INSULINASI

TRATAMENTUL CU INSULIN,

IOAN A. VERE{IU NICOLAE HNCU GABRIELA ROMAN

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei

IOAN A. VEREIU

INSULINA I TRATAMENTUL CU INSULIN / Ioan A. Vereiu

Cluj-Napoca, Echinox, 2004

ISBN 9738298-43-1

Prof. univ. dr. Nicolae HncuUniversitatea de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu Cluj

Catedra de Diabet, Nutriie i Boli Metabolice

Conf. univ. dr. Ioan Andrei VereiuUniversitatea de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu Cluj

Catedra de Diabet, Nutriie i Boli Metabolice

ef lucrri dr. Gabriela RomanUniversitatea de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu Cluj

Catedra de Diabet, Nutriie i Boli Metabolice

Psiholog Mirela PopSpitalul Clinic Judeean Cluj

Centrul Clinic de Diabet, Nutriie i Boli Metabolice

EDITURA ECHINOX

CLUJ-NAPOCA , 2004

INSULINASI TRATAMENTUL CU INSULIN,

IOAN A. VERE{IU NICOLAE HNCU GABRIELA ROMAN

COLABORATOR

PsihologMMIIRREELLAA PPOOPP

Cules: autoriiTehnoredactare si design: MGV Transilvania

Aprut 2004. Bun de tipar: Februarie 2004Format: 50x70x18. Coli tipar: 14

Editura ECHINOXC.P. 80, O.P. 1, Cluj-Napoca

E-mail: echinox@mail.dntcj.ro

ISBN 9738298-43-1

INSULINA I TRATAMENTUL CU INSULIN

Cuprins

1. Introducere................................................................................................................32. Insulina......................................................................................................................63. Fiziologia secreiei i aciunii insulinei.................................................................10

3.1. Elemente de embriogenez i morfopatologie a pancreasului endocrin......103.2. Biosinteza insulinei..................................................................................173.3. Secreia insulinei.....................................................................................183.4. Mecanismele de aciune a insulinei.........................................................223.4.1. Aspecte generale..................................................................................223.4.2. Receptorii pentru insulin.....................................................................223.4.3. Cile de semnalizare post- receptor.....................................................253.4.4. Ci alternative de semnalizare.............................................................273.4.5. Transportorii de glucoz......................................................................273.4.6. Efectele metabolice al aciunii insulinei................................................28

4. Glucagonul, somatostatina, amilina i factorii de cretere insulin-like...............................................................................................................33

4.1. Glucagonul..............................................................................................334.2. Somatostatina .........................................................................................344.3. Amilina ....................................................................................................344.3. Factorii de crestere insulin-like ...............................................................35

5. Fiziopatologia clinic a insulino-deficienei .........................................................376. Fiziopatologia clinic a insulino-rezistenei ........................................................437. Preparatele farmaceutice de insulin ...................................................................46

7.1. Consideraii introductive...........................................................................467.2. Farmacocinetica i farmacodinamica insulinelor comerciale......................497.3. Insulinele prandiale (cu aciune rapid i durat scurt)..........................527.4. Insulinele bazale (cu aciune intermediar i lung)................................537.5. Amestecurile de insuline..........................................................................55

8. Strategia tratamentului cu insulin..................................................................588.1. Regimurile de insulinoterapie

(Prof. Dr. N. Hncu, Dr. I.A. Vereiu)........................................................588.2. Tehnica administrarii insulinelor ..............................................................708.3. Mijloace de administrare a insulinelor .....................................................72

8.4. Pstrarea insulinelor ...............................................................................74

8.5. Perfuzia subcutanat continu cu insulin

(Dr. Gabriela Roman) .................................................................................76

8.6. Tactica tratamentului cu insulin .............................................................94

8.6.1. Obiectivele glicemice ale tratamentului cu insulin .............................94

8.6.2. Etapele tratamentului cu insulin .........................................................95

8.6.3. Iniierea tratamentului cu insulin ........................................................96

8.6.4. Ajustarea dozelor de insulin ............................................................100

9. Automonitorizarea .............................................................................................10910. Monitorizarea glicemic continu (Dr. Gabriela Roman) ................................112

1

11. Particulariti ale tratamentului cu insulin .....................................................11511.1. Tratamentul cu insulin la copii i adolesceni ....................................115

11.2. Tratamentul cu insulin la vrstnici .....................................................116

11.3. Tratamentul cu insulin la gravide

(Dr. Gabriela Roman) ..........................................................................118

11.4. Tratamentul cu insulin pre- i intra-operator

(Dr. Gabriela Roman) ..........................................................................125

11.5. Tratamentul cu insulin n crizele hiperglicemice (acidocetoza diabetic, starea

hiperglicemic hiperosmolar)

(Dr. Gabriela Roman) ...........................................................................128

12. Strategia tratamentului cu insulin in diabetul zaharat tip 1 ........................13113. Tratamentul cu insulin n diabetul zaharat tip 2

(Prof. Dr. N. Hncu).............................................................................................13414. Complicaiile tratamentului cu insulin ...........................................................191

14.1. Lipodistrofia (lipoatrofia i lipohipertrofia) ............................................191

14.2. Alergia la insulin (localizat i generalizat) .......................................191

14.3. Tulburrile de refracie ........................................................................192

14.4. Edemul insulinic ..................................................................................192

14.5. Creterea n greutate ..........................................................................192

15. Hipoglicemiile la pacienii tratai cu insulin ...................................................19416. Bariere psiho-sociale n tratamentul cu insulin

(Psiholog Mirela Pop) .........................................................................................19817. Eficacitatea bazat pe evidene a tratamentului cu insulin .........................22618. Probleme socio-economice n tratamentul cu insulin

(Prof. Dr. N. Hncu, Dr. I. A. Vereiu) .................................................................23019. Anexe ..................................................................................................................237

Anexa 1 - Structura primar i teriar a insulinei ...................................237

Anexa 2 - Pachetul de insuline i administrare a lor, Novo Nordisk .......238

Anexa 3 - Pachetul de insuline i administrare a lor, Aventis ................239

Anexa 4 - Pachetul de insuline i administrare a lor, Lilly .....................240

Anexa 5 - Diverse glucometre .................................................................241

Anexa 6 - Locul de administrare al insulinelor. Lipohipertrofie ...............242

Anexa 7 - Pompa de insulin MiniMed ...................................................243

Anexa 8 - Pompa de insulin Disetronic ................................................244

Anexa 9 - Algoritmul insulinoterapiei n cetoacidoza diabetic ..............245

Anexa 10 - Algoritmul insulinoterapiei n strile

hiperglicemice hiperosmolare ................................................246

Anexa 11 - Evidene clinice n tratamentul cu insulin ................................247

Anexa 12 - Cum s nu educm pacienii cu diabet ................................263

Anexa 13 - Prof. G. Bolli ............................................................................267

2

31. INTRODUCERE

Despre tratamentul cu insulin se poate spune c reprezint caracteris-tica cea mai specific a diabetologiei ncepnd din ianuarie 1922. Deidescoperirea i introducerea insulinei n arsenalul terapeutic a reprezentatunul dintre momentele cruciale, de adevarat glorie, n istoria medicinii, care ai adus ulterior nu mai puin dect trei premii Nobel unor mari cercettori (dinpcate, primul dintre ele, cel atribuit n 1923 pentru descoperirea insulinei,reprezint o "ran" nc deschis pentru medicina romneasc prin injustiiafcut profesorului N.C. Paulescu, asupra creia voi reveni), acest moment a"ridicat vlul" de pe un domeniu practic necunoscut medicinii pn atunci ianume ngrijirea de durat a unor pacieni care i auto-administreaz (mareamajoritate) un medicament prin injecii n condiii de ambulator. n acelai timpa devenit destul de repede evident faptul c descoperirea i administrareainsulinei nu a asigurat dect supravieuirea imediat a pacienilor i c de faptreuita tratamentului depindea de o ajustare continu a dozelor- sarcin carepentru mult timp a revenit practic numai medicului curant- precum i de capa-citatea pacienilor de a respecta, pe termen lung, indicaiile stricte care seinterferau serios cu calitatea vieii lor. Mai mult, odat cu creterea speraneide via a pacienilor cu diabet zaharat prin tratamentul cu insulin, medicinase vedea confruntat cu un capitol nou, foarte puin cunoscut i anume com-plicaiile cronice ale diabetului (E. von Jger a publicat n 1855 n "Beitrgenzur Pathologie des Auges" ceea ce este considerat prima descriere aretinopatiei diabetice, iar pn n 1875 T. Leber a inventariat n literatur 19cazuri. Lui J. Rollo i se atribuie prima descriere a neuropatiei diabetice pe-riferice n 1797 n "An Account of Two Cases of the Diabetes Mellitus", nsaceast complicaie a fost rar diagnosticat pn dup descoperirea insulinei).

Un pesimist ar putea s spun c n cele peste opt decenii care au tre-cut de la descoperirea insulinei nu s-au produs schimbri majore n adminis-trarea ei. ntr-adevr, calea de administare obinuit a rmas cea subcutanati deci pacientul trebuie s se foloseasc n continuare de ac i de siring,injeciile se fac de mai multe ori pe zi, hipoglicemia este un incident aproapeinevitabil i pentru prea muli nc dintre pacieni mentalitatea de bolnav cro-nic umbrete viaa lor i a celor apropiai lor.

Optimistul are ns i el numeroase i consistente argumente atunci cndspune c schimbrile sunt evidente. Seringile de unic folosin, acele ultra-fine, pen-urile, pompele de insulin, insulinele cu farmacocinetica si farmaco-dinamica diferit i, mai nou, analogii de insulin (cu profile farmacodinamicei mai individualizate), auto-monitorizarea, conceptul strategic al "mputerni-cirii" pacientului (empowerment) i nu n ultimul rnd accesul la insulin (celpuin ntr-o mare parte din rile lumii), sunt progrese incontestabile, care audus la o cretere vizibil a calitii vieii pacienilor i a speranei lor de via.

Probabil c este o fatalitate faptul c marile descopeririri, cum este cea a

4insulinei, au drumul marcat de dispute de prioritate, erori flagrante sau victimeale unor nedrepti istorice. Galen a folosit n scrierile lui termenul de diabetfr a meniona ns faptul c termenul i aparinea contemporanului su,Aretaeus din Cappadocia. Teoria lui Galen, conform creia diabetul este oafeciune renal, a "rezistat" n medicin timp de mai mult de cincisprezecesecole. Faimosul Claude Bernard n-a acceptat niciodat faptul c necunos-cutul student neam Victor Hensen a descoperit concomitent cu el glicogenulhepatic.

Probabil c cea mai flagrant nedreptate l-a avut ns ca victim pe for-midabilul cercettor, medic, dascl i nu n ultimul rnd, filosof, care a fost pro-fesorul Nicolae C. Paulescu (tiu c, n abordarea acestui subiect, "subiec-tivismul patriotic", ar putea fi un repro uor de invocat). Pentru cei care suntinteresai n detalii recomand crile, realmente pasionante, ale profesorului I.Pavel "The priority of N. C. Paulescu in the discovery of insulin", Ed. AcademieiR.S.R., Bucureti 1976 i "Corespondena n sprijinul prioritii lui N. C.Paulescu n descoperirea insulinei", Ed. Academiei R.S.R., Bucureti 1986.Acurateea tiinific cu care a descris efectele "pancreinei", este adevarat cn condiii experimentale, la cine, n articolele publicate n 1921, a fostrecunoscut unanim i ar fi fost argumente suficiente pentru a i se atribui i luipremiul Nobel. Este poate suficient s citez doar dou fragmente din rspun-surile primite de profesorul Pavel la scrisorile lui: "Acordarea Premiului Nobelpentru medicin n 1923 a fost cea mai nefericit alegere din toat istoria aces-tor premii Lucrrile lui Paulescu au o clas mai nalt dect ale cercettorilorcanadieni" a scris profesorul Rolf Luft, preedintele de atunci al FederaieiInternaionale de Diabet i "Dup prerea mea i Paulescu trebuia sprimeasc Premiul din pcate, nu exist nici un mecanism prin care PremiulNobel, odat decernat, s poat fi revocat" i-a rspuns profesorul ArneTiselius, membru al Institutului Nobel. Dar profesorul Paulescu a fost i este,n istoria medicinii i tiinei romneti, mult mai mult dect un mare nedrep-tit, iar lectura celor dou cri ale lui "Fiziologie filosofic. Instincte sociale.Patimi i conflicte. Remedii morale" i "Noiunile de suflet i Dumnezeu nfiziologie", reeditate la editura Anastasia n 1995 i respectiv n 1999, este unargument mai mult dect convingtor.

