отзыв

официального оппонента на диссертационную работу Таракановой ЮлииНиколаевны "Влияние условий адсорбции моноклонаJIьных антител на ихантигенсвязывающую активность в твёрдофазном иммуноферментноманализе", представленную на соискание ученой степени кандидатабиологических наук по специ€LIIьности 14.03.09 <<Клиническаяиммунология и €Lллергология))

классические методы твердофазного иммуноферментного анаJIиза

(иФА), основанные на использовании специфических антител,сорбированных на полистирольных планшетах, уже в течение долгоговремени являются наиболее распространенными и широко используемымикак В медициНскоЙ диагностике, так и в других областях. Одной изосновных задач, стоящих перед разработчиками и производителями такихтест-систем является повышение чувствительности анаJIиза и снижениепредела обнаружения определяемых веществ в пробе, поэтому часто в

научной среде говорят о создании иммуноферментных наборов новыхпоколений, отвечающих данным требованиям. особенно остро такие

предъявляются к определению в сыворотке крови человекатребования

возбудителей инфекционных заболеваний, таких как спид, гепатит И Др.,

необходИмостЬ в определениИ которыХ возникает при массовых ан€UIизах,

проводимых при переливании крови, и широких скрининговыхисследованиях населения. Во многом такие характеристики анаJIиза, какчувствиТельностЬ, воспроизводимостъ, предел обнаружения, рабочийдиап€вон, зависят прежде всего от качества и сорбционных свойствпланшетов, содержащих заранее иммобилизованные специфическиемоноклон€LгIьные антитела, осуществляющие первонач€шъное связываниеанаJIизируемого вещества из образца. Поэтому знание механизмовобразования на твердой ф*е таких иммунохимических комплексов иопределение их количественных характеристик имеет первостепенноезначение для создания тест-наборов с наилучшими анаJIитическими

характеристиками. Однако, так как такие исследования часто проводятся

коммерЧескими фирмами-производителями тест-систем и носят закрытый

характер, в научной литературе имеется маJIо исследований, посвященных

этой теме. В основНом онИ относятСя к перВонач€UIьному этапу развитияисследоВаниЙ по ИФА в 90-х годах прошлоГо века и описывают лишь

основные общепринятые условия сорбции антител на планшетах (в т.ч.

вблизи нейтральных значений рН сорбции, как правило от 7,0 до 9,5).

Щиссертационная работа

антитеЛ к ВИt{ и HBsAg. Выбор объекта исследований- широкого спектра

полученных автороВ моноклонаJIьных антитеЛ к возбудителям этих

опасных и распространенных заболеваний человека, €ще раз подтверждает

большуЮ практическую значимость, новизну и актусLлъность данной

работы.

щиссертация Таракановой ю.н. построена по традиционной схеме и

включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, методы

исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы и список

использованной литературы, включающий l07 источников. Работа

изложена на l 15 страницах и проиллюстрирована 13 рисунками и 7

таблицами.

в литературном обзоре автор останавливается на изложении

ОСНОВНЫХ ПРинципов проведения твердофазных методов иммуноанализа,

том числе ИФА. Рассмотрены основные современные подходы получения

моноклон€шьных антител И возможности их использования в

иммуноферментном анаJIизе, приведены примеры усовершенствования

детаJIьЕому выясЕению

Таракановой Ю.Н. как раз и посвящена

условий наилучшей сорбции моноклон€lJIьных

твердофазных методов с целью увеличения чувствительносТи анаJ'Iиза и

возможности использования новых меток и систем детекции сигнаJIа.

математическая модель связывания антигена сПредставлена

иммобилизованными на носителе антителами с целью моделирования

процессов комплексообразования и

характеристик анапиза. Отдельный

получениrI количественных

раздел литобзора посвящен

подробному рассмотрению вопроса о стабильности антител и сохранении

эффективности связывания с антигеном при пассивной сорбции антител на

полистиролъном носителе, при этом подробно рассмотрено влияние

условий сорбции, в том числе состава буферного раствора и величины рН,

на эффективность сорбции антител и сохранение их способности

гrоследующего комплексообразования с антигеном. Автор отмечает, что в

подавляющем большинстве опубликованных работ иммобилизация

моноклон€шьных антител изучаJIасъ при значениях рН адсорбционных

буферов в интервале 7,0 - 9,5, позволяющих достигать, как правило,

оптимагIьных характеристик сорбции антитеJI и анапиза. Вместе с тем,

значения рН адсорбционных буферов ниже 7,0 и выше 9,5 использовались

лишь в единичных работах и эффективность связывания антигена

определялась преимущественно для поликлонzUIьных антител. Автором

отмечено, что в лаборатории, в которой проводиJIась работа, уже ранее

антитела к НВs-антигену, которые

увеличение антигенсвязывающей

были получены моноклонаJIьные

демонстриров€Lли существенное

способности после адсорбции при рН 2,8 (в сравнении с адсорбцией при

рН 7,5). Эти данные tIозволили предположить, что факт увеличения

эффективности связывания антигена сорбированными в более широком

диап€воне рН моноклон€Lтьными антителами может иметь место также и

для моноклон€}JIъных антител другой специфичности. В этой связи автор

формулирует основную цель своего исследованиъ как выяснение

возможности осуществления эффективной сорбции антител и

последующего связывания антигена для широкого пула моноклональных

антител против ВИLI и НВs-антигена при экстремально кислых и

щелочных значениях рН. Автор четко формулирует основные задачи,

лучшим сохранением

удачна фрuзu (МКАих антигенсвязывающеи активности...>); не вполне

и методы) на

флуоресцентным

стр.50 автор

красителем

активированным N-гидроксисукцинимидным эфиром, проводили,

рекомендациям производителя (<BioDye>>, Россия, Москва)>, хотя следует

писатъ об использовании

гидроксисукцинимидом, кроме

индустрияll, d не <<BioDye>>.

