del fármaco a la vez que se mantiene la remisión.
La budesonida es un preparado de liberación entérica pensado para el tratamiento localizado en una parte específica del intestino minimizando los efectos adversos por metabolismo hepático. Indicado para brotes leves a moderados en la enfermedad de Crohn, afectación ileal o ileocolónica y la administración tópica para tratamiento de la colitis izquierda y proctitis. Se
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darán dosis diarias de 9 mg durante 4 semanas y según respuesta se iniciará pauta descendente de 6 mg/diarios seguida de 3 mg/diarios durante un mes más hasta su retirada. Dado su menor perfil de efectos sistémicos, este corticoide permite tratamientos más prolongados. Otro corticoide recomendado para la proctitis distal es la hidrocortisona.
Los pacientes con EII muy grave o fulminante, los cuales no responden a corticoides orales, deben ser hospitalizados y tratados con tratamiento esteroideo intravenoso (prednisona y hidrocortisona).
• El resto de tratamientos usados en la clínica actual se recogen en la siguiente tabla (69, 123):
Tratamiento Compuesto Indicación terapéutica Actividad
Aminisalicilatos Mesalazina
Sulfasalazina
Osalazina
Balsalazina
-‐Tratamiento de primera elección en brotes leves a moderados en colitis ulcerosa, por vía oral (4g/día). Con una respuesta del 60-‐80%
-‐Para colitis ulcerosas distales se usan aminosalicilatos tópicos.
-‐En enfermedad de Crohn colónica moderada puede intentarse administrar aminosalicilatos antes de los esteroides.
-‐Puede usarse en mantenimiento de la remisión conseguida con esteroides.
-‐Inhibición IL-‐1 y TNF-‐α
-‐Inhibición de la vía de lipooxigenasa.
-‐Inhibición de NF-‐kB
Inmunosupresores
Azatioprina
Mercaptopurina
-‐Tratamiento de EII graves, corticodependientes y corticoresistentes.
-‐Su eficacia es lenta.
-‐Inhibición de síntesis de DNA, RNA y proteína.
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Inmunosupresores (continuación)
-‐Mantenimiento en pacientes corticodependientes con la finalidad de poder retirar tratamiento esteroideo.
-‐Tratamiento de enfermedad de Crohn perianal y para prevención de recurrencia post-‐cirugía.
-‐Tratamiento de fístulas.
-‐Dosis: 50 mg/día hasta 150 mg/día.
-‐Inhibición de proliferación celular.
-‐Como efectos adversos: pancreatitis y linfomas
Metotrexato
-‐Tratamiento de casos graves de enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. También de casos con corticodependencia y corticoresistencia.
-‐Inducción y mantenimiento de la remisión en enfermedad de Crohn.
-‐Administración intramuscular de 15-‐25 mg/semana
-‐Efectos más rápidos que los anteriores.
-‐Inhibición de síntesis de DNA, causando muerte celular.
-‐Efectos adversos: Leucopenia, pneumonitis intersticial, fibrosis hepática y embriotoxicidad.
Ciclosporina
Tacrolimus
MMF
-‐Administración intravenosa (2-‐4 mg/kg/día) consigue rápidos efectos en pacientes de colitis ulcerosa cortirefractaria o grave, para intentar prevenir colectomia.
-‐Administración oral menos efectiva en el mantenimiento de la remisión y probabilidad de recaída es elevada.
-‐Para tratamiento de enfermedad de Crohn
-‐Inhibición de la síntesi de citosinas por parte de células T.
-‐Inhibición de la proliferación de células T.
-‐Efectos adversos: insuficiencia renal e hipertensión.
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Agentes biológicos
Infliximab
Adalimumab
Certolizumab
-‐Tratamiento de enfermedad de Crohn refractaria, reduciendo las recaídas.
-‐Tratamiento de enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa de moderadas a graves, y de pacientes no respondedores a tratamiento esteroidal ni con inmunosupresores.
-‐Tratamiento de debut en EC extensa o complicada (tratamiento Top-‐down).
-‐Como terapia de mantenimiento y para prevencion de recurrencia de fístulas.
-‐Administración intravenosa (intramuscular, en caso de adalimumab) de 5mg/kg a intervalos de varias semanas o meses. Se suele adminsitrar tres dosis y si no tienen efectos no es aconsejable seguir con el tratamiento
-‐Se trata de anticuerpos que bloquean el TNFα.
-‐Lisis de células inflamatorias y epiteliales.
-‐Efectos adversos: fiebre, urticaria, anafilaxis, produccion de anticuerpos contra infliximab, reactivación tuberculosis, linfomas
Cirugía -‐ -‐Casos que no responden a tratamiento farmacológico y la vida de paciente corre peligro.
-‐Perforación intestinal, megacolon tóxico, cáncer
-‐Eliminación de la zona afectada.
-‐Complicaciones postquirúrgicas habituales.
A parte del tratamiento farmacológico para la inducción de la remisión, se suelen administrar conjuntamente compuestos que ayudan a reducir los síntomas. Entre los cuales encontramos antibióticos y probióticos (reducen y restituyen con bacterias beneficiosas la microflora intestinal), analgésicos,
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anti-‐diarreicos, cromoglicato sódico (inhibe la degranulación de mastocitos), sales de bismuth (para la inhibición de enzimas bacterianos que degradan mucus intestinal), talidomida (inhibidor de la formación de radicales de oxígeno), aceite de pescado (efectos antiinflamatorios), etc (123).
La nutrición enteral se ha empleado en el tratamiento primario como para el de mantenimiento de la remisión en la EII. De esta forma se pretendía minimizar el uso de corticoides y otros inmunomoduladores, ninguno de los cuales esta exento de efectos adversos ni del fracaso terapéutico, ni tan siquiera de corregir los déficits nutricionales y sus consecuencias para la EII. Los resultados obtenidos de un metanálisis indican que la nutrición enteral es menos eficaz que los corticoides en la inducción de la remisión en la enfermedad de Crohn activa, aunque superior en comparación al placebo (124). Este tipo de dietas enterales constituyen un tratamiento de elección en niños y adolescentes por los efectos sobre el crecimiento y desarrollo sexual que presentan los corticoides.
• Actualmente existen otras opciones terapéuticas bajo estudio. Estas consisten en el bloqueo de la adhesión y migración leucocitaria mediante anticuerpos dirigidos a la integrina-‐α4 o Madcam-‐1, ambas moléculas de adhesión (125,126). Otros tienen como diana la neutralización de citocinas implicadas en el proceso inflamatorio. Estudios en pacientes con EII donde se les administra anticuerpos anti-‐IL12p40 presentan una mayor respuesta clínica en comparación a los tratados con placebo (127). La terapia génica mediante vectores parece ser una opción factible para administración de genes terapéuticos en el intestino. La transferencia génica de IL-‐10 previene el desarrollo de la colitis en modelos experimentales con ratones (128).
2.1.5.-‐ Complicaciones evolutivas y terapéuticas
Existen varias complicaciones derivadas tanto de la evolución de la enfermedad como del tratamiento administrado.
El megacolon tóxico es una complicación grave de la EII o de colitis infecciosas, que se caracteriza por la presencia de toxicidad sistémica y
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dilatación total o segmentaria del colon, no obstructiva, mayor de seis centímetros. Se observa en pacientes de colitis ulcerosa, y en menor proporción en enfermedad de Crohn, que padecen brotes graves. La prevalencia del megacolon tóxico ha disminuido en las últimas décadas debido a un mejor diagnóstico y tratamiento de las colitis graves y fulminantes. Se considera que entre 1-‐5% de pacientes con colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn pueden presentar esta complicación (129). En referencia a su patogénesis, la inflamación en el megacolon tóxico se extendería a través de las capas musculares lisas del intestino y el óxido nítrico inhibiría la actividad muscular, provocando la dilatación (130).
La cirugía en pacientes con colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn puede ser una solución al fracaso terapéutico o a las complicaciones de la enfermedad. Se estima que se lleva a cabo en un 30-‐40% de los pacientes que padecen colitis ulcerosa y entre un 75-‐90% con enfermedad de Crohn (131, 132). Pero el mayor problema de la cirugía en la enfermedad de Crohn es la recurrencia post-‐quirúrgica de la enfermedad. Se da en la zona donde se ha hecho la anastomosis y puede ir seguida de varias resecciones a lo largo de la vida del paciente, pudiendo provocar el síndrome del intestino corto (133). En pacientes con colitis ulcerosa a los cuales se les practica una proctocolectomía total o parcial con reservorio, pueden presentar una inflamación idiopática conocida como reservoritis, que es la complicación más habitual tras la cirugía (134).
La anemia es otra complicación más de la EII, aunque de forma habitual esta es considerada más un síntoma que una complicación como tal. La causa subyacente de la anemia se considera que es debida a la pérdida intestinal de sangre debido a las ulceraciones. Sin embargo, mediadores de la inflamación como el TNF-‐α y fármacos como la sulfasalazina, azatioprina o mercaptopurina, pueden afectar a la eritropoyesis y al metabolismo del hierro y se traduce con la aparición de la anemia de enfermedad crónica (135).
En colitis ulcerosas graves y enfermedad de Crohn de larga duración es frecuente la aparición de malnutrición energético-‐proteica y déficits de micronutrientes como consecuencia de alteraciones metabólicas asociadas
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al propio proceso inflamatorio. Estos trastornos nutricionales empeoran el estado general del paciente, favorecen el desarrollo de complicaciones infecciosas, retrasan el cierre de fístulas o heridas y pueden empeorar el proceso inflamatorio y la lesión intestinal. Además, como consecuencia pueden incrementar la necesidad de cirugía, así como morbilidad asociada a la EII (136). Aunque muchos de estos déficits son asintomáticos, con la excepción del hierro y el folato, pueden comprometer los mecanismos de reparación tisular o la defensa antioxidante frente a la acción de radicales libres de oxígeno, perpetuando el proceso inflamatorio (136). Distintos modelos animales han demostrado que las citocinas pro-‐inflamatorias provocan anorexia y consecuentemente malnutrición energética (137).
Otra complicación frecuente es el cáncer colorrectal (CCR). Varios estudios demuestran que los pacientes de EII tienen un riesgo aumentado para desarrollar CCR en comparación al resto de la población. En efecto esta complicación es la razón de entre un 10-‐15% de muertes en enfermos de EII (138). Pero la magnitud de este aumento es aún objeto de debate, ya que los valores observados son muy heterogéneos. Estudios con pacientes con colitis ulcerosa el riesgo de padecer CCR es de 3-‐7 a 5.7 veces más, valor que se iguala en la enfermedad de Crohn de afectación cólica (139). Sin embargo existen datos recientes que reportan un decremento de este riego en las ultimas décadas, a causa de la mejora en las terapias para la EII (140). Algunos estudios señalan como elementos clave en la aparición del CCR, la extensión, la localización y gravedad de la inflamación, duración de la enfermedad, los distintos tratamientos y la historia familiar (138).
Además, el concepto de cronicidad característico de la EII se encuentra asociada a la posibilidad de progresión en su extensión anatómica y a la tasa de refractariedad al tratamiento médico. La refractariedad a los corticosteroides, supone la repuesta inadecuada al tratamiento de primera elección en la EII aguda. La consecuencia más inmediata de ello es la no mejora de la sintomatología del paciente, pero a más largo plazo supone un curso evolutivo complicado de la EII.
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3. Bases patológicas de la respuesta inadecuada al tratamiento con glucocorticoides
3.1.-‐ Glucocorticoides: Definición y sus acciones
Los GCs (llamados también corticoides, corticosteroides o esteroides) son hormonas esteroideas endógenas, sintetizadas por las células adrenocorticales a partir del colesterol en respuesta a situaciones de estrés fisiológico entendido como el ayuno, la hipoglucemia, la inflamación, la ansiedad, el miedo, etc. Estas hormonas están implicadas en numerosos procesos fisiológicos tales como el metabolismo de la glucosa, proteínas y lípidos, así como en acciones antiinflamatorias e inmunosupresoras, equilibrando los mediadores pro-‐ y antiinflamatorios.
Debido a su función como potentes antiinflamatorios, los corticoides exógenos (entre los que encontramos la dexametasona, prednisolona, metilprednisolona y betametasona) son prescritos como fármacos de primera línea para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, como la EII.
• Acciones de los GCs:
Las enfermedades inflamatorias crónicas comportan la activación y reclutamiento de células inflamatorias e inmunes con la consiguiente síntesis de mediadores inflamatorios.
A nivel celular, los GCs reducen la extravasación leucocitaria al foco de la inflamación, suprimiendo la producción de quimiocinas (CXC relacionadas con la migración de neutrófilos, o eotaxina-‐2, MCP-‐4 y RANTES asociadas a la invasión del tejido por parte de eosinófilos y basófilos) y moléculas de adhesión (como la L-‐Selectina, ICAM-‐1 y VCAM-‐1) (141). Además los corticosteroides pueden inducir apoptosis o anergia de los linfocitos T a través de la inhibición de las señales activadoras vía TCR y de la expresión del MHC-‐II y otras moléculas co-‐activadoras (CD80, CD86, ICAM-‐1/LFA-‐1) (141).
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Se ha demostrado que estas hormonas pueden influir en la diferenciación clonal de los linfocitos T promoviendo la selección Th2, ya sea inhibiendo el factor de transcripción T-‐bet, la secreción de IL-‐12 por parte de macrófagos y células dendríticas o diminuyendo la expresión del receptor de IL-‐12 (142).
Los GCs también ejercen sus efectos a través de la inhibición de la secreción de citocinas pro-‐inflamatorias (incluyendo IL-‐1β, TNF-‐α, IL-‐6, IL-‐8, IL-‐12, etc.) y mediadores inflamatorios (radicales libres de oxigeno, iNOS), o bien aumentando citocinas antiinflamatorias (IL-‐10 y TGFβ). Además mediante la inducción de la secreción de IL-‐10 promueven la diferenciación y expansión de las células Treg (141).
Pero el tratamiento prolongado con dosis elevadas de GCs, puede verse obstaculizado por efectos secundarios no deseados como la osteoporosis, atrofia muscular, afecciones cutáneas, glaucoma, síndrome de Cushing, incremento en el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de infecciones, entre otras (143). Esto hace de especial interés la identificación de los mecanismos de acción de los GCs relacionados tanto con los efectos adversos como de los deseados, para el desarrollo de moléculas con un ratio beneficio/riesgo más elevado y así conseguir un tratamiento más eficiente.
3.2.-‐ Mecanismos de acción de los glucocorticoides
Los mecanismos por los cuales los esteroides ejercen sus funciones antiinflamatorias se pueden dividir en:
• Efectos genómicos, por los cuales estos activaran o inhibirán las transcripción de genes. Dentro de esta categoría también encontramos los mecanismos post-‐transcripcionales de los GCs, relacionados con la estabilidad del RNA mensajero (RNAm) y la traducción proteica, aunque son menos conocidos.
• Efectos no genómicos, donde se engloban aquellos efectos que se producen en un periodo muy corto después de la administración o secreción
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de los GCs y que no afectan directamente en la expresión génica, sino que impulsan efectos mucho más rápidos como la activación de cascadas de señalización de quinasas o mediante cambios en el flujo iónico (144).
Que sea un mecanismo de acción u otro el usado por los GCs dependerá en parte de la dosis y tipo celular sobre el cual actúan.
3.2.1.-‐ Mecanismos genómicos
Para ejercer su acción los GCs difundirán pasivamente a través de la membrana plasmática gracias a su lipofilicidad, y una vez en el citoplasma se unirán a su receptor (GCR). Estos receptores pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares y están compuestos de tres dominios: un dominio N-‐terminal, uno central que es el lugar de unión al DNA y uno C-‐terminal donde se unirá el ligando. Por splicing alternativo resultarán las diferentes isoformas, siendo las más habituales y conocidas la isoforma alpha (GCRα) y la beta (GCRβ) (145). El GCRα es la isoforma que es capaz es unirse a los GCs, mientras la isoforma beta se cree que es un regulador negativo del alpha sin capacidad de unión a ligando (146).
En ausencia de ligando, los GCR se encuentran unidos a un heterocomplejo proteico compuesto por chaperonas (proteínas de choque térmico (Hsp)-‐90, Hsp-‐70, Hsp-‐56), proteínas de bajo peso molecular (p23), inmunofilinas (FKBP51, FKB52, CyP-‐40) y algunas proteínas tipo quinasas (Src quinasa), que los retienen inactivos en el citoplasma (147, 148). Una vez se produce la unión entre ligando y receptor, se produce un cambio conformacional en este último, que le permite disociarse del complejo proteico y dimerizar y translocar al núcleo, donde ejercerá sus efectos moleculares (149).
Una vez en el núcleo el complejo GCRα-‐GCs tiene varias opciones de interferir en la expresión génica y conseguir su función antiinflamatoria (Figura 9):
• Activando la expresión génica:
Los GCs unidos a su receptor pueden unirse directamente al DNA mediante secuencias específicas, dentro de los promotores de los genes diana,
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conocidas como elementos de respuesta a GCs (GRE) y activar la transcripción. Para ello deberán reclutar una serie de co-‐activadores (CBP/p300, SRC-‐1/2 o pCAF) que poseen actividad acetilasa de histonas permitiendo la expansión de la cromatina y dejando los promotores de los genes accesibles a la maquinaria de transcripción (150, 151). Mediante este proceso aumenta la síntesis de proteínas antiinflamatorias como inhibidor del factor de transcripción NF-‐kB (IkB)-‐α, Inhibidor de MAP quinasas (MKP-‐1), IL-‐10 y annexin-‐1 (150).
La transcripción de algunos genes bajo control de los GCs, se ve incrementada por la unión de factores de transcripción de la familia STAT y Smad al GCRα. Pero esta asociación no siempre resulta en un incremento de la transcripción, como en el caso de STAT5, que la unión del GCR aumentaría la síntesis de β-‐caseína (152) y suprime la activación del promotor MMTV (153). De forma recíproca, el GCRα incrementará la transcripción de algunos genes regulados por los factores STAT (149).
