informe de trabajo de investigaciÓn tipo i farmacia
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
INFORME DE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
TIPO I
IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS Y CUANTIFICACIÓN
DE TANINOS Y FLAVONOIDES (QUERCETINA) POR ESPECTROFOTOMETRÍA
UV - Vis EN Artemisia absinthium L. (ASTERACEAE) “AJENJO”
AUTORES:
CHONATE URTECHO CINDY MEDALÍ.
FIGUEROA NEYRA VICTOR HUGO.
ASESOR:
DR. SAGASTEGUI GUARNIZ WILLIAM
TRUJILLO - PERÚ
2011
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JURADO DICTAMINADOR
Mg. GILMER ZARI GIL….…………….……………PRESIDENTE
Mg. FRANCISCO SAAVEDRA SUAREZ……….……...MIEMBRO
DR. WILLIAM SAGASTEGUI GUARNIZ…………..…MIEMBRO
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DEDICATORIAS
A Dios.
Por su inmenso amor
por haber iluminado mi camino
por nunca desampararme
y por brindarme la fuerza
para completar una meta.
CINDY
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A mis padres: Eva y Hermes.
Por su amor, cariño, comprensión y apoyo sin
condiciones, porque creyeron en mí, porque admiro
su fortaleza, porque en gran parte, gracias a ellos
veo alcanzada mi meta.
Con mucha gratitud, afecto, respeto y meritorio valor a mi
madre EVA CONCEPCION URTECHO ZAVALETA,
por lograr una hija profesional haciendo lo posible
de lo imposible, y muchas gracias por ayudarme
en momentos difíciles en el camino de mi vida.
Gracias por ser mi madre y mi amiga.
A mi hermano: Eduardo
Por haber estado siempre a mi lado,
por su cariño y apoyo incondicional,
por llenar mi vida de alegría,
por compartir mis triunfos y tristezas.
Te quiero mucho hermanito.
CINDY
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A mi amigo: Carlos Castillo Pizán
Por que simplemente eres un gran amigo.
Nunca voy a olvidar tus consejos, enseñanzas y
ayuda durante la realización de este trabajo de
investigación.
Gracias por todo mi AMIGO!
CINDY
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A DIOS
A Dios, por ser nuestro creador,
amparo y fortaleza, cuando más
lo necesitamos, y por hacer palpable
su amor a través de cada uno de los
que nos rodean. Por ser el amigo que
nunca falta.
VICTOR HUGO
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A MIS PADRES:
ANDRES Y LUPE
Por estar siempre a mi lado
aconsejándome y apoyándome.
Por hacer de mí una mejor
persona a través de sus consejos.
A MIS HERMANOS:
ANDRES, WALTER, FREDY
y EDINSON.
Por estar siempre a mi lado
brindándome confianza, amor y
cariño en los momentos más difíciles.
Por ser mis mejores amigos.
VICTOR HUGO
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A MIS AMIGOS:
JOHSSY, DHAILY, RENZO
Por su ayuda, confianza, comprensión y
Amistad por haber compartido momentos
maravillosos a lo largo de nuestra
carrera profesional. Siempre es muy bueno
contar con amigos como uds.
VICTOR HUGO
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AGRADECIMIENTOS
A los distinguidos miembros del jurado por sus sugerencias y aportes al
trabajo de investigación realizado. GILMER ZARI GIL (PRESIDENTE),
FRANCISCO SAAVEDRA SUAREZ (MIEMBRO) y WILLIAM SAGASTEGUI
GUARNIZ (MIEMBRO)
A nuestro asesor el DR. William Sagástegui Guarniz por su amistad, por su
paciencia y enseñanzas, por habernos ayudado en la realización de este
trabajo.
A nuestro amigo Carlos Pizán por su paciencia y enseñanzas desde el inicio del trabajo de
investigación.
CINDY Y VICTOR
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PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado:
En cumplimiento con las disposiciones vigentes emanadas del reglamento de
Grados y Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de
Trujillo, sometemos a vuestra consideración y elevado criterio, el presente informe de
investigación tipo I titulado: “Identificación de Metabolitos Secundarios y Cuantificación
de Taninos y Flavonoides (Quercetina) por Espectrofotometría UV - Vis en Artemisia
absinthium L. (Asteraceae) “Ajenjo”.
Esperando que el jurado se sirva a calificar este trabajo según su criterio
establecido, a pesar de la existencia de alguna deficiencia encontrada durante el desarrollo
del presente trabajo de investigación.
Trujillo, Mayo del 2011
Chonate Urtecho Cindy M. Figueroa Neyra Víctor H.
Autor Autor
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ÍNDICE
RESUMEN………………………………………….……………………..
ABSTRACT……….………………………………...…….……….……….
I. INTRODUCCIÓN…...……………………………………….……..
II. MATERIAL Y MÉTODO...………………………………………..
III. RESULTADOS………….……………………………….....……....
IV. DISCUSIÓN……………..…………………………………............
V. CONCLUSIONES………………...……………………………….
VI. RECOMENDACIONES……………………………………………
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………….…..
