inŻynieria genetyczna wykład dla szkół wersja ...inŻynieria genetyczna • silnie związana z...
TRANSCRIPT
INŻYNIERIA GENETYCZNA• narzędzia i techniki:
enzymy restrykcyjne, wektory, transformacja, PCR, klonowanie
• transgeniczne rośliny i zwierzęta
• znakowanie GMO
Prowadzący wykład: dr Artur Dzialuk
INŻYNIERIA GENETYCZNA
Zespół technik umożliwiających:
• izolowanie,
• identyfikację,
• charakterystykę
• i przenoszenie gengenóóww między genomami
• oraz wprowadzanie do nich zmian.
INŻYNIERIA GENETYCZNA• silnie związana z genetyką molekularną,
która koncentruje się na celach poznawczych
• stosuje ten sam warsztat i metody
• silny związek z praktyką – przemysłem, medycyną, farmacją
• jej praktyczne wykorzystanie doprowadziło do rozwoju przemysłu biotechnologicznego
PODSTAWOWE TECHNIKI
PCRKlonowanie DNA
KLONOWANIE DNA
wektor fragment DNA
zrekombinowanywektor
bakteria
transport do komórek gospodarza
bakteria nios ąca zrekombinowanywektor
powielanie zrekombinowa-nego wektora
podziałkomórek gospoda-rza
liczne podziały komórkowe
kolonie bakteryjne
System / układ restrykcji i modyfikacji
mechanizm obronny w komórce bakteryjnej zakażonej bakteriofagami (wirusami bakteryjnymi)
System restrykcji i modyfikacji EcoRI
endonukleazy restrykcyjne = enzymy restrykcyjne =
restryktazy
EcoRI
EcoRI
• wysoka specyficznośćsubstratowa
• hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w DNA
Tępe i lepkie końce
TĘPE KOŃCE LEPKIE KOŃCE
LIGACJA DNA
nietrwałe parowanie zasad między lepkimi końcami
dwa wiązania syntetyzowane przez ligazę DNA
LIGAZA DNA
Trawienie enzymem EcoRI
źródło: DNA Learning Center, www.dnalc.org
Nazewnictwo
Trójliterowe skróty:1. Od rodzaju bakterii
lub sinic2 i 3. od gatunku
Następna wielka litera oznacza szczep lub typ
Liczby rzymskie to numer enzymy z danego szczepu lub typu
ENZYMY RESTRYKCYJNE
• znanych ponad tysiąc enzymów restrykcyjnych
• firmy biotechnologiczne oferują w sprzedaży ponad sto
Wykorzystanie enzymWykorzystanie enzymóów w restrykcyjnychrestrykcyjnych
1.1. Technika Technika rekombinowaniarekombinowania i klonowania DNAi klonowania DNA2.2. sporzsporząądzania fizycznych map genomdzania fizycznych map genomóów,w,3.3. izolacji i identyfikacji genizolacji i identyfikacji genóów,w,4.4. sekwencjonowaniasekwencjonowania DNA,DNA,5.5. porporóównywania DNA z rwnywania DNA z róóżżnych organizmnych organizmóów,w,6.6. diagnostyki chordiagnostyki choróób genetycznych,b genetycznych,7.7. diagnostyki niektdiagnostyki niektóórych typrych typóów chorw choróób b
nowotworowych,nowotworowych,8.8. diagnostyki chordiagnostyki choróób infekcyjnych,b infekcyjnych,9.9. w transplantologii do ustalania zgodnow transplantologii do ustalania zgodnośści tkankowej,ci tkankowej,10.10. w medycynie sw medycynie sąądowej do ustalania pokrewiedowej do ustalania pokrewieńństwa.stwa.
WEKTORY
WEKTOR
DNA DO SKLONOWANIA
GENLIGAZA DNA
GEN
ZREKOMBINOWANA CZĄSTECZKA DNA
• plazmidy
• bakteriofagi
• kosmidy
• sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC)
• sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC)
Matura 2010 PR
F
P
P ?
F
F
P
P ?
F
m.in.
PRAWDA:
większość genów oporności na antybiotyki kodowanych jest na plazmidach
???:
Lekooporność nie jest jedynym przykładem fenotypów zależnych od obecności plazmidów
BUDOWA PLAZMIDU
• ori – miejsce startu replikacji
• promotor – miejsce inicjacji transkrypcji
• MCS (multiple cloningsite) = miejsce wielokrotnego klonowania, polilinker
• gen markerowy – np. oporności na antybiotyk lub białka fluorescencyjnego GFP
Gen kodujący GFP (Green Fluorescent Protein)
Białko fluoryzujące w zakresie barwy zielonej.
Białko to jest izolowane z meduz morskich.
