institut für lebensmitteltoxikologie und chemische analytik · lc-ms/ms flüssigchromatographie...
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Tierärztliche Hochschule Hannover
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik
C18-Furanfettsäuren –
Toxikologische Charakterisierung der Oxidationsprodukte
von konjugierten Linolsäureisomeren
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften
- Doctor rerum naturalium -
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Imme Lengler
aus Hamburg
Hannover 2011
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Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Pablo Steinberg
2. Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen,
Abteilung Lebensmittelsicherheit,
Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)
1. Gutachter: Prof. Dr. Pablo Steinberg und Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen
2. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2011
gefördert durch:
Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; LA 1177)
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Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis .................................................................................. I
Abkürzungen ........................................................................................ V
1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary) ................................. 1
2 Einleitung .......................................................................................... 5
2.1 Konjugierte Linolsäureisomere (CLA) ............................................................. 7
2.1.1 Struktur und Biosynthese von CLA ................................................ 7
2.1.2 Gehalte in Lebensmitteln und Aufnahmemenge von CLA ........... 8
2.1.3 Antikarzinogene Effekte der CLA.................................................... 9
2.1.4 Effekte der CLA auf die Körperzusammensetzung ..................... 13
2.1.5 Weitere Wirkungen und mögliche Risiken von CLA ................... 14
2.2 Furanfettsäuren (FFA) .................................................................................... 16
2.2.1 Struktur von FFA ............................................................................ 16
2.2.2 Vorkommen und Biosynthese von FFA ....................................... 17
2.2.3 Reaktionen von FFA ....................................................................... 20
2.2.4 Physiologische Bedeutung und Toxikologie von FFA ................ 21
2.3 In vitro-Zellmodelle zur Untersuchung der Fettsäuren ................................ 23
2.4 Zielsetzung ...................................................................................................... 25
3 Material ............................................................................................ 26
3.1 Zelllinien........................................................................................................... 26
3.2 Zellkulturmedien und Zusätze ........................................................................ 26
3.3 Fettsäuren ........................................................................................................ 26
3.4 Laborgeräte und Laborhilfsmittel .................................................................. 27
3.5 Verbrauchsmaterialien ................................................................................... 28
3.6 Reagenzien und Chemikalien ......................................................................... 29
3.7 Molekular- und zellbiologische Kits .............................................................. 30
3.8 Primer und Antikörper .................................................................................... 31
3.9 Software ........................................................................................................... 31
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Inhaltsverzeichnis
II
4 Methoden ......................................................................................... 32
4.1 Zellbiologische Verfahren .............................................................................. 32
4.1.1 Kultivierung .................................................................................... 32
4.1.2 Einfrieren und Auftauen der Zellen ............................................... 32
4.1.3 Zellzahlbestimmung ....................................................................... 33
4.1.4 Inkubation mit Testsubstanzen (Fettsäuren) ............................... 33
4.2 Zellassays ........................................................................................................ 34
4.2.1 Lipidfärbung ................................................................................... 34
4.2.2 Proliferation .................................................................................... 34
4.2.3 Zytotoxizität .................................................................................... 35
4.2.4 Apoptose ......................................................................................... 35
4.2.5 Transaktivierungsassay ................................................................ 36
4.3 Genotoxizitätstests ......................................................................................... 38
4.3.1 Ames-Test ....................................................................................... 38
4.3.2 Mikrokerntest .................................................................................. 39
4.4 Proteinbiochemische Methoden .................................................................... 39
4.4.1 Proteinisolierung ............................................................................ 39
4.4.2 Proteinbestimmung ........................................................................ 40
4.4.3 Eindimensionale Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ...................... 41
4.4.4 Westernblot und Immundetektion ................................................ 42
4.4.5 Zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) .............................. 43
4.4.5.1 Isoelektrische Fokussierung (IEF) .................................................... 43
4.4.5.2 Equilibrierung ................................................................................... 45
4.4.5.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ............................................ 45
4.4.5.4 Färbung und Digitalisierung der Polyacrylamidgele ......................... 46
4.4.5.5 Digitale 2-DE Gelbild-Analyse .......................................................... 46
4.4.5.6 Massenspektrometrische Identifizierung von Proteinen ................... 47
4.5 Studien zur Genexpression ............................................................................ 47
4.5.1 RNA-Isolierung ............................................................................... 47
4.5.2 cDNA-Synthese .............................................................................. 48
4.5.3 Quantitative real-time PCR (qPCR) ............................................... 48
4.6 Statistik ............................................................................................................ 49
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Inhaltsverzeichnis
III
5 Ergebnisse ...................................................................................... 50
5.1 Proteomische Analyse der intestinalen Zelllinie Caco-2 ............................. 50
5.1.1 Methodenetablierung anhand der Caco-2-Differenzierung ........ 50
5.1.1.1 Identifizierung differenzieller Proteine der Caco-2-Differenzierung ................................................................................. 51
5.1.1.2 Validierung der 2-DE Ergebnisse mittels Westernblot und qPCR .... 55
5.1.1.3 Netzwerkanalyse .............................................................................. 58
5.1.2 Caco-2-Proteomanalyse nach Behandlung mit t10,c12-CLA ..... 61
5.1.2.1 Identifizierung differenzieller Proteine nach Behandlung mit t10,c12-CLA ..................................................................................... 61
5.1.2.2 Netzwerkanalyse der durch t10,c12-CLA regulierten Proteine ......... 67
5.1.3 Caco-2-Proteomanalyse nach Behandlung mit 10,12-FFA ......... 69
5.1.3.1 Identifizierung differenzieller Proteine nach Behandlung mit 10,12-FFA ........................................................................................ 69
5.1.3.2 Netzwerkanalyse der durch 10,12-FFA regulierten Proteine ............ 72
5.2 Zelluläre Wirkungen von FFA in Caco-2-Zellen ............................................ 75
5.2.1 Zytotoxizität von FFA in Caco-2-Zellen ........................................ 75
5.2.2 Einfluss von FFA auf die Proliferation von Caco-2-Zellen .......... 76
5.2.3 Einfluss von FFA auf die Apoptose in Caco-2-Zellen ................. 78
5.2.4 Aufnahme von FFA in Caco-2-Zellen ............................................ 79
5.3 Zelluläre Wirkungen von FFA in HepG2-Zellen ............................................ 81
5.3.1 Zytotoxizität von FFA in HepG2-Zellen ......................................... 81
5.3.2 Einfluss von FFA auf die Proliferation von HepG2-Zellen .......... 83
5.3.3 Einfluss von FFA auf die Apoptose in HepG2-Zellen .................. 84
5.4 Untersuchungen zur Genotoxizität von 9,11-FFA ........................................ 85
5.4.1 Ames-Test ....................................................................................... 85
5.4.2 Mikrokerntest .................................................................................. 88
5.5 Transaktivierung von PPAR durch 9,11-FFA ................................................ 90
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Inhaltsverzeichnis
IV
6 Diskussion ...................................................................................... 92
6.1 Identifizierung neuer Biomarker der Caco-2-Differenzierung ..................... 93
6.2 Mechanismen der antiproliferativen und differenzierungsfördernden Wirkung von t10,c12-CLA in Caco-2-Zellen .................................................. 96
6.3 Die 10,12-FFA beeinflusst keine toxikologisch relevanten Signalwege in Caco-2-Zellen ............................................................................................ 105
6.4 Zytotoxizität und Genotoxizität von FFA..................................................... 114
6.5 Kanzerogenität von FFA ............................................................................... 116
6.6 Schlussfolgerung und Ausblick .................................................................. 120
7 Literaturverzeichnis ...................................................................... 122
Anhang .............................................................................................. 144
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Abkürzungen
V
Abkürzungen
2-DE zweidimensionale Gelelektrophorese
8,10-FFA 8,11-Epoxy-8,10-octadecadiensäure
9,11-FFA 9,12-Epoxy-9,11-octadecadiensäure
10,12-FFA 10,13-Epoxy-10,12-octadecadiensäure
11,13-FFA 11,14-Epoxy-11,13-octadecadiensäure
APC adenomatous polyposis coli-Protein
APS Ammoniumpersulfat
BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
c9,t11-CLA cis-9,trans-11-Octadecadiensäure
Caco-2 humane Kolonadenokarzinom-Zelllinie
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate
CLA konjugierte Linolsäure(n) (conjugated linoleic acid)
CYP Cytochrom P450 Monooxygenase(n)
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTPs Desoxyribonukleotide
DTT 1,1,1-Trichlor-2,2-bis-(chlorophenyl)ethan
ECL verstärkte Chemilumineszenz
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EtOH Ethanol
FFA Furanfettsäure (furan fatty acid)
FKS fötales Kälberserum
gDNA genomische Desoxyribonukleinsäure
GST Glutathion-S-Transferase(n)
HCCA α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure
HCl Salzsäure
HepG2 humane hepatozelluläre Karzinom-Zelllinie
HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie
IC50-Wert mittlere inhibitorische Konzentration
IEF isoelektrische Fokussierung
IPA Ingenuity Pathway Analyse
IPG immobilisierter pH-Gradient
ITS Insulin-Transferrin-Selenium
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Abkürzungen
VI
kDa Kilodalton
LC-MS/MS Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie
MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time Of Flight
MgCl Magnesiumchlorid
MMLV Moloney Murine Leukemia Virus
mRNA messenger Ribonukleinsäure
MW Molekulargewicht (molecular weight)
NaCl Natriumchlorid
NaOH Natriumhydroxyd
NBT Nitroblau-Tetrazoliumchlorid
nt Nukleotide
Oligo(dT) oligo-Desoxythymidin
ONPG o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
ORF offener Leserahmen
PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PBS-T Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit TWEEN-20
PCR Polymerase-Kettenreaktion
Pen/Strep Penicillin/Streptomycin
pI isoelektrischer Punkt
PPAR Peroxisomen-Proliferator-aktivierter-Rezeptor
PUFA mehrfach ungesättigte Fettsäure (polyunsaturated fatty acid)
qPCR quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
RNasin RNase-Inhibitor
RPMI Roswell Park Memorial Institute Medium
RT Raumtemperatur
SD Standardabweichung des Mittelwertes (standard derivation)
SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SULT Sulfotransferase(n)
t10,c12-CLA trans-10,cis-12-Octadecadiensäure
TBS-T TRIS-gepufferte Kochsalzlösung mit TWEEN 20
TEMED Tetramethylethylendiamin
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
TWEEN 20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
UAS hefespezifische Erkennungssequenz für den GAL4 Faktor
üN über Nacht
v/v Volumen per Volumen
w/v Gewicht per Volumen
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1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary)
1
1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary)
C18-Furanfettsäuren – Toxikologische Charakterisierung der Oxidations-
produkte von konjugierten Linolsäureisomeren
Imme Lengler – Dissertation Tierärztliche Hochschule Hannover 2011
Konjugierte Linolsäureisomere (conjugated linoleic acid, CLA) sind mehrfach
ungesättigte Fettsäuren, die vielfältige physiologische Wirkungen besitzen. Bisherige
Studien zeigen, dass insbesondere das Minorisomer t10,c12-CLA eine
antikarzinogene Wirkung besitzt. Der Mensch nimmt über Milchprodukte und Fleisch
von Wiederkäuern durchschnittlich 0,3 g CLA pro Tag zu sich. Der Europäischen
Behörde für Lebensmittelsicherheit liegen derzeit Zulassungsanträge für neuartige
Lebensmittelzutaten vor, die die tägliche Aufnahme an CLA verzehnfachen könnten.
