interrupción farmacológica del tráfico de los canales de calcio por el ligando α2δ, gabapentina
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Interrupción farmacológica del tráfico de los canales de calcio por el ligando α2δ, Gabapentina Jan Hendrich*, Alexandra Tran Van Minh*, Fay Heblich*, Manuela Nieto-Rostro*, Katrin Watschinger†, Jo rg Striessnig†, Jack Wratten*, Anthony Davies*, and Annette C. Dolphin*‡
*Laboratorio para la Neurociencia Celular y Molecular, Departamento de Farmacología, UniversityCollege London, Londres WC1E 6BT, Reino Unido; e†Institutfu¨rPharmazie, Abteilungfu¨rPharmakologieundToxikologie, Universita¨t Innsbruck, A-6020 Innsbruck, Austria.
Editado por Richard W. Tsien, Escuela de Medicina Universidad de Stanford , Stanford, CA, y aprobado en Enero 15, 2008 (recibido para revisión Septiembre 20, 2007)
El mecanismo de acción de los fármacos antiepilépticos y antinociceptivos de la familia gabapentinoide sigue siendo poco conocido. La gabapentina (GBP) se une a un epítopo exofacial de las subunidades auxiliares α2δ-1 y α2δ-2 de los canales de calcio dependientes de voltaje, sin embargo la inhibición aguda de las corrientes de calcio por GBP es muy baja o ausente. Formulamos la hipótesis de que GBP deteriora la capacidad de las subunidades α2δpara mejorar la densidad en la membrana plasmática de los canales de Ca2+ abiertos por voltaje a través de un efecto sobre el tráfico. Nuestros resultados demuestran de forma concluyente que GBP inhibe las corrientes de calcio, imitando una falta de α2δsólo cuando se aplica crónicamente, pero no agudamente, tanto en sistemas de expresión heteróloga como en neuronas ganglionares de la raíz dorsal. GBP actúa principalmente en una localización intracelular, lo que requiere su captación, debido a que el efecto de GBP aplicado crónicamente es bloqueado por un inhibidor de los transportadores de aminoácidos neutros del sistema-L y reforzado por coexpresión de un transportador. Sin embargo, está mediado por las subunidades α2δ, siendo impedido por mutaciones en ambos α2δ-1 ó α2δ-2 que suprimen la unión de GBP, lo que no se observa para α2δ-3, al cual no se une GBP. Por otra parte, el tráfico de los canals α2δ-2 y Cav2 se interrumpe tanto por GBP como por la mutación en α2δ-2, lo que impide la unión de GBP, encontrándose también que GBP reduce la expresión en la superficie celular de las subunidades α2δ-2 y Cav2.1. Nuestra evidencia indica que GBP puede actuar crónicamente mediante el desplazamiento de un ligando endógeno el cual es normalmente un modulador positivo de la función de la subunidad α2δ, afectando de esta manera la función de tráfico de las subunidades α2δa las que se une.
os canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VGCCs) son
complejos heteroméricos. Las subfamilias CaV1 y CaV2 se
componen de una subunidad α1 formadora del poro, asociada con una
subunidad α2δ anclada a membrana, predominantemente extracelular
(para revisar ver ref. 1) y una subunidad β intracelular (para revisar
ver ref. 2). Los genes de mamíferos que codifican las cuatro
subunidades α2δ han sido identificados (para revisar ver refs. 2 y 3).
La topología de la proteína α2δ se determinó primero para α2δ-1 y se
cree que generaliza a todas las subunidades α2δ (para revisar ver refs.
1 y 4). Ellas son proteínas transmembrana de tipo I, donde la
subunidad exofacial α2 está unida por un puente disulfuro a una
subunidad δ transmembrana, formado por la escisión post-
traduccional de la preproteína α2δ (5).
El mecanismo de acción de los fármacos antiepilépticos y
antinociceptivos de la familia gabapentinoide sigue siendo poco
conocido. La gabapentina (GBP) en sí fue desarrollada originalmente
como un análogo del ácido γ-amino-butírico (GABA), pero ahora se
cree que no tienen ningún efecto sobre los receptores GABA o
transportadores (para revisar ver ref. 6). La primera clave para
entender el mecanismo de acción de GBP vino de la purificación de la
proteína donde se une GBP de cerebro porcino (7), la cual se identificó
como la subunidad auxiliar α2δ-1 de VGCCs. Ahora se sabe que la
GBP se une a un epítopo exofacial presente tanto en las subunidades
α2δ-1 y α2δ-2 (para revisar, véanse las referencias. 1 y 8). Sin embargo,
a pesar de que originalmente se reportó que la aplicación de GBP re-
sulta en la inhibición aguda de las corrientes de calcio (9, 10), en la
mayoría de los estudios, la inhibición aguda por GBP es o bien muy menor
o ausente (para revisión ver ref. 1). Además, los estudios
electrofisiológicos de la transmisión sináptica son también equívocos, con
algunos estudios reportando inhibición por GBP (11), y otros estudios
reportando ninguna inhibición (12).