VIII. ANEXOS
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1
8
17
19
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24
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RESUMEN
Cada día se presta más atención al estudio de las plantas medicinales de forma
que la etnobotánica, la fitoterapia y la fitoquímica están tomando un auge insospechado
ya que el empleo de las plantas medicinales con fines curativos es una práctica que se ha
utilizado desde tiempo inmemorial, y que desde el comienzo de la medicina fueron ellas
las que proveyeron las estructuras bases para numerosos medicamentos. La finalidad del
estudio fue extraer e identificar metabolitos secundarios al mismo tiempo cuantificar
flavonoides expresados como quercetina y taninos con métodos validados en la
universidad de la Habana Cuba presentes en hojas de Artemisia absinthium L.
“Ajenjo”. Se trabajó con la marcha fitoquímica descrita por la Dra. Olga Look
realizando la extracción de principios activos a partir de 1 Kg de Artemisia absinthium
L. seco y molido, para luego comenzar a separar los mismos con solventes de diferente
polaridad (Extrato Hexánico, Extracto Etanólico y Extracto Acuoso Acido), a los cuales
se procedió a realizar la identificación del tipo cualitativo, haciendo uso de reactivos de
coloración y precipitación; también se realizó la identificación de Absintina por
cromatografía de capa fina. Se logró determinar la presencia de taninos, flavonoides,
esteroides, antraquinonas, cumarinas, alcaloides, sesquiterpenlactonas y absintina en
hojas de Artemisia absinthium L. Así mismo, se cuantifico flavonoides expresados en
quercetina mediante el método espectrofotométrico y taninos por el método de tungsteno-
molíbdico-fosfórico, y se obtuvieron como resultado 3.78% y 0.04% respectivamente.
Palabras claves: Artemisia absinthium L., metabolitos secundarios, Método
espectrofotométrico, Tungsteno-molíbdico-fosfórico, flavonoides (quercetina),
taninos.
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ABSTRACT
Every day, more attention is paid to the study of medicinal plants so that
ethnobotany, herbal medicine and phytochemistry are taking an unexpected boom since
the use of medicinal plants for healing is a practice that has been used since time
immemorial, and since the beginning of medicine was they who provided the basis for
many drug structures. The purpose of this study was to extract and identify secondary
metabolites simultaneously quantify flavonoids expressed as quercetin and tannins with
validated methods at the University of Havana Cuba present in leaves of Artemisia
absinthium L. "Wormwood." We worked with the phytochemical described by Dr. Olga
Look by extracting active ingredients from 1 kg of Artemisia absinthium L. dried and
ground, then begin to separate themselves with different polarity solvents (hexane extract,
ethanol extract and aqueous acid extract), to which was performed qualitative
identification, using the coloration and precipitation reagents also performed to identify
absinthin by thin layer chromatography. It was possible to determine the presence of
tannins, flavonoids, steroids, anthraquinones, coumarins, alkaloids, sesquiterpenlactone
and absinthin in leaves of Artemisia absinthium L. Likewise, was quantified flavonoids
expressed as quercetin by the spectrophotometric method and tannins by the method of
tungsten-molybdic-phosphoric, and obtained as a result of 3.78% and 0.04% respectively.
Keywords: Artemisia absinthium L., secondary metabolites, spectrophotometric
method, Tungsten-molybdic-phosphoric acid, flavonoids (quercetin), tannins.
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I. INTRODUCCIÓN
Con el transcurrir del tiempo el ser humano ha venido siendo un blanco
vulnerable, ante las enfermedades producidas por una serie de microorganismos
como bacterias, virus, hongos, etc.; ante este hecho se ha descubierto que la
mayoría del tratamiento a sus enfermedades se encuentra en las plantas1, 2, 3.
Las plantas medicinales han sido desde la antigüedad un recurso al
alcance del ser humano para su alimentación y la curación de sus enfermedades;
eran veneradas por las virtudes que se les había reconocido, transmitiéndose sus
virtudes de generación en generación; nadie buscaba el saber porqué o cómo
actuaban, pero era un hecho incontestable y que parecía mágico4.
El 80% de la población mundial, utilizan las plantas como principal
remedio medicinal, según nos señala la Organización Mundial de la Salud (OMS),
esta práctica está asociada al empirismo en muchos casos; faltan estudios químicos,
clínicos y epidemiológicos que confirmen de forma fehaciente los efectos
fisiológicos de las plantas y los principios activos responsables. Es importante
reconocer que el 25% de los fármacos existentes se obtienen de extractos vegetales,
o bien se han sintetizado a partir de sustancias halladas en la investigación
fitoquímica5.
La OMS considera como planta medicinal todo vegetal que contiene, en
uno o más de sus órganos, sustancias que pueden ser utilizadas con finalidades
terapéuticas o que son precursores en la semisíntesis químico-farmacéutica6.