Bei einer Einnahme dieser Präparate ist gleichzeitig von einer erhöhten Aufnahme
von Oxidationsprodukten der CLA, den Furanfettsäuren (FFA), auszugehen. Die
physiologischen Auswirkungen derartig gesteigerter Mengen CLA und ihrer
Oxidationsprodukte sind nicht bekannt. In dieser Arbeit wurden die zellulären und
molekularen Effekte der FFA im Vergleich zu denen der CLA erstmalig
charakterisiert. Da für CLA insbesondere in humanen Kolonkarzinomzellen
antiproliferative und differenzierungsfördernde Effekte beschrieben sind, wurde die
Kolon-Adenokarzinomzelllinie Caco-2 als in vitro-Modell verwendet.
Im ersten Teil der Arbeit wurden die molekularen Wirkungen der t10,c12-CLA in
Caco-2-Zellen denen der strukturell zugehörigen 10,12-FFA gegenübergestellt.
Mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und Massenspektrometrie (MALDI-
TOF) wurden die proteomischen Veränderungen nach Einwirkung dieser Fettsäuren
analysiert. Nach der Behandlung von Caco-2-Zellen mit bis zu 100 µM t10,c12-CLA
wurden 40 Proteine mit mindestens 1,5fach veränderter relativer Expression im
Gegensatz zur Kontrolle identifiziert. Zum Einen wurden durch die CLA-Behandlung
Proteine beeinflusst, die die Transkription, Translation, Stabilität oder Aktivität von
p53 steigern, was auf eine p53-vermittelte Tumorsuppression hinweist. Zum Anderen
wurden sowohl potentielle Regulatoren des Wnt-β-Catenin-Signalwegs beeinflusst
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1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary)
2
als auch Zielgene dieses Signalweges inhibiert. Dieses konnte als negative
Regulierung des Wnt-β-Catenin-Signalweges durch die t10,c12-CLA interpretiert
werden. Eine Inhibierung dieses Signalweges hat eine Abnahme der zellulären
Proliferation und eine Stimulation der Differenzierung der Zellen zur Folge und
korreliert somit mit der postulierten antikanzerogenen Wirkung dieser Substanz.
Nach Exposition von Caco-2-Zellen mit bis zu 1 mM 10,12-FFA wurden
30 differenziell exprimierte Proteine identifiziert, die jedoch komplett andere Effekte
im Vergleich zur korrespondierenden t10,c12-CLA anzeigten. Es wurden drei
Proteine induziert, die eine Rolle in der Lipidtröpfchenbiogenese spielen. Alle
anderen durch die 10,12-FFA regulierten Proteine waren reprimiert und betrafen den
Zellzyklus sowie allgemeine zelluläre Prozesse wie die Transkription, Protein-
biosynthese und die weitere Prozessierung von Proteinen. Eine Beeinflussung
toxikologisch relevanter Signalwege durch die 10,12-FFA wurde nicht gefunden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden die zellulären Effekte verschiedener FFA-Isomere
in Caco-2-Zellen untersucht. Unter Berücksichtigung einer möglichen metabolischen
Aktivierung des Furanringes der FFA in der Leber wurden die Untersuchungen auf
die metabolisch aktive humane hepatozelluläre Karzinomzelllinie HepG2
ausgedehnt. Es wurde gezeigt, dass die FFA in Caco-2-Zellen aufgenommen und
intrazellulär in Lipidtröpfchen verpackt wurden, in humanrelevanten Konzentrationen
jedoch weder in Caco-2- noch in HepG2-Zellen eine toxische Wirkung entfalteten.
Bei Konzentrationen bis zu 500 µM wiesen die FFA-Isomere weder eine ausgeprägte
Zytotoxizität auf noch beeinflussten sie zelluläre Parameter wie die Proliferation oder
Apoptose. Auch die Peroxisomen-Proliferator-aktivierten-Rezeptoren, die durch
zahlreiche Fettsäuren aktiviert werden und eine Rolle in der Karzinogenese spielen,
wurden durch die FFA nicht beeinflusst. Zudem wies die 9,11-FFA weder in einem
in vitro-Mikrokerntest mit Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters (V79-
Zellen) noch im Ames-Test eine genotoxische Wirkung auf.
Insgesamt geht aus den Ergebnissen dieser Arbeit hervor, dass die t10,c12-CLA
relevante Signaltransduktionswege in Darmzellen beeinflusst, wohingegen von den
Oxidationsprodukten der CLA weder zellulär toxische Wirkungen ausgehen noch
molekulare Signalwege signifikant beeinflusst werden.
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1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary)
3
C18 Furan fatty acids – Toxicological characterisation of oxidation products
from conjugated linoleic acids
Imme Lengler – Thesis University of Veterinary Medicine Hanover 2011
Conjugated linoleic acids (CLA) are polyunsaturated fatty acids and offer a variety of
physiological effects. Recent studies revealed the anticarcinogenic properties of the
minor isomer t10,c12-CLA. The average estimated intake of CLA via milk products
and meat from ruminants by humans is 0.3 g CLA/day. The European Food Safety
Authority currently proves the application for approval of food supplements which
could result in a tenfold increase of daily CLA intake. In addition, ingestion of these
supplements could lead to a simultaneous increased uptake of CLA oxidation
products, the furan fatty acids (FFA). The physiological effects of high concentrations
of CLA and of their oxidation products are unknown.
In this study the cellular and molecular effects of FFA in comparison to CLA were
characterised for the first time. As CLA are known to have antiproliferative effects
and to induce differentiation in particular in human colon carcinoma cells the
colorectal adenocarcinoma cell line Caco-2 was used as in vitro model.
In the first part of this study, molecular effects caused by t10,c12-CLA were
compared with those caused by the corresponding 10,12-FFA in Caco-2 cells. By
using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry (MALDI-TOF) a
detailed overview of proteomic changes after exposure of Caco-2 cells to these fatty
acids was achieved. Treatment of the cells with up to 100 µM t10,c12-CLA led to the
identification of 40 proteins with a more than 1.5-fold altered expression in
comparison to untreated control cells. These data revealed a detailed insight into the
antiproliferative mechanism initiated by CLA. On the one hand, t10,c12-CLA
regulated proteins which are involved in improvement of transcription, translation,
stability and activity of p53 protein. This indicates p53-mediated tumor suppression
triggered by t10,c12-CLA. On the other hand potential regulatory proteins of the
Wnt/β-catenin signaling pathway were affected. Moreover, target genes of the same
pathway were inhibited. This suggests an inhibition of Wnt/β-catenin signaling
through t10,c12-CLA. Repression of this signaling pathway results in a decrease of
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1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary)
4
cellular proliferation and a stimulation of cellular differentiation. Therefore, the data
correlate with the postulated anticarcinogenic effect of this substance.
In case of 10,12-FFA, 30 differentially expressed proteins were identified upon
incubation of Caco-2 cells with up to 1 mM of the substance. However, these proteins
completely differed from those regulated by t10,c12-CLA. Three proteins were
upregulated and these proteins were associated with lipid droplet biogenesis. All
remaining differentially expressed proteins were downregulated. They were
considered to be associated with the cell cycle as well as with general cellular
processes such as transcription, protein biosynthesis and further protein processing.
There was no indication that any signal transduction pathway of toxicological
relevance was affected by 10,12-FFA.
In the second part of this study cellular effects of different FFA isomers were studied
by using the Caco-2 model. Based on the assumption that the furan ring of FFA
might be activated in the liver by cellular metabolic activity, the metabolically active
human hepatoma cell line HepG2 was included in the study. It was shown with
Caco-2 cells that FFA was taken up and stored as triglycerides in intracellular lipid
droplets. FFA showed neither in Caco-2 nor in HepG2 cells toxic effects at
concentrations that could be relevant for humans. At concentrations up to 500 µM,
the FFA isomers showed no pronounced cytotoxicity and did not influence cellular
proliferation or apoptosis. Moreover, FFA did not interact with proxisome proliferator-
activated receptors, which are activated by many fatty acids and which are supposed
to be involved in carcinogenesis. Additionally, 9,11-FFA was neither genotoxic in the
micronucleus test using Chinese hamster lung fibroblasts (V79) nor in the Ames test.
In summary, t10,c12-CLA have an impact on relevant signal transduction pathways
in colon carcinoma cells whereas oxidation products of CLA neither have toxic
cellular effects nor affect significant molecular signaling pathways.
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2 Einleitung
5
2 Einleitung
Konjugierte Linolsäureisomere (conjugated linoleic acid, CLA) sind in Milch und
Fleisch von Wiederkäuern natürlich vorkommende, mehrfach ungesättigte
Fettsäuren. CLA stehen im Fokus des wissenschaftlichen Interesses, da ihnen
zahlreiche Effekte, insbesondere eine antikanzerogene Wirkung, zugeschrieben
werden. In den westlichen Industrieländern besteht ein ausgeprägtes Interesse an
Lebensmitteln mit einem „positiven Effekt“ auf die Gesundheit oder mit anderen
modulierenden Eigenschaften auf den menschlichen Organismus. Die Lebensmittel-
industrie führt stetig neue Produkte mit besonderen Eigenschaften in den in den
Markt ein, die funktionelle Wirkungen vielfältiger Art auf den Menschen besitzen
sollen (Functional Food). Solche Lebensmittel unterliegen einem Genehmigungs-
verfahren nach der sogenannten „Novel Food Verordnung“ (VO 258/97/EG), wenn
die entsprechenden Zutaten vor dem 15. Mai 1997 in Europa nicht in nennenswerten
Mengen als Lebensmittel verzehrt wurden. Diese Verordnung des Europäischen
Parlaments und des Rates der Europäischen Union wurde 1997 erlassen. Kernstück
des Genehmigungsverfahrens ist die Bewertung der gesundheitlichen Unbedenk-
lichkeit des neuartigen Lebensmittels bzw. der neuartigen Lebensmittelzutat. Den als
Novel Food eingestuften konjugierten Linolsäureisomeren wird neben der
antikarzinogenen Wirkung ein positiver Einfluss auf die Entwicklung von
Muskelmasse und die Reduzierung des Körperfettanteils zugeschrieben. Aufgrund
dieser vermuteten positiv anabolen Wirkung sind diverse Firmen daran interessiert,
CLA als Lebensmittelzusatz oder Nahrungsergänzungsmittel einzusetzen. Seit Mai
2007 wurden zwei Anträge auf Zulassung von CLA als Lebensmittelzutat gestellt.
Zuerst beantragte die spanische Cognis GmbH die Zulassung eines CLA-Produkts
namens Tonalin®TG 80. Im November 2007 folgte die irische Firma Lipid Nutrition
B.V. mit der Marke Clarinol®. Die genannten CLA-Produkte werden durch eine
alkalische Behandlung von Distelöl hergestellt, welches große Mengen an Linolsäure
beinhaltet. Dadurch entstehen Mischungen von CLA-Isomeren, so dass die
Präparate nach eigenen Angaben zu gleichen Teilen aus den Isomeren c9,t11-CLA
-
2 Einleitung
6
und t10,c12-CLA (siehe Abschnitt 2.1.1) bestehen. Dies entspricht nicht den
Gegebenheiten in natürlichen CLA-enthaltenden Lebensmitteln, in denen die
c9,t11-CLA bis zu 90% des Gesamt-CLA-Gehaltes ausmacht und das Minorisomer
t10,c12-CLA nur in sehr geringen Mengen vorhanden ist. Die durchschnittliche
Aufnahmemenge von CLA aus natürlichen Lebensmittelquellen beläuft sich auf
insgesamt etwa 0,3 g pro Tag (Abschnitt 2.1.2). Eine Ergänzung um 3 g CLA würde
die Aufnahmemenge demnach für die c9,t11-CLA um etwa das 6fache erhöhen,
wohingegen die Aufnahme der t10,c12-CLA um mehr als das 50fache steigen würde.