Cuando la liberación de neurotransmisores es medida, al parecer hay
poco o ningún efecto sobre la liberación cuando es estimulada por la
despolarización de varios neurotransmisores diferentes, a menos que se
haya mejorado la inhibición de la liberación por mediadores específicos
(13-15). En general, ninguno de estos estudios apunta al mecanismo de
acción siendo una simple inhibición de las corrientes de calcio.
Formulamos la hipótesis de que GBP deteriora la capacidad de las
subunidades α2δ para mejorar la densidad de la membrana plasmática de
VGCC, a través de un efecto sobre el tráfico. Esto estaría de acuerdo con
la conclusión de que la respuesta in vivo a las drogas gabapentinoides sea
bastante lenta al inicio (16), y que GBP no inhiba el dolor agudo (para
revisar ver refs. 6 y 17).
Resultados
La Inhibición de las corrientes de Cav2.1 y Cav2.2 por GBP es crónica
pero no aguda. Primero comparamos la habilidad de GBP para inhibir
las corrientes de calcio, ya sea de forma aguda, o cuando se le incluye
por 40 h en el medio de cultivo después de la transfección de células
tsA-201 con Cav2.1/β4 y α2δ-2. La incubación crónica con GBP (1 mM)
redujo las corrientes formadas con él WT α2δ-2 de 72.2 ± 4.2% a +15
mV (Fig. 1A). Además, mientras la coexpresión de las subunidades α2δ
normalmente desplaza la dependencia de voltaje del estado de
equilibrio de inactivación a potenciales más negativos (Fig. 1B), este
fue despolarizado por 9.3 mV en la presencia continua de GBP (Fig.
1B). En consecuencia, GBP crónica imitó una disminución en la
influencia de α2δ en las corrientes. Como confirmación, un efecto
similar de GBP crónica se observó cuando Cav2.1/β4 fue transfectado
en una línea celular estable que expresa α2δ-2, donde los peaks de
corrientes fueron 53.4 ± 14.0% más pequeños cuando las células
fueron cultivadas con 1 mM de GBP. [información de apoyo (SI) Fig.
5A]. Además, el estado de equilibrio de inactivación fue de nuevo
depolarizado en 11 mV por GBP (SI Fig. 5B), y las corrientes
mostraron significativas reducciones en la inactivación (Fig. 5C y D).
En contraste, cuando GBP fue aplicado ya sea de forma aguda por 10
min (Fig. 1C), o por 3-6 h antes del registro (n=8, datos no mostrados),
no tuvo efecto en IBa en el mismo sistema.
Author contributions: J.H. and A.T.V.M. contributed equally to this work; J.H., A.T.V.M.,
and A.C.D. designed research; J.H., A.T.V.M., F.H., J.W., and A.C.D. performed research; J.H.,
A.T.V.M., M.N.-R., K.W., J.S., and A.D. contributed new reagents/analytic tools; F.H. and
A.C.D. analyzed data; and A.C.D. wrote the paper.
The authors declare no conflict of interest.
This article is a PNAS Direct Submission.
Freely available online through the PNAS open access option.
‡To whom correspondence should be addressed at: Department of Pharmacology, Univer-
sity College London, Gower Street, London, WC1E 6BT, United Kingdom. E-mail:
This article contains supporting information online at www.pnas.org/cgi/content/full/
0708930105/DC1.
