irna in phytopathology

POR CRISTÓBAL GALLARDO ALBA

Descubrimiento de iRNA

El RNA interferente (iRNA) fue

descubierto como convergencia de tres líneas de investigación no relacionadas;

el trabajo más familiar fue el del laboratorio de Andrew Fire y Craig Mello, cuyas conclusiones fueron

publicadas en la revista Nature en 1998.

Por sus trabajos, empleando como organismo modelo a Caenorhabditis elegans Craig y Mello recibieron el

premio novel en fisiología y medicina del año 2006

Craig y Mello en la entrega del Nobel

Mecanismos moleculares del iRNA

Hay dos principales, formas distintas de RNA pequeño interferente implicadas en el

silenciamiento génico de eucariotas, los small interfering RNAs (siRNAs), y los microRNAs

(miRNAs).


Los genes de miRNA constituyen en torno al 1% del total de genes codificados, y forman la mayor clase

de moléculas reguladoras. Evidencias sugieren que la expresión de los miRNA esta regulada a nivel

trascripcional.

Los microRNA son cadenas sencillas de RNA de 19-23 nts de longitud generados a partir de transcritos de cadena simple que poseen una estructura local de hairpin (figura 3, paso a). Esos transcritos son generados por

la pol II, mostrando una caperuza en 5´ y una cola poli A en 3´. A diferencia de la maduración de los RNA grandes, que ocurre en el núcleo, la maduración del miRNA comienza en el núcleo y termina en el citoplasma.

Una importante diferencia existe entre la ruta de biosíntesis en plantas y en animales, y se basa en el hecho de que en las plantas la DCL1 actúa sobre los pre-miRNAs en el núcleo .

En las plantas, los dúplex de RNAs pequeños son sustrato de metiltransferasas que añaden grupos metilo a los residuos 2´-hidroxilo del azúcar ribosa terminal, de forma que esta modificación protege a esas especies de RNA

de cualquier tipo de degradación o uridilación. El clivaje de las dianas es llevado a cabo por Argonauta1, un miembro destacado de la formación miRNA-RISC (miRNP), generando miRNAs maduros (figura 3 paso d).

Los microRNAs muestran una alta especificidad de tejido y expresión temporal y se piensa que han evolucionado para cuidar de forma intensiva las vías de desarrollo lo cual puede ser conseguido a través de la supresión

de la traducción (teniendo lugar principalmente en animales) o por el clivaje de dianas (que ocurre principalmente en plantas).

Así mismo, recientemente microRNAs han sido mostrados a jugar un rol

crítico en conferir inmunidad tanto a animales como a plantas.


El reconocimiento de la diana de miRNA, como en el caso del siRNA, es iniciado por la secuencia de la región semilla. .

Sin embargo, la compleja relación existente entre las los miRNA de

plantas y sus dianas en la mayoría de los transcritos diana cae dentro de la categoría de factores de transcripción y puede así regular muchos

procesos corriente a bajo. Interesantemente, los miRNAs son encontrados a regular negativamente los niveles de expresión de las

principales enzimas de RNAi, como dicer o Argonauta, lo que añade otro peldaño de dificultad a la red reguladora alcanzado por estas moléculas.


En las plantas, los patrones de expresión de los microRNAs se piensa que están dirigidos por múltiples interacciones de feedback que implican

varias fitohormonas, en particular a las auxinas y las giberelinas.

Las fitohormonas regulan la trascripción de varios genes por unión a los elementos cis y esos transcritos poseen sitios para ciertos miRNAs. En

contraste, la transcripción de algunos miRNAs esta directamente regulada por fitohormonas.

Así, la intrincada relación entre los miRNAs y las fitohormonas es central

par a muchos procesos biológicos.



Los small interferent RNAs (o siRNAs), son moléculas reguladoras de longitud comprendida entre 20-24 nucleótidos que, además de

proteger a la célula de la intrusión de cualquier ácido nucleico exógeno (como los virus), están implicadas en el mantenimiento de

la integridad del genoma por el silenciamiento trascripcional de locus indeseables (como retrotransposones o secuencias repetidas).

El principal requerimiento para la generación de siRNA es una larga molécula de RNA bicatenario, los cuales son formados a partir de cualquier evento de transcripción que genere mensajeros con complementariedad de

secuencia o por alguna actividad enzimática capaz de convertir RNA monocatenario en bicatenario (figura 1, pasos a y b). El procesado de los siRNAs comparta gran parte de la maquinaria con el del miRNA como se

observa en el esquema.