Die Sicherheitsbewertung der CLA-Präparate durch das Gremium für Dietätische
Lebensmittel, Ernährung und Allergien der Europäischen Behörde für Lebensmittel-
sicherheit (European Food Safety Authority, EFSA) kam zu dem Schluss, dass die
Sicherheit von 3 g CLA am Tag für gesunde Menschen nur bis zu einem halben Jahr
belegt ist. Außerdem kann wegen unklarer Effekte auf den Cholesterinspiegel und
auf Entzündungsparameter für Personen mit Diabetes Typ II keine Aussage getroffen
werden (siehe Abschnitt 2.1.5). Die Zulassung der beiden CLA-Präparate als
neuartige Lebensmittelzutaten durch die EU-Kommission steht daher bisher noch
aus.
Aus CLA können durch Photo- und Autoxidation Furanfettsäuren (furan fatty acids,
FFA) entstehen. Diese sollten in eine Bewertung mit einbezogen werden. FFA und
deren Abbauprodukte enthalten auf Grund des Furanringes ein toxisches Potential,
das bisher noch nicht charakterisiert wurde. Die physiologische Wirkung von FFA auf
den menschlichen Organismus ist nahezu unbekannt.
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2 Einleitung
7
2.1 Konjugierte Linolsäureisomere (CLA)
Konjugierte Linolsäureisomere (CLA) sind seit den 1980er Jahren bekannt und
wurden zunächst als eine antikarzinogene Komponente in gegrilltem
Rinderhackfleisch beschrieben (Ha et al., 1987). Seitdem werden CLA eingehend
untersucht, so dass ihnen vielfältige - sowohl positive als auch negative - Wirkungen
auf den menschlichen Körper zugeschrieben werden konnten. CLA ist ein
Sammelbegriff für verschiedene positionelle und geometrische Isomere, in
natürlichen Lebensmittelquellen liegt meist ein komplexes CLA-Gemisch vor. Die
meisten Untersuchungen zu den Wirkungen von CLA wurden mit Isomeren-
gemischen durchgeführt. Somit ließen sich die beobachteten Effekte nicht eindeutig
den Isomeren zuordnen. In den letzten Jahren wurden jedoch vermehrt Publikationen
über Studien mit Einzelisomeren veröffentlicht, die demonstrierten, dass die Isomere
unterschiedlich potent sein können und die Wirkungsweise durchaus unterschiedlich
und zum Teil widersprüchlich sein kann (Churruca et al., 2009).
2.1.1 Struktur und Biosynthese von CLA
CLA sind Octadecadiensäuren (C18:2), also positionelle und geometrische Isomere
der Linolsäure (cis,cis-Octadeca-9,12-diensäure) mit konjugierten Doppelbindungen,
die in cis- oder trans-Stellung vorliegen können. Das Hauptisomer der natürlich
vorkommenden CLA ist die c9,t11-CLA, biologisch besonders aktiv ist hingegen das
seltener vorkommende Isomer t10,c12-CLA (Abb. 1).
Linolsäure
c9,t11-CLA
t10,c12-CLA
Abbildung 1: Strukturformel von Linolsäure im Vergleich zu c9,t11-CLA und t10,c12-CLA.
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2 Einleitung
8
Das anaerobe Bakterium Butyrivibrio fibrisolvens aus dem Pansen von Wiederkäuern
isomerisiert Linolsäure zu CLA. Die Reaktion wird von dem Enzym Linoleat-
Isomerase katalysiert. Dieses ist substratspezifisch für ein cis9, cis12-
Doppelbindungssystem und eine freie Carboxylgruppe (Kepler et al., 1966 und
1970). Die Bildung anderer CLA-Isomere beruht auf einer Reihe verschiedener
Isomerasen (Griinari und Bauman, 1999).
2.1.2 Gehalte in Lebensmitteln und Aufnahmemenge von CLA
Der Mensch nimmt CLA hauptsächlich über tierische Nahrungsmittel auf. Aufgrund
ihrer Synthese im Pansen von Wiederkäuern sind CLA vor allem in Milch,
Milchprodukten, Fleisch und Fleischprodukten von Wiederkäuern zu finden. Die
höchsten CLA-Gehalte wurden in Rohmilch, Joghurt und Butter, aber auch in
Schafskäse, Lamm- und Rindfleisch nachgewiesen. Der CLA-Gehalt in Fisch ist
hingegen minimal (Fritsche und Steinhart, 1998; Tab. 1).
Tabelle 1: Durchschnittlicher Anteil an c9,t11-CLA in % der Gesamtmenge an Fettsäuremethylestern (FAMEs) in deutschen Nahrungsmitteln (Auszug aus Fritsche und Steinhart, 1998).
Milchprodukte c9,t11-CLA [%] Fleisch und Fisch c9,t11-CLA [%]
Rohmilch 1,16 Schweinefilet 0,12 Pasteurisierte Milch 0,98 Schweineschnitzel 0,15 Sahne 0,77 Rinderfilet 0,65 Butter 0,94 Rinderleber 0,43 Joghurt 0,69 Lamm 1,20 Probiotischer Joghurt 1,05 Truthahn 0,20 Gouda 0,40 Kaninchen 0,11 Emmentaler 1,16 Huhn 0,15 Gorgonzola 0,69 Karpfen 0,09 Brie 0,49 Dorsch 0,03 Ziegenkäse 0,50 Rotbarsch 0,06 Schafskäse 1,01 Lachs 0,07
Anhand des durchschnittlichen Verzehrs von tierischen und pflanzlichen Fetten in
Deutschland (Heseker et al., 1994) stellten Fritsche und Steinhart eine Schätzung
der durchschnittlichen täglichen Einnahme von CLA an, die besagt, dass Frauen
insgesamt 93,5 g Fett pro Tag zu sich nehmen, davon 0,35 g CLA. Männer nehmen
insgesamt 117 g Fett pro Tag auf, wovon 0,43 g CLA sind (Fritsche und Steinhart,
1998). Die Aufnahmemenge von CLA variiert je nach Geschlecht, Alter und
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2 Einleitung
9
Ernährungsweise. Durch die Nahrung wird hauptsächlich die c9,t11-CLA
aufgenommen, da diese in tierischen Lebensmitteln 80 bis 90% des gesamten CLA-
Gehaltes ausmacht. Im Blut von Nicht-Vegetariern wurde ein CLA-Gehalt von 20 bis
70 µM nachgewiesen, wovon die c9,t11-CLA etwa 80% ausmachte (Fogerty et al.,
1988).
2.1.3 Antikarzinogene Effekte der CLA
Seit ihrer Entdeckung in den 1980er Jahren ist die Zahl der Untersuchungen zu den
physiologischen Wirkungen der CLA in eine schier unübersichtliche Menge
gewachsen. Zahlreiche Studien befassen sich mit der Wirkungsweise auf humane
Tumorzelllinien (Maggiora et al., 2004; Kelley et al., 2007). In vivo wurde in diversen
Fütterungsversuchen mit CLA-Gemischen an Ratten und Mäusen ein Rückgang von
chemisch induzierten Karzinomen insbesondere bei Kolon- und Brusttumoren
beobachtet (Liew et al., 1995; Ip et al., 1995; Ip et al., 1997; Park et al., 2001b;
Kohno et al., 2004). Es konnten sowohl für die c9,t11-CLA als auch für die
t10,c12-CLA antikarzinogene Effekte gezeigt werden (Kelley et al., 2007). Anhand
verschiedener intestinaler Krebszelllinien, wie u.a. der SW480 (O´Shea et al., 1999),
der HT29 (Shultz et al., 1992; Palombo et al., 2002; Cho et al., 2003) und auch der
Caco-2-Zelllinie (Kim et al., 2002a/b; Lampen et al., 2005) konnte gezeigt werden,
dass CLA das Wachstum von Krebszellen in vitro hemmen. Derselbe Effekt trat bei
Brust- (Durgam et al., 1997) und Leberkarzinomzelllinien (Yamasaki et al., 2001) auf.
Bezüglich des Mechanismus der Chemoprotektion von CLA in der Kolon-
karzinogenese wird ein Einfluss der Kernrezeptoren PPAR (Peroxisomen-
Proliferator-aktivierte-Rezeptoren) diskutiert. PPAR sind Transkriptionsfaktoren, die
durch Bindung eines in der Regel kleinen und lipophilen Liganden aktiviert werden.
Liganden sind u.a. Fettsäuren (Arachidonsäure, Palmitinsäure, u.a.) sowie deren
Derivate (Xu et al., 1999) und insbesondere mehrfach ungesättigte Fettsäuren
(Göttlicher et al., 1992; Moya-Camarena, 1999a). Auch für einige CLA-Isomere
konnte gezeigt werden, dass sie Liganden und Aktivatoren der PPAR sind (Moya-
Camarena et al., 1999b; Brown et al., 2003; Lampen et al., 2005).
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2 Einleitung
10
Die Familie der PPAR besteht aus drei Mitgliedern, PPARα, PPARβ/δ und PPARγ,
die sich in ihrer lokalen Expression, Ligandenbindung und Funktion unterscheiden.
Alle drei bekannten Isoformen werden im Darm exprimiert (Braissant et al., 1996).
Die PPAR haben vielfältige Funktionen wie beispielsweise im Lipidmetabolismus
oder im Glukosestoffwechsel. Sie spielen zudem bei der Entstehung von Krebs und
der Tumorentwicklung eine entscheidende Rolle.
PPARα kann über den Tumorsuppressor p53 in die Regulation des Zellzyklus
eingreifen (Khan und Vanden Heuvel, 2003; Sumanasekera et al., 2003), scheint
jedoch in der Kolonkarzinogenese keine große Rolle zu spielen. Die Rolle von
PPARγ bezüglich der Tumorentstehung wird kontrovers diskutiert. Einige frühere
Studien zeigten, dass PPARγ-Liganden in vivo die Ausbildung von Polypen im Darm
von Mäusen fördern (Saez et al., 1998; Lefebvre et al., 1998), jedoch lediglich bei
genetischer Prädisposition in Form vom Mutationen im Tumorsuppressorgen APC
(adenomatous polyposis coli; Girnun et al., 2002). Andererseits wurden Mutationen,
die die Funktionalität der PPARγ-Ligandenbindedomäne beeinträchtigen, mit der
Entwicklung von humanen Kolonkrebs assoziiert (Sarraf et al., 1999) und
heterozygote Deletionen im PPARγ-Gen führten zu einer vermehrten Entwicklung
von chemisch induzierten Kolonkrebs in Mäusen (Girnun et al., 2002; Dai et al.,
2009). Außerdem wurde in einer aktuellen Studie gezeigt, dass die Expression von
PPARγ in Kolonkrebs mit einer günstigen Krebsprognose einhergeht, weshalb
PPARγ als Tumorsuppressorgen diskutiert wird (Ogino et al., 2009). In zahlreichen in
vitro-Studien wurden zudem antikanzerogene Wirkungen von PPARγ in Kolonkrebs
nachgewiesen. Es wurde sowohl eine Induktion der Apoptose (Chen et al., 2002; Lee
et al., 2006; Qiao et al., 2008; Dai et al., 2008) als auch eine Inhibierung der
zellulären Proliferation durch PPARγ-Agonisten nachgewiesen (Kitamura et al., 2001;
Theocharis et al., 2004) sowie eine differenzierungsfördernde Wirkung von PPARγ-
Liganden gezeigt (Yoshizumi et al., 2004; Kawamata et al., 2006). Weitere
Mechanismen der Chemoprotektion durch PPARγ-Liganden werden diskutiert. So
beeinflussen diese neben der Apoptose, Proliferation und Differenzierung
beispielsweise den Tumorsuppressor p53 positiv (Yasui et al., 2005), das Proto-
Onkoprotein β-Catenin negativ (Sharma et al., 2004; Fujisawa et al., 2008) und
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2 Einleitung
11
inaktivieren den Transkriptionsfaktor NF-kappaB, was zu einer Inhibierung des
Zellwachstums von Kolonkarzinomzellen führt (Ban et al., 2010). Bezüglich der
Chemoprotektion von CLA in der Kolonkarzinogenese wird u.a. ein PPARγ-
abhängiger Mechanismus angenommen (Bassaganya-Riera et al., 2004; Evans et
al., 2010).