© 2008 by The National Academy of Sciences of the USA
3628 –3633 1 PNAS 1 March 4, 2008 1 vol. 105 1 no. 9 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0708930105
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Fig. 1. GBP es efectivo para inhibir IBa después de una expresión heteróloga, cuando es aplicado de manera crónica pero no aguda. (A) (izquierda) Relaciones densidad de corrientes-voltaje (IV) para corrientes de Cav2.1/β4/α2δ-2 en ausencia o presencia de GBP crónico (1 mM, círculos rojos, n=11) por ≈40 h (o H2O como control, cuadrados negros, n=13) de inmediato después de la transfección de células tsA-201 hasta que los registros fueron realizados. La reducción en los peaks de IBa fue estadísticamente significativa (P=0.0013 en un test t-Student). (derecha) Ejemplos de corrientes resultantes de pasos de pasos de potenciales desde -90 mV a entre -15 y +15 mV en incrementos de 5-mV, bajo condiciones control y en la presencia de GBP. Las barras de calibración se refieren a ambos conjuntos de trazas. (B) Datos del estado de equilibrio de inactivación obtenidos de células tratadas como se describió en A. GBP crónico (1 mM, círculos rojos, n=12) y control (círculos negros, n=13). El estado de equilibrio de inactivación en la ausencia de subunidades α2δ se entrega para comparación (línea discontinua, n=11). Los datos encajan en una única ecuación de Boltzmann. El V50, inact fue de 37.6 ± 2.1 mV en la presencia de α2δ-2, -30.8 ± 4.4 mV en la ausencia de α2δ (línea punteada), y -28.3 ± 2.7 mV en la presencia continua de GBP (P=0.0103 comparado con la ausencia de GBP, en un test t-student). (C) GBP (1 mM) aplicada de forma aguda por 10 min no tiene efecto en las corrientes de Cav2.1/β4/α2δ-2. Ejemplos de corrientes resultantes del paso de potenciales desde -90 mV a +10 mV, bajo condiciones control y después de la aplicación de GBP por 10 min, a una célula cuya amplitud inicial de corriente estaba estabilizada. Las corrientes son representativas de n=5 células, donde los peaks de corrientes (trazo rojo) después de la aplicación de GBP fueron 99.0 ± 7.1% de su valor inicial, antes de la aplicación de GBP (trazo negro). (D) Relaciones IV para las corrientes de Cav2.1/β4/α2δ-2 a partir de células cultivadas en ausencia o presencia de 100 µM de GBP aplicada crónicamente como se describe en A. GBP (círculos rojos, n=10) y control (cuadrados negros, n=14). La reducción en el peak IBa a +15 mV fue estadísticamente significativa (P=0.0215, en un test t-student). (E) El porcentaje de inhibición del peak de densidad de corriente por GBP (100 µM, barra roja rayada, n=10; y 1 mM, barra roja solida, n=11) fue determinada para cada experimento y comparada con la reducción observada en la ausencia de α2δ (barras gris, n=14). La significancia estadística de la reducción fue determinada respecto a los datos en la presencia de α2δ-2 y ausencia de GBP para cada set individual de experimentos; *, P=0.0013; **, P=0.021; ***, P=0.00004, en un test t-student. (F) (izquierda) Relaciones IV para las corrientes de Cav2.2/β1b/α2δ-1 en la ausencia o presencia de GBP crónico (1 mM, círculos rojos,=10) por ≈40 h o la cantidad equivalente de H2O como control (cuadrados negros, n=8). (derecha) Ejemplos de corrientes resultantes de pasos de potenciales desde -90 mV a entre -15 y +15 mV en incrementos de 5-mV, bajo condiciones control (trazos negros) y en la presencia de GBP (trazos rojos).
Una alta concentración de GBP fue usada inicialmente, porque
nuestra hipótesis requería que GBP fuera tomada ya sea por los
transportadores del sistema L y subsecuentemente se uniera a las
subunidades α2δ intracelulares y afectara el tráfico hacia adelante, o,
alternativamente, unirse directamente a las subunidades α2δ de la
superficie celular y afectar el tráfico a nivel de la endocitosis o el
reciclaje. Para ambos sitios, estará compitiendo con otros aminoácidos
neutros grandes presentes en el medio de cultivo, isoleucina y leucina
ambas presentes a 800 µM y valina presente a 400 µM. Sin embargo,
las concentraciones en el plasma de 70-120 µM de GBP son
clínicamente relevantes, y la aplicación crónica de 100 µM de GBP
también produce una reducción significativa de IBa, a 45.0 ± 9.9% (Fig.
1E y D). También disminuyo la inactivación de las corrientes,
nuevamente un sello distintivo de las corrientes de los canales de
calcio que no son influenciadas por α2δ (SI Fig. 6A y B). Ante la
presencia prolongada de GBP, la densidad de corriente de
Cav2.1/β4/α2δ-2 se aproximó a la observada en ausencia de las
subunidades α2δ (Fig. 1E).
El efecto crónico de GBP también fue observado en la presencia de
α2δ-1 porque 1 mM de GBP redujo los peaks de corrientes de
Cav2.1/β1b/α2δ-1 a 70.5 ± 7.3% (Fig. 1F), y depolarizó el punto medio
para el estado de equilibrio de inactivación de -55.5 ±3.4 mV a -39.7 ±
2.6 mV (n=4 para ambos, datos no mostrados). Estos resultados
también proveen evidencia de que GBP no es selectivo para un subtipo
en particular de composición de canal de Cav2.