в качестве

красителя Су5, активированного N-

того фирма имеет название <<Биотех-

пожелания хотелось бы при характеристике

исПользуемых моноклон€lJIьных антител получить информацию не толъко

проявляли узкую спецuфuчносmь в оmноlаенuu

<Материалы

антител с

по степени их чистоты, но и по таким параметрам, как константы

СВЯЗЫВаНИя (аффинности) антител с соответствующими антигенами, такая

характеристика явJUIется общепринятой для коммерческих антител.

немного затрудняет чтение тот факт, что помимо главы з

<РеЗУЛЪТаТЫ исследований>, в которой приведены экспериментzulьные

результаты и уже проводится их ана_IIиз, отдельно IIрисутствует

дополнительный раздел <обсуждение>. При этом автору поневоле

приходится повторно описывать суть проведенных экспериментов и

ан€шизироватъ полученные резулътаты. Лучше было бы обсуждение

РеЗУЛЬТаТоВ tIроводить более полно по мере изложения самих резулътатов,

а в конце главы дать заключение, обобщающее полученные данные. В этой

связи следует отметить, что при обсуждении резулътатов по

ЭффеКтивНости связыван ия антиT ел, адсорбированных при экстрем€шъных

РН, аВТОР ДеЛает вывод о болъшей доли антител, полностью сохраняющих

СВОЮ СПОСОбность связывания антигена после сорбции при экстремальных

РН, СОвсем не рассматривая возможность изменения константы связывания

пишет

Су5,

следуя

опmuJулальноZо рН аdсорбцuu.. .> (стр.8).

В разделе

кКонъюгацию

аДСОРбИРОВанными антителами. Такую возможность автор отмечает лишь

на последней странице рЕlздела <Обсуждение), хотя вероятность такого

события весьма высока.

Хtелательно было бы в заключении привести также

эксперимент€LIIъные данные по основным анаJIрIтическим характеристикам

тест-систем для определения ВИLI и HBs-Ag, разработанных с

использованием моноклонаJIьных антител, адсорбированных в условиях

оптим€шьных для связывания, тем более, что упоминание о снижении

более, чем на порядок предела обнаружения в тексте диссертации имеется.

Однако, все вышеизложенные соображения имеют частный и

рекомендательный характер, не влияют на обоснованностъ положений,

выносимых на защиту диссертации, и не снижают ее общую очень

высокую оценку. Основные результаты диссертации изложены в четырех

ведущих рецензируемых научных журн€Lлах, входящих в переченъ ВАК.

Содержание работы в полной мере соответствует специаJIьности 14.0З.09 -<<Клиническая иммунология и аJIпергология>. Автореферат полностью

соответствует основным положениrIм и выводам диссертационной работы

и адекватно отражает результаты выпоJIненного исследования.

Таракановой Ю.Н. выполнена научно-квалификационная работа, в

которой, в соответствии с требованиями п. 9 <<Положения о порядке

присуждения ученых степенеи>, предъявляемыми к кандидатским

диссертациям, содержится решение задачи, имеющей существенное

значение для понимания процессов иммунохимических взаимодействий

широкого спектра антител с вирусными антигенами, которые положены в

основу разработки эффективных ИФА тест-систем для количественного

высокочувствительного определения ВИtI и HBsAg.

,Щиссертация Таракановой Юлии Николаевны "Влияние условий

адсорбции монокJIонzlJIьных антител на их антигенсвязывающую

активность в твёрдофазном иммуноферментном анаJIизе", по акту€lJIьности

темы, объему проведенных исследований, научнои новизне

практическои значимости полученных результатов является законченной

РаботоЙ высокого теоретического и экспериментаJIъного уровня.

ЩИССеРтационная работа Таракановой Ю.Н. полностью соответствует

требованиrIм, устанавливаемым <<Положением о порядке присуждения

У{еНЫх СтепенеЙ), утвержденным Постановлением Правительства РФ от

24.09 2а\з г. Jtlb 842 (в редакции Постановления Правительства РФ от 2|.04

20|6 г. j\b ЗЗ5), а ее автор, безусловно, заслуживает присуждения искомой

степени кандидата биологических наук по специ€Lльности 14.0З.09

<<Клиничес кая иммунология и €lJIл ер гология>).

Старший научный сотрудник,

кандидат химических наук

Осипов Александр Павлович

E-mail : aposipov@mail.ru

ФедеРальное государственное автономное образовательное учреждение

ВЫаШеГО образования <<Национ€uIьныЙ исследовательскиЙ технологический

университет <<МИСиС> ( НИТУ <МИСиС>)

Юридический и фактический адрес: Ленинский проспект, д. 4, |19049, г.МоскваТелефон: +7 495 955-00-32Факс: +7 499 2з6-2|-а5

:LодтIисъýрорекгор по

и обпýтья во

НиТУ n'nlm{C

10