De ce o carte (numai) despre tratamentul cu insulin? n literatura naio-nal a specialitii noastre au fost scrise multe monografii remarcabile dedicatediabetului zaharat. n cuprinsul acestora, ca i n cel al majoritii monografiilordin literatura strin tratamentului cu insulin i revine doar o seciune, fapt deneles dac inem cont de complexitatea ntregii problematici a diabetuluizaharat (etio-patogenie, epidemiologie, complicaii acute i cronice, tratamentdietetic, oral s.a.). Din pcate, dei n multe dintre crile de mai sus se gs-esc multe (uneori prea multe) algoritmuri i tabele pe baza crora se fac reco-mandri de stabilire a dozelor de insulin, transpunerea lor n practic nu estedeloc uoar. Nu rareori diabetologii cu experien i dezvolt propriile algo-

5ritmuri, care ns au o not prea personal i sunt greu de mprtit altora.Am constatat att "pe proprie piele", ct i din experiena de aproape zece anide lucru cu rezidenii, c tratamentul cu insulin reprezint nc "piatra dencercare" a practicii de zi cu zi a diabetologului i nu numai a lui. De altfel,atunci cnd mi-am nceput cariera medical insulina era utilizat de psihiatri(pentru tratamentul cu "ocuri insulinice" al unor psihoze) i de ctre internitipentru tratamentul "sindromului duodenal", pentru explorarea secreiei gastricesau pentru stimularea apetitului.

Nu am lipsa de modestie de a pretinde c pot oferi soluii acestor pro-bleme, ns sper ca mcar unii dintre cititori (medici sau chiar pacieni) sgseasc aici unele rspunsuri sau sugestii.

Nici un moment nu trebuie uitat faptul c tratamentul cu insulin repre-zint doar una dintre componentele management-ului complex al pacientuluicu diabet zaharat (educaie, screening-ul pentru complicaiile cronice, abor-darea co-morbiditii, evaluri periodice .a.) i c medicul nu trebuie s-iepuizeze eforturile niciodat ntr-o singur direcie.

Dei introducerea unui capitol de fiziologie a secreiei i aciunii insulineiar putea atenua caracterul practic al crii, cred c cei care sunt interesai i deaceste aspecte vor gsi ceea ce doresc, iar cei n criz de timp pot s-l "sar".

Este o onoare pentru mine faptul c D-l Prof. Nicolae Hncu a acceptatcolaborarea i coautoratul la aceast carte. Nu tiu ce poate fi mai reconfor-tant profesional dect s apari pe coperta unei cri alturi de maestrul tu. Deasemenea, le mulumesc celor dou colege ale mele, d-na dr. Gabriela Romani d-oarei Mirela Pop pentru excelentele capitole cu care au participat laaceast carte, remarcabile i pentru faptul c aceste capitole reflect o realexperien personal.

Nu n ultimul rnd, le sunt recunoscator d-nei dr. Monica Negrean i d-neiCristina Zegreanu pentru indispensabilul ajutor pe care mi l-au dat nredactare.

Le suntem recunosctori reprezentanelor Aventis-Romnia, Lilly-Romnia,NovoNordisk-Romnia i Romdiamed pentru generoasa i dezinteresatasusinere a editrii acestei cri.

P.S n luna august 2003 la lista nedreptilor care au marcat destinul acestui om

aparte, Profesorul N. Paulescu, s-a mai adugat una. Dup ndelungi eforturi,Prof. N Hncu, n numele Federaiei Romne de Diabet, Nutriie i BoliMetabolice, a reuit includerea n calendarul Federaiei Internaionale deDiabet (IDF) a "Premiului Paulescu", a crui prim decernare urma s aib loccu ocazia celui de al XVIII-lea congers al IDF de la Paris. Cu aceeai ocazieurma s fie dezvelit i o plac comemorativ, n numele Societii Romnede Diabet, Nutriie i Boli Metabolice, la istoricul spital Hotel Dieu, unde

6Prof. Paulescu i-a nceput cariera, alturi de Prof. Lanceraux, mentorul su.n ajunul acestor festiviti un articol aprut ntr-un ziar parizian a readus vehe-ment n discuie controversata activitate politic a Prof. Paulescu din deceniile2 i 3 ale secolului trecut, fapt care a dus la anularea celor dou momentemenite s repare parial o injustiie major. Nu am nici abilitatea nici intenia dea perora pe marginea unui subiect att de delicat cum este antisemitismul.M-am strduit s citesc crile "nemedicale" ale Prof. Paulescu (pstrate dinfericire n fondul Bibiotecii Universitare "Lucian Blaga" din Cluj) i recunoscfaptul c ele pot fi de-a dreptul ocante pentru cititorul de astzi. Cred ns cacestea trebuie neaprat analizate n contextul politic, istoric, social i eco-nomic al anilor '20. Pe de alt parte ns, caracterizarea lapidar fcutProfesorului de ctre un filosof i comentator politic contemporan nou, ca"fascist i rasist" o consider simplist, nedreapt i prin acestea, inacceptabil.Cineva care a definit naionalismul ca "... iubirea natural care-i leag ntrednii pe membrii unei naii. Baza naionalismului este familia, iar supremaform natural e neamul... Bestial nu este naionalismul ncadrat n iubireasocial a neamului tu; bestial devine cel care rupt de aceast comunitate deiubire, alunec n aventura revoluiilor sngeroase, mpotriva familiei i nea-mului... " merita mult mai mult...

Alturat reproducem comentariul Prof. G. Bolli, primul deintor al premiuluiIDF N. C. Paulescu decernat cu ocazia celui de al II-lea Congres al FederaieiRomne de Diabet, Nutriie i Boli Metabolice, Satu Mare, nov. 2003.

Ioan Andrei VereiuIan. 2004

6*

Comment about Paulescu's discovery of insulin

A few years ago I fell in love with the fascinating book by Michael Bliss "The disco-very of Insulin". Going through the historical chapters, I was impressed by the intuitionand determination of Frederick Banting, the generous help of J.J.R. Macleod andJames Collip, whose work ultimately resulted into the formulation of a pancreatic extractsuitable for injection into humans. This resulted as the discovery of the most lifesaving drug of mankind. At the time I read the Bliss' book, I had no idea of the roleplayed by Nicolae Paulescu in the history of discovery of insulin. Although his namewas mentioned, Bliss did not expand on the work of Paulescu considerably and I wasleft with the impression that Paulescu belonged to the quite large group of people ofthose who were "close to discover insulin but eventually didn't".

It has been only in November 2003 that I understood the real contribution of NicolaePaulescu to the discovery of insulin after reading his original paper "Recherche sur lerle du pancras dans l'assimilation nutritive" (published in Archives Internationales dePhysiologie 17:85-103, 1921), kindly donated to me by Prof. Pierre Lefebvre fromLiege, the city where Paulescu's paper was printed on 31st August 1921. It is difficultto express the surprise, the admiration and the enthusiasm for the experimentsdescribed by Paulescu. It is clear that in November 1920, Paulescu already made the"perfect" experiment where he injected a dog with diabetes (secondary to pancreatec-tomy which he had done himself) an extract of pancreas from another dog. He showsin a table the decrease of initial hyperglycaemia after the injection of pancreatic extractand its subsequent rebound with time, thus proving not only the blood glucose lower-ing effect of his extract but also the time action profile of his extract. In addition,Paulescu has proven that the effect of the pancreatic extract is not limited to blood andurinary glucose, but extends to ketone body metabolism and protein metabolism aswell. In other words, Paulescu has fully elucidated the key role of internal secretion ofpancreas on multiple metabolic pathways. In the same paper, Paulescu describesseveral other experiments all confirmatory of the previous experiment thus proving con-sistency of his experimental work.

Paulescu did not make his pancreatic extract available for use in humans affected bydiabetes mellitus. The Toronto group in 1922 did it. Therefore Banting and Macleodgot the Nobel Prize. Interestingly, the committee gave the prize not for the discovery ofinsulin but for making it available to humans. Therefore, the question of "discovery" ofinsulin is still open.

Without starting or reiterating the old dispute on the individual merits of the discoveryof insulin, I think that it is time to value the pioneering work of Paulescu who haspreceded that of Banting and his Canadian colleagues by at least one year. The scien-tific, methodological and research approach by Paulescu to the problem of the pancre-atic extract is impressive, and the elegance of his convincing paper simply astonishing.

I believe that Nicolae Paulescu should be recognised as the scientist who has firstdemonstrated beyond any doubt the blood glucose lowering effects of a pancreaticextract in animals (in addition to the effects on ketone body and protein metabolism).Banting and the Toronto group remain the people who "re-discovered" insulin and madeit available for use in humans.

Prepared on 29 Dec 03 for N. HancuProf. Geremia B. BolliDi.M.I.University of Perugia

72. INSULINA

Insulina, hormonul hipoglicemiant produs de celulele din pancreasulendocrin, este o protein de dimensiuni relativ mici, pe care baza de dateSCOP (Structural Classification of Proteins) o ncadreaz in clasa "Proteinemici, Grupa Insulin-like". Este format din dou lanuri polipeptidice, carensumeaz 51 de aminoacizi. n soluie, n funcie de concentraie i de pH, segsete sub form de monomeri, dimeri i hexameri, care au forma unorcristale romboedrice. Tendina la oligomerizare produce mici variaii alelanurilor laterale i ale lanului central, ca rezultat al constrngerilor pe care leimpune structura cuaternar structurii teriare, ns care nu influeneaz activ-itatea moleculei (3). Dei dup primele cercetri s-a crezut c insulina are ogreutate molecular mai mare (aprox. 12.000 daltoni), s-a constatat ulterior caceasta se datora oligomerizrii i c greutatea real este de 5.808 daltoni.

S-au constatat interesante asemnri structurale ale insulinei cu doua altepolipeptide i anume relaxina i bombyxina-II, ceea ce poate oferi ocazia unorspeculaii filogenetice. Relaxina este un hormon care intervine in travaliu (pro-duce o "relaxare" a simfizei pubiene), produce "acomodarea" uterului i influ-eneaz motilitatea spermatozoilor. Este format din dou polipeptide cu 24 deaminoacizi i are o structur teriara foarte asemantoare cu insulina.Bombyxina-II a fost descoperit la viermele de mtase (Bombyx mori) ca unpeptid de origine cerebral care produce reducerea concentraiei trehalozei(principalul glucid la aceast specie) n hemolimf i induce meioza in ovar.Similitudinea structural cu insulina este de 50% pentru lanul A i de 32%pentru lanul B i este primul polipeptid insulin-like descris la nevertebrate (4).

Structura primar a insulinei (anexa 1) a fost descris n 1955 de ctre F.Sanger (Premiul Nobel n 1959)(3).