Prevención del efecto crónico de GBP por mutación de α2δ-1 ó α2δ-2. La mutación de un único aminoácido, R217A, en una forma RRR en
α2δ-1, o el residuo equivalente R282A en α2δ-2, se ha descubierto que
es casi completamente capaz de suprimir la unión de GBP. Para
demostrar que el efecto crónico de GBP era en efecto debido a la unión
a las subunidades α2δ, nosotros examinamos si podía haber algún
efecto en las corrientes formadas por Cav2.1/β4 cotransfectados con
R282A-α2δ-2. La incubación crónica con GBP (1 mM) no inhibió estas
corrientes (Fig. 2A) o resultó en ningún cambio en el estado de
equilibrio de inactivación (Fig.2B). Además, no hubo efecto de GBP en
las corrientes formadas por Cav2.2/β1b/R217A-α2δ-1 (Fig. 2C), o
Cav2.1/β4/α2δ-3 (los peaks IBa fueron -286.58 ± 32.3 pA/pF a +15 mV
para el control, n=8; comparado con -258.7 ± 46.8 pA/pF para GBP
crónico, n=9). Estos resultados están de acuerdo con el hecho de que
ninguna de estas subunidades α2δ une GBP (datos no mostrados).
Evidencia para un sitio de acción intracelular de GBP. La potencia in
vivo de GBP ha mostrado depender tanto de unión a la subunidad α2δ
y en la actividad como sustrato de sistemas transportadores de L-
aminoácidos, atribuido a los requerimientos de drogas Zwitterionicas
para atravesar BHE. Para determinar si el efecto crónico de GBP
requiere su recaptura en un único nivel celular (como se ha esbozado
en la Fig.2D), hemos incluido el inhibidor 2-(-)-endoamino-
bicyloheptane-2-carboxylic acid (BCH) en el medio, tanto solo como
junto a GBP por 40 h. BCH tiene muy baja afinidad para en el
desplazamiento de la unión de GBP a las subunidades α2δ y α2δ-2, y
esto no tuvo efecto en la aplitud de IBa (Fig. 2E) cuando se aplica solo,
a una concentración 10 mM. El peak de densidad de corriente a +15
mV fue -330,2 ±84,7 pA/pF (n=7) para el control y -330,0 ± 73,2 pA/pF
(n=8) en presencia de BCH. Sin embargo, BCH crónico previno el
efecto de GBP crónico tanto reduciendo IBA expresado (Fig. 2E) y
depolarizando el estado estacionario de inactivación (datos no se
muestran). Este efecto de BCH es probablemente resultado de su
habilidad para bloquear la recaptura de GBP.
Para obtener más evidencia de que la recaptura de GBP es
necesaria para su efecto, usamos oocytos de Xenopus, que expresaran
solo a un bajo nivel de actividad del sistema de L-transportadores.
Encontramos que la incubación crónica con 200 µM de GBP sólo
disminuyó significativamente las corrientes de Cav2.2/β1b/α2δ-2 (en
un 57%, Fig. 2F) cuando la proteína LAT4 del sistema de L-
transportadores fue coexpresada. Expresión de LAT4 no tuvo efecto
significativo en el peak de Iba a +5mV, la cual fue -0,49 ±0,12 µA
(n=34) y -0,41 ±0,06 µA (n=41) en ausencia y presencia de LAT4 res-
Hendrich et al. PNAS 1 March 4, 2008 1 vol. 105 1 no. 9 1 3629
Fig. 2. El efecto de GBP requiere tanto unión a la subunidad α2δ como recaptura por un transportador de aminoácido neutro. (A) (Izquierda) Relación IV para corrientes de Cav2.1/β4/R282-α2δ-2 en ausencia o presencia de GBP crónica (1mM, círculos rojos, n=12) por 40 h o cantidad equivalente de H2O como control (cuadrados negros, n=12), desde transfección, inmediatamente hasta que los registros fueron realizados. (Derecha) Ejemplos de corrientes resultantes de potenciales desde -90 mV hasta (entre) -15 y +15 mV en incrementos de 5 mV bajo condiciones control y en presencia de 1 mM GBP. Barras de calibración refieren a ambos sets de señales. (D) Diagrama que ilustra algunos de varios sitios en los que GBP (círculos rojos) o el ligando putativo endógeno (círculos verdes) podría actuar en las subunidades α2δ. El efecto de GBP podría ser por desplazamiento de un ligando endógeno e impedir la habilidad de α2δ-1 y α2δ-2 de incrementar la concentración de VGCC en la membrana plasmática. De este modo, GBP ejercería su efecto en las subunidades α2δ intracelulares durante la maduración y el tráfico del complejo VGCC a la membrana y/o unir a subunidades α2δ superficiales, afectando el reciclaje desde la membrana plasmática. BCH es un inhibidor competitivo de del sistema L-transportador. (E) Relación IV para corrientes de Cav2.1/β4/ α2δ-2 tanto en condiciones control (cuadrados negros, n=8) y luego de tratamiento crónico con GBP (1mM), en ausencia (círculos rojos rellenos, n=7) o presencia (círculos rojos sin pintar, n=10) del inhibidor del sistema L-transportador, BCH (10 mM) aplicado crónicamente desde una hora antes que GBP. La reducción en el peak IBa por GBP sola a +10mV fue estadísticamente significativa comparando con el control. (F) IBa fue medido en oocytos de Xenopus luego de la inyección de cDNA para Cav2.2/qb/α2δ-2, junto con ya sea, cDNA control (Kir-2.1-AAA no conductor (Izquierda)) o con mLAT4 (derecha).