Najwyższe wzbudzenie luminescencji GFP występuje przy λ=395 nm(bliski ultrafiolet) lub λ=475 nm (światło widzialne), emisja światła następuje przy λ=508 nm(barwa zielona).
źródło: DNA Learning Center, www.dnalc.org
Matura 2010 PR
popośśredniredniąą obserwacjobserwacjęę czasu i miejsca powstawania czasu i miejsca powstawania „„pewnego pewnego
biabiałłkaka””
kiedy (czas) i gdzie (miejsce) kiedy (czas) i gdzie (miejsce)
pojawia sipojawia sięę nowotwnowotwóór ?r ?
powyżejponiżej
jednostka transkrypcyjna
sekwencja kodująca
promotor
GFP
TRANSFORMACJA
źródło: DNA Learning Center,
www.dnalc.org
wektorchromosom gospodarza
EKSPRESJA TRANSGENU
białko plazmid
natychmiast po transformacji
po inkubacji 1h w 37ºC
PCRCykl:Cykl:1.1. denaturacjadenaturacja2.2. przyprzyłąłączanie czanie
starterstarteróóww3.3. wydwydłłuużżanieanie
Matura 2011 PR
kryminalistyka – identyfikacja sprawców przestępstw na podstawie
analizy DNA ze śladów biologicznych
identyfikacja ofiar katastrof i zbrodni wojennych
Osiągnięcia w zakresie transgenizacji
Matura 2007 PR
Transgeniczne rośliny
Komórki roślinne sątotipotentne, czyli mająnieograniczoną zdolnośćdo dzielenia się oraz odtwarzania poszczególnych organów i całego organizmu.
TotipotencjaTotipotencja
Metody wprowadzania „obcego DNA”do genomu roślin
1. Metody z wykorzystaniem wektora:• bakterie z rodzaju Rhizobium• wirusy roślinne np. wirus mozaiki kalafiora (CaMV)
2. Metody bez wykorzystania wektora.
Agroinfekcja = agrotransformacja
Wykorzystuje się bakterie z rodzaju Rhizobium: Agrobacterium tumefaciens i Agrobacteriumrhizogenes, które posiadają naturalną zdolnośćdo wprowadzania swojego DNA do roślin.
Agroinfekcja
Agroinfekcjapoważne ograniczenie
- można ją stosowaćwyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają zarażeniu przez Agrobacterium.
Rośliny jednoliścienne, do których należązboża, nie mogąbyć transformowanetym sposobem.
Metody bezwektorowe
Fizyczne
• Elektroporacja
• Mikrowstrzeliwanie
• Mikroiniekcja
Chemiczne
• PEG
• Fuzja liposomów
Elektroporacjaseria impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki
Mikrowstrzeliwanie(metoda biolistyczna)
Mikroskopijne kulki złota lub wolframu zostają opłaszczone DNA a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych za pomocą „armatki genowej”
Matura 2010 PR
Po co tworzy sięrośliny transgeniczne?
1. nauka2. praktyka
Ekspresja białka GFP w komórkach korzenia transgenicznego rzodkiewnika
Rośliny GM w nauce
• modele w poznawaniu funkcji genów
• głównie rośliny modelowe np. rzodkiewnik (Arabidopsisthaliana), tytoń (Nicotianatabacum) – ich genom dobrze poznany i łatwo je transformować
• Uzyskujemy informacje uniwersalne – umożliwiająpoznanie i zrozumienie świata żywego
Transgeniczny tytońzawierający gen lucyferazy pochodzący ze świetlika.
Pomidor Flavr Savr
Pomidor Flavr Savr
• pierwsza komercyjnie zmodyfikowana genetycznie roślina uprawna i jadalna, dopuszczona do spożycia przez ludzi
• wprowadzona do sprzedaży w USA w 1994, pozostał na rynku zaledwie przez kilka lat, zanim wstrzymano jego produkcję.
Strategia antysensowna
• wprowadzono antysensowny gen, którego produkt interferował i powstrzymywał produkcję enzymu – poligalakturonazy.
• poligalakturonaza jest enzymem odpowiedzialnnym za rozkład ściany komórkowej (a zatem mięknięcie tkanki), podczas dojrzewania, starzenia i w końcu psucia się owocu.
Przyczyny niepowodzeń
• wysokie koszty produkcji i spedycji
• zmodyfikowano genetycznie nie najlepszą odmianę
• niskie plony - 25-50% w porównaniu do upraw tradycyjnych
• jedynie połowa owoców była wystarczająco duża i dojrzała, by być sprzedawana jako "McGregors" – docelowy produkt o wyższej cenie.