Molecula de insulin este format din dou lanuri polipeptidice, lanul A acid(fig.2.2), format din 21 de aminoacizi i lanul B, bazic (fig.2.3), format din 30de aminoacizi.

Cele dou lanuri sunt unite prin dou puni disulfidice, Cis A 7 - Cis B 7 iCis A 20 - Cis B 19, iar lanul A mai are o punte disulfidic "intern" Cis A 6 -Cis A 11. Lanul A este o strucur aparent compact n jurul creia este nfu-rat lanul B. n tabelul 2.1 sunt redate diferenele n structura primar a insu-linei la mai multe mamifere.

Tabelul 2.1. Diferenele n structura primar a insulinei la mai multe mamifere.

8Monomerul de insulin este o structur globular cu un "nucleu" hidrofob io manta format n principal din aminoacizi polari ns avnd i dou zonehidrofobe care n cursul dimerizrii i hexamerizrii sunt acoperite.

Insulina folosit iniial era n stare amorf, pn n 1925 cnd Abel a reuitpentru prima dat cristalizarea insulinei, iar nou ani mai trziu Scott adescoperit faptul c cristalele romboedrice sunt complexe de Zn-insulin.Analiza cristalelor cu raze X s-a fcut iniial cu o rezoluie de 2,8 (Hodgkin1969) ajungndu-se apoi pn la 1,1 (1981). Hexamerul de insulin este for-mat din asamblarea a trei dimeri de insulin n jurul a doi ioni de Zn, situai lao distan de 17 , n direct relaie cu His B 10 din fiecare dimer.

Lanul A are dou regiuni anti-paralele care formeaz un alfa-helix imper-fect, stabilizate prin legtura disulfidic intern, iar cele dou extremiti,-COOH i NH2 sunt situate n acelai plan. Lanul B are de asemenea o con-formaie de alfa-helix, iar la nivelul glicinelor din poziiile B20 i B23 se producersucirea acestuia n sens invers ceea ce i confer aspectul literei V. Legturadisulfidic A7-B7 este situat la suprafaa moleculei, iar legtura A20-B19 faceparte din nucleul hidrofob (3).

La pH neutru i la concentraii fiziologice (aprox 1ng/ml) insulina este dis-tribuit sub form de monomeri (forma activ a hormonului), pentru ca la con-centraii mai mari s formeze dimeri, iar n prezena Zn s se producasocierea n hexameri. Formarea dimerilor este mediat de interaciunilehidrofobe dintre mai muli aminoacizi din lanul B, care formeaz i legturi dehidrogen cu aceiai regiune (B24-B26) din molecula vecin.

Conformaia monomerului de insulin poate avea variaii de la un cristal laaltul (Derewenda et al cit de 3) datorate n primul rnd captului NH2 al lanu-lui B. Acesta poate avea dou conformaii exterme, starea "T" n care acestcapt al lanului B este desfurat i starea "R" n care captul NH2 este oextensie a lanului B. Relevana acestor modificri conformaionale nu estenc clar (Nagawa i Tager 1991).

Analiza cristalografic a monomerului nativ de insulin este imposibildatorit faptului c la concentraii necesare formrii cristalelor insulina estentotdeauna dimerizat. Conformaia moleculei de insulin care se regsetepractic n toate cristalele, i deci i n circulaia sanguin, este cea din dimerulsimetric (molecula 2, conform conveniei din China, fa de molecula 1, dindimerul asimetric).

Hexamerul de insulin este toroidal i foarte stabil. Granulele secretoriimature din celulele -pancreatice conin arii dense de aprox 50 diametru, cuo conformaie asemntoare cu a cristalului hexameric de insulin. S-a propus

9astfel c hexamerul cu doi ioni de Zn este forma de depozitare a insulinei,aceast form rspunznd att criteriului de eficien a depozitrii i ferind nacelai timp insulina de aciunea enzimelor proteolitice (Blundell et al 1972).Studii ulterioare (prin rezonan magnetic nuclear) au demonstrat faptul chexamerul 2 Zn-insulin mai conine un locus, n centrul hexamerului, n careeste legat un ion de Ca, care are de asemenea un efect stabilizator.

Fenolul este folosit ca i conservant n preparatele comerciale de insulin(0,2%) i poate uneori s transforme cristalele romboedrice n structuri mono-ciclice (prin "desfurarea" lanurilor B).

La concentraii de 10 ori mai mari ale Zn dect cele necesare cristalizriiinsulinei i cnd n locul fosfatului se folosete acetatul ca soluie tampon, pro-dusul devine insolubil la pH de 7,4. Cu aceast tehnologie au fost produsedou insuline cu efect prelungit, insulina "Ultralente", forma cristalin i cuefect mai ndelungat i insulina "Semilente", forma amorf cu un efect maiscurt.

Amestecarea insulinei cu protamina, n prezena Zn, fenolului sau meta-cre-zolului produce un precipitat. Acest precipitat a fost realizat pentru prima datde ctre Hagedorn i colaboratorii la Copenhaga n ncercrile de a prelungiefectul insulinei administrat subcutan. Ei au constatat c acest precipitat,obinut prin titrare, are o solubilitate minim la pH-ul fiziologic i faptul c ncursul titrrii se produce un moment n care proporia este cea potrivit, pecare Hagedorn l-a numit "izofan". Analiza chimic ulterioar a acestui precipitatarat o proporie de doi ioni de Zn i 22 de molecule de fenol per hexamer i omolecul de protamin la 8,5 monomeri de insulin (Derewnda et al, 1989).

Bibliografie

1.Edlund H. - "Factors controlling pancreatic cell differentiation and func-tion", Diabetologia, 44: 1071-1079, 2001.

2.Klppel G., Gepts W., In't Veld P.A. - "Morphology of the pancreas in nor-mal and diabetic states" in "International Textbook of Diabetes Mellitus", edsK.G.M.M. Alberti, R.A. DeFronzo, H. Keen and P. Zimmet, John Wiley & SonsLtd.: 223-259, 1998.

3.Insulin. Monomers, dimers and hexamers. Principles of proteins structureusing the internet. www.bbk.ac.uk/PPS2/index.htm. Accesat in 15.01.2003.

4.Ying-Yin Cheng - Structure/Function Relationship of Insulin and RelatedHormones. www.chem.uwec.edu/Chem406/Webpages/Ying/page1. htm.Accesat in 15.01.2003.

10

3. FIZIOLOGIA SECREIEI I ACIUNII INSULINEI

3.1. Elemente de embriogenez i morfopatologie a pancreasului endocrin

Studiul morfologiei macro- i apoi microscopice a pancreasului a fost o pre-ocupare a anatomitilor mult nainte de a se face vreo legtur ntre acesta idiabetul zaharat. Spre exemplu, au trecut zeci de secole de la descrierile pan-creasului fcute de ctre "coala hippocratic" i pn la descrierea "diabetu-lui pancreatic" de ctre von Mehring i Minkowski i au trecut mai mult de 50de ani de la descoperirea insulelor, care-i poart numele, de ctre PaulLangerhans, pn la recunoaterea rolului lor n secreia endocrin a pan-creasului. Oarecum la fel, dei embriogeneza pancreasului era relativ binecunoscut, primele cercetri datnd din 60, progresele fcute n ultimul dece-niu n genetic ncep abia acum s dezvluie mecanismele moleculare alediferenierii, proliferrii, dezvoltrii funciilor specifice i supravieuirii celulelorpancreatice. Dei ar putea s par ca innd de domeniul cercetrii zise fun-damentale, i deci avnd un interes "limitat" pentru practicieni, pe cunoatereaacestor mecanisme se bazeaz conceptul de "plasticitate" a pancreasului, cuimportante implicaii etio-patogenetice i terapeutice.

La ora actual eforturile cercettorilor sunt concentrate n direciaidentificrii (1):

- celulelor stem i a celulelor progenitoare pancreatice, capabile deauto-regenerare i de difereniere specific;

- semnalelor care genereaz proliferarea anumitor celule progenitoarepancreatice specifice;

- semnalelor de "instruire" care induc diferenierea celulelor stem i/sau acelulelor progenitoare n celule -pancreatice, capabile s secrete n modfiziologic insulina.

Embriogeneza pancreasului ncepe n sptmnile 4-5 prin formarea celordoi muguri pancreatici, ventral i dorsal, din celulele endodermale ale epiteliu-lui intestinului primitiv (2). n spt. a 7-a se produce fuziunea celor doi muguri,care vor forma capul i, respectiv, corpul i coada pancreasului. Din spt. 8-9pot fi identificate deja toate cele patru tipuri de celule endocrine (dispersate inereunite nc n insule Langerhans), iar din spt. 10-12 sunt prezente i struc-turile acinare exocrine (cu granule de zimogeni). Semnalele de iniiere a "pro-gramului pancreatic" au ca int reprimarea unei familii de gene (hh) respon-sabile de dezvoltarea intestinului. Aceste semnale sunt activina- B i factorulde cretere a fibroblatilor (FGF) secretate de ctre notocord, cel puin pentrumugurele dorsal (1). n tranziia de la endoderm la structurile pancreatice inter-vin mai muli factori de transcripie, dintre care doar o parte sunt cunoscui(pdx-1, p-48, pax-4, pax-6, beta 2, Nkx 2.2, Nkx 6.1) (3) (fig. 3.1)

11

Fig 3.1. Factorii de transcripie care intervin n formareastructurilor pancreatice (3).

Fig. 3.1 Etapele diferenierii celulelor pancreatice (p48, pax6, ipf1/pdx1,Nkx2.2, Nkx6.1 = factori de transcripie, E = ziua de via embrionar, P1 =prima zi post-natal) (3,4)

O parte dintre factorii de transcripie intervin i n dezvoltarea sistemului ner-vos, ntre acetia i mugurii pancreatici, fiind o strns relaie de vecintate nprimele faze ale embriogenezei (3) Exist i alte similariti ntre embriogenezacelulelor pancreatice endocrine i neurogenez (2, 4). De altfel, n evoluia filo-genetic, peptide nrudite cu insulina se gsesc n neuronii gigani ai sistemu-lui nervos al nevertebratelor i sunt implicate n procesul de cretere, pentruca apoi aceste peptide s fie prezente n celule endocrine dispersate n canalulalimentar, iar insulele Langerhans s apar abia la vertebratele primitive (2).Unele caracteristici electrofiziologice ale celulelor mature mai sunt prezentedoar la nivelul neuronilor (Dean P.M., Matthews E.K., 1970, cit de 2).

Factorul de transcripie Ipf1/Pdx1 (insulin promoter factor1/pancreatic duo-denal homeobox factor 1) este necesar i ulterior, pentru a menine fenotipulcaracteristic celulei , (printre altele, secreia de insulin i expresia trans-portorului de glucoza GLUT 2). Este de menionat faptul c n patru dintre celecinci tipuri de diabet zaharat de maturitate cu debut la tineri (MODY), sub-stratul genetic corespunde unor factori de transcripie i, de asemenea, maimuli factori de transcripie par a fi implicai n patogeneza diabetului zaharattip 2 (5).

12

Aa-zisa "plasticitate" a pancreasului endocrin se definete ca fiind capaci-tatea acestuia de a-i adapta masa de celule n vederea asigurrii home-ostaziei glicemice optime (6). Aceast caracteristic a fost observat att ncondiii fiziologice (sarcina), ct i patologice (obezitate, diabet) i ea se rea-lizeaz printr-un echilibru dinamic ntre creterea masei de celule (prin repli-care i neogenez) i scderea ei (n principal prin apoptoz). Fig. 3.2.

Fig. 3.2. Mecanismele prin care se realizeaz plasticitatea imeninerea masei de celule -pancreatice.