Una importante proteína implicada en la biosíntesis de siRNA en plantas, hongos y C.elegans (pero no en humanos) es una RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRP). La principal función de esta proteína es generar

siRNAs secundarios, en una etapa denominada amplificación de la señal en la vía del siRNA.

La cadena simple de siRNA cargada en el complejo proteico puede ser considerada análoga a las enzimas de restricción procarioticas que actúan contra cualquier ácido nucleico foránea. Sin embargo, a diferencia de los mecanismos de defensa procarioticos mediados por las enzimas de restricción, los RNA pequeños eucariotas

pueden regular incluso cuando el DNA extraño ha sido transcrito a RNA.

Los siRNAs se creen que participan en una forma primitiva de respuesta inmune generada contra ácidos nucleicos extraños. Por lo tanto, ellos deben surgir a partir de sitios de producción para conferir una rápida

defensa celular.

Esta hipótesis está apoyada por estudios genéticos llevados a cabo en animales, donde la importancia de los siRNAs dentro de las células ha sido

demostrado a través de una proteína de membrana llamada “Systemic RNA Interference – Defective” (SID-1), encontrando que la asimilación de dsRNAs por la SID-1 era dependiente de longitud, con mayores moléculas

(500 pbs), siendo importada a una mayor velocidad que las moléculas pequeñas (30 pbs).

Implicación del iRNA en la inmunidad en plantas

Dado que en las plantas y los invertebrados no existen células implicadas en la

inmunidad adaptativa, la habilidad del iRNA para silenciar la expresión génica de

una manera secuencia-específica constituye una sofisticada nueva forma de inmunidad cuya diana son ácidos nucleicos

extraños, basada en el reconocimiento ácidos nucleicos bicatenarios como no

propios, y desencadenando muchos tipos de mecanismos de silenciamiento, como

degradación del mRNA, metilación de promotores o modificación de la

cromatina.

Virus del mosaico del tabaco


En el caso de los animales, una característica de la respuesta inmune

adaptativa es la expansión clonal de las células T y B patógeno-específicas.

De forma similar, el iRNA monta y amplifica una altamente específica respuesta contra

patógenos, y dicha especificidad viene dada porque solo se marca como diana a

RNAs idénticos en secuencia al ácido nucleico desencadenante.

Además, el iRNA puede ser un mecanismo

importante para proteger al genoma contra parásitos genéticos como los transposones

o los retrotransposones.

Complejo Argonauta – dsRNA. Argonauta es

el componente del RISC implicado en la especificidad de reconocimiento.


Thomas Hohn, de la Universidad de Basel, fue quien demostró que

las plantas emplean la maquinaria del iRNA como una defensa antiviral en la que los

intermediarios de la replicación viran, en forma de dsRNA, son

procesados por enzimas similares a Dicer (DCL), pudiendo

amplificar el efecto del iRNA empleando una RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRP) y los

siRNAs como primers.


Así, en la respuesta antiviral asociada a silenciamiento génico

post-transcripcional, el dsRNA viral es procesado en primer lugar por una nucleasa similar a una RNAsa

III, denominada Dicer en los animales.

Han sido encontrados muchos

homólogos en Arabidopsis, rindiendo fragmentos de 21 a 25 nts de dsRNA (siRNAs), que son

incorporados a otro complejo con actividad nucleasa, el complejo

RISC, que actúa clivando el RNA de origen vírico.


El iRNA puede ser desencadenado tanto por virus de DNA como de

RNA. Así, Hohn mostró que dos virus de DNA, el CaLCuV y el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) , desencadenaban la síntesis de

nucleótidos de 21, 22 y 24 nts, y el virus ORMV desencadenaba

predominantemente siRNAs de 21 nts.

Sin embargo, los virus también han

evolucionado, desarrollando mecanismos supresores del

silenciamiento del RNA (RSS).

Virus del mosaico de la coliflor


Sin embargo, Oliver Voinnet mostró que las interacciones entre los huéspedes y los

patógenos son mas complicadas que la simple interacción entre los mecanismo de defensa y

contradefensa.

¡¡A por ella!!


Así pues, por ejemplo, Arabidopsis codifica para 10 genes Ago diferentes, de forma que las plantas Ago1 deficientes

son hipersensibles a los virus, indicando que Ago1 está implicada en las respuestas antivirales.

Sin embargo, previamente Ago1 se demostró actuar en la ruta del miRNA, con lo cual, la ruta del miRNA y del siRNA

parecen converger.