Die Bedeutung von PPARβ/δ in Bezug auf die Proliferation von Tumoren ist vielfältig
und eine tumorpromovierende Wirkung wird speziell für die Kolonkarzinogenese
diskutiert. PPARβ/δ wurde als Zielgen des Tumorsuppressors APC in
Kolonkarzinomzellen mit inaktivem APC identifiziert (He et al., 1999). Die Entstehung
von Kolonkarzinomen wird u.a. auf eine Mutation im APC-Tumorsuppressorgen
zurückgeführt (Abb. 2). Das APC-Protein ist ein wichtiger physiologischer Antagonist
des β-Catenins und damit auch des Wnt-Signaltransduktionsweges. Wird diese
Kaskade übermäßig aktiviert, kommt es zur Krebsentstehung beim Menschen.
Normalerweise bindet das APC-Protein an β-Catenin und Axin. In diesem Komplex
wird β-Catenin durch die Glycogen-Synthase-Kinase 3β (GSK3β) phosphoryliert und
nach Ubiquitinierung proteosomal degradiert (Aberle et al., 1997). Bei Zellen mit
inaktivem APC (z.B. Caco-2, siehe Abschnitt 2.3) ist der β-Catenin-Abbau nicht
möglich, wodurch es zu einer Anreicherung des intrazellulären β-Catenins kommt.
Dieses kann im Zellkern als Komplex mit dem T-Zellfaktor 4 (TCF4; Behrens et al.,
1996; Molenaar et al., 1996) als Transkriptionsaktivator die Expression spezifischer
Proliferationsgene wie beispielsweise c-myc (He et al., 1998) und cyclin D1
(Shtutman et al., 1999) induzieren, die das Tumorwachstum fördern. Ein weiteres
Zielgen des β-Catenin/TCF4-Komplexes ist PPARβ/δ (He et al., 1999).
Abbildung 2: Schematische Darstellung des APC/β-Catenin/TCF-Signalweges mit (A) aktivem wt-APC und (B) inaktivem, mutierten APC.
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12
Nach Behandlung mit einem PPARβ/δ-Agonisten zeigen Mäuse mit einer Mutation
im APC-Gen, welche multiple intestinale Multiplasien auslöst, im Vergleich zum
Wildtyp ein deutlich erhöhtes Tumorwachstum (Gupta et al., 2004). Analog bilden
Mäuse mit einer homozygoten Deletion von PPARβ/δ deutlich kleinere
Kolonkarzinome als Wildtyp-Mäuse aus (Barak et al., 2002; Wang et al., 2006; Zuo et
al., 2009) und der tumorpromovierende Effekt des PPARβ/δ-Agonisten GW501516
wird inhibiert (Wang et al., 2006). In vitro zeigen dem entsprechend auch HCT116-
Zellen, deren PPARβ/δ genetisch inaktiviert wurde, eine Hemmung der Proliferation
(Park et al., 2001a) und eine Inhibierung von PPARβ/δ vermindert das Wachstum
verschiedener humaner Kolonkrebszelllinien (Shureiqi et al., 2003). Zudem wurde
gezeigt, dass PPARβ/δ die chemoprotektive Wirkung von PPARγ inhibiert. PPARβ/δ
kann eine ligandeninduzierte PPARγ-vermittelte Apoptose in Kolonkarzinomzellen
unterdrücken und somit tumorpromovierend wirken (Zuo et al., 2006). Allerdings führt
in einer aktuellen Studie ein PPARβ/δ-Knockdown in verschiedenen Kolon-
krebszelllinien durch eine Inhibierung der Differenzierung und Förderung der
Zelladhäsion zu einem kanzerogeneren Phänotyp (Yang et al., 2010).
Für PPARβ/δ wurde im Reportergenassay eine konzentrationsabhängige
Transaktivierung durch c9,t11-CLA und t10,c12-CLA bestimmt werden (Lampen et
al., 2005; Leifheit, 2006). Unklar ist bislang allerdings, ob diese Bindung eine
Aktivierung oder Repression des Rezeptors verursacht. Gezeigt werden konnte
hingegen, dass die mRNA-Expression von PPARβ/δ durch CLA gehemmt wird. Für
die c9,t11-CLA konnte außerdem gezeigt werden, dass sie sowohl die mRNA- und
Proteinmenge von β-Catenin als auch die Expression von Zielgenen des APC-
Weges wie c-myc, cyclin D1 und c-jun direkt hemmen und somit antiproliferativ
wirken (Lampen et al., 2005; Bozzo et al., 2007).
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2 Einleitung
13
2.1.4 Effekte der CLA auf die Körperzusammensetzung
Zahlreiche Fütterungsversuche an Mäusen (West et al, 1998; DeLany et al., 1999,
Takahashi et al., 2002), Ratten (Azain et al., 2000) und Schweinen (Ostrowska et al.,
1999) zeigten, dass CLA eine Reduktion des Körpergewichtes durch Verminderung
des Fettgewebes verursachen kann, wenn dem Futter täglich über 0,5% eines CLA-
Gemisches beigemengt werden. Wenn diese CLA-Gemische vorwiegend das c9,t11-
CLA-Isomer aufwiesen, blieb ein Effekt auf das Körpergewicht aus, so dass die
t10,c12-CLA als das vorwiegend potente Isomer identifiziert werden konnte (Park et
al., 1999). Die Reduzierung von Fettgewebe durch CLA wird auf eine Erhöhung des
Energieumsatzes bei verringerter Fetteinlagerung und Lipogenese und erhöhter
β-Oxidation zurückgeführt. Außerdem wurde ein positiver Effekt auf Apoptose und
Zelldifferenzierung beschrieben (Baddini Feitoza et al., 2009).
Humanstudien sind weniger eindeutig. Der fettreduzierende Effekt von CLA wurde in
einigen Studien auch im Menschen gezeigt; andere Studien kamen hingegen zu dem
Schluss, dass eine Gabe von CLA keine Auswirkung auf die Körper-
zusammensetzung hat. So konnten Atkinson et al. (1999), Blankson et al. (2000) und
Risérus et al. (2001) an übergewichtigen bis adipösen, aber sonst gesunden
Menschen eine signifikante Abnahme des Körperfettanteils nachweisen, wobei ein
Zeitraum der CLA-Applikation von vier Wochen bis sechs Monate gewählt wurde.
Thom et al. (2001) und Gaullier et al. (2004) wiesen in Menschen mit einem
normalen BMI ebenfalls eine signifikante Abnahme des Körperfettanteils (ohne
Reduzierung des Körpergewichts) nach, wobei die Studien jeweils zwöf Wochen
bzw. zwölf Monate andauerten und die Gabe von CLA sowohl in Form von freien
Fettsäuren als auch als Triacylglyceride gebunden vorlagen. Die täglich
verabreichten Dosen von CLA wurden zwischen 1,7 g und 6,8 g gewählt, wobei in
keiner dieser Studien eine Unterscheidung zwischen den Isomeren gemacht wurde
und CLA-Isomerengemische ohne angegebene Mengenverhältnisse verwendet
wurden.
In anderen Studien konnten keine Effekte auf den Körperfettanteil festgestellt
werden. Zambell et al. (2000) verabreichten über einen Zeitraum von 64 Tagen 3 g
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2 Einleitung
14
CLA pro Tag an übergewichtige Menschen, Risérus et al. (2004) verwendeten
c9,t11-CLA und Malpuech-Brugere et al. (2004) stellten eine vergleichende Studie
zwischen der c9,t11-CLA und der t10,c12-CLA an, wobei beide Isomere in gleichen
Mengen (1,5 g und 3 g pro Tag) und in Form von Triacylglyceriden gebunden
verabreicht wurden. In keiner dieser Studien wurden signifikante Effekte auf den
Körperfettanteil von übergewichtigen Menschen beobachtet. Kreider et al. (2002) und
Tricon et al. (2004) machten die gleichen Beobachtungen an gesunden,
normalgewichtigen Menschen.
2.1.5 Weitere Wirkungen und mögliche Risiken von CLA
CLA besitzen kein allergenes Potential und zeigen im Ames-Test und im in vivo-
Mikrokerntest keine Genotoxizität (O´Hagan und Menzel, 2003). Neben der in
zahlreichen Untersuchungen beschriebenen antikarzinogenen Wirkung und der
widersprüchlichen Literaturlage zum Einfluss auf die Körperzusammensetzung,
weisen viele Studien jedoch auf weitere Effekte von CLA hin. Insbesondere wird ein
vielfältiger Einfluss auf den Lipid- und Glukosemetabolismus beschrieben.
Einige Studien zeigten im Speziellen, dass CLA einen hemmenden Einfluss auf die
Entwicklung von Thrombosen und Arteriosklerosen besitzen. Eine durch
Arachidonsäure oder Kollagen induzierte Thrombocytenaggregation wurde durch die
Gabe von CLA zurückgebildet. CLA erwiesen sich demnach als Antagonisten einer
Blutplättchenaggregation (Truitt et al., 1999). In Fütterungsversuchen am Kaninchen
konnte zudem eine Reduktion des LDL-Cholesterinspiegels und des
Triacylglyceridgehalts im Serum mit einhergehendem antiatherogenen Effekt nach
Gabe eines CLA-Gemisches gezeigt werden (Lee et al., 1994a; Nicolosi et al., 1997;
Kritchevsky et al., 2000). Zudem wurden CLA als immunmodulierend beschrieben
(Cook et al.,1993; O´Shea et al., 2004).
Eine mögliche antidiabetogene Eigenschaft von CLA wird kontrovers diskutiert.
Ältere Studien an diabetischen Ratten zeigten eine Normalisierung der gesteigerten
Glukosetoleranz und eine Reduzierung des erhöhten Insulinspiegels im Blut
(Hyperinsulinämie) nach CLA-Fütterung (Houseknecht et al., 1998), wobei diese
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2 Einleitung
15
Wirkungen auf die t10,c12-CLA zurückgeführt werden konnten (Ryder et al., 2001).