Aa cum se vede din figura de mai sus, masa de celule existent la unmoment dat este heterogen din punct de vedere al capacitii de dife-reniere/proliferare. Masa de celule senescente, dei i-a pierdut capacitateade difereniere, continu s fie funcionala pentru o lung perioad, chiar dacla parametri diferii de celulele tinere.

Al doilea grup major de mecanisme, cu efect determinant asupramasei/funciei-celulare, sunt cele responsabile de moartea celular. Aceastase produce prin apoptoza i/sau necroz.

Necroza este rezultatul unei disfuncii celulare acute, care duce la creterearapid a volumului celulei, ruperea membranei celuare i dispersarea n spa-iul extracelular a coninutului acesteia, fiind afectate astfel i celulele vecine igenernd un efect chemotactic pentru celulele proinflamatoare (7). Acestproces morfopatologic este caracteristic tipului 1 de diabet, autoimun, i esteparalel cu ceea ce a fost descris de ctre Gepts W n 1965 ca i insulit, adic

13

infiltrarea limfocitar a insulelor Langerhans i cu prezena marker-ilor circu-lani ai agresiunii autoimune ndreptat mpotriva antigenelor celulelor.Intensitatea procesului de distrucie a celulelor este variabil, el fiind aproapecomplet la un an de la debutul diabetului, atunci cnd debutul se producenainte de pubertate, i mult mai atenuat cnd debutul se produce dup vr-sta de 20 de ani. Exist deci o heterogenitate a susceptibilitii celulelor laagresiunea inflamator/imun, produs de factori (inductori sau protectori) carear putea fi manipulai n scop terapeutic (7).

Apoptoza (moartea celular "programat") este un proces mult maicomplex, activ, implicnd un consum energetic i care este dirijat de sem-nale/receptori specifici, bine conservai n evoluia filogenetic. Morfologic con-st n condensarea cromatinei nucleare, reducerea volumului celulei i for-marea corpilor apoptotici care sunt apoi fagocitai, prevenindu-se astfeldispersarea coninutului celulei n interstiiu i deci amorsarea unui rspunsinflamator/imun (8). Dac necroza este un proces caracteristic diabetuluizaharat tip 1 autoimun, apoptoza este mecanismul principal prin care seproduce reducerea masei de celule n diabetul zaharat tip 1 i - foarteprobabil - i n diabetul zaharat tip 2 (7, 8) (fig 3.3).

Fig 3.3. Mecanisme de inducere a apoptozei celulelor pancreatice.(Chandra J et al, Diabetes, 50, 2001)

n tabelul 3.1 sunt redai civa dintre inductorii apoptozei -celulare iefectorii acestora

14

Tabelul 3.1. Inductori ai apoptozei celulelor i efectorii acestora (7, 8)

Un alt mecanism care poate influena masa de celule [masa de celule =volumul relativ al celulelor (% din pancreas) x masa pancreasului] existentla un moment dat este hipertrofia acestora, indus de diveri stimuli. Ea poatefi tranzitorie i ar putea fi deci un mod mai "economicos" de adaptare pentruc n acest caz "plasticitatea" nu implic replicarea/neogeneza i apoptoza (6).

Pe lng mecanismele mai sus descrise, masa i funcia celulelor suntinfluenate i de mai muli factori hormonali i metabolici. (tabelul 3.2).

Tabelul 3.2. Factori hormonali i metabolici care inhib saustimuleaz masa/funcia celulelor (9).

15

(Abrevieri: AGL= acizi grai liberi, IL-1= interleukina 1, IFN- =interferon-,IGF-I, IGF-II=factorii de cretere insulin-like I,II, GH= hormonul de cretere,PRL= prolactina, PL= hormonul lactogen placentar, TGF= transforming growthfactor, HB-EGF= proteina factor de cretere epidermal-like, care leag hepari-na, aFGF= factorul de cretere fibroblastic acid, VEGF= factorul de creterevascular endotelial, PDGF= factorul de cretere derivat din trombocite, HGF=factorul de cretere hepatocitar/scatter factor, GLP-1= polipeptidul glucagon-like 1, GIP= polipeptidul gastroinhibitor, IAPP= polipeptidul insular amiloidic(amilina), CCK= colecistokinina, NGF= factorul de cretere nervoas, NT-3=neurotrofina-3, Pref-1= factorul preadipocitar 1, FA-1= antigenul fetal 1, PSP=proteina calculilor pancreatici, PTP= proteina pancreatic filiform.)

Insulele Langerhans, la adult, sunt n numr de aprox. 1 milion (reprezen-tnd 3% din masa total a pancreasului), conin aprox. 3000 de celuleendocrine fiecare, au un diametru mediu de 140 m i sunt distribuite printreacinii exocrini, fiind mai dense la nivelul cozii pancreasului i mult mai rare nporiunea posterioar a regiunii cefalice (care este bogat n celule PP iprovine embriologic din mugurele pancreatic ventral) (2,10). Au un "miez" for-mat din celule (70-80 % din masa de celule endocrine) i o "manta" formatdin celulele A (care secret glucagon i constituie 15-20% din masa endo-crina), celulele D (secret somatostatina i au o proporie relativ de 5-10%) icelulele PP (secret polipeptidul pancreatic i au o proporie relativ de15-25%) (2). Aceast arhitectur a insulelor precum i vascularizaia de tipportal a acestora, n care celulele sunt dispuse n amonte, iar celelalte celuleendocrine i acinii exocrini n aval, constituie suportul morfologic al relaiilor detip paracrin ntre acestea i anume, efectul trofic al insulinei asupra acinilorexocrini i supresia secreiei de glucagon de ctre insulin (ceea ce explicatrofia pancreasului exocrin i lipsa supresiei secreiei de glucagon n diabetultip 1) (3).

Tabelul 3.3. Principalele caracteristici morfo-funcionale ale celulelorpancreasului endocrin (2, 10).

16

Din punct de vedere al morfopatologiei "clasice", modificrile pancreasuluin diabetul zaharat tip 1 pot fi considerate ca avnd puine elemente caracte-ristice. "Insulita", adic infiltrarea limfo-monocitar a insulelor Langerhans(observat nc de ctre von Mehring), este un proces distribuit neuniform, peaceiai seciune putnd chiar s lipseasc sau s fie prezent doar n uneleinsule (de obicei aparinnd aceluiai lobul exocrin) (11). La un an de la debu-tul diabetului tip1 se pot constata insule n care celulele lipsesc complet (naprox 70% dintre insule), insule cu populaia de celule intact i insule cu infil-tratul limfo-monocitar. Se mai pot observa o moderat atrofie a pancreasuluiexocrin i uneori o moderat fibroz interstiial, ambele fiind nespecifice iinconstante. Progresele importante s-au fcut ns n ultimele dou decenii iau fost datorate studiilor de imunohistochimie (12,13) care au relevat faptul ccelulele (nu i celulele A, D i PP) ale pacienilor cu diabet tip 1 exprim lasuprafaa lor molecule din clasa II a complexului major de histocompatibilitateHLA (98% dintre aceti pacieni au alelele DR3 i/sau DR4), dei acestea nusunt prezente n mod normal la suprafaa celulelor endocrine. Aceast modifi-care transform celulele n celule care pot prezenta autoantigeni sauautoantigeni modificai limfocitelor T-helper autoreactive (care, secretnddiverse citokine, activeaz prin mecanisme paracrine macrofagele ilimfocitele T citotoxice), devenind astfel inte ale unui proces de agresiuneautoimun prin inducerea apoptozei sau a necrozei acestora. Aceleai modi-ficri, dar de intensitate mai redus au fost descrise i n diabetul autoimun cudebut tardiv (LADA) (2).

n ceea ce privete morfopatologia pancreasului n diabetul zaharat tip 2,variaiile cantitative privind numrul, volumul i coninutul n granule secretoriiale celulelor endocrine, constatate n diverse studii, nu pot fi considerate ca icaracteristice, probele studiate provenind de la loturi inomogene ca vrst,vechime a diabetului, indice de mas corporal. Relativ caracteristic estens aa zisa "amiloidoza" insular (remarcat de Opie E.L n 1900), datoratdepunerii extracelulare, strict limitat la nivelul insulelor care conin celule , aunui material amorf care s-a dovedit a fi format dintr-un polipeptid fibrilar de-numit "polipeptidul insular amiloid" sau "amilina". Acest polipeptid este prezenti n granulele secretorii ale celulelor i face parte din familia calcitoninei

Proporia

17

(care mai include polipeptidul nrudit cu gena calcitoninei, CGRP iadrenomedulina) (14, 15, 16). Dac ntre cantitatea de amilin insular i vr-sta pacienilor cu diabet zaharat tip 2 s-a constatat o relaie direct proporio-nal, mai puin clare sunt relaiile cu vechimea diabetului i severitatea aces-tuia (2). Cel puin n studii experimentale, s-a constatat faptul c depunerea de amilineste uniform i severitatea ei se coreleaz invers cu masa de celule , i (17).

3.2. Biosinteza insulinei

Biosinteza insulinei se desfoar dup modelul de acum destul de binecunoscut al sintezei hormonilor polipeptidici. De altfel, celula dispune deorganitele specifice acestui scop i anume un reticul endoplasmic rugos abun-dent i granule secretorii. Semnalul inductor (glucoza), acionnd la nivelulregiunii promotoare a genei proinsulinei, situat pe braul lung al cromozomu-lui 11, iniiaz sinteza de ARN mesager i transcripia preproinsulinei (un pro-hormon cu 110 aminoacizi), care apoi este translatat la nivelul reticululuiendoplasmic rugos i scindat n proinsulin. Aceasta la rndul ei, este trans-portat n aparatul Golgi, care are un mediu bogat n Zn i Ca i unde seformeaz granulele de secreie imature. n interiorul acestor granule proinsuli-na este scindat, de ctre endopeptidazele legate de membran, n produi descindare succesiv (proinsulin scindat la nivelul aminoacizilor 65,66 i proin-sulin scindat la nivelul aminoacizilor 32,33, din care apoi sunt ndeprtaiaminoacizii adiaceni locului de scindare), pentru ca n final s rmn insuli-na i peptidul C (conecting peptide) (fig 3.4).

Fig. 3.4. Procesarea proinsulineiGranulele care conin cristale de insulin (hexameri avnd n centru un atom

Lanul A

C

C

Lanul A

Lanul B

Lanul B

18

de Zn) sunt numite granule mature. Cristalizarea hexameric a insulinei areprobabil scopul de a stabiliza moleculele i de a stopa aciunea peptidazelor.Aceste granule pot rmne n compartimentul de depozitare a insulinei, pot fiabsorbite n granule mai mari unde insulina este degradat prin crinofagie, sausecretate prin exocitoz. ntreg acest proces de biosintez dureaz aproxdou ore (din care 5-10 min revin transcripiei i scindrii preproinsulinei nproinsulin, 30 min formrii granulelor secretorii imature i aprox. 60 min.scindrii proinsulinei n insulin i peptid C).

Pragul de concentraie al glucozei care stimuleaz sinteza proinsulinei, estemai mic dect cel necesar secreiei insulinei, ceea ce, n condiii fiziologice,previne depleia complet de insulin a celulelor (18). Stimularea sintezei deproinsulin de ctre glucoz i ali secretagogi depinde de capacitatea celulei de a genera ATP, iar cuplarea stimulului metabolic cu biosinteza este asigu-rat de creterea concentraiei intracelulare de K.