Además del silenciamiento génico, los genes de resistencia (R) están también

implicados en el bloqueo de la replicación de los virus en las plantas.

Esos genes codifican receptores que detectan patógenos y activan fuertes

defensas similares a los receptores de reconocimiento de patrones en los

mamíferos, y cada vez se esta mostrando mas claro que los genes implicados en el iRNA son de hecho

genes R que regulan la respuesta hipersensibilidad (HR)

Así, hay evidencias de que factores HR son parte del RISC.

HR en hoja


Pero la acción del iRNA no se limita a la defensa frente a ataques virales. Oliver Voinnet extendió la función del iRNA en plantas a la defensa contra patógenos

bacterianos, de forma que miRNA específicos son inducidos en respuesta a bacterias patógenas que son detectadas

a través de receptores de flagelina.

De forma similar a los virus, las bacterias también codifican factores específicos que son translocados al

interior de la planta para bloquear la vía del miRNA.

Hoja afectada por bacteriosis


Otra de las evidencias que apoya la asociación entre el

iRNA y la inmunidad en plantas fueron proporcionadas por Yoo

y colaboradores, los cuales encontraron pruebas de que el floema es capaz de movilizar

RNAs pequeños.

Así, estudios con savia de floema de diferentes especies

como cucurbitáceas o yuca revelaron la presencia de siRNAs

y miRNAs.


Otra línea de investigación que aun no esta resuelta es el descubrimiento de una nueva proteína, la proteina-1 pequeña del

floema de unión a RNA (PSRP1) la cual actúa uniéndose a las especies de RNA pequeño, lo cual fue confirmado por estudios de

silenciamiento de la cubierta proteica de virus en líneas silenciadas y no silenciadas, donde los autores pudieron encontrar acumulación de siRNAs de cubierta proteica en las líneas silenciadas, pero no en las no

silenciadas.

Sin embargo, el significado del transporte de miRNA a través del floema continua sin ser dilucidado.


Una prueba del potencial del iRNA para hacer frente a infecciones víricas fue aportada por F. Tenllado y col. , los cuales hicieron uso de 3 virus

pertenecientes los grupos tobamovirus (PMMoV), POTYVIRUS (Tobacco etch virus, TEV) y alfamovirus ( virus del mosaico de la alfalfa , AMV), como ejemplos representativos en la diversidad de virus de RNA en plantas.

Efectos del TEV


Estos investigadores estudiaron la capacidad del ssRNA sentido, el ssRNA antisentido y del dsRNA derivado del gen de la replicasa del PMMoV (una región

de 54 kDa de la proteína), para inhibir la formación de lesiones locales producidas por PMMoV, lo cual fue evaluado usando dos huéspedes hipersensibles diferentes,

Nicotiana tabacum cv. Xanthi nc y Capsicum chinense.

Efectos del PMMoV


Encontraron que ni la inoculación mecánica de ssRNA sentido, ni ssRNA antisentido, ni de cDNA correspondiente a la región de 54 kDa de la proteína

del virus causaba una reducción en el numero de lesiones locales producidas por PMMoV. Sin embargo, la capacidad infectiva del virus fue

completamente bloqueada al inocular partículas con dsRNA (figuras A y B).

Resultados de los experimentos de inoculación de ssRNAs y dsRNAS


Además, encontraron que la interferencia con la infección vírica solo tenia lugar cuando las moléculas de dsRNA compartía una secuencia idéntica con el virus, dado que la co-inoculación de PMMoV junto con un fragmento de dsRNA de 1483 pb del gen HC-Pro de TEV no tenia ningún efecto sobre la

infectividad de PMMoV (figura C).



Los investigadores encontraron también que dsRNA homólogos eran competentes para interferir con la infección vírica en una infección sistémica del huésped, para lo cual inocularon a plantas de Nicotiana benthamiana con mezclas de partículas de PMMoV y diferentes dsRNAs derivados de PMMoV,

mostrándose resistentes a la infección sistémica del virus.


RNAi como herramienta para al análisis funcional de genes en plantas

Aunque el iRNA no es una tecnología de knockout sino de knockdown, su alta eficiencia y facilidad de

aplicación la hace aplicable al análisis de la función génica de genomas completos.


Convencionalmente, el silenciamiento génico mediado por un RNA antisentido (ejemplo superior en la imagen), ha sido ampliamente usado en el análisis de la función de plantas, y aunque es un fenómeno relacionado con el iRNA, el iRNA

inducido por hpRNA ha mostrado ser mucho mas eficiente en los estudios de análisis funcional (ejemplo inferior).