• wiele uszkodzeń mechanicznych• konkurencja z właśnie
wprowadzoną tradycyjnąodmianą pomidorów - LSL (ang. long shelf life)
ANI ZAPACH ANI ZAPACH ANI TRWAANI TRWAŁŁOOŚĆŚĆ
DZIKIE
FLAVR SAVR
Złoty ryż (Golden rice)Złoty ryż (Golden rice)
Skala niedoboru witaminy A
• Problem dotyczy 250 mln ludzi, w tym 100 – 140 mlndzieci
• Rocznie ślepnie 250 – 500 tys., w ciągu roku umiera połowa z nich
Złoty ryż 1 - 1.6 1.6 µµgg karotenoidów na gram suchej wagi
Złoty ryż 2 – 37 37 µµgg karotenoidów na gram suchej wagi. (23 x więcej niż ZR1)
Odporność na herbicydy• Zmodyfikowane rośliny
posiadają geny, odpowiedzialne za produkcję enzymów, które rozkładają herbicydy, dzięki czemu stają się na nie odporne.
• Wprowadzenie do rośliny cechy odporności na działanie herbicydu o działaniu totalnym pozwala na łatwą kontrolęchwastów na polu uprawnym.
GMOnie GMO GMOnie GMO GMOnie GMO
Modyfikacja typu Roundup Ready
• glifosat – aktywny składnik herbicydu Roundup®hamuje działanie syntazy EPSPS - enzymu, który bierze udział w syntezie aminokwasów aromatycznych
• Do roślin GMO wprowadza się gen kodujący enzym syntazę EPSPS niewrażliwą na działanie glifosatu lub gen odpowiedzialny za powstanie enzymu (oksydoreduktazy glifosatu) rozkładającego glifosat
• koncerny biotechnologiczne oferują jednocześnie herbicyd i nasiona genetycznie zmodyfikowane, z cechą odporności.
Nazewnictwo
• geny cry (od crystal protein)
• Białka Cry to toksyny Bt
• Rośliny Bt, np. kukurydza Bt (Bt-maize)
Odporność na szkodniki
Omacnica prosowianka (Ostrinia nubialis)
• Powoduje straty na ponad 40% ogólnej powierzchni zasiewów kukurydzy w Polsce.
• Kolejny szkodnik to zachodnia stonka kukurydziana
Matura 2005 PP
Modyfikacja polega na wprowadzeniu do rośliny genu kodującego białko Cry z
bakterii glebowej Bacillus thuringiensis, co powoduje, że roślina GM staje się
toksyczna dla wybranych szkodników owadzich, ale nie dla ludzi i zwierząt.
Szkodliwe jest jedynie spożycie przez owada części rośliny GM.
Preparaty oparte na bakterii glebowej Bacillus thuringiensis w formie
zarodników stosuje się w uprawach polowych, lasach i miejscach wylęgania się
komarów. Pokrywają one cały teren, gdzie zostały zastosowane. Nawet
przebywanie owadów w środowisku tak skażonym stanowi dla nich zagrożenie.
Odporność na choroby powodowane przez grzyby,
wirusy i bakterie
Papaja odporna na wirusa pierścieniowej plamistości papai
(PRSV)
• PRSV łatwo przenoszony przez mszyce.
• Na Hawajach, gdzie papaja jest podstawowąrośliną uprawną, 80% plantacji to odmiany transgeniczne UH Rainbow z tą odpornością.
dzika transgenicznadzika transgeniczna
Ulepszanie cech jakościowych
Matura 2010 PR
sukces wprowadzenia genu LEAFY do komórek drzew (przykład osiki) wskazuje
na możliwości uzyskania genetycznie zmodyfikowanych odmian drzew owocowych
(np. jabłoń, grusza, śliwa), które będą kwitły znacznie wcześniej a zbiór ich
owoców będzie ułatwiony z uwagi na niski wzrost drzew
Przydatność wysoka bo:
Krzewiące się drzewa to niższe koszty zbiorów owoców
Łatwiejszy dostęp do koron drzew owocowych w celach pielęgnacji
Więcej odgałęzień to wyższy plon, zbiór
Łatwiejsza uprawa
FITOREMEDIACJA
Tolerancja stresów środowiskowych
• wysoka temperatura,
• zasolenie,
• zalewanie,
• susza,
• stresy oksydacyjne
• i substancje chemiczne
TRANSGENICZNE ROŚLINY W MEDYCYNIE
Dieta prozdrowotna• złoty ryż• zmiany struktury kwasów tłuszczowych w
roślinach oleistych (zdrowsze oleje spożywcze)• odmiany ryżu i orzeszków ziemnych wolnych od
alergenówSzczepionkirośliny GM jako biofabryki wytwarzające
szczepionki wolne od ryzyka przenoszenia ludzkich lub zwierzęcych chorób.