Andererseits wurde eine durch CLA verursachte Insulinresistenz mit gesteigerten
Insulinwerten im Blut in Tierstudien wie beispielsweise an übergewichtigen und
fettleibigen Mäusen (Tsuboyama-Kasaoka et al., 2000; LaRosa et al., 2006) und
in vitro in humanen Adipozyten gezeigt (Brown et al., 2003; Chung et al., 2005;
Kennedy et al., 2010a). In einer Humanstudie, bei der adipöse Männer 3,4 g
t10,c12-CLA pro Tag zu sich nahmen, konnte ebenfalls eine erhöhte Insulinresistenz
und eine Hyperglykämie nachgewiesen werden (Risérus et al., 2002). Eine
Insulinresistenz erhöht das Risiko zur Erkrankung an Diabetes. Die Insulinresistenz
kann durch inflammatorische Zytokine verursacht werden, wodurch außerdem die
Lipogenese in Adipozyten gehemmt wird und die Lipolyse steigt. Insgesamt wird die
Adipogenese demnach vermindert. Für die t10,c12-CLA konnte gezeigt werden, dass
sie die Expression und/oder Sekretion der Interleukine IL-6, IL-8 und IL-1β sowie des
Tumornekrosefaktors TNF-α in humanen Adipozytenkulturen steigert (Brown et al.,
2004; Chung et al., 2005).
Die Folge einer Delipidation des Fettgewebes durch hohe t10,c12-CLA-Gehalte im
Futter ist eine Verlagerung der Lipideinlagerung in die Leber, so dass eine
Vergrößerung der Leber bis hin zur Verfettung stattfindet, wie es in der Maus
(Tsuboyama-Kasaoka et al., 2000; Chardigny et al., 2003) und im Hamster (Tarling
et al., 2009; Navarro et al., 2009) gezeigt werden konnte. Dies kann sogar zur
Induktion einer nicht-alkoholischen Leberzirrhose in Mäusen führen (Clement et al.,
2002). Außerdem können freie Fettsäuren, die vom Fettgewebe durch Delipidation
ins Blut abgegeben werden, zu Hyperlipidämie, Hyperglykämie und Lipidystrophie
führen, wenn sie nicht in ausreichendem Maße oxidiert werden können (Kennedy et
al., 2010b).
Solche negativen Auswirkungen, insbesondere der t10,c12-CLA auf den Lipid- und
Glukosestoffwechsel und die Insulinresistenz, verdeutlichen, dass weitere
Untersuchungen notwendig sind, um die gesundheitlichen Folgen von CLA auf den
Menschen sicher beurteilen zu können.
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2 Einleitung
16
OH3C-(CH2)m
R2R1
(CH2)n-COOH
2.2 Furanfettsäuren (FFA)
Bei Furanfettsäuren (FFA) handelt es sich um eine große Gruppe von Fettsäuren, die
durch einen Furanring charakterisiert sind. Natürlich vorkommende FFA sind an einer
oder an beiden β-Positionen des Furanringes methylsubstituiert. Nicht-
methylsubstituierte FFA kommen in der Natur nicht vor, können jedoch durch Photo-
oder Autoxidation von CLA entstehen.
2.2.1 Struktur von FFA
FFA weisen unterschiedlich lange, unverzweigte Alkyl- und Carboxylseitenketten auf,
die sich jeweils an den α-Positionen des Furanringes befinden. Die natürlich
vorkommenden FFA haben einen Propyl- oder Pentylrest und eine Carboxylkette mit
9, 11 oder 13 Kohlenstoffatomen. Die β-Positionen des Furanringes liegen mono-
oder dimethyliert vor (Abb. 3). Die häufigste, natürlich vorkommende FFA besitzt
einen Pentylrest und einen Säurerest mit 11 Kohlenstoffatomen und ist dimethyliert
(Spiteller, 2005).
Abbildung 3: Grundstruktur der häufigsten Furanfettsäuren. m= 2 oder 4 ; n= 8, 10 oder 12 ; R1/ R2 = Rest ( –H oder –CH3)
Unsubstituierte FFA können durch Oxidation von CLA entstehen und besitzen somit
18 Kohlenstoffatome, wobei die Alkyl- und Carboxylseitenketten am Furanring
unterschiedliche Längen aufweisen können. Gunstone und Wijesundera wiesen
erstmals 1979 eine Photooxidation von CLA zu FFA unter Temperatur- oder
Lichteinfluss nach. Yurawecz et al. zeigten 1995 zudem eine Autoxidation von CLA,
wobei folgende unmethylierte FFA als Oxidationsprodukte gebildet werden: 8,11-
Epoxy-8,10-octadecadiensäure (8,10-FFA), 9,12-Epoxy-9,11-octadecadiensäure
(9,11-FFA), 10,13-Epoxy-10,12-octadecadiensäure (10,12-FFA) und 11,14-Epoxy-
11,13-octadecadiensäure (11,13-FFA; siehe Abb. 4).
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2 Einleitung
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OCOOH
O
COOH
OCOOH
O
COOH
Abbildung 4: Strukturen der vier unsubstituierten Furanfettsäuren, die durch Oxidation aus CLA entstehen können.
Die Oxidationsrate der CLA wird durch das Lösungsmittel und die Temperatur
bestimmt. CLA können erst oxidieren, wenn der Wasseranteil des Lösungsmittels
über 10% liegt. Je mehr Wasser vorhanden ist, desto stärker werden die CLA
autoxidiert (Yurawecz et al., 1995). Bei Raumtemperatur ist nach 14 Tagen die Hälfte
der CLA oxidiert, während die Halbwertzeit bei 75°C bereits nach sieben Stunden
erreicht ist. Freie CLA werden leichter oxidiert als in Triacylglyceride oder
Phospholipide gebundene CLA (Zhang und Chen, 1997; Eulitz et al., 1999).
2.2.2 Vorkommen und Biosynthese von FFA
Furanfettsäuren wurden erstmals 1966 beschrieben. Morris et al. detektierten damals
eine unmethylierte FFA in einem Samenöl aus Exocarpus, einer Gattung der Familie
der Sandelholzgewächse. Allerdings wird heute davon ausgegangen, dass es sich in
diesem Fall um ein Artefakt der Probenaufarbeitung handelte. Glass et al.
identifizierten 1974 erstmals methylsubstituierte FFA als natürlichen Bestandteil in
Leber- und Testeslipiden des Europäischen Hechts (Esox lucius). Daraufhin wurden
FFA in diversen Süßwasserfischen (Glass et al., 1977; Gunstone et al., 1978) und
Salzwasserfischen detektiert (Gunstone et al., 1978; Ishii et al., 1988; Ota und
Takagi, 1992), wobei diese sowohl in unterschiedlichen Geweben als auch im Blut
vorkommen. Leber und Testes weisen die mit Abstand höchsten Gehalte an
8,11-Epoxy-8,10-octadecadiensäure (8,10-FFA) 9,12-Epoxy-9,11-octadecadiensäure (9,11-FFA)
10,13-Epoxy-10,12-octadecadiensäure (10,12-FFA) 11,14-Epoxy-11,13-octadecadiensäure (11,13-FFA)
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2 Einleitung
18
methylsubstituierten FFA auf. Der FFA-Gehalt innerhalb der Leberlipide kann bei
manchen Fischen bis zu 40% betragen (Gunstone et al., 1978).
In den folgenden Jahren wurden methylsubstituierte FFA außerdem in
verschiedenen Pflanzen (Hannemann et al., 1989) nachgewiesen und seit den
1980er-Jahren kristallisierte sich ein ubiquitäres Vorkommen heraus, als FFA auch in
Invertebraten (Okajima et al., 1984), Amphibien, Reptilien (Ishii et al., 1988), Säugern
(Schödel und Spiteller, 1987) sowie in Hefen und anderen Pilzen (Hannemann et al.,
1989), marinen Bakterien (Shirasaka et al., 1995) und Algen (Kazlauskas et al.,
1982) detektiert werden konnten. Aus marinen Schwämmen wurden methyl-
substituierte FFA isoliert, die insofern ungewöhnlich sind, da sie mehrfach
ungesättigte Alkylreste aufweisen (Ciminiello et al., 1991). Auch im menschlichen
Blut sind FFA nachweisbar, wo sie als Cholesterylester vorliegen (Puchta et al.,
1988). Freie, methylsubstituierte FFA sind in lebenden Zellen nicht nachweisbar. FFA
sind stets in veresterter Form als Cholesterylester, Triacylglyceride oder
Phospholipide gespeichert (Gunstone et al., 1976 und 1978; Glass et al., 1975 und
1977; Ota und Takagi, 1992).
Eine de novo-Synthese von methylsubstituierten FFA findet entgegen damaliger
Vermutungen weder in Fischen (Sand et al., 1984) noch in Säugern (Ratten) statt
(Gorst-Allman et al., 1988). Eine Biosynthese von FFA in Pflanzen wurde hingegen
gezeigt. Die Arbeitsgruppe von Spiteller hat anhand von Zuckerrohr-Zellkulturen
(Saccharum spec.) die Biosynthese in Pflanzen untersucht und konnte nachweisen,
dass das Kohlenstoffgrundgerüst aus Acetat, das Sauerstoffatom des Furanringes
aus Luftsauerstoff und die Methylgruppen aus Methionin stammen, sowie dass die
Biosynthese von der Anwesenheit von Calciumionen abhängig ist (Batna und
Spiteller, 1991; Scheinkönig und Spiteller, 1991 und 1993). Batna et al. konnten 1993
in einer Algen-Zellkultur nachweisen, dass Linolsäure (C18:2) der Ausgangsstoff für
die Synthese einer C18-FFA mit einem Pentylrest ist (siehe Abb. 5). FFA mit einem
Propylrest werden aus 9,12-Hexadecadiensäure (C 16:2) gebildet. In beiden Fällen
wird zunächst ein Lipidhydroperoxid (LOOH) gebildet. Diese Reaktion wird von der
Lipoxygenase unter Verwendung von Luftsauerstoff katalysiert. Anschließend kommt
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2 Einleitung
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es zu einer Ringbildung und die β-Positionen des Furanrings werden mono- oder
dimethyliert. Der Säurerest der FFA kann durch den Einbau von Acetat-Einheiten
verlängert werden (Sand et al., 1984; Spiteller, 2005).
Abbildung 5: Biosynthese von Furanfettsäuren (nach Spiteller, 2005).
Des Weiteren können in Fischen vorkommende Bakterien FFA de novo
synthetisieren, wobei ein anderer Syntheseweg als in Pflanzen angenommen wird.
Hierbei wird zunächst cis-Vaccensäure methyliert und durch Einführung einer
zweiten Doppelbindung kann die entstandene zweifach ungesättigte Fettsäure mit
Sauerstoff reagieren. Anschließend kann es zum Ringschluss kommen (Shirasaka et
al., 1997).
Lipoxygenase (LOX) O2
Cyclisierung
FFA mit Pentylrest FFA mit Propylrest
Cyclisierung
Lipoxygenase (LOX) O2
methylsubstituierte FFA mit Pentylrest methylsubstituierte FFA mit Propylrest
Linolsäure (C18:2) 9,12-Hexadecadiensäure (C16:2)
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2 Einleitung
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Anhand der bisherigen Studien kann davon ausgegangen werden, dass alle FFA
ursprünglich in Pflanzen und Algen oder Mikroorganismen biosynthetisiert und über
die Nahrungskette von anderen Organismen aufgenommen werden. Auf diese Weise
sind methylsubstituierte FFA natürlicherweise in Nahrungsmitteln des Menschen zu
finden. Diese wurden somit beispielsweise in diversen Pflanzenölen wie Sojaöl (Guth
und Grosch, 1991) und Olivenöl (Boselli et al., 2000) oder in tierischen Fetten wie
Butter (Guth und Grosch, 1992) und in großen Mengen in Fischölen und Lebertran
(Scrimgeour, 1977; Wahl et al., 1994) detektiert. Unsubstituierte FFA kommen
normalerweise nicht in Lebensmitteln vor, allerdings könnten diese als Nebenprodukt
der CLA aufgenommen werden. Diese Aufnahmequelle könnte in dem Fall, dass
CLA als Nahrungsergänzungsmittel etabliert werden, relevant werden (siehe oben).