Así, actualmente, en plantas el iRNA se suele conseguir mediante un transgen que produce un hairpin RNA (hnRNA) con una región dsRNA.


En un vector que produzca hpRNA, el gen diana es clonado como una repetición invertida espaciada separada por una secuencia no relacionada y

es conducida por un promotor fuerte como el promotor 35S CaMV para dicotiledóneas o el promotor de la ubiquitina 1 para monocotiledoneas.


Cuando se emplea un intrón como secuencia espaciadora la eficiencia se vuelve muy elevada , mostrando cerca del 100% de las plantas transgénicas el

silenciamiento. Sin embargo, el mecanismo por el que el intrón aumenta la eficiencia continua sin estar clara.


La introducción directa de dsRNAs o de un plásmido productor de hpRNAs transilentemente, por bombardeo de partículas, ha sido mostrado a inducir la iRNA en plantas. Esta aproximación se ha mostrado útil para el análisis de la función de genes en plantas en los casos en que la transformación estable

mediante organismos transgénicos es mas difícil.


El silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) es otra aproximación que se suele

emplear para el análisis de la función de genes en plantas, aprovechando que los virus de RNA generan dsRNA durante su siclo de vida por la

acción de la RdRP codificada por él mismo.

Si el genoma del virus contiene un gen de la planta huésped, la inoculación del virus puede

desencadenar una iRNA contra dicho gen.

Dado que esta aproximación no requiere un proceso de transformación, puede ser adecuada

para el análisis funcional de genes esenciales.

Virus del mosaico del tabaco

Resistencia inducida de virus de plantas a través de la expresión de miRNAs artificiales

El diseño de estrategias antivirales tanto en animales

como en plantas actúa mimetizando los mecanismos naturales del silenciamiento

del RNA.


En las plantas, las estrategias antivirales basadas en el silenciamiento del RNA implican la expresión de largos hpRNAs derivados de

patógenos, que a su vez, serían procesados a siRNAs.

Recientemente se ha comprobado que las clases de siRNAs derivados de hairpins RNAs (hpRNAs) que son responsables de la degradación

de RNAs diana son predominantemente las especies de 21 nts procesadas por DCL-4 y las especies de 22 nts producidas por DCL2,

cuando DCL-4 está ausente.

Importantes técnicas para la generación de RNAs pequeños relacionados con el silenciamiento del RNA en plantas están ya

disponibles.


Un gran avance en este campo fue aportado por el equipo dirigido por la doctora Jing Qu, quienes estudiaron los efectos derivados de la

generación de miRNAs y de shRNAs , sobre la capacidad infectiva del virus del mosaico del pepino (CMV).

Mo Li, Jing Qu y Guanghui Liu


Estos investigadores diseñaron dos vectores de expresión, ambos codificando la misma región diana, el gen supresor 2b del virus del mosaico el pepino:

• Uno de ellos contenía el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor

dirigiendo una secuencia precursora de miRNA. • El otro consistía en una construcción de sh-RNA dirigida por el promotor de

la RNA pol III de planta.


El CMV 2b es uno de los primeros supresores de iRNA estudiados, mostrando que puede bloquear el movimiento de la señal sistémica de silenciamiento,

interrumpiendo el silenciamiento inducido por metilación, e interfiriendo con la ruta antiviral mediada por acido salicílico del huésped. Además recientemente se

ha visto que interacciona directamente con argonauta1 del complejo RISC, bloqueando su actividad nucleasa.


Para examinar si ambos RNAs pequeños podían inhibir la expresión de la diana de forma secuencia-específica se procedió a coinfiltrar cepas de Agrobacterim tumefaciens que

incluían los vectores de expresión para los sRNAs, junto con cepas que portaban vectores de expresión para los ORFs del gen 2b pertenecientes a 3 líneas diferentes:

• La secuencia diana de la línea SD era idéntica a la codificada por los vectores de

expresión de los miRNA • El ORF de la línea Fny de diferenciaba en 2 pb con respecto a la línea SD

• La línea Q presentaba más de 11 cambios con respecto a la línea SD en la región diana.


Los resultados mostraron que tanto los shRNAs como los miRNAs redujeron los niveles de su diana afín SD 2b RNA, y de la estrechamente relacionada Fny 2b (líneas 1 a 6), pero no tenia efecto sobre los Q 2b RNA (líneas 7 y 9). Además

comprobaron que los miRNAs eran mas eficientes que los shRNAs para disminuir la expresión de la diana.