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Un gran porcentaje de los principios activos de plantas deben su
actividad terapéutica a compuestos químicos complejos llamados metabolitos
secundarios, que son compuestos químicos de estructura relativamente compleja;
cuya función en el vegetal no es del todo bien conocida y no son esenciales en el
desarrollo de la planta ni tienen presencia universal para todas las especies
vegetales, tienen funciones como las relacionadas con los mecanismos de
defensa o protección, y actúan como biocidas, repelentes y/o inhibidores de la
alimentación para patógenos, herbívoros y competidores, de manera que puedan
garantizar su sobrevivencia4, 7.
En el proceso de determinación de metabolitos secundarios, se hace uso
de reacciones de precipitación y coloración, con la finalidad de identificar cual
es el metabolito secundario existente en tal o cual especie vegetal1, 3, 4. Estos son
de composición química muy variada, por lo general pertenecen a una de estas
categorías: fenoles, flavonoides, taninos, esteroides, quinonas, cardenólidos,
esteroides, alcaloides, leucoantocianidinas, saponinas, aceites esenciales
(esencias), gomas, resinas, etc.; cada uno de estos con diversa actividad
medicinal y que pueden encontrarse distribuidos por toda la planta en forma de
látex, jugos, secreciones, etc2.
En nuestro país, se encuentra la especie Artemisia absinthium L. (ajenjo)
es una hierba vivaz de la familia de las compuestas (asteraceae), de 50 a 80 cm
de altura, recubierta de un bello que le da un aspecto plateado. También crece en
Europa, Siberia y los Estados Unidos. Medicinalmente se utiliza las hojas y las
sumidades florales, principalmente su aceite en la preparación de ciertas bebidas
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alcohólicas, en especial el vermuth y la absenta. Esta última fue muy popular en
el siglo XIX en toda Europa, y comúnmente fue empleada por artistas y poetas,
incluido Vincent Van Gogh9. Así mismo, la absenta causo varios casos de daño
cerebral y algunas muertes y fue prohibida en muchos países a principios del
siglo XX. El aceite de ajenjo continúa siendo usado como agente aromático en
alimentos8, 9, 10.
Para el caso especial del ajenjo (Artemisia absinthium L.), la mayor parte
de información demuestra que esta planta contiene 2 metabolitos sumamente
importantes como son la tuyona y la absintina. Estas sustancias en cierta medida
son capaces de explicar la farmacología y toxicología de esta planta, sin
embargo también existen otros metabolitos de cierto interés fitoquímico, dentro
de los más comunes tenemos los alcaloides, esteroides, diterpenos,
sesquiterpenlactonas, flavonoides, cumarinas y quinonas 9, 11.
El aceite volátil de la Artemisia absinthium L. obtenida a través de la
destilación proporciona entre un 0.5 a 1.0% de rendimiento. Usualmente es de
color verde oscuro o algunas veces azul, y tiene un fuerte aroma y sabor amargo.
Este aceite es empleado en algunos lugares de Europa como analgésico, siendo
uno de los constituyentes primarios de este aceite el biciclo monoterpeno β-
tuyona (1S, 4R-tuyan-3-ona), el cual puede variar de 17.5 - 42.3% dependiendo
de la procedencia, clima y áreas de crecimiento de la droga12. También existe un
isómero de esta sustancia, la α-tuyona (1S, 4R-tuyan-3-ona), que contiene
cantidades entre 0.53 - 1.22%. Ambos metabolitos se pueden obtener a través de
extracción alcohólica en hojas de la planta. Durante mucho tiempo se sospecha
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que la tuyona, tenía efectos neurotóxicos y que era responsable de producir el
absentismo, el cual es una enfermedad que se caracteriza por una desintegración
física y mental. A pesar de estar en menos cantidad con respecto al β-tuyona, el
principal responsable del efecto psicoactivo y toxico del “ajenjo” es la α-
tuyona13.
Otro de los metabolitos secundarios encontrados en las plantas son los
taninos, estos están constituidos por un amplio grupo de compuestos
hidrosolubles con estructura polifenólica, de masa molecular entre 500 y 3000
aproximadamente, capaces de precipitar ciertas macromoléculas (proteínas,
alcaloides, celulosa, gelatina). Sus acciones farmacológicas son: antídotos en
intoxicaciones por metales pesados y alcaloides (debido a su capacidad para
formar estructuras complejas con estas sustancias), astringentes (debido a su
capacidad para precipitar proteínas de la piel, proteínas salivares, etc. Y por ello
se usan por vía externa como cicatrizante y por vía interna como antidiarreico. El
efecto antidiarreico lo ejercen en el intestino, y se administran combinados con
albumina o gelatina para evitar los ardores de estómago que producirían; como
antisépticos por su acción bactericida y bacteriostática y también ejercen un
efecto antifúngico; como protectores, los taninos se aplica en pomada de uso
externo, impermeabilizan la piel y la protegen de los agentes externos. En casos
de cicatriz favorecen la regeneración de la piel y tiene poder analgésico.