• Mediante represión de la expresión génica:
Esta opción puede darse directamente por unión del complejo GCR-‐ligando a GREs negativos que se traduce en una inhibición de la expresión génica por interferencia de la transcripción. Este mecanismo es el responsable de la gran mayoría de efectos no deseados de los glucocorticoides (154).
Muchos de los genes reprimidos por los GCs no poseen en sus promotores las secuencias GREs, lo que ha evidenciado una forma de represión GRE independiente. La mayoría de los efectos antiinflamatorios de los GCs se llevan a cabo mediante un mecanismo de represión de la transcripción génica llamado trans-‐represión, que conlleva la unión proteína-‐proteína. Esta puede darse entre:
-‐La interacción del GCRα-‐ligando con factores de transcripción, como NF-‐kB y la proteína activadora (AP)-‐1, que da como resultado la inhibición de la síntesis de citocinas (TNF-‐α, IL-‐1 β, IL-‐2, IL-‐6, IL-‐8,etc.), moléculas de adhesión (ICAM-‐1 y V-‐CAM-‐1),
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quimiocinas (MIP, RANTES,...) y enzimas (COX-‐2, iNOS,...) relevantes en los procesos inflamatorios (149).
-‐El complejo GCRα-‐ligando y enzimas con actividad deacetilasa (p.ej.: HDAC-‐2), que implica la deacetilación de las histonas, lo que compactará la cromatina y se inhibirá la transcripción de genes (155).
-‐El GCRα-‐ligando y proteínas co-‐activadoras. Los GCs podrían inhibir también la transcripción de ciertos genes compitiendo con otros factores de transcripción por las proteínas con actividad acetilasa, pej.CBP/p300 (142).
FIGURA 9: Mecanismos de acción genómicos de los GCs. Fuente: Smoak y cols.(149)
Otra forma de reprimir la expresión génica es post-‐transcripcionalmente, incidiendo en la degradación del RNAm y por consiguiente, en la síntesis proteica. La estabilidad del RNAm de muchos genes inflamatorios está regulada por unas regiones ricas en adenosina/uracilo en el extremo 3’ de las
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regiones no codificantes (156). Estas regiones son el lugar de unión de proteínas como la tristetraprolina o HuR que retardan la degradación del RNAm (144). Parece ser que los GCs inhibirían estas proteínas, acelerando así la degradación del RNAm. No se conoce el mecanismo exacto de esta inhibición, porque no parece que los corticoides tengan un efecto sobre la expresión de estas proteínas (150, 157). Las MAPKs, además de tener un papel en la transcripción de genes inflamatorios, también lo tienen en la regulación post-‐transcripcional. Se ha observado que regulan la inflamación a través de la estabilización y traducción del RNAm (158). El hecho que varios genes reprimidos por los GCs estén a la vez regulados post-‐transcripcionalmente por la p38 MAPK, sugiere otra forma de interferir en la estabilidad del RNAm (159).
3.2.2.-‐ Mecanismos no genómicos
Los GCs también inducen efectos rápidos que tienen lugar en minutos y hasta en segundos después de su aplicación. Estos efectos se llaman no genómicos, ya que son independientes de transcripción y síntesis proteica. Este tipo de acciones se han observado en la transmisión de señales inflamatorias (incluyendo vías MAPK), en el intercambio iónico de calcio (principalmente en la degranulación de los neutrófilos y en la de fagocitosis de los macrófagos) y en la adhesión celular (160).
Este tipo de acciones están mediadas por mensajeros secundarios, cambios en el flujo iónico de la célula y por la activación de las vías de las quinasas, que se darán a través de la unión de los GCs a la membrana celular o a través de la unión a los receptores citoplasmáticos clásicos o a receptores de membrana:
• Algunos efectos no genómicos de los esteroides parecen estar mediados por la alteración de las propiedades fisicoquímicas de las membranas celulares. Los GCs son moléculas muy lipofílicas que difunden fácilmente en las membranas lipídicas, donde a elevadas concentraciones pueden interferir en la función de las proteínas de membrana, tales como los canales iónicos. En pacientes asmáticos, el tratamiento con dexametasona
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produce una reducción de calcio intracelular en el epitelio de las vías aéreas que bloquea la hipersecreción de mucus (161). También pueden interferir en la disponibilidad de energía en forma de adenosín trifosfato (ATP) inhibiendo reacciones de fosforilación oxidativa e incrementando la pérdida de protones en la membrana mitocondrial (162). En este sentido, el descenso de la disponibilidad energética se asocia a la inmunosupresión de los GCs sobre las células inmunes, las cuales precisan gran cantidad de ATP para sus funciones básicas (163).
• Los GCs pueden unirse a sus receptores citoplasmáticos y ejercer funciones independientes de unión al DNA. Como se ha indicado anteriormente, algunos de los componentes del multicomplejo proteico que retiene el GCR en el citoplasma, son proteínas con capacidad de desencadenar señales intracelulares. La unión del GCR y su ligando desmontará el heterocomplejo liberando proteínas como la quinasa Src que inhibe la liberación del ácido araquidónico para la producción de metabolitos inflamatorios y de la activación de lipocortina 1 (164).
• Otra forma de actuar que tienen los GCs, es mediante la unión a un receptor de membrana, aunque este mecanismo no está muy definido todavía. Este tipo de receptores se encuentran en células mononucleares como monocitos y linfocitos. Su expresión aumentaría con la actividad de la enfermedad (165). El aumento en el número receptores para los GCs induce apoptosis, por lo que este mecanismo se relaciona con la inmunosupresión (163). Por otra parte, recientemente se ha descrito que estos receptores cuando se activan son capaces de inhibir LCK y FYN, quinasas claves de la vía activadora por TCR (160, 166). Lo que supone una disminución en la producción de citocinas, proliferación y diferenciación de los linfocitos T (167).
3.2.3.-‐ Bloqueo de la actividad NF-‐kB por los Glucocorticoides
Como se ha indicado anteriormente, la inflamación esta mediada por el incremento de la expresión de múltiples proteínas inflamatorias incluyendo citocinas, quimiocinas, moléculas de adhesión y enzimas inflamatorios. El
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incremento de transcripción de gran parte de estas proteínas, esta regulado por factores de transcripción pro-‐inflamatorios como NF-‐kB y AP-‐1.
La represión de NF-‐KB es de especial interés por su implicación patológica en la EII (168). Se ha sugerido distintos mecanismos por los que los GCs median la inhibición de NF-‐kB:
• A través de la unión del GCRα con la subunidad p65 del NF-‐kB. Esto impide que el NF-‐kB interaccione con el DNA y ejerza su función.
• La competición entre NF-‐kB y GCR por cofactores necesarios para la transcripción, como CBP y SRC-‐1, podría explicar la existencia de un antagonismo mutuo de sus actividades. Algunos estudios han revelado que el lugar de unión de SRC-‐1 es el mismo para los dos factores de transcripción (149).
• El reclutamiento de la HDCA-‐2 por parte del GCRα-‐ligando inhibirá la actividad acetilasa de la subunidad p65 del NF-‐kB, compactando la cromatina y por consiguiente impidiendo la transcripción dependiente de NF-‐kB (155).
• El NF-‐KB estimula la elongación del RNAm a través del factor p-‐TEFb, que fosforila el dominio C-‐terminal de la RNA polimerasa II para su activación. En este caso, el GCRα unido a ligando interfiere en la fosforilación de la RNA polimerasa impidiendo la transcripción (169).
• Otra forma suprimir la actividad NF-‐kB por parte del GCRα-‐ligando es mediante la síntesis de su inhibidor, IkB-‐α, que lo mantendrá inactivo en el citoplasma (149).
• Recientemente se ha demostrado que los GCs podrían interferir en la vía de activación del NF-‐kB, modulando la actividad IKK a través de la acción de la quinasa PI3K (170).
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3.3.-‐ Glucocorticoides en la enfermedad inflamatoria intestinal
Aunque generalmente son una terapia efectiva en la reducción de los parámetros inflamatorios y en la inducción de la remisión de la EII, existe una porción de los pacientes que responde poco o no responde al tratamiento. Tal y como demuestra el estudio de Faubion et al., los porcentajes de los pacientes de enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa que entran en remisión inmediata después del tratamiento con esteroides es del 58% y 54% respectivamente; en remisión parcial sin poder dejar el tratamiento es del 26% y 30%; y el 16% en ambas entidades no responden al tratamiento (171). Al cabo de un año, el 32% de los pacientes con enfermedad de Crohn y 49% en colitis ulcerosa estaban en remisión, mientras que el 38% y 29%, respectivamente, necesitaron terapia alternativa quirúrgica. Esta variabilidad conlleva una clasificación clínica de los pacientes con EII, con respecto a la sensibilidad al tratamiento con GCs, aunque puede ser cambiante durante el curso de la enfermedad:
• Corticosensibles: Para la colitis ulcerosa, aquellos que responden bien al tratamiento, en general con una disminución del índice de actividad usado de más del 30%, junto con una disminución de los baremos endoscópicos y la hemorragia rectal. En la enfermedad de Crohn, se consideran sensibles al tratamiento cuando el índice de actividad de la enfermedad (CDAI) disminuye en al menos 70 puntos (66, 67).
• Corticodependientes: Pacientes de colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn a los que no se les puede reducir los corticoides por debajo del equivalente a 10mg/día de prednisolona en los 3 meses siguientes al inicio del tratamiento, o que tengan una recaída en un plazo de 3 meses tras la suspensión del tratamiento (66, 67).
• Corticorrefractarios o corticorresistentes: Son los pacientes de EII que no respondan al tratamiento esteroideo, con la presencia de enfermedad activa a lo largo de un periodo de 4 semanas (66, 67).
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3.3.1.-‐ Consecuencia de la respuesta inadecuada a los esteroides en la enfermedad inflamatoria intestinal
Destacar tanto para la corticodependencia como para la corticorrefractariedad lo importante que es el cambio terapéutico ante el fracaso de los GCs para limitar su administración y reducir los graves efectos secundarios como osteoporosis (172), diabetes mellitus (173) y riesgos cardiovasculares (174), a parte de los grandes costes socio-‐económicos y sanitarios de la EII.
Debido a las razones anteriores y por el hecho que se ha observado que una indicación precoz del tratamiento médico o quirúrgico alternativo a los esteroides, sobretodo en la colitis ulcerosa grave o fulminante, conlleva una reducción drástica de la morbi-‐mortalidad de estos pacientes (175), es de especial importancia descubrir los factores relacionados con el fracaso al tratamiento con GCs e identificar los factores predictivos de la refractariedad.
En este sentido, diferentes estudios clínicos han identificado algunos factores capaces de predecir la respuesta inadecuada a los GCs en al EII:
• Para la colitis ulcerosa, un número importante de deposiciones antes del diagnóstico y durante los primeros días de tratamiento, una persistencia en los niveles elevados de la proteína C reactiva, fiebre, dilatación del colon o hipoalbuminemia, son factores que se asocian con el fracaso terapéutico a esteroides (176-‐178).
Por otra parte, existen estudios en pacientes de colitis ulcerosa colectomizados a causa del fallo terapéutico o megacolon tóxico, que relacionan la infección por citomegalovirus con una peor evolución de la enfermedad (179). La mayoría de veces las infecciones por este virus en pacientes activos se relacionan con la respuesta inadecuada a los GCs, por lo que los pacientes con colitis ulcerosa activa deben cambiar el tratamiento de primera línea por los inmunosupresores (180, 181).
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• Valores elevados de Proteína C Reactiva (>20mg/L), cirugía previa, CDAI inicial elevado o inicio de la enfermedad en edad temprana son factores asociados no tan solo a la refractariedad a los GCs, sino también incrementan el riesgo de recidiva en la enfermedad de Crohn (182, 183).
3.4.-‐ Fisiopatología de la corticorresistencia
Mientras las bases moleculares de la resistencia al tratamiento con GCs se conocen bastante en enfermedades inflamatorias como el asma o la artritis reumatoide, la fisiopatología de la respuesta inadecuada a corticosteroides en la EII ha sido poco estudiada. No obstante los pacientes con poca o nula respuesta a los corticoides padecen de todas formas los efectos no deseados de estos, considerándose el problema de la corticorresistencia es específica de tejido/órgano.
Aunque la corticorresistencia es más frecuente en pacientes con enfermedad más grave, no se ha aclarado si la no respuesta al tratamiento convencional es un fenómeno primario o si la capacidad antiinflamatoria de los corticoides se ve desbordada por un exceso de mediadores inflamatorios. En favor a la primera opción Hearing y Cols. (184, 185) evaluaron la capacidad de la dexametasona en inhibir la proliferación de células T intestinales en pacientes con colitis ulcerosa activa clasificados en corticorresistentes, corticodependientes y corticosensibles. La inhibición de la proliferación en los dos primeros grupos fue < 60%, mientras que en los sensibles al tratamiento fue > 60%, demostrando así que la resistencia a la apoptosis en las células T es un factor clave en la respuesta de los GCs. En este sentido, recientemente se ha identificado al fenotipo de células T CD4+CD25int como responsable de la perpetuación de la inflamación después del tratamiento con esteroides (186).
Además, estudios con linfocitos T procedentes de individuos sanos muestran una amplia variación en la respuesta frente a los corticoides (185). De aquí se desprende la idea de que la corticorresistencia sea una característica
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intrínseca del individuo, y que la gravedad o extensión de la enfermedad per se no son suficientes para explicar este fenómeno.
3.4.1.-‐ Mecanismos de corticorresistencia
Se han descrito varios posibles mecanismos que explicarían la defectuosa capacidad inhibitoria sobre la inflamación por parte de los GCs, algunos de ellos a partir de estudios con pacientes de EII, mientras que otros han sido descritos en otras patologías inflamatorias como el asma o la artritis reumatoide.
• A nivel de GCR
Parece ser que existe una controversia en la implicación del número o cantidad de GRα en el mecanismo de la corticorresistencia en EII. En un estudio donde se cuantificaba los niveles de RNAm del GR, se observó un aumento en los pacientes en comparación con los controles, pero no hubo diferencia entre pacientes que responden y que no a los esteroides (187). Sin embargo, en otros estudios no se observaron diferencias de expresión del GCR, ni en la mucosa colónica ni en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), entre pacientes con colitis ulcerosa y controles pero sí una disminución de este en pacientes resistentes al tratamiento (103). Las conclusiones contradictorias pueden ser el resultado de los métodos de cuantificación y de las características de la población usada en cada uno de los estudios.
Por otra parte, existe la idea que una afinidad por el ligando alterada por parte de los receptores podría ser otra posible explicación a la resistencia terapéutica. Esta disminución de la afinidad a ligando puede estar mediada por las citocinas IL-‐2 e IL-‐4 (188), aumentadas en la EII y que influirían en la fosforilación del receptor por parte de p38 MAPK (189).
La isoforma GCRβ como regulador negativo del receptor funcional GcRα, puede ejercer un rol determinante en la corticorresistencia, abalado por diferentes estudios que han mostrado un aumento en la expresión de este,
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tanto en mucosa colónica como en PBMC de pacientes que no respondían al tratamiento en comparación a aquellos que sí lo hacían (190, 191). Pero esta explicación se encuentra con argumentos que los contradicen, ya sea porque no encuentran diferencias en la expresión por el tipo de respuesta (192) o porque lo niveles de GCRβ son mucho más bajos en casi todos los sistemas celulares, siendo incapaz de inhibir la función de la isoforma α (193).
De un trabajo hecho con un modelo experimental de artritis reumatoide murino, donde además se ha mutado la capacidad de dimerización del GCR en linfocitos T, se desprende la idea de que una respuesta adecuada a los GCs y varios de sus efectos antiinflamatorios dependen de la formación correcta del dímero y su unión al DNA (194). Aunque se han descrito varios polimorfismos en gen del GCR (p.ej.: ER22/23EK, N363S, GCR-‐9β, etc.) no se ha podido establecer ninguna relación clara con la respuesta a corticoides en la EII (195).
• A nivel del heterocomplejo proteico
Una buena integridad del complejo proteico que retiene al GCR en el citoplasma es requerida para una unión óptima del ligando y la subsecuente activación de la respuesta transcripcional. Por lo que anomalías en las chaperonas y co-‐chaperonas que constituyen este multicomplejo, podrían estar implicadas en la mala respuesta a los esteroides. En este sentido, estudios con asmáticos resistentes a GCs han revelado una disminución de la Hsp90 en PBMC (196).
• Gen MDR1 y la respuesta inadecuada a los GCs
El gen MDR-‐1 codifica para la glicoproteína p-‐170 (Pgp-‐170) expresada en la membrana de linfocitos y células epiteliales. Pgp-‐70 es una bomba extractora de diferentes sustratos hacia el exterior de las células incluyendo fármacos como los GCs. El hecho de que diminuya la concentración intracelular de esteroides, puede ser una pieza clave en la aparición de su ineficacia. A favor de esta hipótesis, la elevada expresión encontrada del gen MDR-‐1 en linfocitos y células epiteliales de pacientes con EII que precisaron cirugía por fracaso a los corticoides (197). Aunque algunos polimorfismos como C3435T o
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C1236T en los exones 26 y 12 de este gen alteran la función y en la expresión de la Pgp-‐170, no se ha logrado asociarla a la resistencia terapéutica en la EII (195).