Resultados comparados con respecto a un control de un vector de expresión de GFP


Por otro lado, para comprobar que los miRNAs y los shRNAs podían interferir

con la actividad supresora del silenciamiento de 2b , los

investigadores emplearon una planta transgénica para GFG (línea 16c), y

coinfiltraron tres cepas de Agrobacterium , cada una de las cuales albergaban el plásmido p35s-GFP, p35S-

SD 2b, o uno de los vectores de expresión de sRNAs, en hojas de N.

benthamiana transgénicas y en hojas de plantas salvajes.

Planta transgénica para la proteína GFP


Como puede verse en la imagen, a los cuatro días de la inoculación, la GFP en

las hojas de las plantas transgénicas infiltradas con el p35s-GFP, y el p35S-SD

2b (línea 1) habían aumentado casi 8 veces comparado con las plantas

infiltradas solo con 35S:GFP (línea 4).

Por su parte, la infiltración conjunta con Agrobacterium que contenía los vectores

de expresión para shRNA o miRNA reducían sustancialmente el nivel de

fluorescencia de GFP a 1,6 y 4,3 veces respectivamente.

Resultados del experimento


La función interferente de los RNAs pequeños en la actividad supresora de las proteinas 2b también fueron demostradas en hojas WT de N. benthamiana como

muestran los resultados de westernblot.

En la imagen se muestra además la mayor eficiencia de los miRNA frente a los shRNAs en la supresión del silenciamiento local.

Resultados de Westernblot


También se observó que cuando se agroinfiltraban de forma conjunta con los vectores que codificaban para los miRNAs, un silenciamiento sistémico significante podía ser

observado en las hojas superiores de 10 de las 30 plantas infiltradas (figura 3).

De nuevo, la eficacia de la agroinfiltración con los vectores para shRNAs era menor que en el caso de los miRNAs (figura 4).

Experimento de comprobación de silenciamiento sistémico


Para confirmar la capacidad de plantas transgénicas para la

expresión de RNAs pequeños para conferir resistencia frente a virus, el equipo de Jing Qu generó plantas de tabaco transformadas con Pu6-sh2b

o P35s-miR2bprec, los cuales les conferían la capacidad para producir miRNAs y shRNAS contra la proteína

2b del CMV.


Estas plantas no mostraron ningún fenotipo anormal de desarrollo,

mostrando que los RNAs pequeños específicos de 2b expresados tienen

pocos efectos sobre la expresión génica de la planta.

La presencia de los RNAs pequeños

frente a 2b fue testada mediante PCR.


La aparición de síntomas en cada una de las plantas inoculadas fue

monitorizada a los 5, 9, 15 y 60 días tras la inoculación.

La severidad de la enfermedad fue cuantificada sudando un sistema de

5 puntos, y usado para calcular el DSI, que representa el nivel de resistencia para cada grupo de

plantas transgénicas.


Como se observa en la figura, a los 5 días, 18 de las plantas control mostraban síntomas obvios (DSI 10,3), mientras que solo 1 de las plantas que expresaban los miR2b y 6 que expresaban shsR2b mostraban síntomas, dando un DSI de

0,36 y 4,2 respectivamente

En el periodo de los 5 a 15 días tras la inoculación, los síntomas se

desarrollaron rapidamente, mostrando los mayores niveles de

severidad a los 15 días.

Representación de DSI frente a tiempo post-inoculación


Las plantas control mostraron síntomas severos, y el DSI alcanzó un 76,12. Sin embargo, en el mismo periodo de tiempo, las plantas miR2b y las plantas

shsR2b tenían significativamente menores DSIs de 39,07 y 48,84, respectivamente.

Estos datos muestran que una considerable fracción de esas plantas

eran resistentes o tolerantes a la infección por CMV.

Así, el 63,63% de plantas miR2b y

48,84% de las plantas shsR2b mostraron considerable resistencia frente a CMV, frente al 8,07% de las

plantas control.

Representación de DSI frente a tiempo post-inoculación


Con todo ello, los resultados prueban que la estrategia que la producción de transgénicos de RNAs pequeños

para dianas de proteinas víricas es útil para la generación de plantas resistentes, siendo mas eficiente la expresión

de miRNAs que la de shRNAs.

Además, el equipo de Jing Qu demostró también que la resistencia adquirida por la expresión de RNAs pequeños, es heredada en la mayoría de la población en las plantas

de la generación T2.