pectivamente, en 4 experimentos separados. También encontramos que la incubación crónica de oocytos por 40 h
en presencia de L-leucina (400 µM) aumentó significativamente Iba
solo cuando LAT4 fue coexpreseada (Fig. 2G). Más aun, L-leucina no
aumentó las pequeñas corrientes obtenidas en ausencia de α2δ, a
pesar de la presencia de LAT4 (Fig. 2G). Esto es compatible con la
idea de que un ligando endógeno de bajo peso molecular, como la
misma L-leucina, podría ocupar normalmente los sitios de unión de
GBP en α2δ y α2δ-2 y ser un modulador positivo requerido en la
funcionalidad total de las subunidades α2δ. La existencia de un
ligando endógeno fue previamente sugerida por la observación de que
la afinidad aparente por GBP aumenta en un factor de 5 a 10 ante
una diálisis o una purificación parcial de las subunidades α2δ.
De acuerdo con estas hipótesis, tanto para R217-α2δ-1 y R282A- α2δ-
2, el peak de corriente fue consistentemente más pequeño, comparado
con las subunidades α2δ WT, por 62,5% y 34,5% respectivamente (ver
también refs. 23 y 28). Sin embargo, fueron significativamente
mayores que en ausencia total de subunidades α2δ, donde IBa a +15mV
fue -33,9 ± 5,8 pA/pF para Cav2.2/β1b (n=9, P<0,05) y -65,1 ± 8,8
pA/pF para Cav2.1/β4 (n=13, de ref. 24). Esto es compatible con la
hipótesis de que las subunidades α2δ mutantes RRA son deficientes ya
sea en el tráfico frontal o en el mantenimiento de complejos VGCC
maduros en la membrana plasmática.
GBP crónica reduce la expresión de los canales de calcio en la
membrana plasmática. Para investigar más a fondo si GBP afecta el
tráfico de VGCC, hemos examinado a continuación la distribución
subcelular de las subunidades de VGCC, utilizando doble tag Cav2.1
con un hemaglutinina (HA) exofacial (Cav2.1-2HA, Fig. 3 CA). Bajo
condiciones de control, Cav2.1 y alfa2delta-2 fueron localizados, tanto
intracelularmente (Fig. 3A) y también en la membrana plasmática,
como se ve más claramente en las células no permeabilizadas (Fig.
3B).La expresión en la membrana plasmática en las células no
permeabilizadas se cuantificó a partir de imágenes de baja
magnificación, incluyendo los de la figura 3C, en el que la expresión de
la superficie celular se ve a través de toda la célula debido a la
profundidad de la sección óptica (4.5 µm para éstas imágenes) y
aplanado natural de las células. La incubación crónica con 100 µM y 1
mM de GBP redujo significativamente la expresión de ambos Cav2.1 y
alfa2delta-2 en la membrana plasmática (Fig. 3C) así como el
aumento de la agrupación intracelular no uniforme de las dos
subunidades (Fig. 3A).Un resultado similar se observó para
Cav2.2,que se expresa en todas las células transfectadas Cos-7,por lo
general muestran una distribución bastante uniforme (fig. SI.
7(29).Usando células permeabilizadas, encontramos que WT
alfa2delta-2 localizada con GFP-Cav2.2, tanto intracelularmente como
en la mebrana plasmática (SI fig 7Ai).La aplicación crónica de GBP
resultó en regiones de la agrupación intracelular en la mayoría de las
células, tanto para alfa2delta-2 y para GFP-Cav2.2 (SI fig 7Aii y iii),
cuantificado en la fig SI 7 B).
Para cuantificar aún más el efecto de GBP en las expresión de
alfa2delta2-2 en la membrana celular.Se utilizó biotinilización en la
membrana celular y se encontró que la incubación crónica con GBP( 100
µM y 1 mM), redujola proporción de alfa2delta-2 expresada en la
membrana celular(fig 3D).El procedimiento de biotinilación no induce la
permeabilización celular,y esto no se vio afectada por la incubación
crónica con GBP,Debido a que no se observó biotinilación de la proteína
intracelular Akt (fig.3D).
cDNA (nonconducting Kir2.1-AAA (30) (Left) or with mLAT4 (27) (Right).
Oocytes were incubated without (black bars) or with 200 µM GBP (red bars)
from 1 h after the time of injection until recording between 40 and 48 h later.