Aplicados sobre heridas sangrantes pueden tener una acción hemostática; como
antioxidantes (son capaces de captar radicales libres e inhibir la peroxidación
lipídica); también efecto hipocolesterolemico, además pueden actuar factores
antinutrientes, debido que ciertos taninos disminuyen la eficacia de los alimentos
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porque inhiben algunas enzimas endógenas o porque absorben y ejercen un
efecto sistémico de precipitación de las proteínas de la dieta14, 15.
La quercetina es un flavonoide ampliamente distribuido en el reino
vegetal; se trata de un compuesto polifenólico presente naturalmente en
vegetales, frutas, bebidas no alcohólicas y plantas medicinales. Dependiendo de
la dieta, el consumo de quercetina para la alimentación llega a superar los 500
mg diarios. Entre las principales virtudes de la quercetina destaca su poder
removedor sobre los radicales libres, ejerciendo un papel citoprotector en
situaciones de peligro de daño celular. La quercetina retira oxígeno reactivo
especialmente en forma de aniones superóxidos, radicales hidróxidos, peróxidos
lipídicos o hidroperóxidos y de esta manera bloquea el accionar deletéreo de
estas sustancias sobre las células16. Los efectos citoprotectores de la quercetina
son por ejemplo evidentes en fibroblastos de la piel humana, queratinocitos,
células endoteliales y ganglios sensoriales cultivados en presencia de sulfoxina-
butionina, un inhibidor irreversible de la glutatión sintetasa. Asimismo, la
quercetina ha demostrado inhibir in vitro la oxidación de la lipoproteína de baja
densidad (LDL) y reducir la citotoxicidad de la LDL oxidada. La propiedad
antioxidante de la quercetina se manifiesta por ejemplo, a través de la inhibición
de la peroxidación lipídica por intermedio de varios mecanismos17.
La quercetina demostró disminuir la incidencia de infarto de miocardio y
de derrames cerebrales en personas de tercera edad. Debido a la inhibición de la
peroxidación lipídica, la quercetina protege de la destrucción local del endotelio
por prostaciclina y el factor de relajamiento derivado del endotelio (EDRF). Las
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prostaciclinas y el EDRF inhiben la agregación plaquetaria y tienen acción
vasodilatadora18, 19.
La acción antiinflamatoria que poseen muchos flavonoides se relaciona
en parte con enzimas implicadas en el metabolismo del ácido araquidónico. En
general los flavonoides polihidroxilados actúan por la vía de la enzima 5-
lipooxigenasa, y los menos hidroxilados lo hacen por la vía de la ciclooxigenasa.
En cambio, in vivo pueden comportarse como inhibidores duales debido
probablemente a la biotransformación que sufren en el organismo. Por ejemplo,
se ha constatado a través de diversos ensayos clínicos que la quercetina
disminuye la inflamación de glándulas parótidas humanas, favorece la
cicatrización de heridas, en especial aquellas heridas supuradas del área
maxilofacial y cuello16, 17, 19.
Muchos de los trabajos que informan los principios activos de esta
planta, son de países europeos y asiáticos, tanto así que se describen métodos
para obtener aceites esenciales de las raíces según la farmacopea europea.
Actualmente en el Perú, se han reportado estudios de investigación realizados en
Artemisia absinthium, descubriendo que presentan metabolitos que tienen efecto
antipalúdico, antihelmíntico entre otros 20.
Sin embargo, no se ha reportado datos sobre estudios cuantitativos de los
principales metabolitos secundarios de esta planta, por lo que en este trabajo
pretendemos realizar a fin de determinar las concentraciones de Taninos y
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flavonoides expresados en quercetina. En base a estos antecedentes expuestos,
nos planteamos el siguiente problema de investigación:
¿Cuáles son los diversos Metabolitos Secundarios y cuál es la concentración
de Taninos y Flavonoides (Quercetina) que se encuentran en las hojas
Artemisia absinthium L. “ajenjo”, recolectada en la provincia de Contumazá,
Departamento de Cajamarca?
Para lo cual se plantearon los siguientes objetivos:
Extraer e identificar los metabolitos secundarios presentes en hojas
de Artemisia absinthium L. “Ajenjo”
Cuantificar flavonoides (quercetina) y taninos presentes en Artemisia
absinthium L. por el método espectrofotométrico.
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II. MATERIAL Y MÉTODO
1. MATERIALES
1.1. MATERIAL BIOLÓGICO.
Hojas de Artemisia Absinthium “ajenjo”, obtenidas en la provincia de
Contumazá, departamento de Cajamarca.
1.2. MATERIAL DE VIDRIO
De uso común en laboratorio.