Studierea mutaiilor naturale i a celor induse artificial ale moleculei deinsulin au contribuit la elucidarea unor aspecte ale biosintezei i aciunii aces-teia (19). Au fost identificate cteva familii n care unii membrii aveau o mutaiepunctiform n gena insulinei, ceea ce genera molecule de insulin modificateca structur primar (Val-A3 era nlocuit cu Leu, Phe-B24 nlocuit cu Ser iPhe-B25 nlocuit cu Leu), care au o imunoreactivitate practic identic cuinsulina normal, ns cu o capacitate de legare de receptori mult redus.Indivizii cu aceast mutaie, transmis autosomal dominant, au forme uoarede diabet sau scdere a toleranei la glucoz. Fiind heterozigoi, aceti pacienisecret i molecule normale de insulin ns au o hiperinsulinemie evidentdatorit remanenei prelungite n circulaie a moleculelor de insulin anormal.A fost de asemenea descris la membrii ctorva familii cu hiperproinsulinemieasimptomatic o mutaie n molecula de proinsulin (Arg-65 nlocuit cu His)care altereaz procesarea intra -celular a acesteia (nerecunoaterea locu-lui de clivare a lanului A de peptidul C).

3.3. Secreia insulinei

Procesul de biosintez a insulinei se ncheie cu formarea granulelor secre-torii mature care conin insulina biologic activ. Fiecare celul conineaproximativ 13,000 de granule secretorii (20). Calea principal de eliberare ainsulinei din celulele n spaiul interstiial este exocitoza Ca2+-dependent agranulelor secretorii. Studii efectuate n ultimul deceniu au reuit s descifrezemai multe dintre complexele evenimente ale procesului pre- i post-exocitoticn celulele endocrine (21).

Stimulul fiziologic al secreiei de insulin, glucoza, produce la concentraii ndomeniul normalului, oscilaii ale potenialului de membran ntre platouri dedepolarizare (peste care se suprapun secvene de poteniale de aciune) iintervale inactive de repolarizare (22), care sunt consecina unor oscilaii ale

19

concentraiei intracelulare a Ca2+ i care se materializeaz n secreia pulsato-rie a insulinei. Activitatea electric a celulelor este liniar dependent de con-centraia glucozei i atunci cnd aceasta depete aprox 360 mg/dl descr-carea potenialelor de aciune devine practic continu.

La nivelul membranei celulelor au fost identificate cel puin 10-20 de tipuride canale ionice dintre care cele mai importante n secreia insulinei suntcanalele de K+-ATP dependente i canalele de Ca2+ dependente de voltaj.Canalele de K+-ATP dependente sunt spontan deschise la concentraii mici aleglucozei i prin efluxul ionilor pozitivi de K+ se menine electronegativitateaintracelular caracteristic potenialului de repaus. Ptrunderea glucozei ncelulele , prin intermediul transortorilor GLUT 2 i apoi glicoliza genereazcreterea concentraiei de ATP (i scderea celei de ADP) ceea ce are ca oprim consecin nchiderea canalelor de K+-ATP dependente scderea elec-tronegativitii intracelulare, deschiderea canalelor de Ca2+ dependente devoltaj i influxul ionilor de Ca2+ i declanarea depolarizrii. ATP-ul acioneazca i un blocant al canalelor de K+ n timp ce Mg-ADP produce deschidereaacestora. Celula depolarizat mai poate rspunde i la ali stimuli electro-genici cum este arginina care are o molecul puternic electropozitiv i careare un efect minor asupra secreiei de insulina la concentraii mici aleglucozei ns acest efect devine major la concetraii mari ale glucozei, atuncicnd canalele de K+ sunt complet nchise (23) (fig 3.5)

Fig 3.5. Modificrile electrofiziologice produse de stimulareacelulei . (23)

20

Canalul de K+ (inwardly - rectifying potassium channel) este format din patrusubuniti i exist dou tipuri de astfel de canale: Kir 6.1 i Kir 6.2. Primul esteprezent n celulele musculare netede vasculare i n astrocite i are caracte-ristici diferite fa de cel de al doilea, care este prezent n majoritatea celulelor.Fiecare canal de K+-ATP dependent este asociat cu un receptor pentru sul-fonilureice (SUR), structur polipeptidic complex care face parte din familiatransportorilor numii "caseta care leag ATP "(ATP binding casette ABC). (fig3.6)

Fig. 3.6. Topologia membranar a Kir6.2 i SUR1 (23).

S-au descris dou tipuri de astfel de receptori: SUR1, prezeni n celulele i pancreatice, n celulele intestinale care secret GLP-1 i n neuroni, iSUR2, cu dou subtipuri SUR2A, prezeni n musculatura scheletic i car-diac, i SUR2B n celulele musculare netede.

Grodsky i col au demonstrat cu mai mult de 30 de ani n urm(Endocrinolgy, 1968) faptul c secreia de insulin se desfoar bifazic, cu oprim faz de secreie rapid (care dureaz 5-10 min), urmat de o faz desecreie mai lent ns susinut n timp (cteva ore). Faza rapid de secreiepoate fi indus, alturi de glucoz, i de ali stimuli cum sunt sulfonilureicele,ns pentru faza de secreie lent este necesar un stimul metabolic (exglucoza, aminoacizi).

Msurarea capacitantei membranei celulare (direct proporional cu

Legarea / hidroliza nucleotidelor

21

suprafaa acesteia) este metoda care a permis monitorizarea cu o foarte bunrezoluie temporal (aprox 1 ms) a dinamicii traficului granulelor secretorii (24).Alipirea membranei granulelor secretorii de membrana celular i deschidereaporului de secreie produce o cretere a suprafeei acesteia din urm i astfelo modificare a capacitanei care poate fi nregistrat.

O familie de proteine denumite SNAP (soluble NSF attachement protein,NSF= N-ethylmaleimide sensitive fusion protein), este implicat n fuziuneamembranelor. Cele mai importante dintre acestea sunt syntaxina i SNAP-25,aparinnd membranei celulare i synaptobrevina, care ine de membranagranulelor secretorii. Acestea produc fuziunea membranelor dup modelulunui fermoar (22). Aceste proteine, alturi probabil de proteine din familiasynaptotagminelor ar putea juca rolul de senzori pentru ionii de Ca2+. Un altgrup de proteine care leag GTP, proteinele Rab, au de asemenea un rolimportant n secreie, acionnd ca i "frne" ale acestui proces (25). n condiiiexperimentale lipsa acestor proteine produce scderea toleranei la glucoz.

Din punct de vedere funcional dar i spaial pool-ul de granule secretoriieste format din mai multe compartimente. Imediat sub membrana celular suntsituate granulele care constituie compartimentul gata pregtit pentru secreie(readly-releasable pool). Aceste granule pot fi secretate imediat, fr nici opregtire (priming) prealabil. Un al doilea compartiment cuprinde granulesituate n apropierea primului (la o distan de aprox un diametru al granulelor)care pentru a putea fi secretate necesit "pregtire". n timp ce secreia gra-nulelor din primul compartiment nu necesit consum energetic, exocitoza celordin al doilea compartiment este ATP-dependent (22). Proteinele SNARE nuintervin numai n fuziunea membranelor, ci ele au i importantul rol de adireciona influxul de ioni de Ca2+ spre zonele membranei plasmatice vecine cugranulele secretorii.

Dup golirea, prin stimulare, a compartimentului "gata pentru secreie"capacitatea de secreie se restabilete treptat pe parcursul a aprox 1,5 minnecesare reumplerii acestuia din compartimentul imediat vecin (22). Un altreilea compartiment este format din granulele secretorii situate n citoplasmi care parcurg traseul spre membrana celular prin micri saltatorii sau prindifuziune lent, prin reeaua microtubular, n care un rol major l au kinesi-nele ATP-dependente. n condiii experimentale, distrugerea reelei microtubu-lare cu vincristin produce o reducere cu peste 50% a secreiei de insulinindus de glucoz (26). Aceast reducere se coreleaz cu o scdere cu 85%a micarilor saltatorii ale granulelor (22).

Reglarea metabolic a secreiei insulinei de ctre glucoz este mediat demodificrile n concentraia K+ n spaiul sub-membranar. Modificrile concen-traiei ADP i ATP "pregtesc" granulele pentru secreie prin modificarea pH-ului intragranular. Odat produs exocitoza membranele granulelor secretoriisunt endocitate printr-un proces mediat de clathrin.

Relevana pentru diabet a proceselor mai sus sumarizate este intens eva-

22

luat la ora actual. Perturbri n glicoliza sau n metabolismul oxidativ arputea induce modificri ale concentraiei dinamice a ADP i ATP. Polimorfismulgenelor care codific canalele de Ca2+ sau alte proteine care particip la exo-citoz ar putea fi diabetogen. Polimorfismul unei singure nucleotide din genacare codifica syntaxina s-a dovedit a se asocia cu vrsta de debut i necesarulde insulin la pacienii cu diabet tip 2 (27). Nu n ultimul rnd, acizii grai liberi,a cror concentraie n sngele portal este crescut la pacienii cu diabet i/sauobezitate i/sau sindrom metabolic, exercit de asemenea efecte complexeasupra secreiei de insulin. Prezena unui aport de acizi grai liberi estenecesar pentru secreia normal a insulinei. O cretere rapid a concentraieiacestora amplific secreia de insulin indus de glucoz, prin creterea con-centraiei de acil-CoA i stimularea unor enzime care intervin n exocitoz.Expunerea cronic la concentraii crescute de acizi grai liberi produce acelaiefect, dar prin intermediul obezitii se reduce efectul stimulator al glucozei.Creterea concentraiei de c-AMP are efect incretinic prin stimularea, vialipaza hormono-sensibil din celulele , a lipolizei (28).

3.4. Mecanismele de aciune ale insulinei

3.4.1. Aspecte generale

Insulina este un hormon cu o ndelungat ontogenez, n cursul creia s-au"rafinat" efecte metabolice multiple asupra majoritii celulelor. n urm cu maimult de o jumtate de secol Levine i Col (cit de 29) au emis ipoteza conformcreia insulina i exercit efectul principal, cel asupra glicemiei, prin facilitareatransportului glucozei prin membrana celular, ipotez confirmat n 1971 prindescoperirea de ctre Roth i Col a receptorilor insulinei. Ulterior au fostdescrise i unele dintre etapele post-receptor ale aciunii insulinei i n primulrnd fosforilarea resturilor tirozinice a mai multor proteine citozolice, printrecare familia de proteine denumite "substratul receptorului de insulin" (cel maibine cunoscut este insulin receptor substrate-1), principalul generator de sem-nale intracelulare, precum i efectul de stimulare a sintezei unui alt mediatorintracelular major, fosfatidilinozitolul 3-fosfat. Au rmas ns, din pcate, eveni-mente produse de aciunea intracelular a insulinei incomplet cunoscute i deasemenea i relevana lor pentru etio-patogeneza i tratamentul diabetului.

3.4.2. Receptorii pentru insulin

Receptorii pentru insulin sunt structuri polipeptidice complexe care segsesc practic n toate esuturile vertebratelor, numrul lor pe suprafaa uneicelule variind ntre 40 n cazul eritrocitelor circulante i 200.000 n cazuladipocitelor i al hepatocitelor (30). Gena acestor receptori este localizat pe

23

braul scurt al cromozomului 19 (19p13).Precursorii receptorilor (proreceptor) sunt clivai post-translaional n dou

subuniti, i , care se dimerizeaz i care n drumul lor spre membranacelular sunt glicate i acilate. Receptorul matur este un heterotetramer 2-2.Subunitile sunt situate extracelular i conin locul de legare a insulinei, napropierea captului NH-terminal. Subunitile sunt legate de subunitile prin puni disulfidice noncovalente i traverseaz membrana celular, pori-unea intracelular coninnd resturi tirozinice fosforilate distribuite n trei regiu-ni importante: regiunea juxtamembranar, domeniul catalitic i locul de fosfo-rilare COOH-terminal (fig. 3.7).