To combine data from several experiments, the mean peak control IBa at +5
mV was normalized and the effect of GBP determined relative to control. The
numbers of determinations are shown on the bars. Statistical significance: **,
P = 0.0042 for the effect of GBP in the mLAT4 condition only (two-way ANOVA
and Bonferroni’s post hoc test). (G) As in E, with the combinations of trans-
fected subunits indicated below the bars. Oocytes were incubated without
(black bars) or with (white bars) 400 µM L-leucine. The statistical significance
is P = 0.011 (*) for the effect of L-leucine in the mLAT4 condition and only in
the presence of a28-2.
3630 1 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0708930105 Hendrich et al.
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Fig. 3. Efecto de GBP crónica en la localización de Cav 2.1 y alfa 2delta-2 en la membrana plasmática en células Cos-7. (A) Cav2.1-2HA se cotransfectó con beta4 y alfa-2 delta-2 y se cultivaron durante 48hrs. Ya eea en ausencia o en presencia de GBP (100 µM y 1 mM).Las células fueron fijadas y permeabilizadas antes de la localizacion inmunocitoquímica de Cav 2.1(HA Ab,izq.) y alfa-2-delta-2 ( Ab, centro), utilizando una amplificación objetvo × 63. Imagenes fusionadas se muestran ( derecha),(Cav2.1 se muestran en verde y alfa-2-delta-2 en rojo, con las regiones de colocalización de color naranja-amarillo). Tincion nuclear (azul, DAPI)
se muestra en las imagenes fusionadas. (B) Las imágenes se obtuvieron como en A, pero las células no se permeabilizaron.La células transfectadas en cada imagen se identifican por una flecha, se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos
independientes (Barra Escala: 30 µm.) (C) (Izquierda). .) imagenes de celulas fusionadas no permeabilizadas tomadas con una ampliacion de objetivo ×20 para mostrar un mayor campo de visión para las células transfectadas como en A y se cultivaron durante 48hrs ya sea en presencia o ausencia de GBP( 100 µM y 1 mM). La seccion optica para estas imagenes es de 4,5 micras y como las celulas son aplanadas, la tincion se ve en la mayor parte de la membrana celular (derecha). La cuantificación de la intensidad de la fluorescencia de celulas de la superficie por unidad de superficie celular de Cav2.1 (barras blancas) y alfa-2-delta-2 (barras grises) para magnificacion X20 imagenes bajo
condiciones de control (n = 22 cells) and in the presence of 100 µM GBP (n = 19
cells) and 1 mM GBP (n = 24 cells). **, P < 0.01; ***, P < 0.001; one-way ANOVA,
with Bonferroni’s post hoc test. (D) The effect of GBP (100 µM and 1 mM) was
determined on cell-surface expression of a28-2 (Upper), with the intracellular
protein Akt as control (Lower). (Left) Whole-cell lysate (WCL). (Right) Streptavidin pull-down of biotinylated proteins, immunoblotted with a2-2 (102–117) or Akt Ab. The leftmost lane is from nonbiotinylated control cells (con). The proportion of a28-2 at the cell surface was estimated from the ratio of the biotinylated a28-2 to the amount of a28-2 in the WCL. Data are from five experiments; 4.93 ± 1.92% of total a28-2 was at the plasma membrane, and this was reduced compared with control by 19.8 ± 7.6% and 30.4 ± 14.4% in the
chronic presence of 100 µM and 1 mM GBP, respectively (n = 5, P < 0.05, repeated-measures ANOVA and Bonferroni’s post hoc test).
En contraste, GBP crónica no redujo el nivel de R282A-alfa2delta-2
expresada en la membrana celular (SI fig.8A). Además, en la
presencia de R282A-alfa-2-delta-2,hubo una distribución menos
uniforme tanto de la mutación alfa-2-delta y GFP Cav 2.2, que la ob-
Fig. 4. Efecto de la GBP en las corrientes de Ca nativos con DRGs.(A) ( superior izq).La relación de IV para HVA Iga registrados para ratas DRGscultivados por 3 días en ausencia (cuadrados negros) o presencia de GBP (1 mM,circulos rojos).Ejemplo HVA corrientes de uu potencial de reposo (Vh) de -40mV a entre -30 y +10mV en rangos de 10mV.Trazos superiores (negro) de control; trazos menores (rojo) GBP crónico (1 mM).Iga se midió a 20ms, como se indicaven la línea punteada.Iga a 0mV
fue significativamente inhibida por GBP crónica.(B) (P = 0.02, Student’s
two-tailed t test). (Lower) As above, except VH was -80 mV, and IBa
amplitude was measured at the end of the 220-ms step, as indicated by the
dotted line. IBa was obtained in the absence (black squares, n = 12), or presence of GBP (1 mM, red circles, n = 13). (B) la aplicación aguda de GBP (1mM) no tuvo efecto sobre las corrientes HVA nativos DRGs.(izq) Gráfico de barras muestra la falta de activados por la corrientes de calcio ( HVA),cuando los DGR se incubaron con 1mM de GBP por 3 días (fig.4A).La contaminación con corriente T se evitó por la medición de corriente del mantenimiento del pick de potencial en -40mV,aunque un resultado similar se obtuvo cuando se mide Iga al final de un rando de 50-ms desde -80mV(fig. 4A).En contraste, la aplicación aguda de GBP durante 10min, no tuvo efecto en adultos DRG Iga (fig. 4B)..