2.2.3 Reaktionen von FFA
FFA sind reaktive Verbindungen, die durch Photooxidation (Boyer et al., 1979) oder
Autoxidation (Boyer et al., 1979; Rosenblat et al., 1993) leicht oxidierbar sind.
Außerdem können FFA durch Lipoxygenasen oxidiert werden (Boyer et al., 1979;
Batna und Spiteller, 1994a/b). Die Photo- oder Autoxidation von FFA kann durch
Singulett-Sauerstoff (1O2) hervorgerufen werden, aber auch durch die Anwesenheit
von Radikalen (Takayama et al., 1977). Diese antioxidative Wirkung scheint der
Grund für das Vorkommen von FFA in Pflanzen zu sein. FFA sind sehr effektive
Radikalfänger und können beispielsweise vor der Wirkung von UV-Strahlung und vor
Hydroxyl-Radikalen schützen (Okada et al., 1996; Spiteller, 2008). Außerdem bieten
sie einen Schutz vor Lipidperoxidation (Spiteller, 2007). Zusätzlich könnten die
oxidativen Abbauprodukte eine wichtige Funktion bei der Abwehr von
Schadorganismen haben.
Der Unterschied zwischen methylsubstituierten und nicht-methylsubstituierten FFA
besteht in ihrer Reaktivität und der unterschiedlichen Stabilität der gebildeten
Oxidationsprodukte. Unmethylierte FFA besitzen lediglich eine minimale antioxidative
Wirkung (Okada et al., 1990) und die Reaktivität nimmt mit dem Substituierungsgrad
zu. Sowohl substituierte als auch unsubstituierte FFA können prinzipiell jedoch unter
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21
OO
(CH2)8-COOHH11C5
CH3H3C
O
H3C CH3
H11C5 (CH2)8-COOH
Ringöffnung zu cis-Dioxoenfettsäuren oxidieren (Schödel und Spiteller, 1985; Jandke
et al., 1988; Abb. 6).
Abbildung 6: Oxidation von methylsubstituierten Furanfettsäuren unter Bildung von cis-Dioxoenfettsäuren.
Die aus nicht-methylsubstituierten FFA entstehenden cis-Dioxoenfettsäuren
isomerisieren anschließend zu trans-Dioxoenfettsäuren (Boyer et al., 1979;
Yurawecz et al., 1997; Eulitz et al., 1999). Diese sind so stabil, dass sie isoliert
werden können und gut charakterisiert sind (Boyer et al., 1979; Batna und Spiteller,
1994a). Die trans-Dioxoenfettsäuren können mit Thiolen wie beispielsweise Cystein
oder Glutathion Thioether bilden (Jandke et al., 1988).
2.2.4 Physiologische Bedeutung und Toxikologie von FFA
Wenn Fremdstoffe wie beispielsweise Furan oder Furanderivate in den Körper
gelangen, werden diese im Darm enzymatisch umgewandelt, um die Hydrophilie zu
erhöhen und das Ausscheiden zu ermöglichen. Die Metaboliten gelangen über die
Blutbahn zur Leber und werden anschließend über Galle oder Urin ausgeschieden.
Bei der Metabolisierung können jedoch reaktive Produkte entstehen. Furan wird
beispielsweise durch CYP2E1 zu einem instabilen Epoxid oxidiert, welches weiter zu
dem reaktiven Dialdehyd cis-Buten-1,4-dial reagiert (Kedderis et al., 1993; Parmar
und Burka, 1993; Chen et al., 1995; Abb. 7). Dieses kann aufgrund des elektrophilen
Charakters der Aldehyde irreversibel an Proteine und Nukleotide binden (Byrns et al.,
2002 und 2006). So lässt sich erklären, dass Furan selbst zwar biologisch inaktiv ist,
jedoch als leber- und nierentoxisch gilt und in Nagern ein Leberkarzinogen ist. Aus
diesem Grund wird Furan von der Weltgesundheitsorganisation WHO als
„möglicherweise krebsauslösend (karzinogen) für den Menschen“ eingestuft.
Oxidation
Furanfettsäure Dioxoenfettsäure
-
2 Einleitung
22
OR
OR
O
O O
RH
Abbildung 7: Metabolisierung von Furan: CYP2E1 katalysiert die Oxidation von Furan zu einem instabilen Epoxid, das unter Ringöffnung weiter zum reaktiven Dialdehyd cis-Buten-1,4-dial reagiert.
Die Metabolisierung von FFA ist im Detail nicht erforscht. Im Jahr 1979 untersuchten
Spiteller und Spiteller menschlichen Urin auf ihre Fettsäuren hin und fanden
Abbauprodukte der FFA, die sie aufgrund ihrer Herkunft als Urofuransäuren
bezeichneten. Die Hauptmetaboliten von methylsubstituierten FFA im menschlichen
Urin sind die Dicarbonsäuren 3-Carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropansäure und
3-Carboxy-4-methyl-5-pentyl-2-furanpropansäure (Spiteller et al., 1980). Diese
entstehen, indem der Carboxylrest der methylsubstituierten FFA durch β-Oxidaton
bis auf drei Kohlenstoffatome abgebaut wird. Anschließend ist eine Oxidation des
Methylrestes an Position 3 des Furanringes zu einer Carboxylgruppe möglich, so
dass die Dicarbonsäuren entstehen (Schödel et al., 1986). In einer aktuellen Studie
konnte gezeigt werden, dass auch der Säurerest von unsubstituierten FFA über
β-Oxidation bis auf drei Kohlenstoffatome verkürzt werden kann, wobei weder der
Alkylrest noch der Furanring beeinflusst werden (Göckler, 2009). Eine weitere
Metabolisierung wurde bisher nicht untersucht. Ebenfalls ist unklar, ob es in vivo zur
Bildung von toxischen Metaboliten von FFA kommen kann. In vitro konnte gezeigt
werden, dass nach oxidativer Umsetzung mit Rattenlebermikrosomen von 8,10-,
9,11- und 10,12-FFA Epoxide entstehen können, die jedoch in der GC-MS-Analyse
instabil und nur über ihre Reaktionsprodukte nachweisbar waren (Göckler, 2009).
Solche elektrophilen Epoxide der FFA sind unter toxikologischen Gesichtspunkten
interessant, da die Möglichkeit besteht, dass sie mit nukleophilen Gruppen reagieren
und Protein- oder DNA-Addukte bilden könnten, welche zu Schädigungen bis hin zu
Mutationen führen könnten. Das Vorkommen solcher Metaboliten in humanen Zellen
wurde jedoch bisher nicht untersucht.
CYP2E1
Furan cis-Buten-1,4-dial
-
2 Einleitung
23
Zur Toxizität von FFA gibt es nur wenige Untersuchungen. Eine unsubstituierte,
ungesättigte FFA mit 20 Kohlenstoffatomen, die in einem Schwamm (Hymiaridon
bauraki) als Sterylester vorliegt, wirkte in einer Untersuchung mit einer murinen
Monozyten-Makrophagen Zelllinie und einer Primaten-Nierenzelllinie zytotoxisch
(Prinsep et al., 1994). Eine weitere Studie zeigte, dass eine aus Schwämmen
isolierte, unsubstituierte FFA mit 22 Kohlenstoffatomen stark zytotoxisch auf die
humane Kolonkarzinom-Zelllinie COLO-250 und schwach zytotoxisch auf die
humane Nasopharynx-Zelllinie KB-16 wirkt (Shen et al., 2001). Zur Toxizität von
unsubstituierten, gesättigten C18-FFA gibt es bislang keine Studien.
2.3 In vitro-Zellmodelle zur Untersuchung der Fettsäuren
Zur Untersuchung der zellulären Wirkungen der CLA und FFA wurden in dieser
Arbeit die humane Kolon-Adenokarzinomzelllinie Caco-2 und die humane
hepatozelluläre Karzinomzelllinie HepG2 verwendet.
Die Caco-2-Zellen stammen aus einem Adenokarzinom des Kolons eines 72-jährigen
männlichen Kaukasiers (Fogh et al., 1977). Sie besitzen durch eine Mutation im
APC-Gen eine erhöhte β-Catenin Expression im Cytosol und induzieren somit die
β-Catenin-TCF4-Signalkaskade, die mit einer Induktion von PPARβ/δ und einer
Hyperproliferation der Tumorzellen einhergehen könnte (Ilyas et al., 1997;
Mariadason et al., 2001). Die Zelllinie Caco-2 besitzt eine herausragende Rolle, da
sie spontan differenzieren kann und somit ein weit verbreitetes in vitro-Modell für den
menschlichen Darm darstellt. Auf dem Differenzierungsprozess beruht die
kontinuierliche Erneuerung des Darmepithels. Aus proliferierenden Stammzellen
entstehen durch Differenzierung die vier Darmzelltypen Enterozyten, Becherzellen,
enteroendokrine Zellen oder Paneth-Zellen. Die Enterozyten bilden den Hauptanteil
an differenzierten Dünndarmzellen.
Proliferierende Caco-2-Zellen beginnen spontan den Differenzierungsprozess,
nachdem sie den konfluenten Zustand erreicht haben. Nach etwa dreiwöchiger
Kultivierung unter Standardbedingungen ist der Differenzierungsprozess
-
2 Einleitung
24
abgeschlossen. Differenzierte Caco-2-Zellen weisen mehrere morphologische und
biochemische Charakteristika von reifen Enterozyten des Dünndarms auf (Pinto et
al., 1983). Die differenzierten Zellen wachsen in einem epithelialen Monolayer und
zeigen eine zylindrische Morphologie mit einer deutlich ausgebildeten
Bürstensaummembran auf der apikalen, dem Medium zugewandten Seite (Hidalgo et
al., 1989). Hier sind typische Enzyme des Dünndarms wie beispielsweise die
Sucrase-Isomaltase, Intestinale Alkalische Phosphatase (IAP), Lactase und
Aminopeptidase N exprimiert (Zweibaum et al., 1984). Zudem entwickeln die
differenzierten Caco-2-Zellen Tight Junctions als Zell-Zell-Kontakte (Hidalgo et al.,
1989).
Die 1975 etablierte hepatozelluläre Karzinomzelllinie HepG2 entstammt dem
primären Hepatoblastom eines 15-jährigen argentinischen Jungens (Aden et al.,
1979). Die Morphologie der Zellen ist flach und polygonal und sie besitzen eine
Länge von 18 bis 23 μm. Die adhärenten Zellen wachsen größtenteils als Monolayer
in kleinen Aggregaten (Knowles et al., 1980). Im Zellrasen zeigten die Zellen
epithelioides Wachstum. Die HepG2-Zelllinie wurde als in vitro-Modell für die Leber
gewählt, da die HepG2-Zellen weitgehend normale Leberfunktionen besitzen und
viele Eigenschaften der primären Hepatozyten inklusive einer metabolischen
Aktivierung verschiedener Xenobiotika besitzen (Knowles et al., 1980; Lu und Huang
1994; Rueff et al., 1996; Urani et al., 1998). Im Vergleich zu primären Hepatozyten ist
die metabolische Aktivität allerdings gering (Rodriguez-Antona et al., 2002).