1.3. EQUIPOS DE LABORATORIO
1.4. REACTIVOS
Bicloruro de Mercurio
Acido Fosfomolibdico
Acido Fosfórico
Acido Tánico
Acetato Plúmbico
Estufa Mermmet Tv-15u
Refrigeradora Imaco
Balanza analítica Sartorius ME 215
Baño maría Sartorius PRECISTERM
Bomba de vacio GAST 746ª
Espectrofotómetro UV/Vis HP
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Diclorometano
Tolueno
Resorcinol
Patrón de Quercetina
Hexano
Etanol 96°
Agua destilada
Acido Acético
Anhídrido Acético
Acido Sulfúrico concentrado
Acido Pícrico
Hidróxido de Potasio
Hidróxido de Sodio
Yoduro de Potasio
Amoniaco
Tricloruro Férrico
Tungstato de Sodio Dihidratado
Carbonato de Sodio
Acetona
Sulfato de Sodio Anhidro
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2. MÉTODO
2.1. Preparación de la muestra en estudio
Las muestras de hojas se limpiaron y secaron a temperatura ambiente,
luego se llevaron a secado en estufa a 40° C por tres días y se pulverizó.
2.2. Obtención de los extractos de las hojas de Artemisia absintium L.
Se pesó 100 gramos de hoja pulverizada, se colocó en los frascos de boca
ancha, se agregó cantidad suficiente de Hexano y etanol respectivamente,
exactamente hasta cubrir la droga, se dejó macerar por 7 días, a excepción de
la muestra que contiene agua acidulada, la cual solo fue llevado a infusión
por 45 minutos. Durante la maceración se agitó constantemente cada 24
horas. Luego, las muestras que contienen hexano y etanol, se filtraron
obteniéndose dos productos: el marco (droga ya tratada) y el extracto con
solvente. El marco se volvió a tratar 2 veces más con el respectivo solvente y
luego los extractos se juntaron, se llevaron a baño maria en vasos de
precipitación previamente tarados a 40°C hasta evaporar el solvente, se
volvió a pesar hasta peso constante y por diferencia de pesos se obtuvo el
rendimiento de cada extracto y finalmente se llevó a refrigeración de -5 hasta
0 °C. Para el caso de los extractos con agua acidulada, se filtró obteniéndose
nuevamente los productos antes mencionados. Finalmente, se pesaron los
vasos con extracto desecado y por diferencia de pesos se obtuvo el
rendimiento del mismo4, 21.
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2.3.Identificación de los metabolitos secundarios presentes en los extractos.
2.3.1. Identificación de Flavonoides
Reacción de Shinoda: En 0.1g del extracto etanólico desecado se
agregó alcohol y luego una pequeña porción de limaduras de
magnesio y dos gotas de acido clorhídrico concentrado21.
2.3.2. Identificación de Esteroles y Terpenoides
Reacción de Lieberman-Buchardat: Se colocó 1mg del extracto
hexánico desecado, luego se añadió 10 gotas de anhídrido acético, 20
gotas de acido acético y 1 gota de acido sulfúrico21.
2.3.3. Identificación de Alcaloides
Reacción de Mayer: Se aforó 1.35g de bicloruro de mercurio y 4g
de yoduro de potasio en una fiola de 100mL con agua destilada.
Luego los extractos (acuoso ácido y etanólico) desecados obtenidos
se acidularon con una solución de ácido clorhídrico al 1%4.
2.3.4. Identificación de Cumarinas
Se diluyó 0.1g de los extractos desecados en mención en 2 mL de
alcohol etílico 96 °. Luego se colocaron en tubos de ensayo y se
expusieron a lámparas UV (366 nm.)21.
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2.3.5. Identificación de Lactonas
Reaccion de Baljet: Se emplearon dos soluciones que se mezclaron
en volúmenes iguales antes de usarse. Solución A, 1g de acido
pícrico en 100mL de etanol de 96°; Solución B, 10g de hidróxido de
sodio en 100mL de agua. Para la prueba se pondrán 2-3mg de
compuesto y unas 3-4 gotas de reactivo4.
2.3.6. Identificación de Absintina
Se tomó de cada extracto desecado una cantidad equivalente a 5g de
ajenjo pulverizado, se agregó 5mL de solución de acetato plúmbico
10% para clarificar. El filtrado se extrajo con 50mL de
diclorometano, se separó la fase orgánica y se secó con sulfato de
sodio anhidro, finalmente el solvente se evaporó y el residuo se
diluyó en 0.5-1mL de etanol. Como no se disolvió completamente,
esto se colocó en baño maria. El extracto obtenido se colocó en
cromatoplacas de silicagel, y se tomó como patrón una cantidad
adecuada de resorsinol, debido a que ambas sustancias tienen el
mismo Rf. La fase móvil que se empleó fue una combinación de
acetona: acido acético 98%, tolueno: diclorometano en la proporción
de 10:10:30:50 v/v respectivamente4.
2.3.7. Identificación de Quinonas
Reacción de Bortranger: Se colocó en un tubo de ensayo una
pequeña porción de extracto desecado. Se añadió unos 5mL de
benceno y se agitó. El benceno tomó color amarillo. Luego se
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transvasó el benceno a otro tubo de ensayo y se añadieron unas gotas
de solución de KOH21.
2.3.8. Identificación de Saponina
Reacción de Rossel. Se colocó en una cápsula de porcelana cantidad
suficiente de extractos desecados (acuoso ácido o etanólico), se
añadió unas gotas de ácido sulfúrico concentrado4.