Fig 3.7. Receptorul de insulin. (30)

Receptorul pentru insulin face parte dintr-o familie care mai include recep-torul pentru IGF-1 i aa-numitul insulin receptor-related receptor (IRR), unreceptor "orfan" pentru care nu s-a identificat nc un ligand. Omologia struc-turii de aminoacizi n aceast familie este de 80%.

Subunitatea a receptorului n stare liber exercit un efect inhibitor asuprakinazelor din zona intracelular. Fiecare subunitate are dou locuri de legarea insulinei, care odat fixat produce modificri conformaionale ale celor dousubuniti. Regiunea transmembranar a receptorului are, se pare, rolul de a

Subunitile a

S

24

stabiliza modificrile conformaionale ale subunitilor a, induse de legareainsulinei. Legarea insulinei i modificrile conformaionale ale subunitilor ainduc activarea tirozin kinazelor, ceea ce produce autofosforilarea resturilortirozinice ale subunitilor intracelulare (30). Autofosforilarea resturilortirozinice din regiunea intramembranar a subunitii este absolut necesarpentru legarea domeniului fosfo-tirozinic al proteinelor din substratul recep-torului de insulin (IRS). Autofosforilarea resturilor tirozinice din zona catalitic(aa-numita "regulatory loop") crete de 10-20 de ori activitatea kinazelor.Mutaiile din aceast serie duc la pierderea activitii biologice a receptorului in final la insulinorezisten sever. Secvena aminoacizilor din aceast zonare similitudini cu cea a altor receptori cum sunt cei pentru IGF-1, IL-4.

Regiunea COOH-terminal a subunitii are funcii mai puin bine cunos-cute i pare a fi implicat n activitatea mitogen a receptorului (29).

Efectul major al legrii insulinei de receptorii specifici const n facilitareatransportului transmembranar al glucozei. Acest efect este prezent ns numain musculatura scheletic, n adipocite i la nivelul miocardului. Pe de altparte ns, insulina stimuleaz sinteza proteic n toate celulele, acionnd lanivelul genelor specifice i favoriznd preluarea aminoacizilor i sinteza lipide-lor n esutul adipos, ficat i musculatura scheletic i inhib lipoproteinlipazahormonosensibil. Insulina inhib gluconeogeneza la nivelul ficatului irinichilor i stimuleaz transportul transmembranar al ionilor i sinteza de ADNn practic toate esuturile (fig. 3.8).

Fig 3.8. Efectele insulinei la nivelul esuturilor periferice (29).

25

3.4.3. Cile de semnalizare postreceptor

Multitudinea de efecte produse de insulin n diverse celule poate fi expli-cat prin activarea unor ci diferite de semnalizare post-receptor (mesagerisecundari) (29). Dou dintre aceste ci sunt mai bine cunoscute: calea recep-tor de insulin/fosfatidilinozitol-3-kinaza (IRS/PI 3-K) i calea Ras/proteinki-naza mitogen activat (MAPK).

Substratul receptorului pentru insulin (IRS-1) este cel mai bine caracterizatmesager secundar. Face parte dintr-o familie de proteine care include patrumembri (IRS 1-4), care au n comun trei secvene: domeniul omolog cu pleck-strina, domeniul legrii fosfotirozinei i domeniul legrii ansei regulatoare.

El acioneaz ca i substrat i pentru alte sisteme de receptori cum sunt ceipentru familia IL 6 (hormonul de cretere, omostatina), IL 2 (IL 2, IL 4, IL 9, IL13 i IL 15) i pentru interferoni (IFN a/ i IFN ?) (30). IRS conine cel puin 8locuri de fosforilare a tiroizinei i cel puin 30 de locuri de fosforilare pentruserin/treonin.

IRS-1 poate exercita, paradoxal, un efect inhibitor asupra receptorului deinsulin, producnd insulinoreziseten. Astfel de forme de IRS-1 au fostextrase numai din adipocite i din celulele musculare striate (sediile insuli-norezistenei clinice!). Factorul de necroz tumoral (TNF ) induce insuli-norezisten prin efectul inhibitor asupra activitii tirozinkinazice a receptoru-lui de insulin i a IRS-1 (31).

Calea IRS/PI 3-K genereaz PI 3-K, apoi activeaz alte kinaze fosfatidili-nozitol dependente, printre care proteinkinaza C (PKC) i, n continuare, altekinaze cum este serin/treonin (AKT kinaza)(produs al protoomogenei AKT)care la rndul ei acioneaz asupra glicogen sintetazei (GSK-3). PKC poatepoate fi activat i de diacilglicerol i ea activeaz la rndul ei MAPK i pro-duce transcripia factorului NF-KB care induce sinteza de proteine.

Calea Ras/MAPK este implicat n efectul proliferator i de cretere al insu-linei. n fig. 3.9 este redat schematic modul de producere al specificitii aciu-nii insulinei, iar n fig. 3.10 sunt prezentate cele dou ci majore de sem-nalizare post-receptor.

26

Fig 3.9. Efectele tisulare specifice ale insulinei (29)

Fig 3.10. Activarea cilor de semnalizare intracelular dectre insulin (29)

Specificitatea aciunii insulinei

Receptorulde insulin

Numrul de receptori de suprafa

27

3.4.4. Cile alternative de semnalizare

n afara modului de aciune via receptorii specifici i substratul receptoruluipentru insulin (IRS), insulina poate produce efecte directe i asupra altorproteine membranare sau citosolice. Astfel pp120 este o glicoproteinhepatospecific care regleaz reciclarea receptorilor pentru insulin (29).Receptorul pentru hormonul de cretere care leag proteine i insulin (GRB-IR) produce, sub aciunea insulinei, o atenuare a rspunsului la stimularea pecalea clasic. Existena acestor ci diferite de semnalizare argumenteaz deasemenea diversitatea aciunilor insulinei n diferite esuturi.

3.4.5. Transportorii de glucoz

Funcia major a insulinei, aceea de a facilita transportul transmembranar iintracelular de glucoz, se exercit prin intermediul unor proteine complexeataate mambranelor celulare i membranelor organitelor celulare numitetransportori de glucoz (GLUT). Familia de proteine GLUT are opt membri.Prototipul folosit pentru descrierea acestor proteine este GLUT 4. Acesta esteun lan polipeptidic cu 12 domenii transmembranare. Prima ans extracelularconine locurile de glicare, iar captul COOH-terminal, intracelular, conine situlde fosforilare i o secven aminoacidic care faciliteaz endocitoza rapid atransportorului (29).

GLUT 1 este prezent ubiquitar i este implicat n transportul transmembra-nar al glucozei n condiii bazale, independent de insulin. n cele mai multecelule, aceast cale este singura prin care se produce influxul de glucoz.

GLUT 2 este exprimat mai ales de ctre celulele pancreatice i hepatocite.El asigur un flux transmembranar constant de glucoz la glicemii fiziologicei la nivelul celulelor asigur cuplarea stimulului glicemic cu secreia deinsulin.

GLUT 3 este prezent mai ales la nivelul sistemului nervos central i avndo afinitate mare pentru glucoz asigur eficiena maxim pentru captareaglucozei la acest nivel.

GLUT 4 este majoritar n celulele insulinosensibile, adipocite, celulelemusculare netede i miocite. El este depozitat n organite specifice, veziculeleGLUT 4. Stimulul insulinic produce translocarea din aceste locuri de depo-zitare spre membrana celular (32). Veziculele GLUT 4 parcurg patru etapeevolutive: "nmugurirea", fisiunea, "ancorarea" i fuziunea cu membranacelular (fig. 3.11).

28

Fig. 3.11. Formarea veziculelor de GLUT 4 (29)

Mai multe proteine (mai ales din familia SNAP) regleaz aceste procese, unrol important revenind i PI-3 kinazei.

GLUT 5 este transportorul pentru fructoz i este prezent n celulelemembranei epiteliale ale intestinului subire i n rinichi.

GLUT 6 este incomplet descris. GLUT 7 este transportorul de glucoz la nivelul microzomilor. GLUT 8 este modulat de insulin, ns cu funcii incomplet cunoscute.

3.4.6. Efectele metabolice ale aciunii insulinei

Insulina, ca i principalul hormon anabolizant, produce efecte asupra tutu-ror verigilor metabolismului intermediar, detalierea acestora depind inteniileacestui paragraf.

3.4.6.1. Efectele asupra metabolismului proteicPrimele observaii sistematice privind aciunea insulinei aupra metabolis-

mului proteic (ca i asupra corpilor cetonici) pot fi considerate ca fiind fcutede N. Paulescu. n articolul publicat n Arch. Int. Phisiol. n 31 mai 1921 (cit de

29

33) este redat evoluia concentraiei urinare de glucoz i uree la cinele pan-createctomizat dup administrarea extractului pancreatic. Mai trziu, n 1933,Aschley DW i col comunic n J. Clin. Invest. observaiile privind pozitivareabilanului azotat la pacieni odat cu iniierea tratamentului cu insulin (cit de34). Insulina, administrat n doze suprafiziologice, produce o reducere cupn 30% a proteolizei, rezultnd astfel o reducere a concentraiei plasmaticei intracelulare a aminoacizilor. Prezena aminoacizilor eseniali este absolutnecesar pentru realizarea acestui efect al insulinei. n condiii fiziologice,dup un prnz mixt, secreia prandial de insulin produce o cretere cu10-20% a sintezei proteice. Insulina are deci att un efect de reducere a pro-teolizei, ct i de cretere a sintezei proteice. La nivelul ficatului, insulinacrete viteza de sintez a albuminei o scade pe cea a fibrinogenului, aantitrombinei III i a apolipoproteinei B-100 (34). ntr-un studiu efectuat de AsuCJ i col (35) s-a constatat c dup expunerea la insulin, din 150 de tipuri demARN hepatocitare evaluate, la 11 s-a produs o cretere a concentraiei, la 2concentraia a sczut, iar restul au rmas nemodificate. n afara acestuimecanism de aciune, insulina poate modula i aciunea unor factori de iniierea sintezei proteice cum sunt IF-2 (initiation factor 2) i GEF (guaninenucleotide exchange factor).

3.4.6.2. Efectele asupra metabolismului proteicUnul dintre cele mai importante efecte ale insulinei este cel asupra sintezei

glicogenului, forma sub care este stocat glucoza la regnul animal. Sinteza glico-genului este doar una dintre etapele complexe ale metabolismului hidrailor decarbon, care mai include glicoliza, oxidarea piruvatului de ctre sistemul piruvat-dehidrogenazei, ciclul acizilor tricarboxilici, ciclul pentozo-fosfat, gluconeogenezai glicogenoliza. Pe lng rolul major al acestor cicluri metabolice n generareaenergiei, glicoliza produce spre exemplu, la nivelul eritrocitelor, 2,3-difosfoglicer-at, influennd astfel legarea oxigenului la acest nivel, iar n hepatocite metabo-lismul hidrailor de carbon are ca i produs "secundar" glicerolul, necesar sintezeitrigliceridelor (36).

Glicogenul este un polimer intens ramificat al a-D-glucopiranozei, care segsete n primul rnd n hepatocite i celulele musculare scheletice, sub formaunor granule de mrimi diferite, extramitocondrial. Glicogenina este miezul prote-ic al glicogenului i are propreti enzimatice.

Locul major de aciune al insulinei, n sinteza glicogenului, este asupra kinazei-3 glicogen sintazei (GSK-3), care catalizeaz fosforilarea glicogen sintazei n maimulte locuri. Insulina activeaz AKT kinaza, pe o cale dependent de PI-3 kinaz(29). Este posibil s existe i alte sedii de aciune ale insulinei n glicogenez, cumeste componenta proteic a glicogenului, glicogenina. Fosforilarea glicogen sin-tazei produce inactivarea acesteia; ea poate fi produs de mai multe kinaze. Pede alt parte, hormoni glicogenolitici, cum este adrenalina, pot produce fosfori-larea glicogen sintazei prin creterea concentraiei de kinaze cAMP-dependente.