-
2 Einleitung
25
2.4 Zielsetzung
Mit Hilfe einer hypothesefreien proteomischen Screeningmethode sollen molekulare
Signal- und Stoffwechselwege entschlüsselt werden, die durch CLA in humanen
Darmzellen beeinflusst werden. Hierfür sollen die Effekte des potenten Minorisomers
t10,c12-CLA auf die Kolon-Adenokarzinomzelllinie Caco-2 mittels zweidimensionaler
Gelelektrophorese und Massenspektrometrie (MALDI-TOF) untersucht werden. In
einem parallelen Ansatz sollen die Effekte des zugehörigen Oxidationsproduktes der
t10,c12-CLA, die 10,12-FFA, auf das Proteom von Caco-2-Zellen analysiert werden,
um einen Vergleich der molekularen Wirkungen von CLA und FFA zu erlangen.
Des Weiteren soll im Rahmen dieser Arbeit erstmalig eine detaillierte toxikologische
Charakterisierung der Isomere 8,10-, 9,11-, 10,12- und 11,13-FFA, die nachweislich
durch Oxidation von CLA entstehen können, durchgeführt werden. Unter
Verwendung der Zelllinie Caco-2 sollen verschiedene toxikologische Parameter zur
Zytotoxizität, zellulären Proliferation und Apoptose getestet werden. Auf der Basis
der Hypothese, dass der Furanring der FFA metabolisch zu elektrophilen Epoxiden
aktiviert werden könnte, soll zusätzlich die metabolisch aktive hepatozelluläre
Karzinomzelllinie HepG2 in diese Studien mit einbezogen werden. Zudem soll
geprüft werden, ob FFA wie zahlreiche andere Fettsäuren die Fähigkeit besitzen, an
die Peroxisomen-Proliferator-aktivierte-Rezeptoren zu binden und diese zu
aktivieren. Schließlich soll das genotoxische Potential der FFA in einem in vitro-
Mikrokerntest und im Ames-Test bestimmt werden.
Die im Rahmen dieser Arbeit generierten Daten sollen einen Beitrag zur
Risikobewertung von FFA leisten, die Oxidationsprodukte der CLA darstellen und bis
dato toxikologisch nicht charakterisiert sind.
-
3 Material
26
3 Material
3.1 Zelllinien
Die Zelllinie Caco-2 ist eine permanente Zelllinie aus einem humanen
Adenokarzinom des Kolons (Fogh et al., 1977) und wurde von der ECACC
(European Collection of Cell Cultures, Nr. 860 10 202) bezogen. Die Zellen wachsen
in Kultur als epithelialer Monolayer und differenzieren spontan nach Erreichen der
Konfluenz. Die Zelllinie HepG2 (ECACC, Nr. 850 11 430) ist eine humane
hepatozelluläre Karzinomzelllinie. Die adhärenten, epithelialen Zellen wachsen als
Monolayer und in kleinen Aggregaten (Knowles et al., 1980). Die humane
embryonale Nierenzelllinie HEK293-T, kurz HEK-T (American Type Culture
Collection (ATCC) Nr. CRL-11268), weist eine hohe Transfektionseffizienz auf und
wurde daher für den Transaktivierungsassay verwendet (Abschnitt 4.2.5). Für die
Passagierung der adhärenten HEK-T-Zellen wurde kein Trypsin verwendet, die
Zellen lösten sich bereits durch leichtes Klopfen an die Zellkulturflasche.
3.2 Zellkulturmedien und Zusätze
DMEM high glucose + L-Glu & Na-Pyruvat PAA, Cölbe
RPMI1640 + GlutaMAX™-I + 25 mM HEPES Invitrogen, Karlsruhe
Fötales Kälberserum (FKS) PAA, Cölbe
Penicillin/Streptomycin (100 x) PAA, Cölbe
3.3 Fettsäuren
8,11-Epoxy-8,10-octadecadiensäure Universität Hamburg, Prof. Steinhardt
9,12-Epoxy-9,11-octadecadiensäure Biotrend, Köln
9(Z),11(E)-Octadecadiensäure Biotrend, Köln
10,13-Epoxy-10,12-octadecadiensäure Larodan, Malmö (S)
10(E),12(Z)-Octadecadiensäure Biotrend, Köln
11,14-Epoxy-11,13-octadecadiensäure Universität Hamburg, Prof. Steinhardt
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3 Material
27
Die 8,10-FFA und 11,13-FFA wurden von der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Dr. Hans
Steinhart (Institut für Biochemie und Lebensmittelchemie, Universität Hamburg)
synthetisiert und im Rahmen des DFG-Verbundprojekts „Lipidnet“ zur Verfügung
gestellt.
3.4 Laborgeräte und Laborhilfsmittel
Absaugvorrichtung für Zellkultur neoLab Migge Laborbedarf, Berlin
Agfa Arcus II densitometer Biostep, Meinersdorf
Analysenwaage Sartorius, Göttingen
Blot-Apparatur Fast Blot B33 Biometra, Göttingen
ChemiDoc-XRS-System BioRad, München
CO2-Inkubator Heraeus, Hanau
ETTAN IPGphor® 3 IEF System GE Healthcare, Chalfont St.Giles (UK)
ETTAN Dalt twelve® separation unit GE Healthcare, Chalfont St.Giles (UK)
Gene Genius Bio Imaging System-Anlage Syngene, Cambridge (UK)
InvestigatorTM ProPicTM workstation Genomic Solutions, Ann Arbor (USA)
Kompaktschüttler KS 15 Edmund Bühler GmbH, Hechingen
Magnetrührer RH basic 2 IKA, Staufen
Mehrkanalpipette (8-/12-Kanal), 30-300 µl Eppendorf, Hamburg
Meßpipetten (5, 10, 20 ml), Blauband VWR International, Darmstadt
Mikroskop Labovert Leitz, Wetzlar
Mikrowelle Bosch, Gerlingen-Schillerhöhe
Mikrozentrifuge Roth, Karlsruhe
Mithras Multimode Reader LB 940 Berthold Technologies, Wien (A)
Multifuge 1S-R (Falcon-Zentrifuge) Heraeus, Hanau
Mx3005PTM Real-time Cycler Stratagene, Amsterdam (NL)
Nalgene Einfriercontainer VWR International, Darmstadt
NanoDropTM 1000 Spektrophotometer Nanodrop Techn., Wilmington (USA)
Niederspannungsnetzteil Power Pack P25 Biometra, Göttingen
PCR-Werkbank Heto-Holten, Allerod (DK)
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3 Material
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pH-Meter CG 837 Schott Instruments, Mainz
Pipetten (0,5 – 2.500 μl) Eppendorf, Hamburg
Pipettierhilfe Eppendorf, Hamburg
ProXPRESS®fluorescence PerkinElmer Lifesciences, Waltham,
imaging workstation Massachusetts (USA)
Schüttler für 96-well-Platte Heidolph, Schwabach
Sterilwerkbank HERAsafe KS15 Heraeus, Hanau
Thermomixer Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg
Ultraflex II Massenspektrometer Bruker, Bremen
Ultraschall Homogenisator Bandelin electronic, Berlin
Sonoplus HD 2070
Ultrazentrifuge Optima LE-80K Beckmann, München
Vortexer Heidolph, Kehlheim
Wasserbad GFL, Burgwedel
Zählkammer Neubauer Hennberg-Sander, Gießen
3.5 Verbrauchsmaterialien
6- bis 96-well Mikrotiterplatten Greiner bio-one, Frickenhausen
Falcon-Röhrchen (15 und 50 ml) Fischerbrand, Schwerte
Fast Optical 96 Well Reaction Plate Applied Biosystems, Darmstadt
Filterpapier Amersham Biosciences, Freiburg
Nalgene Kryoröhrchen VWR International, Darmstadt
Nitrocellulosemembran HybondTMECLTM Amersham Biosciences, Freiburg
Pasteurpipetten VWR International, Darmstadt
Pipettenspitzen 0,5-2.500 µl Eppendorf, Hamburg
Reaktionsgefäße (2, 1,5 und 0,5 ml) Eppendorf, Hamburg
Sterilfilter (0,45 µm), Whatman Schleicher & Schnell, Dassel
Zellkulturflaschen mit Filter, steril 75/ 25 cm2 Greiner bio-one, Frickenhausen
Zellschaber Greiner bio-one, Frickenhausen
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3 Material
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3.6 Reagenzien und Chemikalien
Sämtliche gängige Chemikalien, die nicht extra aufgeführt sind, wurden in
p.a.-Qualität von den Firmen Merck (Darmstadt), Sigma-Aldrich (Taufkirchen) oder
Carl Roth (Karlsruhe) bezogen.
Reagenzien und Chemikalien für Zellkultur und Zellassays
Ac-DEVD-AMC Calbiochem, Darmstadt
BSA (fettsäurefrei), 96% lyophylisiert Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Camptothecin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
DMSO Sigma-Aldrich, Taufkirchen
GW501516 Enzo Life Sciences, Lörrach
GW7647 Calbiochem, Darmstadt
Insulin Transferrin Selenium (100 x ITS) Invitrogen, Karlsruhe
LipofectaminTM2000 Transfektionsreagenz Invitrogen, Karlsruhe
Neutralrot Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ölrot-O Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Opti-MEM® Invitrogen, Karlsruhe
Troglitazon Biozol, Eching
Trypsin-EDTA PAA, Cölbe
Vectashield mounting Medium Vector laboratories, Peterborough(UK)
Reagenzien und Chemikalien für proteinbiochemische Arbeiten
Agarose Merck, Darmstadt
Anchor 600 Target Bruker Daltonics, Billerica, MA (USA)
APS, p.a. Serva, Heidelberg
Bromphenolblau Merck, Darmstadt
BSA (Albumin Fraktion V) Roth, Karlsruhe
DeStreak-Reagenz GE Healthcare, Chalfont St.Giles (UK)
Mineralöl (Drystrip Cover Fluid) GE Healthcare, Chalfont St.Giles (UK)
ECL Plus Western Blotting Detektionsreagenz AmershamBiosciences, Freiburg
Glycin Serva, Heidelberg
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3 Material
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HCCA-Matrix Bruker Daltonics, Billerica, MA (USA)
IPG-Gelstreifen, 24 cm, pH3-10 GE Healthcare, Chalfont St.Giles (UK)
Pepmix Standard 1000-4000 Care, Bremen
Ponceau-Rot Roth, Karlsruhe
Precision Plus Protein Western C Standard BioRad, München
Protease-Inhibitor Mix Calbiochem, Darmstadt
Protease-Inhibitor Cocktail Set III Merck, Darmstadt
Proteome Grade Wasser BioRad, München
SDS Serva, Heidelberg
TBE-Puffer 0,5 x Merck, Darmstadt
TEMED, 99% Serva, Heidelberg
TRIS, 99,9% Roth, Karlsruhe
Tween 20 Fluka AG, Buchs (CH)
Reagenzien und Chemikalien für RNA-Isolierung und qPCR
ABsolute qPCR SYBR Green Mix plus ROX ABgene, Hamburg
Desoxyribonukleosidtriphospat Promega, Mannheim
M-MLV Reverse Transkriptase Promega, Mannheim
M-MLV RT 5x Reaktions-Puffer Promega, Mannheim
Oligo (dT)15Primer Promega, Mannheim
Random-Hexamer-Primer Applied Biosystems, Darmstadt
RNasin Plus Promega, Mannheim
Wasser (RNase/ DNase frei) Fluka AG, Buchs (CH)
3.7 Molekular- und zellbiologische Kits
BioRad-Protein-Assay BioRad, München
Caspase-Glo®3/7 Assay Promega, Mannheim
Zellproliferationsreagenz WST-1 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden
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3 Material
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3.8 Primer und Antikörper
In Tabelle 2 sind die verwendeten Primer mit ihren Sequenzen aufgelistet.