• Corticorresistencia a nivel de transcripción
Los GCs pueden favorecer la condensación de la cromatina para impedir la expresión de algunos genes inflamatorios. La reducida expresión de HDCA2 detectada en PBMC y macrófagos de pacientes con asma que no responden a los GCs (198), podría ser la causa de la resistencia al tratamiento. También en enfermedad pulmonar obstructiva crónica, donde los pacientes apenas responden al tratamiento esteroideo, se ha comprobado que una de las principales causas es la reducción en la actividad de HDCA2 por el estrés oxidativo (150, 157). En la EII también existe un cierto grado de estrés oxidativo que podría explicar, en parte, la deficiente respuesta a corticosteroides (150). Por otro lado, el complejo SWI/SNF encargado de la remodelación de la cromatina necesaria para la transcripción, es reclutado por el GCR-‐ligando. En pacientes con leucemia linfocítica aguda la menor expresión de algunos de los componentes de el complejo SWI/SNF (como por ejemplo, el SMARCB1) se ha relacionado con la resistencia a los GCs (199).
• Influencia de los mediadores inflamatorios
Como se ha definido anteriormente uno de los mecanismos de represión génica de los GCs, es mediante la unión a factores de transcripción pro-‐inflamatorios como el NF-‐kB. De la misma forma, este factor (200) podría regular negativamente la transcripción mediada por el complejo GCR-‐ligando (149). En células mononucleares de pacientes con artritis reumatoide no respondedores al tratamiento, los GCs fueron incapaces de bloquear la elevada actividad de NF-‐kB in vitro (200). Bantel H y cols. (201) demostraron un patrón diferente de localización del NF-‐kB y proteínas de sus vías de señalización, entre pacientes con enfermedad de Crohn con diferente respuesta al tratamiento con esteroides. Así pues, la localización del NF-‐kB activo, como la p38 MAPK y la quinasa c-‐Jun N-‐terminal (JNK), se observó en macrófagos de la lamina propria en pacientes corticosensibles, mientras que
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sen corticorresistentes el marcaje se observó en células epiteliales. Por lo que los autores sugieren que una excesiva y constitutiva activación del NF-‐kB en el epitelio intestinal, podría estar involucrado en la corticorresistencia de la enfermedad de Crohn.
Existen varios estudios que sugieren que las citocinas modifican los efectos de los Gcs. Ya hemos comentado el papel que jugarían las citocinas IL-‐2 y IL-‐4 en la corticorresistencia, disminuyendo la afinidad del GCR por su ligando. Pero también la IL-‐1β es un mediador clave en el mantenimiento de la inflamación que contrarresta los efectos de los GCs sobre la represión de NF-‐kB en líneas celulares epiteliales intestinales (202). El TNF-‐α disminuye la sensibilidad de los GCs en monocitos y se encuentra más elevado en la mucosa de pacientes con colitis ulcerosa corticorresistentes (203).
Otra citocina que tiene potentes efectos pro-‐inflamatorios que antagoniza los efectos de los GCs es el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) (204). Niveles elevados de esta citocina se han encontrado en células mononucleares de la lamina propria de pacientes con colitis ulcerosa corticorrefractaria (205). Además en el mismo estudio aparece una elevada producción de IL-‐8 y una activación del eje MIF/p38 MAPK que se relaciona con la aparición de la resistencia al tratamiento con esteroides. Aunque otros estudios relacionan los efectos de la MIF sobre los GCs mediante la inhibición de la expresión de IkB-‐α y MKP-‐1 (206, 207).
La deficiencia observada de la citocina antiinflamatoria IL-‐10 en pacientes con enfermedad de Crohn corticorresistentes antes de la administración del tratamiento (208), sugiere la existencia de una relación entre la presencia de esta proteína con una buena respuesta a los GCs. En el mismo estudio, se propone esta citocina como un buen marcador predictivo de respuesta a corticoides. En esta misma línea, otro estudio muestra una menor secreción de IL-‐10 por parte de células dendríticas en pacientes de Crohn con un fenotipo de la enfermedad más agresivo, y por ende, con una respuesta inadecuada a los GCs (209). Por lo tanto, la aparición de ciertas citocinas pro-‐inflamatorias, o bien la deficiencia en la producción de citocinas
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antiinflamatorias o reguladoras pueden ser claves en la corticorrefractariedad.
• Corticorresistencia a nivel celular
La secreción de IL-‐10 por células Treg en respuesta a los GCs esta inhibida en pacientes con asma resistentes a esteroides. No obstante, el tratamiento con vitamina D revierte el proceso, sensibilizando a los pacientes frente a los corticoides (210). Dado que la Vitamina D es importante para el desarrollo de las células Treg, una dieta escasa en esta vitamina o la falta de luz solar, podrían ser factores que contribuirían a la resistencia a GCs (198).
Tanto la apoptosis de linfocitos T como de monocitos, se considera un mecanismo clave en la acción antiinflamatoria de los GCs, por lo que existen varios estudios en este sentido. Células T de lamina propria de pacientes con enfermedad de Crohn muestran una expresión baja de la proteína pro-‐apoptótica Bax de forma que aumenta el ratio Bcl-‐xl (proteína anti-‐apoptótica)/Bax (110). De hecho, en la etiopatogenia de la enfermedad de Crohn se considera que uno de los componentes capaces de perpetuar la inflamación es un defecto que hace insensibles a las células T activas a la apoptosis (211). Más recientemente, se ha demostrado que no todos los pacientes Crohn tienen una deficiencia en la apoptosis, sino solo aquellos que son refractarios o dependientes al tratamiento con corticoides (208). Además, el mismo estudio mostró una mayor apoptosis en células B de pacientes sensibles al tratamiento, involucrando también a este subgrupo celular en la fisiopatogénia de la corticorrefractariedad.
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Antecedentes, hipótesis y objetivos
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Antecedentes e hipótesis
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4. Antecedentes e hipótesis La EII es una compleja patología cuya incidencia está en aumento en nuestro país, representado en la actualidad una de las enfermedades crónicas de manejo hospitalario más frecuentes y que conlleva la utilización de numerosos recursos sanitarios.
Los esteroides son el fármaco de primera línea en los brotes de actividad moderada o grave en la colitis ulcerosa (123), a pesar de que distintos estudios han demostrado que hasta un 60% de los pacientes no responde adecuadamente al tratamiento esteroidal, siendo ineficaces en un 30% y sólo parcialmente eficaces en otro 30% (171). La refractariedad a esteroides es una grave complicación en el tratamiento de la colitis ulcerosa y en la EII en general. La pérdida de eficacia no reduce los efectos secundarios de los corticosteroides y supone la substitución terapéutica. En este sentido, se ha comprobado que una indicación terapéutica correcta y precoz reduce drásticamente las complicaciones de la enfermedad (175).
Trabajos de nuestro grupo sobre las complicaciones terapéuticas en la EII han revelado un aumento de la apoptosis en las células T y B de la mucosa intestinal en pacientes con enfermedad de Crohn sensibles al tratamiento con GCs (208). De hecho, estudios anteriores ya habían sugerido que defectos en la inducción de la apoptosis de las células T de la lamina propria intestinal estarían relacionados con la patogénesis de la enfermedad de Crohn (211). Pero este mecanismo no es el único atribuido a la corticorresistencia. Distintos trabajos han relacionado el fracaso a esteroides con la presencia de polimorfismos en el gen MDR-‐1 que inducen un aumento de los niveles de la Pgp-‐170, cuya actividad es la detoxificación celular lo que se relaciona con un descenso de los niveles intracelulares de GCs (197).
Aunque la mayoría de acciones inmunosupresoras de los GCs se han descrito sobre células inmunes (141, 212), existen estudios donde las células diana de los corticoides son los enterocitos. La reabsorción intestinal de glucosa observada tras la administración oral de dexametasoma es revertida en ratones deficientes para el GCR (83) en enterocitos, evidenciando la
Antecedentes e hipótesis
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implicación de las células epiteliales en algunos mecanismos de acción de los GCs (213).
Nuestro grupo ha demostrado que la presencia de RNAm de la IL-‐10 en biopsias de pacientes con enfermedad de Crohn activa, antes del tratamiento con esteroides (208), se asoció con una buena respuesta a los GCs. La deficiencia de esta misma citocina inmunoreguladora en modelos animales se ha asociado con un aumento de la permeabilidad intestinal y al desarrollo de colitis espontánea (83). Asimismo, la IL-‐10 es capaz de reducir el estrés del retículo endoplasmático en células epiteliales del intestino producido por TNF-‐α (62).
En conjunto, las premisas anteriores sugieren un papel clave de la IL-‐10 sobre el epitelio intestinal, capaz de regular la función barrera e introducir cambios antiinflamatorios. No obstante, los mecanismos moleculares promovidos por la IL-‐10 sobre las células del epitelio intestinal y si estos influyen sobre la respuesta a los GCs, son poco conocidos.
HIPÓTESIS:
La IL-‐10 influye en la actividad del epitelio intestinal favoreciendo el aislamiento de la lamina propria, facilitando la respuesta a los esteroides en pacientes con colitis ulcerosa activa.
Objetivos
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5. Objetivos
• Comprobar en un modelo in vitro si la presencia de IL-‐10 puede favorecer la respuesta a los GCs actuando sobre la función barrera en las células epiteliales del intestino.
• Averiguar si estos cambios in vitro también son percibidos en la mucosa cólica de pacientes con colitis ulcerosa activa con diferente respuesta al tratamiento con GCs.
Objetivos
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Material y métodos
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Métodos
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6. Métodos
6.1.-‐ Evaluación de la apoptosis inducida por dexametasona en células T aisladas de sangre de controles sanos
6.1.1.-‐ Muestras y procedencia
Se partió de 20 ml de sangre periférica de 7 individuos sanos, a partir de la cual se aislaron las células T para los posteriores experimentos. La sangre se recogió en nuestro centro, Hospital Universitari “Germans Trias i Pujol”, por personal autorizado y para ello se usaron tubos con anticoagulante EDTA de 10 ml.
6.1.2.-‐ Aislamiento de linfocitos T de sangre periférica
Se llevó a cabo una separación celular por gradiente de ficoll® (Linfoprep). Para conseguirlo se diluyó la sangre 1:1 con suero fisiológico y la mezcla se depositó, con cuidado de no romper el gradiente, encima de una capa de 10 ml de ficoll previamente añadidos. A continuación se centrifugó a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1500 rpm sin freno. Se recuperó la interfase que es donde se encontraban los linfocitos y otras células mononucleares y se hicieron 3 lavados de 7 minutos a 1500 rpm con medio RPMI más antibióticos. Después del último lavado se resuspendió el pellet con un volumen conocido de medio, para el recuento y viabilidad celular en la cámara de Neubauer con azul de tripano. A continuación, se resuspendió el pellet en solución MACS a relación de 40 µl por cada 107 células para proceder a la selección celular.
La separación de las células T se hizo mediante selección negativa por el sistema de separación MACS® (Figura 10) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Este método se basa en el aislamiento de las células de nuestro interés presentes en una mezcla mediante el reconocimiento por anticuerpos específicos conjugados con partículas metálicas que permiten la retención del resto de células no deseadas en columnas magnéticas. Para ello se usó el kit comercial para muestras humanas: Pan T Cell insolation.
Métodos
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A la suspensión se le añadieron 10 µl del cóctel de anticuerpos biotinilados anti-‐células no T y se incubó durante 10 minutos a 4ºC. Seguidamente, se añadieron 20 µl de las microesferas magnéticas anti-‐biotina y se dejaron incubar 15 minutos a 4ºC. Pasado ese tiempo, se añadió unas 10 veces el volumen de la suspensión celular resultante de solución MACS y se centrifugó todo a 300xg durante 10 minutos. El pellet se volvió a resuspender con 500 µl de solución MACS. Después de montar la columna de retención LS en el sistema MACS, se hizo pasar la muestra a través de ella. Los complejos formados por las microesferas-‐anticuerpo-‐célula no T, fueron retenidos en la columna dejando pasar las células T, que se recogieron con la elución en un tubo aparte (Figura 10). De nuevo se hizo un recuento celular, para saber el número de linfocitos con los cuales contábamos para los experimentos de estimulación a través de TCR.
Microesferas metálicas unidas a células no T
Células T
Columna de retención MACS
Imán sistema MACS
Tubo de recolección con las células T
FIGURA 10: Sistema y principio de separación por selección negativa MACS para células T.
6.1.3.-‐ Diseño experimental
Para llevar a cabo los experimentos con células T, estas se activaron con un estímulo proliferativo vía TCR/MEK, mediante anticuerpos CD3 y CD28, de
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duración breve (durante 24h) o prolongada (durante 72h). La apoptosis se indujo mediante dexametasona (GCs) en comparación con el inhibidor de la MEK (PD98059), o bien con la combinación de ambos.
Las condiciones experimentales resultantes fueron las siguientes:
Para la estimulación, se incubaron los linfocitos T en placas de 96 pocillos, de fondo plano y con una superficie de alta adherencia. El anti-‐CD3 se añadió diluido en 100 µl de PBS 1x estéril a cada pocillo y dejándolo 90 minutos a 37ºC para conseguir unirlo a la placa. Pasado ese tiempo, se retiró el volumen de los pocillos por inversión y seguidamente, se bloqueó la placa con albúmina de suero bovino (BSA) al 3% en PBS 1x estéril, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se hicieron dos lavados con PBS 1x estéril y el último se hizo con medio para el cultivo de linfocitos AIM-‐V.
Una vez preparada la placa, se sembraron 105 linfocitos T por pocillo en medio 100 µl AIM-‐V con CD28, al cual se le añadió dexametasona y/o PD98059 según las condiciones. Para los estímulos breves, a las 24h se cambiaron las células a una placa nueva sin estímulo y se añadió el medio con el resto de los componentes hasta las 72h. En cambio, la incubación con el estímulo continuado se prolongó durante 72h, con una renovación del medio correspondiente, a las 24h (Figura 11). En las condiciones con PD98059, las células se incubarán previamente al inicio de la estimulación solo con el inhibidor. Esta pre-‐incubación se hará en eppendorfs a 37ºC
Condición CD3 (5µg/ml)
CD28 (2.5µg/ml)
GCs (Dexametasona,
0.1µM)
PD98059 (100µM)
CD3/CD28 24h (basal) X X CD3/CD28 72h (basal) X X CD3/CD28 24h_GCs X X X CD3/CD28 72h_GCs X X X CD3/CD2824h_PD98059 X X X CD3/CD2872h_PD98059 X X X CD3/CD28 24h_GCs_PD98059 X X X X CD3/CD28 72h_GCs_PD98059 X X X X
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durante 1 hora, como indica el fabricante. Los grupos basales se incubaron solo con el estímulo CD3/CD28 de forma breve o prolongada, siguiendo las mismas pautas anteriores. Pasadas 72h se recogieron las células de todas las condiciones en tubos y se hicieron 2 lavados con PBS 1x estéril.
Estímulo prolongado
Dexametasona PD98059
Dexametasona PD98059
Estímulo CD3/CD28
Estímulo CD3/CD28
Estímulo breve
0h 24h 72h
Estímulo CD3/CD28Estímulos breve y prolongado BASALES Estímulo CD3/CD28
Retirada o renovación del estímulo (según condición) y cambio de
medio Siembra células T
Valoración apoptosis
FIGURA 11: Esquema de estimulación y diseño experimental con células T estimuladas con CD3/CD28 y tratadas con o sin GCs y/o PD98059.
6.1.4-‐ Valoración del grado de apoptosis en linfocitos CD4+ y CD8+, mediante citometría de flujo
La apoptosis se evaluó mediante Anexina V-‐PE y 7-‐AAD, mientras el fenotipo se identificó con anti-‐CD4-‐APC o anti-‐CD8-‐FITC. Se añadieron 5 µl por 106 células de cada anticuerpo conjugado y se dejó incubar durante 20 minutos en oscuridad a 4ºC. Luego, para eliminar el exceso de anticuerpo no unido, se hicieron dos lavados con PBS 1x (10 minutos a 1300 rpm).
Para la valoración del grado de apoptosis se usó el kit Annexin V-‐PE apoptosis detection. Este kit se basa en la afinidad de la anexina V por la fosfatidilserina, fosfolípido presente en la parte interna de La membrana plasmática que cuando las células entran en apoptosis se externaliza, y en el
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Apoptosis tardía o muerte celular
Células viables
Apoptosis temprana
Anexina V
7-‐AA
Dmarcador vital 7-‐AAD, que solo entrará en las células con una membrana degradada. Por lo que este kit puede detectar células viables (Anexina V negativa y 7-‐AAD positivo), células en apoptosis (Anexina V positiva y 7-‐AAD negativo) y necrosis (Anexina V y 7-‐AAD positivos) (Figura 12).
FIGURA 12: Cuadrantes de identificación del grado de apoptosis mediante los marcadores Anexina V y 7-‐AAD por citometría de flujo.
La muestra resultante de la centrifugación anterior se resuspendió con la solución de unión 1x del kit, 100 µl por 105 células, a la que se añadió 5 µl de los marcadores Anexina V-‐PE y 7-‐AAD. Se vortearon suavemente las muestra para mezclarlas y se incubaron durante 15 minutos en oscuridad y a temperatura ambiente. Para pasar la muestra por el citómetro de flujo de cuatro canales (BD, Franklin Lakes, USA.) antes se añadieron 400 µl de solución de unión.
La adquisición de las muestras en el citómetro se hizo hasta tener un mínimo de 10.000 linfocitos valorados. Anteriormente se habían calibrado las fluorescencias de todos los marcadores por separado, para delimitar bien las regiones de captación y evitar el solapamiento de señal (Figura 13).
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Figura 13: Plots de citometria de flujo donde se valora el fenotipo de linfocitos T, CD4 y CD8, además del grado de apoptosis mediante Anexina V-‐PE y 7-‐ADD. La Figura A,
sería un ejemplo de los grupos con un %
de apoptosis bajo, en comparación con la
figura B, donde se observa un valor más
elevado.