servada con WT alfa2delta-2 y localizacion menos uniforme del la
subunidad R282A-alfa-2-delta y GBP Cav 2.2 (SI fig. 8B yC), no
tuvo ningún efecto adicional sobre la distribución de la subunidad
R282Aalfa-2-delta-2 (SI fig.8 B y C).
GBP crónico inhibe las corrientes de calcio nativas en las neuronas
DRG. Para determinar la relevancia de nuestros hallazgos a VGCCs
nativas en un sistema neuronal relevante para el uso terapéutico de
GBP, se examinó si GBP tuvo un efecto crónico similar en la densidad
de IBA en cultivos de neuronas de raíz dorsal ganglionar adultas
(DRG). Se encontró una marcada reducción en el peak de las
corrientes de calcio activadas por alto voltaje (HVA) (por 50,7 ± 11,2%
a 0 mV, n=19), cuando los GRD se incubaron con 1 mM de GBP
durante 3 días (Fig. 4A). La contaminación con corriente tipo T se
evitó mediante la medición de la corriente peak desde un potencial de
mantenimiento de 40 mV, aunque se obtuvo un resultado similar se
obtuvo cuando se midió IBa al final de una etapa de 50 ms a partir de
80 mV (Fig. 4A). En contraste, la aplicación aguda de GBP durante 10
minutos no tuvo ningún efecto en DRG Iba adultas (Fig. 4B).
Hendrich et al. PNAS 1 March 4, 2008 1 vol. 105 1 no. 9 1 3631
Discusión
Luego del descubrimiento de que GBP se une a cierta subunidad
VGCC α2, la evidencia de que las drogas gabapentinoides tienen su
efecto terapéutico a través de esta ruta es muy fuerte ahora, ya que
un ratón R217A knockin-α21 desarrolla dolor neuropático en
respuesta a la lesión del nervio, pero esto no responde a cualquier
GBP o su análogo pregabalina. Ahora se muestraa que GBP es un
inhibidor del tráfico de VGCC, en lugar de un inhibidor directo de las
corrientes de calcio, y por lo tanto ejerce sus efectos inhibidores sobre
todo en subunidades α2 intracelulares. Hemos demostrado que las
subunidades α2 tienen su efecto principal sobre el tráfico de VGCC, y
que el factor de von Willebrand-Un dominio (VWA) es clave para este
proceso. Es notable que GBP se une a las dos subunidades α2 que
tienen dominios VWA con sitios de adhesión ión-metal perfectos
(MIDAS). Se ha postulado que todos esos dominios VWA se someten a
un cambio conformacional durante la unión de la proteína ligando a
este dominio, y se podría especular que los fármacos gabapentinoides
podrían interferir con esta función del dominio VWA. La reducción en
la expresión de α2 y Cav2.1 en la superficie celular en presencia de
GBP y la disminución en la colocalización de α2 de R282A con Cav2.2
proporciona evidencia de apoyo para esta hipótesis. Los resultados presentados aquí podrían explicar la falta de efecto, o
respuestas pequeñas, informadas con GBP aguda en diferentes sistemas
experimentales, tanto en las corrientes de calcio como la la transmisión
sináptica. Estudios previos que examinan la exposición más prolongada a
GBP también han demostrado ya sea ninguna inhibición o poca inhibición
de la amplitud de la corriente. Nuestra conclusión de que el efecto de GBP
requiere su captación en las células individuales explica el requisito de
una concentración relativamente alta de GBP, ya que tendrá que competir
con grandes aminoácidos neutros para la captación en este sitio. Es claro
que el tráfico de VGCCs y su inserción y extracción de la membrana
plasmática procede dinámicamente, y estas tasas probablemente
dependerán del estado fisiológico de las neuronas, y la cantidad de
subunidades α2 presentes, que mejorarán el tráfico y disminuirán el
cambio de VGCCs. La inserción de VGCCs en la membrana plasmática de
las terminales presinápticas o axones puede ocurrir rápidamente bajo
ciertas condiciones, por ejemplo, después de la inducción de dolor
neuropático, cuando los niveles de las subunidades α2-1 están elevados.
Respecto a esto, se ha informado que GBP inhibe las corrientes de calcio
lentamente durante un período de minutos en DRGs de ratones que
sobreexpresan α2-1 (imitando el estado de dolor neuropático), pero no los
ratones WT. (36).
