Laboratorios de MicrofotónicaDepartamento de Inmunología y Oncología

Centro Nacional de Biotecnología - CSICMadrid (Spain)

PROTOCOLOS PARA MICROSCOPÍA

1. INMUNOTINCIÓNEl objetivo de éste, y el resto, de los protocolos, es dar una idea general de la técnica, de sus posibilidadesy limitaciones. Las condiciones que comentamos son completamente orientativas, y aunque puedenfuncionar perfectamente en la mayoría de las situaciones, cada experimento necesitaría ajustar losparámetros correspondientes.Se asume que el lector tiene unos conocimientos elementales de los conceptos y técnicas básicos debiología celular.

PREPARACIÓN DE LAS CÉLULAS.Las muestras se obtienen por cortes de tejidos o de cultivos celulares. Las células cultivadas se siembransobre láminas cubreobjetos o directamente sobre portas preparados a una densidad de unas 100000-30000por ml (un pocillo de placa de 24) y se dejan adherir al menos 6-8 horas antes de procesarlas. Los cortesde tejidos se procesan como se describe en los protocolos de histología.

FijaciónDependiendo de la molécula que deseemos estudiar, las condiciones de fijación varian ampliamente.Los dos fijadores más empleados son los aldehidos, sobre todo el formaldehido (FA), y el etanol.El fijador más versatil es el formaldehido diluido al 3,7% en PBS (de no indicarse otra cosa el pH delPBS es 7,4). Se prepara diluyendo la solución comercial de formol (viene con un 37% de pureza) 1:10 enPBS. Algunos usuarios prefieren utilizar el parafolmaldehido (viene en polvo) al 4% en PBS que da unosresultados idénticos al formol pero es mucho más dificil de preparar y debe almacenarse a –20ºC. El FAfija las células manteniendo la permeabilidad de la membrana, si se desea acceder a moleculasintracelulares es preciso permeabilizar la membrana con un detergente (como el triton) o un divolvente delípidos (como la acetona). El etanol, si permeabiliza las membranas y permite que nos ahorremos esepaso.Una fijación estandar se hace:1. Retirar el medio de cultivo (solo para células cultivadas).2. Lavar dos veces con PBS (30 s cada vez)3. Añadir la solución de fijador y dejar 5 minutos. Para muestras gruesas, dejar 10 min.4. Lavar dos veces, 5 minutos, con PBS.5. Permeabilizar si es necesario. La mejor opción es el Tritón X-100 al 0,05 % en PBS cinco minutos.

Es posible emplear otros detergentes (como el Tween-20) pero no son tan eficientes y a lasconcentraciones necesarias en el proceso pueden alterar los resultados finales. Tras permeabilizarlavar con PBS durante 10 minutos.

BloqueoEn el interior de la célula existen moléculas que pueden unirse inespecíficamente a proteinas (como losanticuerpos) por interacciones no inmunes y dar falsos positivos. Para evitarlos se procede a laneutralización de este tipo de interacciones por medio de la solución de bloqueo.Existen diferentes soluciones de bloqueo tanto comerciales como artesanas: Albúmina bobina BSA enPBS, leche descremada, sueros de cabra o conejo diluidos en PBS o incluso el suero bobino fetal, etc. Lamás empleada es PBS con un 1% de BSA y 10 % de suero de cabra al que se añade un 0,01 % de tritónX-100 en el caso de que sean células permeabilizadas.

AutofluorescenciaLas células son autofluorescentes debido a que existen productos del metabolismo celular que sonfluorescentes (el principal de ellos es el Flavin adenin dinucleótido), pero cuando se fijan con aldehidos laautofluorescencia aumenta, llegando a ser espectacular en el caso del glutaraldehido. Esta fluorescenciainespecífica puede, tanto llegar a ser considerada como un falso positivo, como enmascarar señalesespecíficas débiles. La autofluorescencia debe ser eliminada en la medida de lo posible.

Para inhibir la autofluorescencia podemos realizar un lavado de las muestras recién fijadas, durante 10minutos, con una de las dos soluciones más empleadas:1. Borohidruro de sodio al 0.1 % (recién preparado) en PBS pH 8.0.2. Cloruro amónico 50 mM en PBS pH 8.0.

TECNICA DE INMUNODETECCION DIRECTA.Se utilizan anticuerpos específicos contra antígenos concretos que vienen ya marcados con el fluorocromocorrespondiente (u otro marcador) en su presentación comercial.1. Diluir el anticuerpo en tampón de bloqueo a la concentración sugerida por el fabricante.2. Incubar 30 minutos en atmósfera saturada de humedad, a la temperatura que indique el fabricante. .

Si no se indica nada suele ser suficiente 30 minutos a temperatura ambiente en atmósfera saturada dehumedad ya que que prácticamente todos los anticuerpos trabajan bien en un rango entre 18 y 37ºC.No obstante, la temperatura ideal es 4ºC (hay menos uniones inespecíficas) y si el anticuerpofunciona a esa temperatura deberíamos incubar en frío.

3. Lavar tres veces con PBS (con 0,01 % de tritón X-100 si las células estaban permeabilizadas), 10minutos cada vez.

TECNICA DE INMUNODETECCION INDIRECTAEs muy común que los anticuerpos contra los principales marcadores de superficie ya vengan conjugadoscon fluorocromos y otros marcadores (peroxidasa, fosfatasa, etc.), pero muchos anticuerpos, sobretodo sison poco comunes, no están disponibles en formas conjugadas, para poder visualizar la unión de éstos asu correspondiente antígeno es preciso recurrir a marcajes indirectos.Un marcaje indirecto consiste en utilizar una molécula conjugada con un marcador (fluorocromo uenzima) que reconoce al anticuerpo primario de modo que se detecta la presencia de éste y, de ese modoindirecto, la de la molécula que reconoció. Vamos a describir la técnica de inmunodetección porinmunofluorescencia indirecta con anticuerpos conjugados con fluorocromos, aunque existen otras, comola avidina-biotina, que se explican en otro lugar.

Anticuerpo primario.1. Lavar las muetras 10 min con PBS para retirar los restos del inhibidor de autofluorescencia2. Diluir el anticuerpo primario, en solución de bloqueo, a la concentración adecuada.3. Incubar en atmósfera húmeda a la temperatura y tiempo sugeridos por el suministrador del

anticuerpo. De no indicarse nada, hacerlo a temperatura ambiente 30 minutos.4. Retirar el anticuerpo y lavar tres veces con PBS (con 0,01 % de tritón X-100 si las células estaban

permeabilizadas), 10 minutos cada vez.

Anticuerpo secundario.1. Preparar la dilución sugerida por el fabricante (en PBS), añadir a las muestras e incubar 1 hora.2. Retirar el anticuerpo y lavar tres veces con PBS.

PREPARACION DE LAS MUESTRAS PARA OBSERVACIONAlmacenamientoGuardar a 4º hasta el momento de la observación.Si las células no se van a observar en un plazo corto (72 h) deberían ser refijadas 10 minutos con FA al3,7% en PBS y luego retratadas para bloquear la autofluorescencia.

Montaje para la observaciónColocar 20 ul de medio de montaje entre porta y cubre. Existen diferentes medios de montaje, el másempleado para una observación rápida es el glicerol al 75% en PBS.