CD4+
CD8+
CD8+ CD4+
7.41 % Apoptosis
A
CD8+ CD4+
CD4+
CD8+
22.74 % Apoptosis
B
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Los resultados se expresaron como incrementos porcentuales respecto a sus condiciones con estímulo basal a 24h o 72h, para restar el posible efecto de este en la apoptosis celular. Esta normalización de los resultados se hizo mediante la fórmula:
6.2.-‐ Estudios in vitro sobre monocapas de células Caco-‐2 confluentes.
6.2.1.-‐ Muestras y procedencia
La línea celular utilizada fue la línea epitelial Caco-‐2, derivada del carcinoma de colon humano. Bajo condiciones estándar de cultivo dan lugar a monocapas celulares y presentan características morfológicas y bioquímicas similares a las de los enterocitos diferenciados (214, 215).
Las células se obtuvieron de la European collection of cell cultures (ECACC) con un número de pases +8. Se almacenaron en alícuotas de 106 células en medio D-‐MEM con 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotector
6.2.2.-‐ Cultivo celulares sobre transwells y estimulaciones
El cultivo en transwells o filtros semipermeables favorece la polarización de las células Caco-‐2 (215). Estos sistemas poseen una membrana de polietileno en la base, de 0.4µm de poro, donde se adhieren las células (Figura 14) y les permite crecer en monocapa, con una gran semejanza funcional a las células epiteliales del intestino.
Valor condición experimental -‐ valor condición basal Valor condición basal
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Células adheridas a membrana de polietileno
Transwell
FIGURA 14: Detalle del sistema transwell usado para el cultivo de monocapas de células Caco-‐2.
Primero, se descongelaron 106 células almacenadas en nitrógeno líquido (-‐196ºC) en un baño a 37ºC. Una vez descongeladas se añadieron a un tubo con 5 ml de medio cultivo D-‐MEM y se centrifugaron a 900 rpm 5minutos para eliminar el DMSO. El pellet se resuspendió en 6 ml de medio de cultivo, que se añadió directamente a un frasco de 75 cm2. El cultivo celular se mantuvo a 37ºC con 5% de CO2, realizando un cambio de medio a días alternos, hasta llegar al 80% de confluencia, momento en que las células se sub-‐cultivaron aumentando así el número de pase. Para ello, se separaron las células adheridas a la superficie de los frascos de 75 cm2 realizando una suspensión de las mismas, mediante la adición de 3 ml de tripsina 0.25%, incubándolas a 37°C durante 4 minutos. Para inactivar la acción de la tripsina, se añadieron 5 ml de medio D-‐MEM y la resuspensión se transfirió a un tubo de 15 ml que se centrifugó a 900 rpm durante 5 minutos. Luego se descartó el sobrenadante y el pellet se volvió a resuspender de forma homogénea con 4-‐5 ml de medio D-‐MEM. A partir de esta suspensión se hizo el recuento de células viables mediante la cámara de Neubauer y se sembraron en un nuevo frasco entre 6-‐7.105 células con 6 ml de medio de cultivo.
Son necesarios dos pases a partir de las células descongeladas para poder obtener una buena diferenciación celular en los transwells. Por lo tanto, una vez hechos dos pases, se volvieron a tripsinizar las células para recuperarlas
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pero esta vez se sembraron en los transwells a razón de 3.104 células por cada uno. En la parte basal del transwell se añadió 700 µl y 350 µl en la parte apical de medio D-‐MEM.
A los 21 días post-‐siembra, cuando este tipo celular se diferencia totalmente creando una monocapa celular con función barrera, se estimularon según las condiciones experimentales (ver punto 6.2.3). La estimulación se añadió al medio basal del filtro, que después de validar el tiempo de duración se acordó mantenerlo durante 48 horas con una renovación a las 24 horas (Figura 15).
FIGURA 15: Diseño experimental de las estimulaciones con células Caco-‐2.
6.2.3.-‐ Diseño experimental
Con las células Caco-‐2 se llevaron a cabo dos estudios:
a) Estudio I: Efecto de la sinergia entre IL-‐10 y GCs sobre la función barrera en monocapas de células Caco-‐2. Para este estudio se les indujo un estímulo inflamatorio mediante TNFα y se valoraron las capacidades antiinflamatorias o reparadoras de los GCs y la IL-‐10 en combinación o por separado. El grupo control se incubo sólo con medio D-‐MEM.
Métodos
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Se hicieron 7 réplicas de cada una de las siguientes condiciones:
b) Estudio II: Efecto de fosforilación de la p38 MAPK sobre las uniones intercelulares de células Caco-‐2. En el segundo estudio las células Caco-‐2 fueron igualmente tratadas con TNFα, y para determinar el papel que juega la fosforilación de p38 MAPK en las funciones reparativas de los GCs y IL-‐10, se añadió el inhibidor de la fosforilación de p38 MAPK, SB203580. Al estar el inhibidor disuelto en DMSO, a parte del control con medio de cultivo sólo, se incluyó un control con D-‐MEM y DMSO a la misma concentración final que en la condición inflamatoria, tal y como se observa en tabla siguiente:
De las condiciones anteriores se realizaron 8 réplicas de cada una.
6.2.4.-‐ Medida de la Resistencia Eléctrica Transepitelial
La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) mide el paso de electrones a través de una monocapa celular. Este es un buen indicador de la confluencia celular y de la integridad de la monocapa, así como de la formación de las
Condición D-‐MEM TNF-‐α (100ng/ml)
GCs (Metilprednisolona, 50µM )
IL-‐10 (20ng/ml)
Control X TNF-‐α X X TNF-‐α_GCs X X X TNF-‐α_IL-‐10 X X X TNFα_GCs_ IL-‐10 X X X X
Condición D-‐MEM TNF-‐α (100ng/ml)
GCs (Metilprednisolona,
50µM )
IL-‐10 (20ng/ml)
Inhibidor (SB203580, 20µM)
DMSO (20µM)
Control X DMSO X X TNFα_GCs X X X TNFα_GCs_ IL-‐10
X X X X
TNFα_GCs_ IL10_SB203580
X X X X X X
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uniones estrechas intercelulares y del estatus de la función barrera (216). Con la ayuda de un Volt-‐óhmetro se determinó el potencial de membrana y la resistencia transepitelial entre el compartimento basal y el apical de las monocapas confluentes de células Caco-‐2 (Figura 16).
FIGURA 16: Detalle de la medida de TEER
Para saber la evolución de este parámetro en nuestras monocapas de Caco-‐2 como consecuencia de las diferentes condiciones experimentales, se recogió el valor basal de TEER (TEERi) a los 21 días post-‐siembra (antes del inicio de la estimulación) como referencia y se comparó con el valor final (TEERf), a las 48h de estimulación. Anteriormente, a los 14 días post-‐siembra, se hizo un registró de este parámetro como control del buen crecimiento celular y del desarrollo de la barrera (Figura 15). Para la medición de la TEER, los transwells se trasladaron a una placa de 24 pocillos con PBS estéril y a temperatura ambiente.
Al valor TEER obtenido se le restó el valor blanco (resistencia ofrecida por un transwell sin monocapa de células adheridas) y los valores resultantes (en
ohms,�) se multiplicaron por el área del transwell (0.3 cm2) para obtener la
resistencia eléctrica transepitelial en �/cm2. Todos los estudios se llevaron a
cabo con una TEERi a los 21 días post-‐siembra, igual o superior a 450 �/cm2.
Los resultados fueron expresados como incrementos percentuales de TEER, mediante la fórmula siguiente:
Métodos
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6.2.5.-‐ Cuantificación de IL-‐8 mediante ELISA
La cuantificación de IL-‐8 como medida indirecta de inflamación, se hizo mediante la técnica ELISA a partir de los sobrenadantes basales de los cultivos celulares de Caco-‐2. Para ello se usó el kit comercial BD OptEIA set human IL-‐8 siguiendo las indicaciones del fabricante en placas de 96 pocillos.
Inicialmente, se diluyó el anticuerpo de captura en carbonato sódico 0.1M y se añadieron 100 µl de esta solución a cada pocillo, dejándolo durante toda la noche a 4ªC para la buena adhesión del anticuerpo a la superficie. Al día siguiente, se bloqueó la placa durante 1 hora con FBS al 10% en PBS y se hicieron los lavados indicados. Paralelamente, se prepararon los estándares de IL-‐8 (de 200 pg/ml a 3.1 pg/ml de proteína) mediante diluciones sucesivas a partir del stock (100ng/ml) con una solución de 10% FBS en PBS. Posteriormente, se añadió 100 µl de los sobrenadantes de los cultivos celulares y los estándares en cada pocillo, para incubarlos durante 2 horas a temperatura ambiente. Una vez desechado el contenido de los pocillos, se procedió a la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, con 100 µl los anticuerpos conjugados con estreptavidina unida a HRP, la detección se realizó a 450nm con el Varioskan (ThermoScientific, Waltham (MA), USA). Todas las muestras se valoraron por duplicado.
6.2.6.-‐ Extracción proteica y determinación de proteínas mediante Western blot
6.2.6.1.-‐ Obtención de proteína total
Las células Caco-‐2 se recuperaron con el medio de cultivo del transwell con la ayuda de una pipeta. El volumen se traspasó a un eppendorf estéril y se lavaron con PBS 1x a 4ºC. Para la extracción de la proteína total se incubaron las células durante 45 minutos en agitación y a 4ºC con 200 µl de la solución
TEERf-‐TEERi x100 TEERi
Métodos
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de lisado RIPA. A continuación se centrifugaron los tubos 15 minutos a 14000 rpm a 4ºC. El sobrenadante resultante con las proteínas se congeló en alícuotas a -‐80ºC.
6.2.6.2.-‐ Obtención de proteína soluble e insoluble
Para la obtención de la fracción proteica soluble e insoluble por separado se modificó el protocolo de extracción proteica total. Después de la incubación y centrifugación con el tampón RIPA, el sobrenadante se recuperará igual que para la proteína total considerando estas las proteínas más solubles. Esta vez el pellet resultante se incubó durante 50 minutos a temperatura ambiente con una solución de UREA/Thiourea. Después se realizó una ultracentrifugación (50000xg) de 1hora a 21ºC, de la cual se obtuvo un sobrenadante que contenía las proteínas insolubles. Igualmente, los sobrenadantes se almacenaron a -‐80ºC hasta su uso. En ambos casos se cuantificó la concentración proteica mediante el método de Bradford, con el kit comercial Kit Quickstard® Bradford protein assay.
6.2.6.3.-‐ Inmunoblotting
Mediante la técnica de western blot se determinaron los niveles de las proteínas implicadas en vías de señalización (p38 MAPK, AKT, JNK, MLCK), proteínas de las uniones estrechas (ZO-‐1, Ocludina) y la proteína housekeeping α-‐tubulina. Para ello se utilizó el sobrenadante con el contenido proteico total, soluble e insoluble.
Debido a la escasa concentración de proteína, los sobrenadantes procedentes de las células Caco-‐2 se concentraron con el método TCA-‐DOC (ácido Tricloroacético/detergente Na-‐deoxycholate). Los cálculos se hicieron para poder cargar 40 µg de proteína en cada carril del gel de electroforesis. Al volumen de muestra necesario para ello, se le añadió 1/100 volúmenes de DOC al 2%. La mezcla se dejó incubar 30 minutos en a 4ªC. Pasado ese tiempo se añadieron 1/10 volúmenes de TCA al 100% y se dejó otra vez a 4ºC durante toda la noche. Al día siguiente se centrifugaron a 15000xg 15 minutos en frío, y se descartó el sobrenadante por inversión de los eppendorfs sobre un papel absorbente. El pellet se lavó con acetona a -‐20ºC
Métodos
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para retirar cualquier resto de TCA. El lavado se hizo con 300 µl de acetona y una centrifugación de 10 minutos a 10000xg. Una vez descartada la acetona, se dejaron secar al aire los pellets durante 10 minutos.
Los 40�g de proteína precipitada se suspendieron con 23 �l de LDS 1x y 2.5
�l de agente reductor 10x, para iniciar el protocolo de inmunoblotting. La suspensión se desnaturalizó durante 10 minutos a 70ºC, con la ayuda de un baño seco. Luego, las muestras proteicas se separaron según su peso molecular en un gel del 4-‐12% de poliacrilamida durante aproximadamente 45 minutos 200V en buffer MOPS. Una vez finalizada la electroforesis se hizo la transferencia húmeda de estas proteínas a una membrana de nitrocelulosa, (Figura 17) en solución de transferencia a 100V durante 90 minutos.
Papeles de filtroGel de poliacrilamidaMembrana
Dirección de la transferencia
Esponja
FIGURA 17: Esquema del “sandwich” para la transferencia húmeda
A continuación se bloqueó la membrana en buffer de bloqueo Odyssey durante 1 hora a temperatura ambiente y agitación. Pasado ese tiempo se hicieron tres lavados consecutivos de 15 minutos con PBS-‐T y se procedió a la incubación overnight a 4ºC con el anticuerpo primario (Phospho-‐p38 MAPK 1/250, MLCK 1/100, phospho-‐AKT 1/100, phospho-‐JNK 1/100, ZO-‐1 1/100, Ocludina 1/100, α-‐tubulina 1/6000) en solución de bloqueo. Al día siguiente se lavó la membrana para eliminar el exceso de anticuerpo primario y se incubó la membrana con el anticuerpo secundario correspondiente conjugados con moléculas fluorescentes (Donkey anti-‐mouse IRDye 800CW o Donkey anti-‐rabbit IRDye 680 a 1/20000 en solución de Bloqueo). La incubación en este caso, fue de 1 hora a temperatura
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ambiente. De nuevo se lavó la membrana para la detección y cuantificación de la señal mediante el escáner Odyssey.
La cuantificación de las bandas se hizo a través del software Odyssey Infrared Imaging system (versión 3.0), expresando los valores en intensidad integrada que corresponde a la suma de intensidad de todos los píxeles de una banda (restándole los valores del fondo) y multiplicado por el área de esta. Los valores de cada condición fueron normalizados por la intensidad de la proteína referencia, en este caso la α-‐tubulina, y se expresaron como incrementos respecto al grupo control.
6.2.7.-‐ Inmunofluorescencia en células Caco-‐2
Para poder conocer la localización de las proteínas de las uniones estrechas (ZO-‐1) y de las vías de señalización (p38-‐MAPK fosforilada) se hicieron tinciones sobre las monocapas de Caco-‐2 adheridas a las membranas de los transwells.
Una vez finalizadas las estimulaciones, los transwells se cambiaron a una nueva placa de 24 pocillos para iniciar el protocolo de inmunofluorescencia. En un primer lugar se hicieron 2 lavados de 5 minutos a temperatura
ambiente, depositando 300�l en la parte apical y 700�l en la parte basal de PBS 1X. A continuación para fijar las células, se añadió de la misma forma que con los lavados, 4% paraformaldehído/2% sucrosa y se dejó durante 40 minutos a 4ºC. Se volvieron a hacer tres lavados y se procedió a la permeabilización de las células con metanol frío durante 8 minutos a -‐20ºC. Sin dejar que se secasen las muestras, se hicieron 3 lavados más y se pasó al bloqueo de estas mediante la incubación con una solución al 3% de BSA (en PBS). En este punto, se recortaron las membranas de los transwells con las células adheridas y se colocaron en un portaobjetos, teniendo especial cuidado con la orientación de la membrana, dejando las células hacia arriba. A continuación se incubaron con los anticuerpos primarios (ZO1 2 µg/ml,
fosfo-‐p38 MAPK 1/100) depositando 100 �l de solución 1%BSA con el anticuerpo sobre las membranas durante toda la noche a 4ºC. Al día
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siguiente se hicieron tres lavados sumergiendo las membranas en 300 �l de PBS 1X durante 5 minutos y con una ligera agitación. Inmediatamente
después se añadieron 200 �l de los anticuerpos anti-‐rabbit Alexa 488 o anti-‐mouse Cy3 (dilución 1/200 en BSA 1% en PBS), que se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente y al resguardo de la luz. Una vez retirada la solución con el anticuerpo secundario, se añadió el marcaje nuclear Hoechst a una concentración de 0,4 µg/ml y se dejó durante 10 minutos más. Luego se hicieron tres lavados para eliminar los restos de anticuerpos o marcaje y las muestras se montaron con medio Fluoroprep y se sellaron con un cubreobjetos y laca de uñas. Para la adquisición de las imágenes se utilizó el microscopio AxioObserver Z1 (Carl Zeiss S.A., Alemania) con el software AxioVision (versión 4.8.1). Se cuantificó el porcentaje de células con marcaje positivo en el núcleo y su localización en el citoplasma (homogénea o periférica).
6.2.8.-‐ Expresión de genes mediante PCR a tiempo real
La expresión de diferentes genes implicados en vías antiinflamatorias (BCL-‐3, SOCS-‐3, IkB-‐α, IL10Rα y GCRα) y en las uniones intercelulares (E-‐CADHERINA) se valoraron sobre el RNA procedente del estudio II en los cultivos de monocapa Caco-‐2 preservado a -‐80ºC en Qiazol.
6.2.8.1-‐ Extracción de RNA total
Todo el material que se usó (tubos y puntas de pipeta) era libre de RNAsas/DNAsas, al igual que el área trabajo que se limpió con Termi-‐DNA-‐Tor, tanto para impedir la degradación del RNA como la contaminación del material con DNA. La extracción de RNA total se hizo mediante el kit miRNeasy Mini en el sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos QIAcube (QIAGEN, Madrid, España).
Las muestras se descongelaron en hielo y se dejaron 5 minutos a temperatura ambiente con el Qiazol, lo que permitió la lisis celular. Luego se añadió 140 µl de cloroformo por cada 700 µl de Qiazol, se mezcló bien y se
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dejó a temperatura ambiente 3 minutos más. Seguidamente se centrifugó a 12000xg durante 15 minutos para la formación de 3 fases líquidas: superior (dónde se encuentra el RNA), Interfase (dónde está el DNA) y inferior (dónde se encuentran las proteínas y restos celulares). Se recuperó la parte superior, procurando no coger material de la interfase y se traspasó a un tubo nuevo. A partir de aquí la extracción se hizo automatizada siguiendo el protocolo del fabricante: “Purification of total RNA, including small RNAs, from animal tissues and cells (aqueous phase)”. Se recogió un volumen de 30µl donde estaba el RNA.