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La inserción de VGCCs en la membrana plasmática de las terminales
presinápticas o axones puede ocurrir rápidamente bajo ciertas
condiciones, por ejemplo, después de la inducción de dolor neuropático,
cuando están elevados? 2? -1 Niveles de subunidades. A este respecto, se
ha informado de que GBP inhibe las corrientes de calcio lentamente
durante un período de minutos en GRD de 2 -1 -? Ratones que
sobreexpresan (imitando el estado de dolor neuropático), pero no los
ratones WT. (36)
En conclusión, la acción de GBP dilucidada aquí, para inhibir el tráfico
de VGCC y la expresión en la membrana plasmática, representa un
mecanismo de acción de fármaco no caracterizado previamente, y señala
el camino a seguir para el desarrollo de fármacos.
Métodos Cultivo de tejidos y expresión heteróloga de ADNc. Los detalles figuran en Métodos SI.
Electrofisiología. Las corrientes de los canales de calcio se registraron
esencialmente como se describe y detalla en Métodos SI.
Inmunotransferencia. El análisis por inmunotransferencia se realizó
esencialmente como se ha descrito. Muestras de SDS / PAGE resueltas se
transfirieron a membranas de PVDF y se probaron con Abs primarias como se
describió y con las Abs secundarias conjugadas con peroxidasa de rábano
picante respectivamente, seguida de detección de quimioluminiscencia.
Inmunocitoquímica e Imagen. El método utilizado es esencialmente como se describe y detalla en Métodos SI.
Ensayo de Bioquinilación. A las 72 h después de la transfección con los
ADNc descritos, las células fueron lavadas tres veces con PBS y después se
incubaron con PBS que contenía 1 mg / ml de Sulfo-NHS-SS-biotina (Pierce)
durante 30 min a 4 ° C. La solución de biotina se eliminó y se enjuagó dos
veces con PBS que con glicina 100mM (pH 8,0) a temperatura ambiente
para enfriar la reacción. Las células se lavaron suavemente tres veces con
PBS y se lisaron a continuación. La mitad del lisado celular se cargó en un
gel de Tris-Acetato de 3-8% para determinar la expresión de proteína total.
Igual cantidad de proteínas biotiniladas se precipitaron mediante la adición
de 50microL de perlas de estreptavidina-agarosa (Pierce) y se incubaron
durante la noche a 4 ° C. Las perlas de estreptavidina-agarosa se lavaron
tres veces y se incubaron con DTT 100 mM en 2x Tampón de muestra
Laemmli durante 1 hora a 37 ° C. Las proteínas eluidas fueron resueltas por
SDS / PAGE. La inmunotransferencia para la proteína citosólica de Akt se
utilizó como control para determinar que las proteínas intracelulares no se
biotiñeron como resultado de daño celular.
Statistical Analysis Data are given as means ± SEM, and the statistical tests
used are either ANOVA with Bonferroni’s post hoc test or Student’s two-tailed
t test, as stated.
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Norm
aliz
ed
Curr
ent
I (pA
/pF
) B
a
I/I
(m
s)
max
in
inact
ac
A Step potential (mV)
-40 -20 20 40 60 80
B
1.0
-100
transient Ca 2.1/
0.8
0.6
V 4
-200
-300
* *
stable -2 cell line 2
Control
chronic GBP (1 mM)
0.4
0.2
0.0
-120 -80 -40 0 40
Conditioning potential (mV)
C 0.0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
+20 mV
control
chronic GBP (1 mM)
0 250 500 750 1000
Time (ms)
440000
330000
220000
110000
00
D
control
*
1 mM GBP
(m
s)
act
Norm
aliz
ed C
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ent
in
A 0.0
-0.2
+20 mV
-0.4
-0.6
-0.8
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control
chronic GBP
(100 M)
0 250 500 750 1000
Time (ms)
B 500
*
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0
control
100 M GBP
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niform
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trib
ution
ii
A
i
Con
α2-2
(102-117 Ab) GFP-Cav2.2
merge
regions of B co-localization
60
50
***
control
+ 1mM GBP
***
40
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+ GBP 20
iii
10
0
WT -2 GFP-Ca 2.2 + GBP V
% o
f ce
lls w
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-unifo
rm d
istr
ibutio
n
C
A
R282A biotinylated
R282A biotinylated
GBP (mM) 0
kDa
0.1 1
0 0.1 1
IB
160
WCL Pull-down
B α -2 (102-117 Ab) GFP-Ca 2.2 merge 2 v
control
R282A- -2
controlll 70 + 1mM GBP
60
R282A
α2δ-2
50
40
+ GBP 30
20
10
0
-2 GFP-Ca 2.2 V