Potencial del RNAi en el control de enfermedades en plantas producidas por virus

Obviamente, la interferencia de infecciones víricas mediada por productos de transcripción in vitro o mediante la expresión transilente de dsRNAs mediada

por Agrobacterium esta limitada a estudios fundamentales. Así, métodos efectivos de producción y desarrollo de productos de interferencia adecuados para su aplicación sobre la superficie de las plantas deben ser desarrollados

antes de un empleo práctico del iRNA en la protección de plantas.


Una de las estrategias desarrolladas por Tenllado y colaboradores fue utilizar un

sistema de expresión inducible basado en una cepa de Escherichia coli

modificada genéticamente, la cual permite de forma sencilla, rápida, segura y barata la producción de

dsRNAs derivados de secuencias de virus.

Escherichia coli


La cepa empleada fue la HT115(DE), la cual se caracteriza por:

• Ser deficiente en RNAsa III, lo cual permitía la acumulación de dúplex de RNA en el interior de la célula bacteriana.

• Expresar la RNA pol. T7 a partir de un promotor inducible por IPTG, para la preparación de cantidades masivas de dsRNA viral in vivo.

• Posee una construcción codificante para un shRNA derivado de una región de 54 kDa del PMMoV, acumulándose importantes niveles del dsRNA derivado de dicha construcción.


Los dsRNAs producidos por las bacterias se demostraron capaces de interferir

con la infección de PMMoV.

De hecho, plantas de Nicotiana benthamiana inoculadas con mezclas de PMMoV y extractos de ácidos nucleicos

preparados a partir de bacterias HT115(DE3) que expresaban el dsRNA

estaban libres de síntomas durante sus ciclos de vida completos.

Además, los niveles de RNA viral estaban

por debajo del limite detectable tanto en las hojas inoculadas como en las

superiores.


Pero la producción a gran escala de dsRNA necesario para la introducción del iRNA en las protección de las plantas

depende del desarrollo de procedimientos simples y rápidos para la obtención de productos con capacidad interferente a

partir de las bacterias, evitando el uso de protocolos complejos para la purificación de los ácidos nucleicos.


Un métodos que se mostro efectivo fueron las preparaciones crudas de bacterias obtenidas por lisado de pellets celulares mediante prensa

francesa, observándose que la acumulación de virus era

completamente inhibida en las hojas de Nicotiana benthamiana que habían sido inoculadas con una mezcla de

lisado de bacterias que expresaban los dsRNAs derivados de PMMoV y

partículas de PMMoV, observándose significativas diferencias en los

controles, como se puede observar en la imagen. Respuesta de plantas de Nicotiana benthamiana a

diversos tratamientos


Experimentos adicionales han demostrado que la tecnología del iRNA es adecuada para el control de las infecciones de una gran variedad de plantas de virus, como por ejemplo del virus de la enfermedad de sharka, responsable de

una de las enfermedades mas importantes que afectan a Europa.

Ejemplo de frutos afectados por la enfermedad de sharka


La presencia de productos interferentes en la superficie de las hojas por muchos días

no es sorprendente de acuerdo con los análisis previos de la estabilidad de las

moléculas de dsRNA sintetizadas in vitro después de su liberación sobre las hojas, siendo persistentes incluso después de

lavados intensos.

Estos esperanzadores resultados condujeron al concepto de la pulverización de

preparaciones crudas de E.coli HT115(DE3) que expresan dsRNA como un método muy

conveniente para el desarrollo de inductores de iRNA en plantas y además contribuyendo a hacer la tecnología del iRNA ampliamente disponible y aplicable para su aplicación en

el campo.

Mecanismos bioquímicos de la supresión de RNA interferente por virus de plantas

.

Los virus de la familia Potyviridae codifican los supresores HC-Pro, que

es un ejemplo clásico de proteína multifuncional, participando por

ejemplo en la replicación , el transporte sistémico e intracelular y

el clivaje de proteinas. Sin embargo la función biológica mas importante de

HC-Pro es su participación en la supresión del iRNA.

Imágenes de M.E.T. de un Potovirus


.

Diversos estudios sugieren que el mecanismo de acción de HC-Pro consiste en la inhibición de las

proteinas DCL, provocando además defectos en el crecimiento y diferenciación de las plantas

infectadas, al afectar a las vías de regulación de la expresión génica

regulados por miRNAs.

Imágenes de M.E.T. de un Potovirus


.

La proteína P19 de la familia Tombusviridae se trata de otra

proteína multifuncional, habiéndose demostrado como un importante

factor de virulencia para el progreso de las infecciones.