6.2.8.2-‐ Cuantificación, pureza e integridad del RNA
Una vez extraído el RNA se valoró la concentración y pureza mediante el Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, USA). El ratio de absorbancia A260/280nm indica la pureza de la muestra, siendo óptima entre 1.8 y 2. La absorbancia a 260nm corregida por el coeficiente de extinción molar, indicará la concentración del RNA en ng/ml.
La integridad se midió mediante el sistema automatizado de electroforesis Experion (Bio-‐Rad, Hercules, USA) usando chips para RNA con un rango de sensibilidad de 25-‐500 ng/µl. Para ello se desnaturalizaron 2µl de RNA total y del marcador de peso molecular por muestra, a 70ºC durante 2 minutos. Se cargará el gel y las muestras en los pocillos del chip y se montará en la estación Experion. Una vez finalizada la electroforesis el software nos devolverá una imagen virtual de la fluorescencia captada donde la presencia de las dos bandas del RNA ribosómico (18S/28S) demuestra una buena integridad. En cambio, si el RNA estuviera degradado se observaría un conjunto de bandas continuo a lo largo del carril (Figura 18).
El valor de integridad de RNA (RQI) se obtiene mediante un algoritmo que compara electroferogramas estándares de RNA de muestras eucariotas, siendo 10 para el RNA intacto y 1 para el degradado. En este trabajo se usaron las muestras con un RQI ≥ 7.
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18S28S
18S
28S
RQI = 5.7
RQI =8.2
FIGURA 18: Imagen virtual de la electroforesis con chip de RNA: del carril 1-‐4 son muestras donde el RNA esta degradado a diferencia de los carriles 5-‐12. A la derecha, se muestran el detalle de los carriles 2 y 6, donde se pueden apreciar los picos que corresponden a la subunidad 18S y 28S del RNA ribosómico, y el valor de RQI.
6.2.8.3-‐ Retro-‐transcripción a DNA complementario
Para la retro-‐transcripción del RNAm a DNA complementario (cDNA) se usó el kit PrimeScriptTM RT reagent (Perfect Real Time). Se emplearon 800ng de RNA total (a una concentración de 200ng/µl) por reacción de transcripción reversa, en un volumen de 40µl para obtener una concentración de 20ng/µl de cDNA. Se preparó la master mix (MM) de la reacción para todas las muestras a valorar según las siguientes proporciones:
Reactivo µl por muestra 5X PrimeScript buffer (for Real Time) 8 PrimeScript RT Enzyme MIX 2 Oligo dT Primer (50µM) 2 Random 6 Mers (100µM) 2 RNAse free H2O 22 Volumen final 36
A continuación se mezclaron 36 µl de MM con 4 µl de muestra (un total de 800ng de RNA total) en un tubo de 0.2µl RNAsa free y se pusieron en el termociclador con las siguientes condiciones: 15 min, 37ºC _ 5 seg, 85ºC _
Métodos
99
HOLD 4ºC. Se harán alícuotas del cDNA resultante de la reacción y se almacenará a -‐80ºC hasta su uso.
6.2.8.4.-‐ PCR a tiempo real
La PCR en tiempo real (RT-‐qPCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la cual amplifica y cuantifica de forma absoluta el producto de la amplificación, DNA. En este caso se mide la fluorescencia depués de cada ciclo de amplificación y es por esto que se le denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultánea). La fluorescencia viene dada por el SYBR Green añadido a la reacción, que por su gran afinidad por el DNA de cadena doble se incorporará a las nuevas cadenas sintetizadas.
En nuestro caso, se usó el kit SYBR Premix Ex Taq para formato de placas de 384 pocillos y la fluorescencia fué captada por el equipo LightCycler 480 (Roche Applied Science, Barcelona, España).
Se diseñaron los primers (Tabla 1) con la ayuda del programa Primer express® (Life Technologies), para valorar la expresión de los genes IL-‐10, BCL-‐3, SOCS-‐3, IkB-‐α, receptor IL-‐10 α/β, receptor GC α/β, E-‐Cadherina, y GAPDH como gen de referencia o “housekeeping gen” (HKG). El HKG normaliza la expresión de los genes problema, equilibrando las posibles variaciones de carga de cDNA entre muestras. Cada gen se valoró por duplicado.
GEN Parejas de Primers IL10 Forward 5”-‐AGATCTCCGAGATGCCTTCAG-‐3”
Reverse 5”-‐CCCTTAAAGTCCTCCAGCAAG-‐3”
IL10R α Forward 5”-‐ATGAGATTGCCATTCGCAAG-‐3” Reverse 5”-‐AAGCGACAGATGGTTTCACCT-‐3”
IL10R β Forward 5”-‐GTACCACCTCCCGAAAATGTC-‐3” Reverse 5”-‐GCTGTGAAAGTCAGGTTCCCT-‐3”
GCR α Forward 5”-‐CTTGGATTCTATGCATGAAGTGGTT -‐3” Reverse 5”-‐TTGGAAGCAATAGTTAAGGAGATTTTC-‐3”
GCR β Forward 5”-‐ACT CTTGGATTCTATGCATGAAAATG-‐3” Reverse 5”-‐TGTGTGAGATGTGCTTTCTGGTTT -‐3”
IkB α Forward 5”-‐GAAGAAAAGGCACTGACCATGG-‐ 3” Reverse 5”-‐TTCTGGCTGGTTGGTGATCAC-‐3”
BCL-‐3 Forward 5”-‐AACACCGAGTGCCAAGAAACC-‐3” Reverse 5”-‐TGTTGTTTTCCACGGCGT-‐3”
Métodos
100
SOCS-‐3 Forward 5”-‐CCCCCCAGAAGAGCCTATTACA-‐3” Reverse 5”-‐ACAGAGATGCTGAAGAGTGGCC-‐3”
E-‐CADHERINA Forward 5”-‐GGCCTGAAGTGACTCGTAACGA-‐3” Reverse 5”-‐CAGCCGCTTTCAGATTTTCATC-‐3”
GAPDH Forward 5”-‐ TCTGCTCCTCCTGTTCGACAGT-‐3” Reverse 5”-‐ ACCAAATCCGTTGACTCCGAC-‐3”
TABLA 1: Secuencias de los primers forward y reverse para la valoración por RT-‐PCR
En cada pocillo se añadieron 9µl de MM (Tabla 2) a 20ng de cDNA y después de centrifugar la placa, se configuró el programa del LightCycler con las condiciones adecuadas (Tabla 3) para amplificación y valoración de la expresión.
Reactivos Volumen (uL) Concentración final
SYBR Premix Ex Taq (2x) 5 1x PCR Forward primer (10uM) 0.2 0.2uM PCR Reverse primer (10uM) 0.2 0.2uM Muestra (200ng/uL) 1 dH2O 3.6 Total 10
TABLA 2: Composición y concentraciones de la MM para la RT-‐PCR
Tiempo Temperatura Ciclos
Desnaturalización 30” 95º 1 Amplificación 5” 95º 35
20” 60º 10” 72º
Enfriamiento HOLD 4º 1
TABLA 3: Condiciones de PCR
El software del equipo nos indicó para cada muestra, el primer ciclo de la PCR en el que se detecto fluorescencia (Ct). El Ct es inversamente proporcional a la cantidad de RNAm de partida por muestra. En nuestro caso la expresión génica se cuantificó de forma relativa mediante el método 2-‐ΔΔCt, lo que significa que cada caso se referenció respecto a la condición basal,
Métodos
101
normalizando ambas con su valor de HKG. La condición basal fue para todas la condición control, excepto para TNF_GCs_IL10_SB203580, que fue la condición DMSO. La fórmula que se usó para ello fue la siguiente:
2-‐ΔΔCt ΔΔCt= (Ct muestra – Ct HKG) condición problema -‐ (Ct muestra – Ct HKG)condición basal
6.2.9.-‐ Microscopia electrónica de transmisión
Una total de dos réplicas de cada condición del estudio II con cultivos celulares Caco-‐2, se emplearon para captar imágenes mediante microscopia electrónica de transmisión (MET) y valorar la cantidad y localización de las oberturas en las uniones intercelulares. Par ello, una vez finalizada la estimulación de las células se fijaron con solución de Karnovsky a pH 7.4 durante 5 horas. A continuación se lavaron con solución de cacodilato (0.1M, pH 7.4) con 2 cambios de 10 minutos, para luego fijarlas con tetróxido de Osmio al 1% durante 1 hora. Luego se deshidrató la muestra por inmersión en una serie de alcoholes (2x10 minutos en etanol 96%, 2x10 minutos en etanol absoluto y finalmente, 2x 5minutos en óxido de propileno). Para la inclusión de la muestra en la resina primero se cortaron las membranas de los transwells con las células adheridas, y luego se incubaron con la resina a diferente proporción, de la siguiente forma:
-‐ 1:3 de resina y óxido de propileno, 20 minutos -‐ 1:1 de resina y óxido de propileno, 20 minutos -‐ 3:1 de resina y óxido de propileno, 20 minutos -‐ Resina pura, 2 horas
Luego se dejó durante 12 horas en estufa a 60ºC para que se acabara de solidificar. Para identificar la región del bloque de resina donde se encontraba nuestra muestra, se hicieron unos cortes de 0.5 µm que se tiñeron con azul de Toluidina y se miraron al microscopio óptico. Una vez seleccionada la región, se cortaron secciones de 0.1 µm para hacer la preparación final para la visualización en el MET. Estas se secaron en estufa a 37ºC durante toda la noche y se depositaron en una rejilla de cobre. Se
Métodos
102
tiñeron con acetato de uranilo al 5% durante 20 minutos en estufa. Se lavaron con agua destilada y se acabaron de teñir con citrato de plomo. Por último se montaron con medio DPX.
Se capturaron varias imágenes a diferentes aumentos (6000x-‐10000x) de cada muestra, con la ayuda del microscopio JeoL-‐1011 (Jeol Ltd., Tokyo, Japón) del servicio de anatomía patológica del Hospital Universitari Germans Trias i Pujol.
Métodos
103
6.3.-‐ Estudios con biopsias procedentes de pacientes con colitis ulcerosa activa e individuos sanos
6.3.1.-‐ Procedencia de las biopsias
Para este ensayo se usó la colección de biopsias cólicas incluidas en parafina generadas por el trabajo de Domènech E. y cols. 2008 (181) (Anexo 5). Los pacientes con colitis ulcerosa activa incluidos en este estudio estaban libres de infección por citomegalovirus y se estratificaron en función a la respuesta a GCs en corticosensibles (n=6) y corticorresistentes (n=5) (grupos 1 y 2 del artículo). Los pacientes clasificados como corticosensibles se les trató con prednisolona (1mg/Kg/día) y a los corticorresistentes se les administró tratamiento reemplazo con ciclosporina A intravenosa (4mg/Kg/día) al no mostrar mejora a los 7 días con tratamiento esteroideo. Además, también dispusimos de biopsias intestinales de pacientes con colonoscopia normal y sin historia familiar de EII, a los que se les practicó un control endoscópico por algún otro motivo (n=6) (grupo 5 del artículo). Otros datos sobre los pacientes incluidos en el trabajo de Domènech y cols. se recogen en la tabla 4.
Grupo 1 (n=25)
Grupo 2 (n=19)
Grupo 5 (n=25)
Edad (años) 38 (20-‐81) 40 (20-‐70) 48 (20-‐70)
Sexo (% hombres) 76 68 44
Meses desde diagnóstico 62 (0-‐213) 46 (1-‐180) -‐
Índice Truelove-‐witts 12( 8-‐17) 13 (8-‐10) -‐
TABLA 4: Medianas IIQ de edad, sexo, meses de diagnostico e índice de truelove-‐witts de los pacientes incluidos.
Las biopsias se recogieron antes del inicio de tratamiento con corticosteroides y 7-‐10 días después (pre-‐ y post-‐tratamiento, respectivamente) del centro de las úlceras, cuando era posible. De los controles solo se obtuvieron muestras en un único momento (Figura 19). Todas las biopsias fueron incluidas en parafina por el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitari Germans Trias i Pujol.
Métodos
104
Día 7-‐10
Recogida de biopsias pre-‐tratamiento Grupo 1,2 y 5
Clasificación pacientes según respuesta a
tratamiento
Día 0
Inicio tratamiento corticoesteroides
Recogida de biopsiasPost-‐tratamiento
Grupo 1 y 2
FIGURA 19: Diseño experimental de recogida de biopsias en pacientes con EII y controles.
6.3.2.-‐ Inmunohistoquímica en muestras de pacientes con
enfermedad inflamatoria intestinal e individuos sanos
Para el estudio inmunohistoquímico de fosfo-‐p38 MAPK en muestras de pacientes con EII se hicieron cortes histológicos de 4 µm de grosor. Se hicieron cortes de 4 µm para adherirlos al cristal secándolos a 62ºC durante 3 horas. Se desparafinaron con incubaciones consecutivas en soluciones alcohólicas (3x8 minutos en xilol, 5 minutos en xilol/etanol absoluto (1:1), 4 minutos en etanol absoluto, 4 minutos en etanol 96%, 4 minutos en etanol 80%) y finalmente se hizo un lavado de 5 minutos con agua destilada.
EL anticuerpo primario, anti-‐fosfo-‐p38MAPK, se usó a una dilución de 1/50. En lugar de anticuerpos secundarios se usó el kit de marcaje Ultaview Universal DAB (para reconocer anticuerpos primarios procedentes de conejo y ratón). Todo el protocolo se hizo de forma automática con la plataforma de tinción BenchMark XT (Ventana Medical Systems, Arizona, USA). La contra-‐tinción se hizo con hematoxilina y se montó con medio DEPEX.
La positividad para p38 MAPK y localización se cuantificó según el baremo de la Figura 20, en paralelo con un anatopatólogo de nuestro centro desconociendo los grupos de pacientes analizados. Las valoraciones se
Métodos
105
hicieron a 400x aumentos en 10-‐20 campos por muestra en el microscopio Axioskop 2 (Carl Zeiss S.A., Alemania), y las imágenes se capturaron con el programa AxioObserver (versión 4.8.1).
1 2 30
No tinción nuclear Escasos núcleos Bastantes núcleos Todos o casi todos los núcleos
FIGURA 20: Baremo de tinción nuclear para la p38 MAPK fosforilada (imágenes a 400x).
6.3.3.-‐ Inmunofluorescencia en biopsias de pacientes con colitis ulcerosa y controles
Se realizó una doble tinción para los receptores alfa de los GCs (GCRα) y de la IL-‐10 (IL10Rα), en biopsias de pacientes con colitis ulcerosa y de individuos controles para poder observar el patrón de marcaje de ambas moléculas según la respuesta a los GCs.
El protocolo de fijación al portaobjetos y desparafinización se realizó de igual forma que para la técnica de inmunohistoquímica (apartado 6.3.2). Para la recuperación antigénica se utilizó una solución de citrato a pH6 que se incubó a 100ºC durante 45 minutos. A continuación, se realizaron una serie de lavados primero con agua destilada y luego con PBS-‐T y se dejaron las muestras incubando durante toda la noche con los anticuerpos primarios (GCRα, 1/50; IL10Rα, 1/100). Un vez finalizado, se lavaron los portaobjetos para eliminar restos del anticuerpo primario para a continuación incubarlos con los anticuerpos secundarios Donkey anti-‐rabbit Alexa-‐546 y Donkey anti-‐goat Alexa-‐488, 1/100, durante 1 hora en oscuridad. Para contra-‐teñir los núcleos se usó directamente medio de montaje con DAPI.
Las valoraciones se hicieron con el microscopio AxioObserver Z1 (Carl Zeiss S.A., Alemania). Se cuantificó la intensidad de marcaje del epitelio con un baremo de 0-‐3 (Figura 21) para ambas tinciones en 10-‐20 campos. Las comprobaciones y fotografías se hicieron con el microscopio confocal SP5 (Leica, Alemania), con el programa de procesamiento Leica LAS AF v.3.
Métodos
106
Negativo
1
2
3
GCRαIL10Rα
FIGURA 21: Baremo de intensidad de marcaje para los receptores GCRα e IL10Rα en biopsias de pacientes con colitis activa (imágenes a 630x).
Métodos
107
6.4.-‐ Estudio estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante el programa estadístico SPSS.15 (SPSS Inc.). Los resultados se expresaron como medianas (intervalo intercuartil, IIQ) o como medias ± error estándar (ES). Para las comparaciones intragrupo se ha empleado el test no-‐paramétrico de Wilcoxon. Mientras que para los resultados intergrupo de TEER, ELISAs, expresión, western blot y análisis histológicos e inmunofluorescencia se utilizó el test U-‐Mann Whitney. El criterio adoptado como significación estadística fue p≤0.05
Existen límites que se han de considerar. Por una parte la escasez de muestras procedentes de pacientes hace que los resultados de estos análisis deban ser corroborados en posteriores estudios. Mientras que los resultados obtenidos de la MET no permitieron comparar si las aberturas paracelulares eran más frecuentes en un grupo que en otro ante la dificultad de localización de las áreas de unión y por el escaso número de muestras por condición. No obstante, está claro que de todas las oberturas intercelulares analizadas se daban exclusivamente a nivel de AJ y desmosomas.