30

3.4.6.3. Efectele asupra metabolismului proteicInsulina are i importante efecte asupra metabolismului lipidelor, n primul

rnd prin efectul ei antilipolitic prin inhibarea lipoproteinlipazei hormonosensi-bile. Aceste efect se produce prin inactivarea protein-kinazei cAMP-depen-dente de ctre fosfodiesteraza inhibat de GMP (cGI-PDE)(29). i n acest cazhormonii de contrareglare i produc efectul prin creterea concentraiei decAMP. Aa cum am amintit mai sus, insulina moduleaz i sinteza apolipopro-teinei B, ns are efecte i asupra receptorilor pentru LDL, crescnd activitateaacestora i implicit catabolismul LDL (37).

3.4.6.4. Efectele asupra metabolismului proteicUn efect de asemenea major al insulinei este cel asupra cetogenezei.

Cetogeneza, surs energetic n condiii de inaniie, este suprimat odat cureducerea ofertei de substrat care sunt acizii grai liberi cu lan lung, produin exces ca urmare a lipolizei. n condiii de insulino-deficien, cetogenezaeste consecina diminurii efectului antilipolitic al insulinei i a exacerbrii efec-tului lipolitic al hormonilor de contrareglare (38).

3.4.6.5. Efectele asupra metabolismului proteicTransportul transmembranar al ionilor este de asemenea modulat de

insulin, la nivelul tuturor celulelor. Efectele sunt complexe, ea stimulnd pe deo parte influxul ionilor de Na+ i efluxul celor de H+, i pe de alt partefavoriznd efluxul Na+ i influxul de K+ (39).

Bibliografie

1. Edlund H. - "Factors controlling pancreatic cell differentiation and fun-ction", Diabetologia, 44: 1071-1079, 2001.

2. Klppel G., Gepts W., In't Veld P.A. - "Morphology of the pancreas innormal and diabetic states" in "International Textbook of Diabetes Mellitus" edsK.G.M.M. Alberti, R.A. DeFronzo, H. Keen and P. Zimmet, John Wiley & SonsLtd.: 223-259, 1998.

3. Weir C.G., Bonner-Weir S., Sharma A. - "Regulation of insulin secre-tion and islet cell function" in " Atlas of Diabetes" ed Kahn R.C., Science PressLtd, London: 2-9, 2000.

4. Edlund H. - "Developmental biology of the pancreas", Diabetes 50,suppl 1: S5-S9, 2001.

5. Macfarlane W.M., Frayling T.M., Ellard S., et al - "Missens mutations inthe insulin promoter factor-1 gene predispose to type 2 diabetes", J. Clin.Invest. 104: R33-R39, 1999.

6. Bonner-Weir S. - " - cell turnover. Its assessement and implications",Diabetes 50, suppl 1: S20-S24. 2001

7. Chandra J., Zhivotovsky B., Zaitsev S. et al. - "Role of apoptosis in

31

pancreatic -cell death in diabetes", Diabetes 50, suppl 1: S44-S47.8. Mandrup-Poulsen T., - " - Cell apoptosis. Stimuli and signaling",

Diabetes 50, suppl 1: S58-S63, 2001 9. Nielsen J.H., Galsgaard E.D., Mldrup A., Friedrichsen N.B., et al -

"Regulation of -cell mass by hormones and growth factors", Diabetes 50,suppl 1, S25-S29: 2001.

10. Bishop E.A., Polak J.M. - "The anatomy, organization and ultrastruc-ture of the islets of Langerhans", in "Textbook of Diabetes" eds Pickup J.,Gareth W., Blackwell Scientific Publications:57-71, 1990.

11. Foulis A.K., Liddle C.N., Farquharson M.A. et al - "The Histopatologyof the pancreas in Type 1 (insulin-dependent) diabetes mellitus: a 25-yearreview of deaths in patients under 20 years of age in the United Kingdom",Diabetologia, 29: 267-274, 1986.

12. Bottazzo G.F., Pujol-Borrell R., Hanafusa T., Feldman M. - "Role ofaberrant HLA-DR expression and antigen presentation in induction ofendocrine autoimmunity", Lancet, 11: 1115-1118, 1983.

13. Foulis A.K., Farquharson M.A., Hardman R. - "Aberrant expression ofClass II major histocompatibility comp;lex molecules by cells and hyperexpresionof Class I major histocompatibility complex molecules by insulin containing islets inType 1 (insulin-dependent) diabetes mellitus", Diabetologia, 30: 333-343, 1987.

14. Westermark P., Wilander E., Westermark G.T., Johnson K.H. - "Isletamiloid polipeptid (IAPP)-like immunoreactivity in the islet -cells of type-2 dia-betic individuals", Diabetologia, 30: 887-892, 1987.

15. Johnson K.H., O'Brien T.D., Betsholtz C., Westermark P. - "Islet amy-loid, islet-amyloid polypeptide, and diabetes mellitus", New Engl J Med, 321:513-518, 1989.

16. Gebre-Medhin S., Olofsson C., Mulder H. - "Islet amyloid polypeptidein the islets of Langerhans: friend or foe?" Diabetologia, 43: 687-695, 2000.

17. Wang F., Hull L.R., Vidal J. et al - "Islet amyloid develops diffuselythroughout the pancreas before becoming severe and replacing endocrinecells", Diabetes, 50: 2514-2520, 2001.

18. Malaisse W. J. - "Insulin biosynthesis and secretion in vitro" in"International Textbook of Diabetes Mellitus" eds K.G.M.M. Alberti, R.A.DeFronzo, H. Keen and P. Zimmet, John Wiley & Sons Ltd.: 261-283, 1998.

19. Pratley RE, Weyer C - The role of impaired insulin secretion in thepathogenesis of type II diabetes mellitus. Diabetologia, 44: 929- 945, 2001.

20. Dean PM - Ultrastructural morphometry of the pancreatic -cell.Diabetologia, 9, 115-119, 1973.

21. Steyer JA, Horstmann H, Almers W - Transport, docking and exocytosisof single secretory granules in live chromaffin cells. Nature, 388: 474 478, 1997.

22. Rorsman P, Renstrom E - Insulin granule dynamics in pancreatic betacells. Diabetologia, 46: 1029-1045, 2003.

23. Gribble FM, Reinman F - Sulphonylurea action revisited: the post-

32

cloning era. Diabetologia, 46: 875-891, 2003.24. Neher E, Marty A - Discrete changes in cell membrane capacitance

observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal cromaffinecells. Proc Natl Acad Sci USA, 79: 6712-6716, 1982.

25. Regazzi R, Ravazzola M, Iezzi M et al - Expression, localization andfunctional role of small GTPase Rab3 family in insulin-secreting cells. J Cell Sci,109: 2265-2273, 1996.

26. Bertrand G, Ishyiama N, Nenquin M et al - The elevation in glutamatecontent and the amplification of insulin secretion in glucose-stimulated pancre-atic islets are not causally related. J Biol Chem, 277: 32883-32891, 2002.

27. Tsunoda K, Snake T, Nakagawa T et al - Single nucleotide polymorfism(D68D, T to C) in the syntaxin 1A gene correlates with age at onset and insulinrequierment in type II diabetic patients, Diabetologia, 44: 2092-2097, 2001.

28. Yaney CG, Corkey BE - Fatty acid metabolism and insulin secretion inpancreatic beta cells. Diabetologia, 46: 1297-1312, 2003.

29. Accili D, Kanno H - The mechanisms of insulin action. In " Atlas ofDiabetes" ed Kahn R.C., Science Press Ltd, London: 17-28, 2000.

30. White MF - The insulin signalling system and IRS proteins.Diabetologia, 40: S2-S17, 1997.

31. Hotamisligil GS, Budavari A, Donovan A et al - Inhibition of insulinreceptor signaling by TNF a-induced phosphorylation of IRS-1: a novel mecha-nistic model for insulin resistance. Science: 665-668, 1996.

32. Kahn BB, Cushman SW - Subcellular translocation of glucose trans-porters: role of insulin action and its perturbation in altered metabolic states.Diabetes/Metab Rev, 1: 203-206, 1985.

33. Ionescu-Tirgoviste C - Insulina. Descoperirea medicala a secoluluiapartine romnului N Paulescu. Ed Geneze, Bucuresti, 1996.

34. Volpi E, De Feo P - Effeti dell`insulina sul metabolismo proteiconell`uomo. Il Diabete, 6: 2-19, 1994.

35. Hsu CJ, Kimball SR, Antonetti DA, Jefferson LS - Effects of insulin ontotal RNA, poly (A)+RNA and mRNA in primary cultures of rat hepatocytes. AmJ Physiol, 249: E1106-E1112, 1992.

36. Seifter S, Englard S - Carbohydrate metabolism. In "Ellenberg andRifkin`s Diabetes Mellitus. Theory and Practice", Rifkin H, Porte D eds, 4-th ed,Elsevier, New-York, Amsterdam, London: 1-40, 1990.

37. Mazzone T, Foster D, Chait A - In vivo stimulation of low density lipopro-tein degradation by insulin. Diabetes, 33: 333-338, 1984.

38. Walker M, Alberti KGMM - Insulin action in vivo: Its role in the regula-tion of ketone body metabolism. In "International Textbook of Diabetes Mellitus"eds K.G.M.M. Alberti, R.A. DeFronzo, H. Keen and P. Zimmet, John Wiley &Sons Ltd.: 459-466, 1998.

39. Kahn CR - New concepts in the patogenesis of dabetes mellitus. AdvIntern Med, 41: 285-321, 1996.

33

4. GLUCAGONUL, SOMATOSTATINA I AMILINA

Avnd n vedere importantele corelaii funcionale ale acestor hormoni cuinsulina, am considerat ca oportun o prezentare concis a acestui subiect. ncazul polipeptidului pancreatic (PP) secretat de celulele PP ale pancreasuluiendocrin i de celulele intestinale i care are variaii circadiene legate dealimentaie nu s-au descris deocamdat relaii semnificative cu secreia deinsulin.

4.1. Glucagonul

Glucagonul este un polipeptid relativ mic, cu dimensiuni apropiate de celeale insulinei, avnd 29 de aminoacizi. A fost izolat, purificat, descris i dozat laintervale apropiate de insulin. O caracteristic important a acestui hormoneste o neobinuit conservare filogenetic a structurii lui primare (1).Glucagonul provine dintr-un preprehormon a crui gen se gsete n celuleleA din pancreas i din intestinul subire (fig 4.1), prin procesarea cruia seformeaz i GRPP (glucagon-related polypeptide), oxintomodulina (uninhibitor al secreiei gastrice) i GLP-1 i 2 (glucagon-like peptide).

Fig 4.1. Procesarea diferit a proglucagonului n pancreas iintestinul subire (8).

34

GLP-1 s-a dovedit a avea un important efect asupra secreiei de insulin(stimuleaz att biosinteza ct i secreia insulinei), un efect inhibitor asupraevacurii gastrice i asupra secreiei de glucagon, efecte pe care se bazeazutilizarea terapeutic n diabetul tip 1 i 2. GLP-1 este produs i la nivelul sis-temului nervos central, iar administrarea lui intraventricular are un efectinhibitor asupra apetitului i aportului de ap (2).