Tabelle 2: Primersequenzen der untersuchten Gene
Gen Sequenz
human β-actin Forward
5´- gac aag tct gtg caa tgg atc aa - 3´
Reverse
5´- ata cga gac aca gcc tgg tag at - 3´
human TST Forward
5´- acg cac gtg gtg gtg tat aa - 3´
Reverse
5´- gcc acc act gag cac tga ta - 3´
human CES1 Forward
5´- agg agc tct tgg aga cga ca - 3´
Reverse
5´- tca atc aca gtg ccc aga ag - 3´
human BDH2 Forward
5´- caa gcc aga gga aat cct ga - 3´
Reverse
5´- acg cag agc atg gct att tc - 3´
Für die Westernblot-Analysen wurden folgende Antikörper verwendet:
anti-β-Actin Dunn Labortechnik, Asbach
anti-BDH2/ DHRS6 Everest Biotech, Oxfordshire (U.K.)
anti-CES1 Santa Cruz Biotech., Santa Cruz (USA)
anti-Rhodanese (anti-TST) Santa Cruz Biotech., Santa Cruz (USA)
3.9 Software
Delta2D (Version 3.6) Decodon, Greifswald
Ingenuity Pathway Analysis (Version 9) Ingenuity Systems, Redwood City (USA)
MASCOT-Plattform Matrixscience, London (U.K.)
Phoretix 1D advanced software Biostep, Meinersdorf
SwissProt-Datenbank http://www.expasy.ch
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4 Methoden
32
4 Methoden
4.1 Zellbiologische Verfahren
4.1.1 Kultivierung
Die Kultivierung der verwendeten humanen Zelllinien erfolgte in 75 cm2-
Zellkulturflaschen in einem CO2-Brutschrank (CO2-Gehalt 5%) bei einer Temperatur
von 37°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95%. Alle Arbeiten mit lebenden
Zellen wurden unter einer Sterilwerkbank durchgeführt.
Caco-2- und HEK-T-Zellen wurden in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)
mit 4,5 g Glucose, L-Glutamin und Natrium-Pyruvat kultiviert, HepG2-Zellen in
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI-1640). Die Medien enthielten i.d.R.
10% hitze-inaktiviertes fötales Kälberserum (FKS) und 1% (v/v) Penicillin-
Streptomycin-Lösung („Komplettmedium“). Das Zellmedium wurde im Durchschnitt
alle drei Tage erneuert. Die Passagierung der Zellen erfolgte nach Entfernen des
Mediums und einmaligen Waschens mit PBS durch Behandlung mit 1 ml einer
Trypsin-EDTA-PBS-Lösung (0,2% Trypsin). Anschließend wurden die abgelösten
Zellen in frischem, 37°C warmen Medium aufgenommen und 5 min bei 350 x g
abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in frischem Medium resuspendiert und die
Zellen auf neue Zellkulturgefäße verteilt.
4.1.2 Einfrieren und Auftauen der Zellen
Zur Lagerung der Zelllinien wurden die trypsinierten, pelletierten Zellen in einem auf
4°C vorgekühlten speziellen Einfriermedium (70% DMEM bzw. RPMI, 20% FKS,
10% DMSO) aufgenommen. Der Inhalt einer 75 cm2-Zellkulturflasche wurde auf fünf
Kryoröhrchen (1 ml) verteilt. Um die Zellen stufenweise auf -80°C herunter zu kühlen,
wurden die Kryoröhrchen in einen auf 4°C vorgekühlten, mit Isopropanol isolierten,
Einfriercontainer gestellt und üN in einem -80°C-Gefrierschrank aufbewahrt. Am
folgenden Tag wurden die Zellen zur permanenten Lagerung in einen Behälter mit
flüssigem Stickstoff (–196°C) umgesetzt.
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4 Methoden
33
Zur Kultivierung wurden die gefrorenen Zellsuspensionen bei 37°C schnell aufgetaut
und sofort in 9 ml vorgewärmtem Medium aufgenommen, um der toxischen Wirkung
des DMSO entgegenzuwirken. Nach einer Zentrifugation bei 350 x g wurde das
Zellpellet in 1 ml Medium resuspendiert und in eine 25 cm2-Zellkulturflasche mit 9 ml
Medium ausgesät. Am folgenden Tag wurde das Medium gewechselt, um die
abgestorbenen Zellen zu entfernen.
4.1.3 Zellzahlbestimmung
Zur Bestimmung der Zelldichte einer Zellsuspension wurde ein Aliquot der
Suspension in einer Neubauer-Zählkammer (0,1 mm Tiefe; 0,0025 mm2) ausgezählt.
Hierfür wurden die Zellen mit Trypsin vom Flaschenboden gelöst und vereinzelt.
Nach Aufnahme in einem definierten Volumen Medium wurden 40 µl der
Zellsuspension im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau (0,4%) gemischt und auf das
Zählfeld pipettiert. Es erfolgte die Auszählung der farblosen, lebenden Zellen in vier
Großquadraten. Der Mittelwert der gezählten Zellen wurde gebildet und
anschließend mit dem Verdünnungsfaktor 2 und dem Volumenfaktor 1 x 104
multipliziert. Das Produkt stellte die Anzahl lebender Zellen pro ml Medium dar.
4.1.4 Inkubation mit Testsubstanzen (Fettsäuren)
Die Zellen wurden in einer definierten Zellzahl ausgesät und üN unter
Normalbedingungen kultiviert. Am Folgetag wurde das Medium abgenommen und
mit Medium ersetzt, das die Testsubstanzen enthielt. Für die Inkubationsansätze
wurde serumfreies Medium mit 1% Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) und 0,1 mg/ml
Rinderserumalbumin (BSA) verwendet („Inkubationsmedium“). Die zu testenden
Substanzen wurden mit fettsäurefreiem BSA im molaren Verhältnis von 4:1 versetzt
(Beispiel: 100 µM FS + 25 µM BSA) und dann ins Versuchsmedium gegeben.
Sämtliche Testsubstanzen waren in DMSO gelöst. Die DMSO-Konzentration wurde
für jeden Inkubationsansatz angepasst, wobei die Endkonzentration an DMSO
maximal 1% betrug. Als Negativkontrolle dienten stets unbehandelte Zellen, die
-
4 Methoden
34
ebenfalls mit der entsprechenden Konzentration DMSO inkubiert wurden (DMSO-
Kontrolle).
4.2 Zellassays
4.2.1 Lipidfärbung
Für die Lipidfärbung wurden Caco-2-Zellen in mit Deckgläsern (13 mm Durchmesser)
bestückten 24-well-Platten kultiviert. Pro well wurden 40.000 Caco-2-Zellen
ausgesät. Nach einer Kultivierung üN im CO2-Brutschrank wurde das Medium
abgenommen und mit Inkubationsmedium ersetzt, das die Testsubstanzen enthielt
(Abschnitt 4.1.4). Für jede Probe wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt. Nach
48 h wurde eine Ölrot-O-Färbung zur spezifischen Färbung von Triacylglyceriden
durchgeführt. Hierfür wurden die Zellen zunächst einmal mit PBS gewaschen und
anschließend für 1 h mit 3,7% Formaldehydlösung fixiert. Die Färbung erfolgte für 1 h
mit 0,3%iger Ölrot-O-Lösung (in 60% Isopropanol) im Dunkeln. Zur Visualisierung
der Färbung wurden die Deckgläschen mit den angefärbten Caco-2-Zellen nach
unten auf einen mit 10 μl Vectashield mounting Medium benetzten Objektträger
platziert, mit H2Odest gewaschen und mikroskopisch ausgewertet.
4.2.2 Proliferation
Zur Messung des Proliferationsverlaufes der Zellen unter Einwirkung der
Testsubstanzen wurde das Zellproliferationsreagenz WST-1 verwendet. Hiermit ist
ein colorimetrischer Nachweis zur Bestimmung der Anzahl lebender, proliferierender
Zellen möglich. Der Test beruht auf der enzymatischen Spaltung des wasserlöslichen
Tetrazoliumsalzes WST-1 durch mitochondriale Dehydrogenasen. Die Entstehung
des dunkelroten Formazan-Farbstoffes korreliert mit der Anzahl proliferierender
Zellen.
Die Zellen wurden mit 100 µl ihres jeweiligen Komplettmediums in 96-well Platten
kultiviert. Caco-2-Zellen wurden mit 5.000 Zellen je well ausgesät und HepG2-Zellen
-
4 Methoden
35
mit 10.000 Zellen je well. Nach einer üN-Kultivierung im CO2-Brutschrank wurde das
Medium abgenommen und durch 100 µl Inkubationsmedium ersetzt, das die
Testsubstanzen enthielt (Abschnitt 4.1.4). Für jede Probe wurde eine
Fünffachbestimmung durchgeführt. Alle Zelllinien wurden drei Tage mit den
Testsubstanzen inkubiert. Zur Messung der Proliferationsrate wurden 10 µl des
WST-1-Reagenz in jedes well gegeben. Der Farbumschlag wurde nach einer
30minütigen Inkubation im Brutschrank bei einer Wellenlänge von 450 nm im Mithras
Multimode Reader LB 940 Photometer gemessen. Als Leerwert diente WST-1 in
Medium ohne Zellen. Nach Abzug des Leerwertes wurden die unbehandelten Zellen
(DMSO-Kontrolle) als 100% Wachstum definiert und alle anderen Proben auf diesen
Wert bezogen.
4.2.3 Zytotoxizität
Zur Messung der zytotoxischen Wirkung von Testsubstanzen wurde der
Neutralrotassay angewendet. Aussaat und Inkubation der Zellen erfolgte
entsprechend den Angaben zum Proliferationsassay (Abschnitt 4.2.2). Nach der
Inkubation der Testsubstanzen für drei Tage wurde das Medium entfernt und die
Zellen mit 200 µl frisch angesetzter Neutralrot-Gebrauchslösung (0,4%-
Neutralrotlösung 1:80 in Medium verdünnt) versetzt und für 3 h bei 37°C im CO2-
Brutschrank inkubiert. Alle lebenden Zellen nehmen den Farbstoff Neutralrot in ihre
Lysosomen auf. Anschließend wurden die wells zweimal mit je 100 µl PBS
gewaschen. Eine Zugabe von 200 µl essigsaurer Ethanollösung (50% EtOH, 1%
Eisessig) diente der Farbentwicklung. Durch 15minütiges Schütteln bei RT wurde
eine Homogenität der Farbe erreicht und die Ansätze konnten bei 540 nm
photometrisch vermessen werden. Die Werte der unbehandelten Zellen (DMSO-
Kontrolle) wurden als 100% Wachstum (entspricht 0% Zytotoxizität) gesetzt.
4.2.4 Apoptose
Zur Messung der Apoptose-induzierenden Wirkungen von Testsubstanzen wurden
die Zellen für 24 h mit verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanzen inkubiert
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4 Methoden
36
(Abschnitt 4.1.4). Anschließend wurde die Caspase-3-Aktivität gemessen. Als
Positivkontrolle diente das Tumortherapeutikum Camptothecin in einer Konzentration
von 25 µM. Die Werte der unbehandelten Zellen (DMSO-Kontrolle) wurden auf 1
gesetzt und alle anderen Proben auf diesen Wert bezogen, um eine Zunahme der
Apoptose zu visualisieren. Die Induktion der Caspase-3-Aktivität in Caco-2-Zellen
wurde mit Hilfe des Caspase-3-Substrates (Ac-DEVD-AMC, Cal