SZCZEPIONKI
87-krotny wzrost od 1996 r. do 2010 r., rok do roku wzrost o ok.9 mln ha, czyli ok.7%
1
23
4
5
6
7
8
91011
12
13
14
15
16
17
UPOWSZECHNIENIE UPRAW GMO
Transgeniczne zwierzęta
METODY TRANSGENIZACJI ZWIERZĄT
Po co tworzy sięzwierzęta transgeniczne?
1. nauka2. praktyka
Zwierzęta GM w nauce
• modele do badań nad rozwojem, zachowaniem, pamięcią
• w medycynie, transgeniczne myszy służą jako modele chorób człowieka, takich jak np. otyłość, karłowatość, przyspieszone starzenie, choroby układu krążenia, cukrzyca, i in. oraz jako obiekty do testowania nowych, obiecujących metod leczenia
• badania funkcji genów
1
2
mRNA kodujące białko sygnałowe determinujące rozwój osi ciała wstrzykiwano w brzuszną częśćblastomeru żaby szponiastej, co spowodowało rozwój drugiej osi ciała
Wykorzystanie techniki transgenezyzwierząt gospodarskich
• Uzyskanie zwierząt o przyspieszonym tempie wzrostu (wzrost produkcji mięsa) przez wprowadzenie do ich genomu genów kodujących np. gen hormonu wzrostu
• Zwiększenie masy mięśni u zwierząt rzeźnychRyby zawieraj ące ssaczy gen hormonu
wzrostuRyby zawieraj ące ssaczy gen hormonu wzrostu
Wykorzystanie techniki transgenezyzwierząt gospodarskich
• Uzyskanie zwierząt o przyspieszonym tempie wzrostu (wzrost produkcji mięsa) przez wprowadzenie do ich genomu genów kodujących np. gen hormonu wzrostu
• Zwiększenie masy mięśni u zwierząt rzeźnych
Podwójnie umięśniona krowa
Poprawa jakoPoprawa jakośści produktuci produktu: np. poprzez obniżenie zawartości cholesterolu w mięsie, mleku i jajach, obniżenie zawartości laktozy w mleku, zmniejszenie zawartości tłuszczu w mięsie i modyfikacje jego składu
Modyfikacje cech biochemicznych• np. poprawy jakości i tempa wzrostu wełny
poprzez wprowadzenie do genomu owiec genów białek keratynowych
• zwiększenie produktywności: np. zwiększenie mleczności krów, nieśności kur niosek
Uzyskanie zwierząt wykazujących tolerancję lub odporność na patogenne wirusy i bakterie
Wykorzystanie techniki transgenezyzwierząt gospodarskich
ZWIERZĘTA JAKO BIOREAKTORY
Wytwarzanie biofarmaceutyków
Roczne światowe zapotrzebowanie na czynnik VIII
(leczenie hemofilii A)
• 354 transgenicznych szczurów
• 217 transgenicznych królików
• 2 transgeniczne świnie
• po jednej transgenicznej kozie, owcy lub krowie
• Humanizacja ekspresji genów człowieka w organizmie zwierzęcym – modyfikacja zmian potranslacyjnych tak, aby uzyskać białko identyczne jak w organizmie człowieka
• ksenotransplantacje genetycznie zmodyfikowane organy zwierzęce nadające sięna przeszczepy u ludzi, zniesienie immunologicznej bariery międzygatunkowej i zapewnienie organów do transplantologii.
Matura 2009 PR
Produkcja leków i szczepionek wolnych od ryzyka przenoszenia chorób ludzkich lub zwierzęcych
„Złoty ryż” może zlikwidować problem niedoboru witaminy A
mniejsze zużycie herbicydów
fitoremediacja
Matura 2006 PP
DNA jest trawiony w przewodzie pokarmowym człowieka.
Czy ktoś obawia się schabowego z kapustą?
Obowiązek znakowania GMO w UE
W przypadku gdy cały produkt jest genetycznie zmodyfikowany oznakowanie powinno być uzupełnione informacją: produkt genetycznie zmodyfikowany.
Jeśli tylko niektóre składniki są genetycznie zmodyfikowane, obok nazwy składnika należy umieścić napis: genetycznie zmodyfikowany.
Napis i informacja powinny być czytelne i zapisane czcionkątej samej wielkości co nazwa składnika lub produktu.
„NIE MODYFIKOWANY GENETYCZNIE”
„MODYFIKOWANY GENETYCZNIE”
JAK ROZUMIEĆ ETYKIETĘ?
1.2 % GM
<0.9%
<0.9%0.6+0.6=1.2%
1.2% > 0.9%
źródło: European Commission, Joint Research Centre
Matura 2007 PP
Dziękuję za uwagę