Métodos
108
Material
109
7.1.-‐ Reactivos utilizados
Generales
NaCl, DTT, Xilol, Urea, TRIS-‐base/-‐HCl, Tween-‐20, NaF, Etanoles,TBS, PBS, IL-‐2, Cóctel inhibidor proteasas, SDS, Glicina, NP-‐40, Na3VO4, PMSF, DOC, Thiourea, Cacodilato de sodio , Glutaraldehído, Formaldehído, DMSO, Linfoprep‚, Azul de tripano, Acetrona, Sucrosa, Metanol, TCA, Carbonato sódico, BSA, Cloroformo, oxido de propileno, Urea
Sigma-‐Aldrich St. Louis, USA.
Específicos para western blot
NuPAGE‚ : Reducing Agent (10x), LDS Sample Buffer (4x), MOPS SDS Running Buffer (20x), Antioxidant. Novex®: 4-‐12% Bis-‐Tris Gel 1.0 mm. SeeBlue® Plus2 prestained standard 1x (marcador pes molecular)
Invitrogen (LifeTechnologiesTM)
Paisley, UK.
Quick Start® Bradford protein assay Pierce (Thermo Fisher) Rockford, USA.
Membrana nitrocelulosa 0.2μ PROTAN®
Millipore Billerica, USA.
Solución de bloqueo Odyssey‚ LI-‐COR biosciences Nebraska, USA
Específicos para cultivos celulares
Líneas celulares Caco-‐2 ECACC Salisbury, UK
RPMI-‐L-‐Glutamina DMEM-‐L-‐Glutamina Penicilina/estreptomicina, Human rTNF-‐α Human rIL-‐10 Tripsina Aminoácidos no esenciales (NEAA)
Invitrogen (LifeTechnologiesTM)
Paisley, UK.
AIM-‐V Sigma-‐Aldrich St. Louis, USA.
Material
110
PD98059 (MEK1 inhibitor) CellSignaling Technologies Danvers, USA.
CD3 unlabel, CD28 unlabel
BD Franklin Lakes, USA.
SB203580 (p38/RK MAP Kinase Inhibitor)
InvivoGen San Diego, USA
Metil-‐prednisolona (Urbason) 40mg SANOFI Paris, Francia
Dexametasona (Fortecortín) Merck S.L Darmstadt, Alemania
FBS LabClinics Sta. Perpètua de la Mogoda, España
Específicos para Inmunotinciones
Medio montaje DePeX® VWR Radnor, USA.
Fluoroprep® BioMérieux Marcy d’Etoile,Francia.
Medio de montaje con DAPI Hematoxilina
Sigma-‐Aldrich St. Louis, USA.
Ultra view Universal DAB Ventana medical systems Arizona, USA
Específicos para RT-‐PCR
Termi-‐DNA-‐Tor Biotools Madrid, España
Primers IDT Iowa, USA
Qiazol QIAGEN Maryland, USA
Anticuerpos primarios
Rabbit anti-‐Phospho-‐p38MAPK (Thr180/Tyr182) XPTM Rabbit anti-‐p38MAPK Rabbit anti-‐phospho-‐JNK Rabbit anti-‐phospho-‐AKT
Cell Signaling Technologies Danvers, USA.
Rabbit anti-‐Ocludina (N-‐term) Rabbit-‐ anti ZO1 (Mid) Mouse anti -‐MLCK (clone K36) Hoechst
Invitrogen (LifeTechnologiesTM)
Paisley, UK.
Material
111
Mouse anti-‐α-‐Tubulina Sigma-‐Aldrich St. Louis, USA.
Goat Anti-‐IL-‐10α receptor R&D systems Minneapolis, USA
Rabbit anti-‐Glucocorticoid-‐α Receptor
Abcam Cambridge, UK
Anticuerpos secundarios
Donkey Anti-‐Mouse IRDye® 800 Donkey Anti-‐Rabbit IRDye® 680
LI-‐COR biosciences Nebraska, USA
Donkey anti-‐rabbit Alexa-‐546 Donkey anti-‐goat Alexa-‐488 Donkey anti-‐rabbit Alexa-‐488 Donkey anti-‐mouse Cy3
Invitrogen (LifeTechnologiesTM)
Paisley, UK.
Anticuerpos citometria
Anti-‐CD4-‐APC Anti-‐CD8-‐FITC
BD Franklin Lakes, USA.
Kits comerciales
OptEIA set human IL-‐8 Annexin V-‐PE apoptosis detection
BD Franklin Lakes, USA.
Pan T Cell Insolation Kit (Human) + Columnas de retención LS
Miltenyi Biotec Bergisch Gladbach, Alemania.
miRNeasy mini kit Ambion (LifeTechnologiesTM)
Paisley, UK.
PrimeScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time)
TAKARA Bio Inc. Otsu, Japan
tEPON 812 embedding kit TOUSIMIS Rockville, USA
ExperionTM RNA StdSens analysis kit Bio-‐Rad Laboratories Carolina, USA
Material
112
7.2.-‐ Soluciones y medios de cultivo utilizados
Medio cultivo linfocitos T
RPMI RPMI 100 µg/ml Estreptomicina 100 U Penicilina
AIM-‐V AIM-‐V 10% FBS 20U IL-‐2 100 µg/ml Estreptomicina 100 U Penicilina PBS 1x pH 7.2
Aislamiento de linfocitos T
Solución MACS PBS 1x pH 7.2 0.5% FBS 2mM EDTA
Cultivo células Caco-‐2
D-‐MEM D-‐MEM con L-‐Glutamina 10% FBS 2% NEAA 100 µg/ml Estreptomicina 100 U Penicilina
Extracción de proteínas
Solución lisado RIPA 25mM TRIS-‐HCl 150mM NaCl 1% NP-‐40 1% DOC 0.1% SDS 1mM Na3VO4 1mM PMSF 1mM NaF 10µl/ml Inhibidores proteasas sigma Agua destilada
Material
113
Solución UREA/Thiourea 5M UREA 2M Thiourea 50mM DTT 0.1% SDS PBS 1X.
Inmunoblotting
PBS-‐T PBS 1X 0.1% Tween-‐20
Buffer MOPS 1x MOPS SDS Running Buffer (20x) 0.25% Antioxidant Agua destilada
Buffer de transferencia 20% Metanol 27mM TRIS-‐BASE 197mM Glicina Agua destilada
Microscopia electrónica de transmisión
Solución de Karnosvky 10% Formaldehído 25% Glutaraldehído 0.2M Cacodilato de sodio
Resina para inclusión (8 bloques) 22,5 ml EPON 812 15 ml DDSA 9 ml NMA 0.8ml DMP-‐30
Material
114
115
Resultados
116
Resultados
117
8. Resultados
8.1.-‐ La estimulación prolongada vía TCR de la población CD3+CD4+ disminuye la inducción de apoptosis por dexametasona en comparación a un estímulo breve
Para reforzar las hipótesis de partida nos propusimos evaluar si células T estimuladas vía TCR durante 24h responderían diferente a las estimuladas durante 72h. Con ello, pretendíamos comprobar si la presencia prolongada o no de antígenos comprometía la apoptosis de las células T inducida por esteroides.
El estímulo muestra escasos cambios en la diferenciación del fenotipo de las células CD3+ (Anexo 1). Por lo que respecta al grado de apoptosis destaca el incremento que registran las células T CD4+ estimuladas 24h y tratadas con GCs o con GCs más el inhibidor respecto a sus homólogas estimuladas durante 72h (Figura 22A). En cambio, cuando calculamos la apoptosis más necrosis lo que pudimos comprobar que esta solo aumentaba en los grupos tratados con inhibidor (Figura 22B). Estos cambios no fueron evidentes para el fenotipo CD8+ (Anexo 1 C y D). Hay que destacar que con el empleo del inhibidor bloquemos la vía de señalización proliferativa TCR/MEK, que en nuestras condiciones se relaciona con el aumento de la necrosis en células estimuladas durante 24h (Figura 22B)
Los aspectos evaluados demuestran una mayor sensibilidad a la apoptosis del fenotipo CD4+ frente a los corticosteroides cuando el estímulo es de duración breve. En otras palabras, este experimento sugiere que una reducción de antígenos luminales que irrumpen en la lamina propia intestinal facilitaría la inducción de la apoptosis de las células potencialmente colitogénicas por parte de los corticosteroides. Por ello, la capacidad de impermeabilización del epitelio intestinal puede jugar un papel clave en la respuesta a esteroides en pacientes con colitis ulcerosa.
Resultados
118
GCs 72H PD98059 72h
GCs + PD98059
72h
*
*Increm
ento apo
ptosis
células T
CD4
+A
GCs 72H PD98059 72h
GCs + PD98059
72h
Increm
ento apo
ptosis +
necrosis de
células T
CD4
+ *
*
B
FIGURA 22: Variaciones en la apoptosis inducida por GCs en las células T sanguíneas en función del tiempo de estímulo. Los valores representan la mediana (IIQ) de los
incrementos respecto a las condiciones con estímulo CD3/CD28 basales, durante 24h (boxes blancos) o 72h (boxes negros). La figura A representa los incrementos de apoptosis y la E los
incrementos de apoptosis más necrosis, en células T CD4+. *p≤0,041 vs 72h (los valores de las condiciones basales se agrupan en la tabla ANEXO 2)
8.2.-‐ La cooperación entre la interleucina-‐10 y los glucocorticoides refuerza la unión intercelular del epitelio intestinal
Para comprobar si el epitelio intestinal y la IL-‐10 podrían facilitar la respuesta al tratamiento esteroidal en la colitis ulcerosa decidimos realizar un estudio in vitro con monocapas de células Caco-‐2. Para ello, las sometimos a una noxa inflamatoria o no, en presencia de GCs, IL-‐10 o de ambos. A las 48h del cultivo medimos el paso de electrones para valorar en la confluencia la integridad de la monocapa celular, así como la fortaleza de las uniones paracelulares.
Resultados
119
Control TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_IL10
Increm
entos T
EER (%
)
*
**
FIGURA 23: Incrementos de TEER en cultivos monocapa de células Caco-‐2 a las 48h de ser estimuladas o no con TNFα. Las medidas representan el incremento porcentual entre TEERi
y TEERf en condiciones no inflamatorias (control; boxes blancos) e inflamatorias (grupos con TNFα; TNFα_GCs; TNFα_IL-‐10; y TNFα_GCs_IL-‐10; boxes grises). Los resultados se expresan
como mediana (IIQ); *p≤0.02 vs control y TNF_GCs_IL10
Así, mientras que las condiciones sin TNF-‐α no mostraron cambios destacados entre ellas (Anexo 3), en los cultivos tratados con TNFα (con o sin IL-‐10 o GCs) desciende la TEER muy por debajo del valor control. Por el contrario, el tratamiento combinado con GCs e IL-‐10 lo elevaba a niveles cercanos a los del control (Figura 23). Este hecho destacable sugiere la posibilidad de una sinergia entre la citocina reguladora y los esteroides que podría ayudar a la impermeabilización de la lamina propria intestinal.
Adicionalmente, se midieron las concentraciones de IL-‐8 como indicador de la actividad inflamatoria de las células epiteliales según la condición analizada.
Resultados
120
Control TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_IL10
*
*
IL8 pg
/ml
A
IL8 pg
/ml
Control TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_IL10
#
*
B
FIGURA 24: Niveles de IL-‐8 en el sobrenadante basal a las 24h (A) y a las 48h (B) de cultivo
celular. Los resultados muestran la mediana (IIQ) de la concentración. *p≤ 0,025 vs resto de grupos; #p≤ 0,01 vs TNF_IL10 y TNF_GCs_IL10
Como era de esperar tanto a las 24h como a las 48h el grupo control (sin TNF) mantiene unos niveles de IL-‐8 muy inferiores al resto de grupos experimentales (Figuras 24 A y B). Las células Caco-‐2 tratadas con esteroides mostraron un incremento significativo en la producción de IL-‐8 respecto al resto de grupos a las 24h (Figura 24 A). Este hecho se revierte por acción de la IL-‐10, especialmente a las 48h (Figura 24 A y B).
8.3.-‐ La fosforilación de la p38 MAPK constituye un elemento clave en las acciones sinérgicas entre la IL-‐10 y los glucocorticoides
Para esclarecer los cambios observados sobre el epitelio se exploraron distintas vías de señalización y proteínas de las TJ mediante western blot. No se registraron cambios en AKT, JNK o MLCK, ni tan siquiera en las proteínas de las TJ (ZO-‐1, Occludina) (Anexo 4). El hecho de no observar cambios relevantes en los componentes de las TJ analizados no significa que no existan procesos de redistribución intracelular, o bien que el tempo de expresión no coincida con el del análisis efectuado. Además, el análisis reveló el potencial papel de la p38 MAPK en la sinergia entre IL-‐10 y los GCs. El TNF-‐α incrementa la fosforilación de p38 MAPK muy por encima de los
Resultados
121
niveles alcanzados por las monocapas celulares tratadas con IL-‐10 y/o GCs (Figura 25A). Pero a la vez, las células que recibieron GCs presentaban menor fosforilación de p38 MAPK que la tratadas con IL-‐10, mientras que el co-‐tratamiento mostró una fosforilación intermedia (Figura 25A). En cualquier caso, los resultados alcanzados muestran que IL-‐10 fue capaz de fortalecer las uniones intercelulares con unos niveles de fosforilación de p38 MAPK lejos de la excesiva actividad inducida por el TNF-‐α, o del bloqueo provocado por los GCs. De hecho, la presencia IL-‐10 consigue que los GCs no reduzcan excesivamente la fosforilación de p38 MAPK.
P38 MAPK Fosforilada43KDa
43KDa
α-‐Tubulina50KDa
P38 MAPK Total
Control
TNF_GC
s
TNF_IL10
TNF_GC
s_IL10
TNF
Marcado
r de
pe
so molecular
C
TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_IL10
Ratio
increm
entos MAP
K p3
8 fosforilada
/total
(Intensidad
Integrada )
D
TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_IL10
Increm
entos fosforilación
MAP
K p3
8
(Intensidad
Integrada )
*
#
Increm
entos MAP
K p3
8(In
tensidad
Integrada )
TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_IL10
A B
n.s
†
FIGURA 25: Representación de la búsqueda de mediadores moleculares implicados en la sinergia IL-‐10/GCs mediante western blot. Las figuras A y B representan los incrementos en medias±ES respecto el grupo control de la cantidad de p38 MAPK fosforilada y de p38 MAPK
total, respectivamente y la Figura C los ratios de ambos incrementos. La Figura D es un ejemplo de las bandas obtenidas del western blot para estas proteínas y para la α-‐tubulina,
utilizada como HKG.*p≤0,026 vs resto de grupos; #p= 0,028 vs TNF_IL10; †p= 0,026 vs TNF_GCs
Resultados
122
8.4.-‐ La inhibición de la fosforilación de la p38 MAPK revierte la colaboración entre la IL-‐10 y los esteroides
Debido a los resultados anteriores se iniciaron una serie de estudios, de nuevo sobre cultivos monocapa de células Caco-‐2 confluentes. De esta manera se pretendía comprobar la implicación de la p38 MAPK en el sinergismo entre la IL-‐10 y los GCs. Para ello comparamos las condiciones TNF_GCs y TNF_GCs_IL10 con o sin inhibidor de la fosforilación de p38 MAPK, además del control sin TNF-‐α. Los resultados reproducían los alcanzados en el primer estudio con células Caco-‐2 que analizaba 5 condiciones. La IL-‐10 provoca un incremento en la unión paracelular, más evidente a las 48h, superior al de las células incubadas con TNF-‐α y GCs, y cercano al valor del control (Figura 26 A y B). No obstante, la inhibición de la fosforilación de la p38 MAPK (SB203580) bloquea el incremento de TEER mediado por la IL-‐10.
Increm
entos T
EER (%
)
A
Control TNF_GCs TNF_GCs_IL10
TNF_GCs_IL10_SB203580
B
Increm
entos T
EER (%
)
Control TNF_GCs TNF_GCs_IL10
TNF_GCs_IL10_SB203580
* *
n.s
FIGURA 26: Influencia del bloqueo de la fosforilación de p38 MAPK sobre la TEER en monocapas de células Caco-‐2. Los valores representan la mediana (IIQ) del incremento
porcentual entre TEER inicial y las 24h (A) o 48h (B) de la estimulación. Las condiciones analizadas fueron no inflamatorias (control; boxes blancos) e inflamatorias
(TNFα_GCs;TNFα_GCs_IL-‐10 y TNFα_GCs_IL-‐10_SB203580; boxes grises).*p≤0.042 vs control
Resultados
123
Por otra parte, el TNFα y GCs provocan el incremento más pronunciado en la producción de IL-‐8, mientras que al incorporar la IL-‐10 se produce un descenso (significativo a las 24h) y que se acentúa cuando se inhibe la fosforilación de p38 MAPK (Figuras 27 A y B).
IL8 pg
/ml
A
*
*
*
Control TNF_GCs TNF_GCs_IL10
TNF_GCs_IL10_SB203580
*
Control TNF_GCs TNF_GCs_IL10
TNF_GCs_IL10_SB203580
*
IL8 pg
/ml
B
FIGURA 27: Efecto de la IL-‐10 y de la inhibición de p38 MAPK sobre la producción de IL-‐8 por parte de las células Caco-‐2 tratadas con TNF-‐α y GCs. Las concentraciones de IL-‐8 medidas mediante ELISA a las 24h del cultivo (A) o a las 48h (B) de los grupos: control, TNFα_GCs; TNFα_GCs_IL-‐10 y TNFα_GCs_IL-‐10_SB203580. Los valores se representan como
medianas (IIQ); *p≤0.036 vs resto de grupos
Estos resultados confirman el papel clave de la p38 MAPK en la modulación de la adherencia intercelular. No obstante, aparecen dos aspectos destacables. Por una parte, a pesar que la inhibición de la fosforilación p38 MAPK produce un descenso considerable de la TEER y de la producción de IL-‐8 en el cotratamiento IL-‐10 y GCs, el patrón de respuesta es distinto, la TEER aumenta y los niveles de IL-‐8 disminuyen en el grupo tratado con IL-‐10 y GCs respecto al que solo recibió GCs en condiciones inflamatorias. Por otra parte, los niveles de TEER se incrementan entre las 24 y 48h, mientras que los de IL-‐8 sufren un claro descenso. De nuevo estamos ante un patrón evolutivo distinto.