2.3.9. Identificación de Taninos
Se preparó una solución de Tricloruro de Hierro al 3% y se agregó
unas gotas a cada uno de los extractos desecados obtenidos4.
2.4. Análisis de Resultados cualitativos:
Los resultados obtenidos se presentan en cuadros donde se explica en forma
cualitativa la presencia (+) o ausencia (-) de los metabolitos secundarios para
cada ensayo realizado.
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2.5. Cuantificación de Metabolitos Secundarios
2.5.1. Cuantificación de Taninos por el Método del Tungsteno-
molibdico-fosfórico, UV-Vis 22, 23.
2.5.1.1. Preparación de la solución muestra
Se agitaron 10g de muestra con 500mL de etanol al 50% durante
6 horas, se dejó en reposo 8 horas y se agitó nuevamente por 30
minutos, para posteriormente filtrar. Se transfirieron 3mL de
filtrado a un matraz aforado de 50mL y se diluyó con agua
destilada hasta enrasar (Sm).
2.5.1.2.Solución de Referencia de Acido Tánico
Se disolvió 25mg de ácido tánico (previamente secado a 100 ºC
durante 2 h) en 100 mL de agua destilada, se tomó 20mL y se
completó hasta 100mL.
2.5.1.3. Reactivo para taninos
Se disolvió 10.0 g de tungstato de sodio dihidratado, 0.2g de
ácido fosfomolibdico y 5mL de ácido fosfórico al 85% en 75mL
de agua destilada. Se reflujó 2h (hasta aparición de color
amarillo; no verde, ni azul) y después se completó a 100mL con
agua destilada.
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2.5.1.4.Solución de carbonato de sodio.
Se disuelven 10g de carbonato de sodio anhidro en 50mL de agua
destilada.
Finalmente se prepararon matraces aforados de 50mL, los cuales
contenían:
REACTIVOS BLANCO PATRÓN MUESTRA
Sm (Solución Muestra) - - 1mL
Sol. de Referencia de Acido Tánico - 3mL -
Agua destilada 5mL 2mL 4mL
Reactivo para Taninos 2mL 2mL 2mL
Se agitó y se dejó reposar durante 5 minutos.
Sol Carbonato de Sodio al
20% 1mL 1mL 1mL
Se completó con agua destilada hasta enrase y se mezcló para finalmente
llevarse a lectura a 700nm después de transcurridos 2 minutos de la
reacción.
La expresión para los cálculos es la siguiente:
𝑋 =𝐴𝑚 × 𝑃 × 1000 × 1 00
𝐴𝑝 × 𝑃𝑀 × (100 − 𝑝)
X = contenido de taninos en la droga (%)
P = masa de la sustancia de referencia (g)
Am = Absorbancia de la muestra
Ap = Absorbancia de la solución de
referencia
PM = masa de la droga (g)
P = humedad de la droga (%)
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1000 y 100 = factor matemático para el
cálculo.
2.5.2. Cuantificación de Flavonoides totales expresados como
quercetina por el Método espectrofotométrico22.
Se reflujó 0.5g de muestra, 2 horas con 20mL de acido sulfúrico
al 10% y 20mL de etanol al 50%, luego se enfrió y filtró con ayuda
de vacío. El residuo se lavó con 30mL de etanol al 50% para
desecharlo finalmente; el filtrado se evaporó en baño de agua hasta la
mitad del volumen inicial, se enfrió sobre baño de hielo durante
30min y luego se filtró, lavando el precipitado formado con 4
porciones de 10mL de agua destilada fría (10-15°C). Se eliminó el
filtrado y los lavados, y el residuo tanto del filtro como del recipiente
se disolvió con 70mL de etanol al 96%, calentando previamente a
50°C; la solución se pasó a una fiola de 100mL y se completó
volumen con etanol al 96% (solución muestra). Posteriormente se
leyó las absorbancias a 258nm. Como patrón se empleó 0.04g de
quercetina, los cuales se disolvieron con etanol al 96% hasta
completar un volumen de 50mL; de esta solución se tomó 1mL y se
diluyó a 100mL con etanol al 50%. El blanco consistió en una
solución de etanol al 50%.
La expresión que se empleará para el cálculo será la siguiente:
𝑋 =𝐴𝑚 × 𝑃𝑅 × 5 × 100
𝐴𝑅
X= contenido de flavonoides totales
expresados como quercetina (%)
Am= Absorbancia de la solución muestra
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(nm)
PR= peso de la sustancia de referencia (g)
AR= Absorbancia de la solución de referencia
III. RESULTADOS:
Cuadro Nº1: Resultados de metabolitos secundarios encontrados en hojas de Artemisia
absinthium L. utilizando los métodos de coloración, precipitación y CCF
EXTRATO M. SECUNDARIO REACCIÓN RESULTADO
EXTRACTO
ETANOLICO
Flavonoides Shinoda +
Alcaloides Mayer +
Cumarinas Fluorescencia +
Lactonas Baljet +
Absintina CCF +
Quinonas Bortranger +
Saponinas Rossel -
Esteroides Liebermann-Burchard +
Taninos FeCl3 +
EXTRACTO
HEXANICO
Esteroides Liebermann-Burchard +
Lactonas Baljet +
Absintina CCF +
Quinonas Bortranger +
Taninos FeCl3 +
EXTRACTO
ACUOSO ACIDO
Cumarinas Fluorescencia +
Taninos FeCl3 +
Alcaloides Mayer +
Quinonas Bortranger +
Saponinas Rosell -
Lactonas Baljet +
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Absintina CCF +
(+): Reacción positiva. Presencia del Metabolito Secundario
(-): Reacción Negativa. Ausencia del Metabolito Secundario
CCF: Cromatografía en capa fina.