La función de P19 como supresor del iRNA lo ejerce mediante la unión a los

abundantes siRNAs virales, haciéndolos inaccesibles para que sean procesados por RISC. Como resultado, las moléculas de RNA

virales se acumulan en los organismos infectados.

Imágenes de M.E.T. de un Tombusvirus


.

La proteína 2b fue uno de los primeros supresores del iRNA descubiertos. Esta proteína actúa bloqueando la

distribución de las señales celulares del iRNA e inhibiendo la metilación en el

núcleo.

La supresión del iRNA por la proteína 2b se encuentra también asociada con la unión a moléculas de siRNA, lo que

determina que sea un factor de virulencia crítico para el virus.

Efecto de Cucumovirus


.

Estudios recientes han demostrado que 2b, a diferencia de la mayoría de los supresores virales, interacciona

directamente con el centro catalítico de Ago1 en el complejo RISC, conduciendo a la

inhibición específica de la hidrólisis enzimática por dicho complejo.

La habilidad de 2b para interaccionar

directamente con el RISC y disminuir su actividad es un sorprendente ejemplo de la complejidad de la evolución cooperativa

y la adaptación de plantas y virus. Imagen de M.E.T. de Cucumovirus


.

El virus «beet western yellow virus, un representativo virus de la familia

Polerovididae codifica la proteína P0, que es un potente supresión del iRNA.

Esta proteína se comprobado capaz de interactuar SKP1, un componente de la familia SCF de la ubiquitina ligasa E3.

Cabe destacar que la expresión de P0 conduce a la degradación de AGO1, la

proteína encargada del clivaje en el complejo RISC. Proteína Ago1: En morado se destaca el dominio

PIWI, donde se encuentra el centro catalítico.


.

Estudios bioquímicos han demostrado que el mecanismo

de supresión del iRNA por P0 se basa en la interacción de la caja-F de la proteína con el

dominio PAZ de AGO1, marcándola para la degradación proteosomal, siendo crítica para

ello la interacción con SKP1.

Imágenes de microscopía electrónica de un Polerovirus


.

El genoma de virus del mosaico del tabaco (TMV) codifica una

proteína de 125 kDa responsable de la replicación y el transporte del virus, y posteriormente se ha comprobado también participar

en la supresión del iRNA.

Otro virus relacionado, el virus del mosaico del tomate, también

se ha visto que codifica una proteína similar.

Imágenes de microscopía electrónica del virus del TMV


.

Exámenes bioquímicos de interacción entra la replicasa del

TMV y las moléculas de RNA indican que la proteína puede unir

moléculas de siRNA, evitando su incorporación al complejo RISC.

Recientes estudios muestran que la

infracción por TMV impide la metilación de los por la

metiltrasferasa HEN1, estando directamente relacionada con la

expresión de la replicasa, sin embargo el mecanismo por el que

ocurre no esta claro. Imágenes de microscopía electrónica del virus del TMV


.

Exámenes bioquímicos demuestran que la actividad

supresora de la proteína P21, de 21 kDa, interacciona con dúplex

de miRNAs y siRNAs in vivo, impidiendo su metilación ,

aunque sin afectar a la actividad del complejo RISC.

Imágenes de microscopía electrónica de Closterovirus


.

La proteína de la cápside p38 (CP/p38),del virus de la arruga del nabo (TCV) es otro ejemplo de una proteína viral que muestra muchas biológicas funciones, participando en la distribución sistémica, como componente estructural y en

el transporte intracelular, además de en la supresión del iRNA.

Diversas investigaciones han demostrado que p38 se une dsRNAs independientemente de su longitud, pudiendo unir también dsRNAs largos, lo cual impide la accesibilidad del sustrato por la nucleasa DCL, lo cual disminuye

la acumulación de siRNAs.


.

Fue aislada por primera vez en el TRV (Tobacco rattle virus); se trata de

una proteína de 16 kDa rica en cisteína. Esta proteína se ha

mostrado clave en la acumulación de TRV en los procesos infecciosos.

Estudios recientes indican que actúa

bloqueando el iRNA antes de la formación del dsRNA, aunque su

diana no esta clara. Es llamativo que esta proteína actúa

también bloqueando el iRNA en Drosophila.

Imágenes de M.E.T. de un Tobravirus


.

El BSMV (barley stripe mosaic virus) codifica una proteína γb de 17 kDa rica en cisteína , que no es crítica

para la replicación y el transporte del virus, pero afecta significativamente

a su virulencia.