Resultados
124
8.5.-‐ Fosforilación de la p38 MAPK en la mucosa intestinal de pacientes con colitis ulcerosa activa
Para comprender la implicación patológica de la fosforilación de la p38 MAPK en la respuesta a los GCs se estudiaron biopsias intestinales procedentes de pacientes con colitis ulcerosa activa. Para ello, mediante inmunohistoquimica, marcamos la p38 MAPK fosforilada en biopsias de pacientes respondedores y no respondedores, obtenidas antes y después del tratamiento con esteroides. A pesar, del escaso número de pacientes incluidos (n=5-‐6/grupo) los resultados obtenidos nos muestran claramente la disposición nuclear de la p38 MAPK fosforilada que, en las biopsias previas al tratamiento de pacientes corticorefractarios, se halla significativamente disminuida (Figura 28). Por otra parte, hay que destacar que los controles sanos mantienen un sorprendente elevado nivel de fosforilación de p38
MAPK (media±ES: 2.67±0.24); sin embargo estos resultados se han de tomar con una cierta cautela ya que los controles sanos incluidos, fueron el resultado de endoscopias por sospecha de otras alteraciones intestinales (IBS, neoplasias, etc)
Cortico-‐sensibles
Cortico-‐resistentes
Fosfo
rilación p3
8 MAP
K (Barem
o marcaje)
*
Pre-‐tratamiento
Post-‐tratamiento
FIGURA 28: Detección de p38 MAPK fosforilada en biopsias intestinales de pacientes con colitis ulcerosa activa. La gráfica muestra los resultados del baremo de fosforilación de p38
MAPK expresado como media±ES; *p=0.028 vs Cortico-‐sensibles pre-‐tratamiento.
Resultados
125
8.6.-‐ La IL-‐10 facilita la nuclearización de la p38 MAPK fosforilada en presencia de TNF-‐α y glucocorticoides
El estudio con inmunofluorescencia en monocapas de células Caco-‐2 permitió comprobar que la incorporación de IL-‐10 al medio de cultivo con TNF-‐α y GCs facilitaba la translocación al núcleo de la p38 MAPK fosforilada. En cambio, al añadir el inhibidor SB203580 se revertía el efecto de la IL-‐10 (Figura 29 A y C). A las 24h las células tratadas con TNF-‐α, GCs e IL-‐10 muestran un mayor índice de p38 MAPK nuclear (fosforilada) que a las 48h; no obstante, ambos casos fueron más elevados significativamente que en el resto de grupos (Figura 30).
En la mayoría de los casos, la detección nuclear de p38 MAPK fosforilada coincidía con la aparición de un marcaje en la periferia celular, coincidente con los límites de la célula (Figura 29 B y D; figura 30 ).
Resultados
126
FIGURA 29: Disposición nuclear o periférica de de la p38 MAPK fosforilada en cultivos de células Caco-‐2 a 24h y 48h. Los gráficos representan la mediana (IIQ) del % células con marcaje positivo nuclear (figuras A y C) y/o en la periferia celular (figuras B y D) de p38
MAPK fosforilada a las 24h y 48h de incubación. Las condiciones analizadas fueron no inflamatorias (control; boxes blancos) e inflamatorias (TNFα_GCs; TNFα_GCs_IL-‐10 y
TNFα_GCs_IL-‐10_SB203580; boxes grises).*p≤0,021 vs resto de grupos; #p≤0,043 vs
TNFα_GCs_IL-‐10_SB203580; †p≤0,021 vs control; Φp≤0,043 vs TNFα_GCs y TNFα_GCs_IL-‐10_SB203580
Resultados
127
24H
p38 MAPK fosforilada
Control/DMSO
TNF_GCs
TNF_GCs_IL10_SB203580
TNF_GCs_IL10
Resultados
128
Control/DMSO
TNF_GCs
TNF_GCs_IL10_SB203580
TNF_GCs_IL10
48H
p38 MAPK fosforilada
FIGURA 30 (y página anterior): Inmunotinción de p38 MAPK fosforilada en monocapas de células Caco-‐2 a 24h y 48h. Las imágenes son representativas del
marcaje para las condiciones basales (Control y DMSO) y de las condiciones inflamatorias (TNF_GCs y TNF_GCs_IL-‐10, con y sin SB203580). Se marcaron con
anti-‐p38 MAPK fosforilada (Thr180/Tyr182) (rojo) y con Hoechst el núcleo (Azul). Todas las imágenes están tomadas a un aumento de 400x (las imágenes dentro de
los cuadrados blancos corresponden a ampliaciones de las fotografías).
Resultados
129
8.7.-‐ Rastreo de los mecanismos implicados en el eje IL-‐10/p38 MAPK
Con el objetivo de averiguar como la IL-‐10 modula la función de p38 MAPK en un entorno inflamatorio y con GCs, estudiamos la expresión de genes potencialmente implicados. Sobre el mismo diseño anterior y los mismos grupos experimentales (TNF_GCs; TNF_GCs_IL-‐10; TNF_GCs_IL-‐10_SB203580), se analizaron los cambios que se producen en la expresión de E-‐cadherina, GCRα y β, IL-‐10Rα y β, IL-‐10, SOCS-‐3, BCL-‐3 e IkBα.
A B
C D
Resultados
130
E F
G
FIGURA 31: Expresión de genes influenciados por la IL-‐10 vía fosforilación de la quinasa p38. Los valores representan los 2-‐AACt de las condiciones inflamatorias (TNF_GCs; TNF_GCs_IL10; TNF_GCs_IL10_SB203580) respecto a su respectiva condición basal (control
o DMSO). Medianas (IIQ). *p=0.014 vs TNF_GCs_IL10; #p≤0.04 vs resto de grupos; †p≤0.037 vs TNF_GCs_IL10_SB203580
La presencia de IL-‐10 junto con TNF y GCs incrementa la expresión de los genes E-‐Cadherina, GCRα, IL-‐10Rα, SOCS-‐3, IkBα y BCL-‐3, los 3 primeros significativamente respecto a las monocapas celulares tratadas con TNF y GC (Figura A, B y C). Por otro lado, la inhibición de la fosforilación de p38 MAPK reduce ligeramente la expresión de E-‐Cadherina y bloquea la de GCRα (Figura 8.7 A y B). Sin embargo, SOCS-‐3 e IkBα incrementaron significativamente su expresión como consecuencia de inhibir la activación
Resultados
131
de p38 MAPK. En el caso de las evaluaciones efectuadas sobre IL-‐10 y GCRβ, no se detectó expresión (Anexo 5).
Estos resultados muestran dos patrones de expresión diferenciados, el que constituyen la E-‐caherina y el GCRα, y el formado por genes capaces de introducir cambios antiinflamatorios (IL-‐10Rα, SOCS-‐3, IkBα y BCL-‐3). De hecho, el perfil de expresión de IL-‐10Rα, SOCS-‐3, IkBα y BCL-‐3 coincide, pero en sentido opuesto, al de la producción de IL-‐8.
8.8.-‐ Efecto de la inhibición de la p38 MAPK sobre las adherens junctions y los desmosomas
Los cambios en la expresión de E-‐Cadherina que muestran los resultados anteriores, así como los estudios sobre las proteínas de las TJ por western blot donde no se registraron excesivos cambios entre condiciones (Anexo 4) hicieron sospechar que la regulación del paso de electrones medido a través de la TEER se produjera en otras uniones paracelulares. Mediante el MET analizamos las monocapas de células confluentes sometidas a las condiciones anteriores. De esta manera se constató que mientras en todas las condiciones analizados la TJ permanecían cerradas, los grupos TNF_GCs y TNF_GCs_IL-‐10_ SB203580 presentaban con más frecuencia zonas de separación preferentemente a la altura de las uniones adherentes y desmosomas (zonas de adherencia entre células ricas en Cadherinas) (Figura 32).
FIGURA 32 (página posterior): Resultados obtenidos mediante MET de las uniones paracelulares en las monocapas de células Caco-‐2. Las imágenes A-‐C, AJ y desmosomas principalmente sellados (espacio intermedio gris o oscuro) observado en el grupo
experimental tratado con TNF_GCs_IL10,. Las imágenes D-‐F pertenecen a los grupos tratados con TNF_GCs y TNF_GCs_IL10_SB203580, donde se observa la apertura a nivel de
AJ y, en mayor medida, en los desmosomas. Las fotografías de la derecha son una magnificación de los cuadrados rojos. El aumento oscila de 12000x a 100000x. Las uniones
indicadas con flechas rojas: AJ, adhrens junctions; D, desmosomas; y TJ, tight junctions
Resultados
132
40000x
25000x
40000x
TJD
TJ
DAJ
TJ
D
A
B
C
Resultados
133
40000x
25000x12000x
30000x
100000x
D
E
F
TJ
D
TJD
TJD
Resultados
134
8.9.-‐ Determinación de los cambios de expresión de los receptores α de IL-‐10 y glucocorticoides en la mucosa de pacientes con colitis ulcerosa activa
Dado que en los resultados de la qPCR los receptores α de GCs e IL-‐10 en monocapas de células Caco-‐2 se mostraron influenciados por la IL-‐10 (ver punto 8.7, figuras 31 B y C), se analizó mediante inmunofluorescencia en biopsias intestinales de pacientes con colitis ulcerosa activa los cambios que aparecen en la presencia epitelial del IL-‐10Rα y del GCRα. Los resultados indican que en los pacientes respondedores hay una menor presencia significativa del GCRα y del IL-‐10Rα respecto a sus homólogos con una respuesta inadecuadamente al tratamiento (Figura 33 A y B). No obstante, durante el transcurso inflamatorio los individuos respondedores incrementan la presencia y difusión de GCRα, aunque no es significativa, a diferencia de lo que ocurre con los no respondedores (Figura 33 A).
Cortico-‐sensibles
Cortico-‐resistentes
Intensidad
de marcaje IL10Rα
(Barem
o marcaje)
Pre-‐tratamiento
Post-‐tratamiento
Intensidad
de marcaje GCR
α(Barem
o marcaje)
Pre-‐tratamiento
Post-‐tratamiento
Cortico-‐sensibles
Cortico-‐resistentes
A B
* **
*
#
#
FIGURA 33: Medias ± ES de las valoraciones de las tinciones por inmunofluorescencia para los GCRα e IL-‐10Rα, en muestras de mucosa cólica procedentes de pacientes con colitis ulcerosa activa, sensibles y refractarios al tratamiento con GCs. Figura A representa los valores de marcaje para GCRα, mientras que la B lo hace para los valores del IL10Rα. *p≤0.038 vs corticorresistentes; #p≤0.008 vs post-‐tratamiento; Medias ±ES del grupo
control: GCRα 2.4±0.074; IL10Rα 0.95±0.091.
Resultados
135
Por lo que hace referencia a la intensidad de la fluorescencia para el IL10Rα, ambos grupos de respuesta a los GCs experimentaron un descenso significativo post-‐tratamiento, aunque más acusado en el grupo de pacientes que no respondieron al adecuadamente (Figura 33 B).
El patrón observado de marcaje para los GCRα y IL-‐10Rα tanto en pacientes como en controles es difuso de forma homogénea (Figura 34) por toda la célula epitelial. A pesar de ello, en la mayoría de pacientes sensibles a los GCs se han distinguido unas agrupaciones de alta intensidad de marcaje y más delimitadas, en las que en ocasiones co-‐localizan los dos receptores. (Figura 35).
FIGURA 34 (página posterior, superior): Marcaje por inmunoflourescencia de GCRα e IL10Rα, en biopsias de pacientes con CU activa. Se observa un marcaje difuso en el citoplasma de las células epiteliales del intestino tanto para el GCRα (rojo), como para la
IL10Rα (verde) El núcleo marcado con DAPI (Azul). Todas las imágenes están tomadas a un aumento de 630x (las imágenes dentro de los cuadrados blancos corresponden a
ampliaciones de las fotografías).
FIGURA 35 (página posterior, inferior): Detalle del patrón observado para la inmunoflourescencia de GCRα e IL10Rα, en pacientes con CU activa y sensibles al tratamiento con glucocorticoides. Se marcaron con anti-‐GCRα (rojo), con anti-‐IL10Rα (verde) y con DAPI el núcleo (Azul). Todas las imágenes están tomadas a un aumento de
630x (las imágenes dentro de los cuadrados blancos corresponden a ampliaciones de las fotografías).
Resultados
136
GCRα
IL10Rα
DAPI
Merge
GCRα
IL10Rα
DAPI
137
DISCUSIÓN
138
Discusión
139
9. Discusión
La respuesta inadecuada a los GCs constituye una de las principales complicaciones en el tratamiento de la EII con una grave repercusión en la curación del paciente. Los GCs son la primera línea terapéutica en la colitis ulcerosa activa, no obstante la corticorrefractariedad puede llegar a afectar más del 30% de pacientes (171, 178). Por ello, conocer los mecanismos implicados en la falta de respuesta a esteroides es básico para mejorar su efectividad. Hasta la fecha, los mecanismos implicados en esta falta de sensibilidad a los corticoides se han relacionado con alteraciones en la expresión del GCR y con disfunciones de los mecanismos de desintoxicación celular (MDR-‐1 y Pgp-‐170) (103, 197). Estos estudios han evidenciado una posible relación de la refractariedad terapéutica con la incapacidad de los esteroides en inducir apoptosis a macrófagos y células T activas, y por consiguiente, con una perpetuación la inflamación en la mucosa intestinal (184, 211). En este sentido, nuestro grupo inició hace unos años una aproximación experimental en pacientes con enfermedad de Crohn para comprender los mecanismos moleculares y celulares implicados en el fracaso terapéutico a esteroides. Este estudio mostró un menor grado de apoptosis en células T y B de la lamina propria intestinal en los pacientes con enfermedad de Crohn activa no respondedores (208). En el mismo estudio, también pudimos comprobar que la sensibilidad a los esteroides se asociaba significativamente a la presencia de RNAm de la IL-‐10 en la mucosa intestinal de los pacientes respondedores.
En el presente estudio se muestra la reducción de la apoptosis que sufren las células T CD4+ cuando son activadas vía TCR de forma prolongada en comparación con las activadas de forma breve (Figura 21 A). Este fenómeno, recuerda lo importante que puede llegar a ser el epitelio intestinal en la respuesta terapéutica regulando la entrada excesiva de antígenos luminales.
Muchos de los polimorfismos asociados a la predisposición de padecer colitis ulcerosa se relacionan con disfunciones de la barrera a nivel del epitelio (MDR-‐1 , CDH1, HNF4α y MAGI2) (87, 217, 218). La implicación patológica de este funcionamiento erróneo es incluso percibido en los familiares de primer
Discusión
140
grado de pacientes con colitis ulcerosa, libres de la enfermedad, que registran un aumento de la permeabilidad intestinal superior a la población sana sin antecedentes de EII (219). Además, la deficiencia de IL-‐10 en ratones también aumenta la permeabilidad intestinal como antesala de la aparición de lesiones intestinales (83). En cambio, si los ratones IL-‐10 (-‐/-‐) son tratados con un inhibidor de la zonulina (AT-‐1001), capaz de disminuir la permeabilidad intestinal, los signos de la colitis se reducen (220). A pesar que la IL-‐10 ejerce funciones inmunoreguladoras y antiinflamatorias en el intestino, polarizando la respuesta inmune celular en la lamina propria hacia la tolerancia (221, 126), evidencias recientes sugieren su capacidad de influir sobre funciones de la inmunidad innata y adaptativa en el epitelio intestinal (222). De hecho, otras citocinas de la familia de la IL-‐10 también ejercen acciones sobre el epitelio en la EII, como la IL-‐22 que participa en la remodelación y recuperación de las lesiones activando STAT-‐3 en las células del epitelio intestinal (223, 224). En consecuencia, parece plausible pensar que una baja expresión de IL-‐10 en la mucosa intestinal facilitaría el contacto de los antígenos luminales con la lamina propria y, por ende, se favorecería la respuesta inadecuada a los corticosteroides en la EII. En cualquier caso, explorar la función de la IL-‐10 sobre el epitelio intestinal representa un reto de especial interés en la colitis ulcerosa.
Los cultivos monocapa de células Caco-‐2 confluentes revelan un hecho destacado y a la vez sorprendente, mientras el TNF-‐α incrementaba significativamente el paso de electrones a través de las monocapas celulares, la presencia conjunta, y no por separado, de IL-‐10 y GCs lo bloqueaba (Figura 23). Esta acción sinérgica no ha sido descrita con anterioridad, a pesar que existen indicios de la capacidad de cada uno de ellos por separado en modular la permeabilidad en condiciones inflamatorias. Así, mientras el tratamiento de IL-‐10 fue capaz de prevenir la pérdida de la ZO-‐1, ocludina y E-‐cadherina en un modelo experimental de nutrición parenteral total (225), los GCs regularon la barrera epitelial del intestino bloqueando la expresión de MLCK y facilitando el cierre de las TJs (226). Sin embargo, en nuestras condiciones, la colaboración entre la IL-‐10 y los GCs no produjo cambios
Discusión
141
destacables en el contenido de ZO-‐1, ocludina y MLCK (Anexo 3), ni en la obertura o cierre de las TJ (Figura 32).