Cuadro Nº 2: Concentración de Taninos en hojas de Artemisia absinthium L. por el
método del Tungsteno-molíbdico-fosfórico en espectrofotometría
UV-Vis.
TANINOS
Concentración en mg Porcentaje (%)
44.38 0.44
Cuadro Nº 3: Concentración de Flavonoides (Quercetina) en hojas de Artemisia
absinthium L. por el Método Espectrofotométrico UV.
FLAVONOIDES (QUERCETINA)
Concentración en mg Porcentaje (%)
18.88 3.78
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IV. DISCUSIÓN
En el presente trabajo se propuso identificar los metabolitos secundarios y
cuantificar taninos con el método tungsteno-molíbdico-fosfórico y flavonoides
expresados como quercetina según el método espectrofotométrico, presentes en
hojas de Artemisia absinthium. Para ello se realizó la identificación preliminar
mediante métodos fisicoquímicos por reacciones de coloración, de precipitación
y de cromatografía en capa fina, los metabolitos secundarios presentes en los
diversos extractos de la droga obtenidos con solventes orgánicos de diferente
polaridad: Hexánico, Etílico, y con Agua acidulada24.
En el cuadro N° 01 se reporta los metabolitos secundarios identificados con
reacciones de coloración, precipitación y de cromatografía en capa fina en los
diferentes extractos, teniendo en cuenta la polaridad del solvente empleado,
encontrándose la presencia de flavonoides, alcaloides, sesquiterpenlactonas,
antraquinonas, taninos, esteroides, absintinas y cumarinas, no se logró
identificar saponinas en ninguno de los extractos.
Los resultados muestran que las lactonas de naturaleza sesquiterpénica,
según el ensayo, se obtuvieron de acuerdo a su intensidad de coloración, en
mayor proporción en el solvente de más baja polaridad; resultando menor en
etanol y casi nula en el agua acidificada. Esto justifica la presencia de lactonas
muy lipofílicas, las cuales están poco solvatadas con agua, en contraposición con
las solubles en agua, que poseen sustituyentes hidrofílicos24.
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Las sesquiterpenlactonas, se encuentran distribuidas en la familia
Asteraceae, notablemente en géneros Artemisia y Ambrosia. Son sustancias
amargas que se encuentran en todas las partes de la planta, en concentraciones
que varían entre 0.01 y 8% del peso seco, siendo las concentraciones mayores
generalmente en las hojas. Además, son de gran importancia por la variada
acción biológica que han demostrado siendo la acción citotóxica, antitumoral,
analgésica, inhibidoras del crecimiento de bacterias, entre otras25.
Para identificar la presencia de absintina, se utilizó el método de
cromatografía en capa fina, utilizando como estándar el resorsinol. Este
metabolito es la principal sesquiterpenlactona presente en la Artemisia
absinthium, la cual es un guainólido dimérico, es decir que se encuentra
formado por dos núcleos lactónicos, y que en los análisis organolépticos es el
responsable del sabor amargo12, 25.
En el estudio químico de la especie se decidió cuantificar taninos y
flavonoides totales expresados como quercetina, por ser metabolitos secundarios
que se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal con múltiples
propiedades farmacológicas : antioxidantes, antiinflamatorias, antiagregantes
plaquetarios, antimicrobianas, antirradicales libres, antimutagénicas,
anticarcinogénicas, antiaterogénicas y quimioprotectoras25.
Se obtuvo 0.44% de taninos en hojas de Artemisia absinthium obtenidas de
la provincia de Cajamarca-Perú (cuadro N° 02). Cabe señalar que los datos son
validos solo para las muestras analizadas ya que se conoce que la variabilidad de
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los taninos depende de diferentes factores como: condiciones edafológicas,
tiempo de cosecha, forma de almacenamiento de la hoja lo mismo que el tiempo
de almacenamiento e incluyendo la individualidad entre los mismos cultivos
sembrados en diferente o igual localidad. Como concluye el Dr. Yi Yun en el
estudio clínico Comparison of Tannin Contents in Artemisia argyi from
Different Areas donde las concentraciones de taninos varían desde 2.92% hasta
13.29%. Esto tienen relación con un estudio realizado en la provincia de Sari-
Iran, donde se encontró una concentración de taninos de Artemisia absinthium
que varía entre 14.99% ± 0.97%, utilizando el mismo método de tungsteno-
molíbdico-fosfórico26, 27, 28.