Efectul glucagonului se produce asupra unor receptori specifici careactiveaz adenilat-ciclaza i cresc astfel concentraia intracelular de cAMP.La nivelul ficatului produce inhibarea sintezei de glicogen i stimuleazglicogenoliza i neoglucogeneza, crescnd astfel producia hepatic de glu-coz. La nivelul adipocitelor stimuleaz lipoliza i implicit crete cetogenezahepatic (3). Eliberarea de glucagon este produs de diveri stimuli:hipoglicemia, scderea concentraiei de acizi grai liberi, creterea concen-traiei unor aminoacizi, descrcri adrenergice i vagale, stress-ul,nfometarea i unele medicamente (furosemid, L-dopa, clonidina).

4.2. Somatostatina

Somatostatina (somatotropin release inhibiting factor- SRIF) este secretatde celulele D ale pancreasului endocrin, celulele intestinale i unii neuroni.Efectele somatostatinei sunt foarte diverse, majoritatea inhibitorii. Ea reducedrastic secreia de insulin i glucagon, inhib secreia mai multor hormoniintestinali (ex. gastrina, motilina), inhib secreia i aciunea hormonului soma-totrop, poate induce senzaia de saietate, toate acestea (cu excepia efectuluiinhibitor asupra secreiei insulinei) putndu-i conferi un rol terapeutic n diabet(4). Administrarea de somatostatin s-a dovedit a atenua fenomenul "dawn" lapacienii cu diabet tip 1, ns exacerbeaz hipoglicemia la cei cu diabet tip 2.

4.3. Amilina

Amilina (sau polipeptidul amiloidic insular) este constituentul major alamiloidozei fibrilare care se constat n pancreasul pacienilor cu diabet tip 2i este n acelai timp o component normal a celulelor , fiind co-secretatmpreun cu insulina (5). Are o evident omologie structural cu calcitoningene-related peptide, un neuropeptid produs de celulele C ale tiroidei (6).Polimerizarea moleculelor de amilin duce la formarea fibrilelor de amiloid. ntabelul 4.1 sunt redate cteva dintre efectele amilinei.

35

Tabelul 4.1. Efectele amilinei.

Acumularea progresiv a fibrilelor de amiloid la pacienii cu diabet zaharattip 2 ar putea contribui la deteriorarea funciei celulelor . Prevenirea depo-zitrii amiloidului insular ar putea fi una din abordrile terapeutice de viitor.

4.4. Factorii de cretere insulin-like

Factorii de cretere insulin-like 1 i 2 (IGF 1 i 2) au n primul rnd un efectmajor asupra proliferrii i diferenierii celulare, dar i importante efecte meta-bolice, asemntoare insulinei. ntre IGF 1 i 2 exist o coresponden de 65%n ceea ce privete secvena aminoacidic i dei ambele molecule suntmonocatenare, ele seamn cu molecula de insulin prin prezena a trei punidisulfidice i prin faptul c pot fi identificate domeniile A, B i C (corespunz-tor peptidului C). Factorii de cretere insulin-like se caracterizeaz printr-odeosebit stabilitate structural filogenetic, fiind prezeni i la nevertebrate,iar IGF-1 are o structur primar identic la porcine i bovine. Receptorii pen-tru IGF sunt ubiquitari, iar ntre receptorul pentru IGF-1 i cel pentru insulinexist o evident asemnare structural.

Efectele biologice IGF-1 pot fi defalcate n efecte pe termen scurt, insulin-like i efecte pe termen lung, de inducere a proliferrii i diferenierii celulare.La concentraii mari, insulina acioneaz i asupra receptorului IGF-1. S-auconstatat asocieri posibile ntre IGF-1 i complicaiile micro- i macrovasculareale diabetului zaharat i exist studii care au evaluat eficiena acestuia n trata-mentul insulinorezistenei de tip A (7).

Bibliografie

1.Bromer WW - Chemical characteristics of glucagon. In Glucagon,Lefebvre PJ ed, Springer, Berlin: 1-22, 1983.

2.Drucker DJ - Glucagon-like peptides. Diabetes, 47: 159-169, 1998.3.Lefebvre PJ - Biosyntesis, secretion and action of glucagon. In

36

"International Textbook of Diabetes Mellitus" eds K.G.M.M. Alberti, R.A.DeFronzo, H. Keen and P. Zimmet, John Wiley & Sons Ltd.: 383-389, 1998.

4.Gerich JE, - Role of growth hormone in diabetes mellitus. N Engl J Med,310: 848-850, 1984.

5.Hartter E, Svoboda T, Ludvik B et al - Basal and stimulated plasma levelof pancreatic amylin indicate its co-secretion with insulin in humans.Diabetologia, 34: 52-54, 1991.

6.Molina JM, Cooper GJS, Leighton B, Olefsky JM - Induction of insulinresistance in vivo by amylin and calcitonin gene-related peptide. Diabetes, 39:260-265, 1990.

7.Frystyk J, rskov H - IGF-I, IGF-II and IGF-binding proteins and diabetes. In"International Textbook of Diabetes Mellitus" eds K.G.M.M. Alberti, R.A.DeFronzo, H. Keen and P. Zimmet, John Wiley & Sons Ltd.: 417-436, 1998.

8.Bottazzo G.F., Pujol-Borrell R., Hanafusa T., Feldman M. - "Role of abe-rrant HLA-DR expression and antigen presentation in induction of endocrineautoimmunity", Lancet, 11: 1115-1118, 1983.

9.46. Bronfeldt KE, Gidlof RA, Wasteson A et al - Binding and biologicaleffects of insulin, insulin analogues and insulin-like growth factors in rat aorticsmooth muscle cells. Comparison of maximal growth promoting activities.Diabetologia, 34: 307-313, 1991.

37

5. FIZIOPATOLOGIA CLINIC A INSULINO-DEFICIENEI

Prototipul strilor de insulino-deficien este diabetul zaharat tip 1 (DZ 1), cumanifestarea lui extrem ceto-acidoza diabetic. n DZ 1 insulino-deficiena seproduce prin distrucia progresiv, printr-un complex mecanism imunologic, acelulelor pancreatice. Dei debutul clinic al acestui tip de diabet are, de multeori, aspectul acut, el se produce abia atunci cnd peste 80-90% din masa decelule a fost distrus, pe parcursul a mai multor luni sau ani n care se des-foar faza preclinic, asimptomatic. Fa de acest punct de vedere "clasic",exist n ultimii ani date experimentale care se cer confirmate i susin oevoluie mult mai rapid a procesului de distrucie a celulelor ntr-o perioadcare precede cu puin debutul clinic (1).

Predispoziia genetic pentru DZ 1 este dovedit la ora actual (cu toate cla 85% dintre pacieni nu se pot evidenia antecedente familiale), iar implicaiamajor revine genelor antigenelor leucocitare umane (HLA)(Fig. 5.1).

Fig. 5.1. Regiunea HLA localizat pe braul scurt al cromozomului 6. (1)

S-au identificat cel puin nc 20 de locusuri crora li se poate atribui 50-70% din transmiterea predispoziiei (2). n ceea ce privete complexul majorde histocompatibilitate (HLA, studiile epidemiologice au relevat existena aaziselor gene de susceptibilitate (care cresc sau modific riscul) i a genelor"protectoare". 95% dintre pacienii cu DZ 1 sunt pozitivi pentru HLA-DR3 i/sauDR4 n timp ce n populaia general acest genotip este prezent doar la 40%.

38

ntr-un studiu efectuat n ara noastr pe 204 familii (756 membri) frecvenapacienilor cu DZ 1 pozitivi pentru HLA-DR3 i/sau DR4 a fost de 90%, iar lamembrii lor de familie neafectai de DZ 1 a fost de 70% (3).

n mod obinuit celulele nu exprim moleculele HLA din clasa II, ns elesunt prezente la declanarea procesului patologic. Moleculele din clasa II suntexprimate de celulele care prezint antigeni limfocitelor T, cum suntmacrofagele i celulele dendritice. Este foarte probabil c polimorfismul geneiDQ A1 i DQ B1 poate induce modificri n secvena aminoacidic a lanului al HLA din clasa II, ceea ce modific capacitatea lor de a accepta i prezentaautoantigeni derivai din celulele (4). Agresiunea autoimun este substratula ceea ce, din punct de vedere morfopatologic, a fost descris ca "insulit",adic prezena infiltratului inflamator limfocitar la nivelul insulelor pancreatice,imediat dup debutul diabetului. La 1 an dup debut, insulita este rar prezen-t, ns se constat necroza difuz a celulelor i atrofia consecutiv ainsulelor, dispersarea celulelor i i, rar, insule regenerate din epiteliul duc-tal (1). n ultimele decenii, au fost identificai mai muli autoanticorpi, dintre carecel mai bine descrii sunt anticorpii antiinsulari citoplasmatici (ICA), autoanticor-pii antiinsulari de suprafa, autoanticorpi anti decarboxilaza acidului glutamic(GAD) i autoanticorpii antiinsulin (IAA). n tabelul 5.1 este redat frecvena cucare se deceleaz anticorpii anti-GAD n diferite forme de diabet (1).

Tabelul 5.1. Frecvena prezenei anticorpilor anti GAD

Mecanismul patogenetic prin care se realizeaz distrucia celulelor estecomplex i include participarea mai multor citokine i mai ales a factorului denecroz tumoral a (TNF ) i a interleukinei 1 (IL-1) secretate de macrofagei a unor ageni citotoxici, cum sunt radicalii liberi de oxigen (inclusiv deficitulde antioxidani) i oxidul nitric. Exist modele patogenice imune n care suntincluse i virusuri, substane chimice, proteine bacteriene i animale.

Implicaiile metabolice complexe ale insulinei fac ca i consecinele insuli-nodeficienei s fie la fel de complexe, interesnd practic toate etapelemetabolismului intermediar i energetic. Modul n care se manifest

39

consecinele fiziopatologice ale insulinodeficienei depinde de rapiditateainstalrii i durata acesteia.

Deficitul absolut (n DZ tip 1) sau relativ (n DZ tip 2) de insulin producedezechilibre metabolice acute a cror caracteristic comun este "criza hiper-glicemic" i care se manifest sub forma cetoacidozei diabetice i/sau subforma strii hiperglicemice hiperosmolare. Aceste dezechilibre grave sunt pre-cipitate cel mai frecvent de: subdozarea sau omisia tratamentului cu insulin,infecii, debutul diabetului i evenimente vasculare (coronariene, cerebrale),care pe lng accentuarea deficitului de insulin produc i stimularea intensa secreiei hormonilor de contrareglare. Att n cetoacidoza diabetic, ct i nstarea hiperglicemic hiperosmolar, acest context hormonal produce "virajul"metabolismului spre o stare de catabolism intens tradus prin glicogenoliz,neoglucogenez, lipoliz, proteoliz i cetogenez. Dei nu ntru totul susi-nut de argumente concrete, cea mai plauzibil explicaie a lipsei cetogenezein starea hiperglicemic hiperosmolar este faptul c insulinosecreia, chiar iminim, este suficient pentru a menine inhibat lipoliza. La pacienii cucetoacidoz diabetic, valorile peptidului C s-au constatat a fi de 5-10 ori maimici dect la cei cu stri hiperglicemice hiperosmolare (5, 6).

n figura 5.2 este redat schematic patogeneza cetoacidozei diabetice i astrii hiperglicemice hiperosmolare.

40

Fig. 5.2. Patogeneza cetoacidozei diabetice i a strii hiperglicemice hiperosmolare (6).

Pe termen lung, consecinele insulinodeficienei i hiperglicemia consecu-tiv sunt foarte numeroase i sunt reunite sub denumirea de complicaii micro-("specifice") i macro-vasculare, comune att DZ tip 1, ct i DZ tip 2. Unul din-tre mecanismele majore n producerea acestor complicaii este glicareamacromoleculelor (7). Glicarea p