Entre las vías de señalización analizadas, la fosforilación de la p38 MAPK mostraba una modulación distinta de su actividad en función de si las monocapas celulares habían sido tratadas con GCs o IL-‐10. De hecho el tratamiento conjunto de GCs e IL-‐10 mantuvo los niveles de fosforilación de p38 MAPK muy por debajo a los alcanzados por la administración de TNFα, pero a la vez sin llegar a niveles tan bajos como los inducidos por GCs (Figura 25A). En relación a esto, estudios en células epiteliales de vías aéreas han demostrado que la inhibición de la p38 MAPK por la dexametasona es ejercida a través de la mitogen-‐activated protein kinase fosfatase-‐1 (227, 228). Por otro lado, la presencia de IL-‐10 estimula la p38 MAPK que reduce el estrés del retículo endoplasmático de las células epiteliales del intestino en condiciones inflamatorias por el bloqueo del eje activating traslocation factor (ATF)-‐6/glucose-‐regulated protein (grp)-‐78 (62). La actividad p38 MAPK juega un papel clave en la respuesta inflamatoria en la EII, mostrando un incremento destacado en las mucosas intestinales de estos pacientes (25, 229, 230). Sin embargo, estudios clínicos y experimentales han mostrado resultados contradictorios respecto a la función de p38 MAPK en el intestino. Pacientes de enfermedad de Crohn con una actividad grave muestran una favorable remisión clínica al ser tratados con CNI-‐1493 (231), un inhibidor de la fosforilación p38 MAPK; mientras que en otros estudios no se observa mejoría al inhibir con SB203580 (232). Por otro lado, ratones con colitis inducida con TNBS o DSS empeoran su evolución al ser tratados con distintos inhibidores de la activación de p38 MAPK, a pesar de mostrar signos antiinflamatorios como la reducción de algunas citocinas (233, 234). En cambio, Hollenbach y cols. comprobaron que la inhibición de p38 MAPK era capaz de reducir drásticamente la actividad NF-‐kB con la consiguiente mejora de las lesiones intestinales (235). Nuestros resultados indican que la acción conjunta de GCs e IL-‐10 modula la fosforilación de p38 MAPK en las células del epitelio intestinal a un nivel adecuado para reforzar las uniones paracelulares y disminuir ligeramente la producción de IL-‐8 respecto de lo que ocurre con el
Discusión
142
grupo tratado con GC en condiciones inflamatorias. Esto sugiere la existencia de distintos niveles de participación de esta quinasa aportando un potencial efecto protector de la línea epitelial. De hecho, incluso la producción autocrina o paracrina de IL-‐8 se han relacionado con la activación de procesos protectores sobre la línea epitelial que favorecen la recuperación de las lesiones (236, 237). La dicotomía en la actividad de p38 MAPK también ha sido reportada en un excelente estudio con ratones portadores de una deleción en las células mieloides, que resulta en una reducción de la actividad inflamatoria inducida por DSS, mientras que si esta deleción era exclusiva de las células epiteliales se potencian los efectos deletéreos producidos por el modelo (238), corroborando el papel protector de la p38 MAPK en el epitelio. Reforzando esta idea, existen estudios in vitro que han demostrado la participación de p38 MPAK en distintas funciones protectoras sobre el epitelio intestinal controlando el ciclo celular, la autofagia y reforzando la función barrera (239-‐242). Se ha demostrado que una cierta actividad de p38 MAPK mediada por probióticos en condiciones inflamatorias refuerzan las TJ (243-‐245), lo que promueve la reepitelización y curación de las lesiones intestinales (241). Para averiguar el papel de la IL-‐10 sobre p38 MAPK en la adhesión lateral de las células epiteliales del intestino, y por ende, en la respuesta a los esteroides, se realizaron una serie de experimentos in vitro con células Caco-‐2 a las que añadimos el inhibidor de la fosforilación de la p38 MAPK, SB203580. En estos ensayos comprobamos que la presencia conjunta de IL-‐10 y GCs coincidía con un mayor número de núcleos positivos para p38 MAPK fosforilada (Figura 29) y con un aumento de la TEER, mientras que el bloqueo de la actividad de la p38 MAPK revertía estos indicadores. Por lo tanto, el papel de la fosforilación de p38 MAPK es clave para entender la función de la IL-‐10 en condiciones inflamatorias sobre el epitelio intestinal. En este sentido, la presencia nuclear de la p38 MAPK fosforilada también fue más elevada en las biopsias intestinales previas al tratamiento de pacientes respondedores que en las de los no respondedores (Figura 28), lo que podría suponer mayor capacidad de aislamiento de la lamina propria en los
Discusión
143
pacientes sensibles. Estudios previos de nuestro grupo mostraron que los pacientes corticosensibles tenían un incremento de la expresión de IL-‐10 en la mucosa cólica muy superior a la de los pacientes refractarios antes del tratamiento con GCs (40,0 vs 2,4; p=0,023. Anexo 6) (246). Aunque la evolución del proceso inflamatorio en pacientes no es del todo equiparable a las observaciones in vitro, existen coincidencias sutiles que implican una mayor actividad del eje IL-‐10/MAPK en el epitelio intestinal de los pacientes sensibles a los GCs. Sin embargo, estos resultados han de considerarse con cautela, ya que los grupos según la respuesta terapéutica estuvieron constituidos por un total de 5-‐6 pacientes. De todas formas, la localización nuclear de la forma fosforilada de p38 también ha sido detectada en el epitelio intestinal de pacientes con enfermedad de Crohn activa no respondedores a los esteroides (201). No obstante, la producción intestinal de citocinas en la enfermedad de Crohn es muy diferente al de la colitis ulcerosa (208), donde la expresión de IL-‐10 es diez veces superior. Por consiguiente, con un patrón de activación de p38 MAPK distinto entre ambas entidades de EII. En definitiva, la IL-‐10 aporta una ventaja en la recuperación de la barrera epitelial a través de la activación de p38 MAPK en la colitis ulcerosa activa tratada con GCs. Esta recuperación del epitelio a través del eje IL-‐10/p38 MAPK se concreta en nuestros estudios con un aumento de la TEER y puede llegar a suponer una más eficaz curación de las lesiones. Dada la poca implicación de las proteínas de las TJ analizadas en el aumento de las uniones paracelulares, exploramos otros mecanismos de adhesión celular. Las cadherinas juegan un importante papel en la regulación de la permeabilidad intestinal, modulando la expresión de Claudina-‐5 y regulando la función de Akt/FoxO (247). En el presente estudio, la IL-‐10 era capaz de aumentar la expresión de la E-‐cadherina de forma independiente a p38 MAPK en las células epiteliales tratadas con GCs en un entorno inflamatorio. El hecho que las cadherinas sean las proteínas más abundantes en las AJ y desmosomas, hicieron pensar que la regulación de la TEER vía p38 MAPK se produjera a este nivel y no a través de las TJ. De hecho, el análisis efectuado por MET puso de relieve que la principal área de desacoplamiento celular se producía a nivel de desmosomas (Figura 32). Los desmosomas son claves en
Discusión
144
la regulación de la permeabilidad, de hecho distintos estudios demuestran que el bloqueo mediante anti-‐desmogleína-‐2 o -‐3 (cadherinas desmosomales) son capaces de romper la integridad del epitelio y su función barrera (248-‐250), no obstante la función de p38 MAPK en estos procesos es controvertida. Por otro lado, es destacable el patrón de expresión del GCRα que coincide con el de la TEER, aumentado por acción del eje IL-‐10/p38 MAPK. Estos datos, junto con evidencias anteriores (226), sugieren una posible asociación entre las acciones antiinflamatorias propias de la activación del GCRα con el fomento de las uniones intercelulares. La expresión de IL-‐10Rα está claramente influenciada por la IL-‐10, pero a diferencia del GCRα, el bloqueo de la fosforilación de p38 MAPK supone un aumento considerable de su expresión. El patrón observado para el IL-‐10Rα, es similar al de SOCS-‐3 e IkBα, y a la vez antagónico al de la producción de IL-‐8. En cualquier caso, la actividad generada por IL-‐10 parece influir en una modulación de la actividad p38 MAPK distinta al bloqueo de esta por SB203580.
La expresión in vitro de los receptores α de IL-‐10 y GCs se contrastó en biopsias de pacientes con colitis ulcerosa. Los receptores se hallaron distribuidos homogéneamente por el citoplasma de las células epiteliales intestinales, pero en los pacientes sensibles al tratamiento aparecían unas agrupaciones adicionales donde co-‐localizaban ambos receptores (Figuras 34 y 35). A pesar que la IL-‐10 incrementa la expresión de ambos receptores en las monocapas celulares, en las biopsias cólicas están incrementados en los pacientes no respondedores. Estos resultados podrían considerarse contradictorios si consideramos que la expresión de la IL-‐10 está muy disminuida en estos pacientes refractarios (Anexo 6). No obstante, en la complejidad del intestino el descenso de actividad en una vía de señalización se suele compensar con feedback que produce un aumento en la expresión de receptores activadores. Esto sugiere una disfunción en la trasmisión de señales a través de IL-‐10Rα y/o GCRα en los pacientes resistentes a los GCs, mientras que en los sensibles las agrupaciones de ambos receptores se asocian a una correcta activación de la señalización intercelular.
Discusión
145
En definitiva, este estudio demuestra que la presencia de la IL-‐10 influye sobre el epitelio intestinal reforzando las uniones intercelulares a través de un mecanismo que implica a la fosforilación de p38 MAPK, a la vez que se favorece la expresión de los receptores α de IL-‐10 y GCs. La acción sinérgica sobre el refuerzo paracelular que aparece por acción de la IL-‐10 y los GCs puede favorecer la recuperación del epitelio lesionado en la colitis ulcerosa. Probablemente a través de una disminución del estrés que genera el proceso inflamatorio sobre la célula epitelial. Lo que ayuda a recuperar la homeostasis y aislar la lamina propria de antígenos luminales. Además, los cambios moleculares que afectan a la respuesta frente a los GCs pueden ser detectados en el epitelio intestinal de pacientes con colitis ulcerosa. En todo caso, los resultados alcanzados sugieren posibles dianas en el epitelio intestinal respecto al problema de la respuesta inadecuada a los GCs en la colitis ulcerosa, lo que deberá ser concretado en posterior estudios.
Discusión
146
147
CONCLUSIONES
148
Conclusiones
149
10. CONCLUSIONES
1. La colaboración entre IL-‐10 y GCs fomenta la unión intercelular del epitelio intestinal. 2. La activación de p38 MAPK juega un papel importante en el sinergismo entre la IL-‐10 y los GCs en las células epiteliales del intestino. 3. La consecuencia biológica de esta sinergia es la regulación de la adherencia intercelular a nivel de desmosomas y, probablemente, modulando la expresión de cadherinas. 4. La presencia de IL-‐10 y GCs no se traduce en un cambio de la cantidad de proteínas de las TJ en células epiteliales tratadas con TNF-‐α. 5. La acción de la IL-‐10 sobre el epitelio intestinal induce la nuclearización de la p38 MAPK fosforilada que se evidencia en pacientes con colitis ulcerosa antes del tratamiento con corticosteroides. 6. La IL-‐10 en presencia de GCs modula la expresión del receptor α de los glucocorticoides y de la IL-‐10, implicando de nuevo la actividad de p38 MAPK. 7. La expresión de ambos receptores es detectada en el epitelio intestinal de pacientes con colitis ulcerosa mostrando cambios según la respuesta terapéutica.
Conclusiones
150
151
ANEXO
152
Anexo
153
GCs 72H PD98059 72h
GCs + PD98059
72h
*#
Increm
ento cé
lulas T
feno
tipo CD
4+
GCs 72H PD98059 72h
GCs + PD98059
72h
Increm
ento cé
lulas T
feno
tipo CD
8+
A
#
Bn.s
Anexo 1: Valores de incrementos de fenotipo, apoptosis, apoptosis y necrosis y células vivas del estudio en linfocitos de sangre periférica de individuos sanos, estimulados vía TCR.
Representación gráfica de la mediana IIQ de los incrementos de las células T con fenotipo CD4+ (Figura A) y con fenotipo CD8+ (figura B), después de 24h (boxes blancos) o 72h (boxes negros) de estímulo vía TCR.
Los resultados de estos estudios in vitro nos muestran un escaso cambio en los fenotipos celulares según la condición analizada. No existen cambios entre las poblaciones sometidas a estímulo de 24h respecto a las estimuladas durante 72h, excepto en la población de células T CD4+ tratadas con inhibidor y GCs conjuntamente (Anexo 1 A; *p≤0.04 vs 72h). Esta condición también muestra un incremento tanto a las 24h como en las 72h respecto a las células tratadas sólo con GCs (Anexo 1 A; #p=0.044 vs GCs).
Anexo
154
GCs 72H PD98059 72h
GCs + PD98059
72h
Increm
ento apo
ptosis
células T
CD8
+C
Increm
ento apo
ptosis +
necrosis de
células T
CD8
+
GCs 72H PD98059 72h
GCs + PD98059
72h
Dn.sn.s
Mediana IIQ de los incrementos de apoptosis (Anexo 1 C) y apoptosis más necrosis (Anexo 1 D) de células T CD8 + a las 24h (boxes blancos) o 72h (boxes negros) de estímulo vía TCR.
GCs 72H PD98059 72h
GCs + PD98059
72h
GCs 72H PD98059 72h
GCs + PD98059
72h
* *
n.s.
Increm
ento cé
lulas T
vivas
CD4+
Increm
ento cé
lulas T
vivas
CD8+
E F
Incrementos (medianas IIQ) de células T vivas CD4+ (figura E) y CD8 + (figura F) a las 24h (boxes blancos) o 72h (boxes negros) de estímulo vía TCR.
Estos resultados muestran una disminución en la viabilidad de las células T CD4+ en las condiciones tratadas con inhibidor con o sin GCs y un estímulo breve (24h) respecto a un estimulo de 72h (Anexo 1 E; *p≤0.025 vs 72h)
Anexo
155
Anexo 2: Medianas (IIQ) de los grupos basales de estimulación CD3+CD28+ de linfocitos de sangre periférica de individuos sanos.
24h 72h
Porcentaje fenotipo CD3+CD4+ 21.8 (15.30-‐26.26) 24.63 (17.72-‐34.70) Porcentaje fenotipo CD3+CD8+ 8.99 (6.15-‐17.93) 9.92 (4.97-‐12.66) Apoptosis CD3+CD4+ 11.75 (7.9-‐13.84)* 18.7 (14.1-‐23.96) Apoptosis CD3+CD8+ 16.92 (10.65-‐32.31) 35.7 (22.06-‐56.05) Apoptosis y necrosis CD3+CD4+ 27.28 (24.44-‐45.06)* 52.14 (39.25-‐80.56) Apoptosis y necrosis CD3+CD8+ 27.9 (16.56-‐48.01) 41.7 (24.5-‐61.84) *p≤0.031 vs 72h
Anexo
156
Anexo 3: Valores de TEER de las condiciones sin TNF-‐α de los cultivos monocapa Caco-‐2.
Control GCs
IL-‐10 GCs_IL-‐10
-‐5.9 (-‐10.5-‐4.5) -‐4.39 (-‐25.2-‐3.71) -‐6.8 (-‐13.2-‐8.5) 7.9 (-‐20.7-‐14.1) Medianas IIQ; n.s.
Anexo
157
Anexo 4: Resultados de los western blot realizados en células Caco-‐2 (Estudio I).
TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_IL10
Increm
entos Oclud
ina _solub
le
(Intensidad
Integrada )
Increm
entos Oclud
ina_Insoluble
(Intensidad
Integrada )
TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_IL10
C D
TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_IL10
Increm
entos MLCK
(Intensidad
Integrada )
E
TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_IL10
Increm
entos ZO
-‐1 _soluble
(Intensidad
Integrada )
Increm
entos ZO
-‐1_Insolub
le(In
tensidad
Integrada )
TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_IL10
A B
Anexo
158
190KDa
190KDa
A
61KDa
Control
TNF_GC
s
TNF_IL10
TNF_GC
s_IL10
TNF
Marcado
r de pe
so
molecular
61KDa
50KDa
50KDa
B
C
D
E
α-‐Tubulina
F
Los gráficos A-‐E representan las medias ± E.S. del resto de proteínas determinadas por western blot, sin significación estadística. En la imagen F se observa un ejemplo de las bandas obtenidas a partir de las membranas mediante el escáner Odyssey, para cada proteína representada en los gráficos anteriores y de la α-‐Tubulina, usada como gen de referencia.
Por contra, mediante la misma técnica de inmunobloting se validaron las formas fosforiladas de las quinasas JNK y AKT, y de ninguna de ellas se obtuvo señal.
Anexo
159
Anexo 5: Curvas de amplificación de la RT-‐PCR de los genes GCRβ e IL-‐10 valorados en monocapas de células Caco-‐2.
Imagen de las curvas de amplificación de RT-‐PCR donde se observa que no hay
expresión de los genes IL10 y GCRβ.
Anexo
160
Anexo 6: Clasificación de pacientes con colitis ulcerosa activa, utilizados para el estudio de la fosforilación de p38 MAPK por Inmunohistoquímica en la mucosa intestinal.
GRUPO Respuesta CMV Número
1 Colitis ulcerosa/corticosensibles Negativo 6
2 Colitis Ulcerosa /corticorresistentes Negativo 5
5 Individuos controles Negativo 6
Anexo
161
Anexo 7: Trabajo presentado en el congreso “Digestive Disease Week” de la American Gastroenterological Association.
Pre-‐tratamiento Post-‐tratamiento Sensibles Refractarios Sensibles Refractarios IL-‐10 40.0(8.85-‐1355.8)* 2.4(0.2-‐26.8) 11.8(2.9-‐25.2) 7.6(0.1-‐41.5) TNF-‐α 5.6(0.4-‐67.9) 80.9(1.68-‐223.38) 0.2(0.1-‐9.7)** 22.4(0.8-‐244.0) *p=0.023 sensibles vs refractarios **p=0.025 sensibles vs refractarios
Resultados representan los incrementos respecto a los controles sanos (apartado 6.2.8.4) Los resultados fueron normalizados a β2-‐microglobulina
Anexo
162
163
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