Existen diferentes métodos para cuantificar taninos, entre los que destacan
métodos fisicoquímicos, químicos y biológicos, siendo este último el más
adecuado. Sin embargo, los taninos no se reconocen como causantes de
hemólisis pero en recientes estudios se han demostrado que algunos de ellos si
presentan propiedades hemolíticas, por lo que se hace necesario la evaluación de
esta actividad en aquellas plantas que los presenten, según el estudio sobre la
actividad hemolítica de los posibles taninos extraídos a partir de la Boldoa
purpurascens Cav. 29. No obstante, dentro de los métodos químicos podemos
realzar el método utilizado en este estudio ya que mide la capacidad reductora de
la muestra, esto se basa en la reducción del acido fosfomolíbdico por los fenoles
en un álcalis acuoso. Además, determina la totalidad de los grupos fenólicos
libres y por consiguiente determina la totalidad de fenoles solubles tanto taninos
hidrolizados como taninos condensados. Otra de las ventajas es que el método
espectrofotométrico utilizado es más selectivo, preciso, exacto, que un análisis
por valoración volumétrica que usa el método de jean29, 30, 31.
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Se encontró también un 3.78% de flavonoides expresados como
quercetina en “ajenjo” de la provincia de Cajamarca-Perú, cuadro N°03,
mientras que en el estudio en Artemisia absinthium de Iran, el resultado obtenido
fue de 1.24%, estas variaciones posiblemente se deben a factores ambientales
descritos anteriormente 27. Esta cuantificación se realizó por el método
espectrofotométrico, donde los flavonoides son hidrolizados con calefacción en
solución de etanol/H2SO4 y cuantificados en la región ultravioleta a la 258nm
32, 33. Los métodos de cuantificación utilizados en este estudio fueron validados
por el instituto de Farmacia y Alimentos de la Universidad de la Habana20, 34.
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V. CONCLUSIONES
De los resultados obtenidos en el presente trabajo se concluye lo siguiente:
Los metabolitos secundarios identificados en el extracto de hojas de
Artemisia absinthium L. son: taninos, flavonoides, esteroides,
quinonas, lactonas, cumarinas, absintina y alcaloides.
La concentración de taninos en las hojas de artemisia absinthium
provenientes del departamento de Cajamarca, fue de 0.44%.
La concentración de flavonoides expresados en quercetina en las
hojas de artemisia absinthium provenientes del departamento de
Cajamarca, fue de 3.78%.
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VI. RECOMENDACIONES
1. Este trabajo pretende estimular la realización de futuros estudios para evaluar
el posible efecto farmacológico de los metabolitos secundarios encontrados
en las hojas de Artemisia absinthium L. y ver su posible aplicación contra
alguna patología.
2. Divulgar la información obtenida de este estudio para contribuir a promover
la evaluación preliminar de metabolitos secundario en plantas.
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ANEXO 1: IDENTIFICACION DE METABOLITOS SECUNDARIOS
Reacción de Shinoda: Flavonoides Reacción de Lieberman: Esteroles
Reacción de Mayer: Alcaloides Fluorescencia: Cumarinas
Reacción de Baljet: Lactonas Reacción de Borntrager:
Antraquinonas
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BIBLIO
TECA D
E FARMACIA
Y B
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Cromatografía en Capa Fina: Absintina
Reacción de Rosell: Saponinas Reacción con FeCl3: Taninos
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ANEXO 2: REACCIONES QUÍMICAS DE IDENTIFICACIÓN
REACCION DE LIEBERMANN-BURCHARD
(Verde azulado o anaranjado)
REACCION DE MAYER
CH3
CH3
CH3
CH3 O CH3
O OS
O
O
OOH H_
__
__ __
__
___
__
HgCl2 + 4KI Hg2-
III
I
. K+
. K++ 2 KCl
Hg2-
III
I
. K+
. K++
2
N+R
H. HSO4
-
Hg
III
I
N+R
H
N+R
H
2-
Ppdo Blanco
CH3
CH3
CH3
C- C-O CH3CH3
OO
H H
__ __ ++
CH3
CH3
CH3
C- C-O CH3CH3
OO H
H
+
+__
__
_
_ _ _ __
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ICA
REACCION DE SHINODA
O
O
MgCl2
O+
OMgCl
O
O
O+
O-
O+
O-
Mg
(Rojo)
Flavona
O
OOH
MgCl2
O+
O
O
Mg Cl
H
O
O
OH
(Rojo a Crimson)
Flavonol
___
O+
O-
O+
H
Mg
O+
O-
O+
H
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REACCION DE BORNTRAGER
O
O
MgCl2
Flavanona
O+
O Mg Cl
O
O
O+
O
O+
O Mg
(Crimson a Magenta)
O
O
OOH
H
Na+OH -
O-
O
OOH
O
O
O-
OH
. Na+
(Rojo)
Antraquinona
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ANEXO 3: FOTO DEL ENSAYO DE LA CUANTIFICACIÓN DE TANINOS EN
HOJAS DE Artemisia absinthium L.
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