Exámenes bioquímicos han revelado que esta proteína interacciona con

cadenas simples de RNA a través de tres dedos de zinc localizados en su extremo N-terminal, encontrándose esta asociación relacionada con su capacidad para suprimir el iRNA.

Proteína γb de Hordeivirus

Imágenes de M.E.T. de un Hordeivirus

Perspectivas en el uso del iRNA para la protección de cultivos

.

Planta transgénica malvada

Hasta hace poco, la única estrategia directa disponible, mas

allá de la clásica mejora de las plantas, para el control de las enfermedades víricas era el

empleo de plantas transgénicas que conferían resistencia.

Así, la demostración en 1986 de que la expresión de proteinas de

la cápside vírica en plantas transgénicas podría conferir

resistencia a virus representó un gran avance.


Activistas de Greenpeace

Sin embargo, mas de 10 años después, las cuestiones

concernientes al potencial impacto ecológico de las plantas transgénicas han provocado que estas estrategias

no hayan proliferado.

En vista a estas preocupaciones, estrategias alternativas aspiran a

proteger los cultivos contra las enfermedades víricas reduciendo o

eliminando los posibles riesgos asociados con la expresión

transgénica de secuencias virales.


Así, la tecnología del RNA proporciona una importante nueva estrategia para combatir enfermedades virales en muchos organismos, desde plantas

a mamíferos, ofreciendo una combinación de extrema especificidad y la explotación de una vía celular subyacente que ha evolucionado

aparentemente de forma natural para este propósito.


A pesar de ello , en la actualidad existan algunas limitaciones, como el gran desconocimiento que

aun se tiene acerca de los requerimientos estructurales y de secuencia que gobiernan el reconocimiento de la diana y su subsecuente procesamiento por el complejo siRNA-RISC.

Sin embargo, la ausencia en las células vegetales de efectos inhibitorios no específicos activados

por dsRNA (presente por ejemplo en los mamíferos por ejemplo), permite que estas

limitaciones puedan ser superadas mediante el empleo de dsRNAs largos.


De esta forma, el procesamiento de los dsRNAs largos por la maquinaria del iRNA

genera una mezcla de siRNAs correspondiente a distintas regiones del precursor de dsRNA, de forma que la degradación del RNA viral ocurre como resultado de múltiples siRNAs funcionando cooperativamente en distintas

posiciones del RNA diana.

De este modo, en plantas se vence una de las principales limitaciones de la tecnología del

iRNA que afecta a los mamíferos.


Por otro lado, el empleo de cultivos bacterianos proporciona

un enfoque práctico y reproducible para la producción de dsRNAs en masa, ofreciendo la posibilidad de ser fácilmente

aislado, almacenado y distribuido, sin perder sus

propiedades interferentes con la infección del virus de la planta.


Además, la demostración bajo condiciones experimentales de que el dsRNA puede producir interferencia con las infecciones víricas cuando los preparados crudos de bacterias son rociados sobre la superficie de

las platas contribuye ha hacer a esta tecnología ampliamente disponible y aplicable para su empleo en el campo.


Pero existen otras limitaciones que deben ser resolvidos antes de que la tecnología basada en el iRNA pueda ser usada como una herramienta para el

control de los virus en el campo a escala comercial: 1. Eficacia sobre virus transmitidos por vectores naturales. 2. Actividad sobre tejidos distales de la planta no que no son inoculados

directamente. 3. Duración de la actividad de los tratamientos basados en el iRNA. 4. Necesidad de estudios de aplicación del tratamiento a gran escala.


Se trata de una cuestión especialmente problemática, dado que la gran mayoría de los virus de plantas son transmitidos de planta

a planta en la naturaleza por vectores invertebrados que, en

muchos casos, liberan las partículas víricas directamente

dentro de las células de las plantas.

1. Eficacia sobre virus transmitidos por vectores naturales

Graphocephala coccinea, un importante vector de transmisión en Norteamérica


Dado que la mayoría de los virus de ssRNA, incluyendo aquellos grupos económicamente importantes de Potovirus, son transmitidos por áfidos en la naturaleza, muchos estudios se están llevando a cabo para extender esa

resistencia contra la inoculación viral por afidios.


Grupo de áfidos


Otros estudios están dirigidos a la búsqueda de coadyuvantes adecuados que faciliten la penetración de las formulaciones de iRNA

dentro de las células vegetales.


Grupo de áfidos


2. Actividad sobre tejidos distales

Una solución para incrementar la dispersión de los preparados de

iRNA en la planta se basa también en el empleo de coadyuvantes en las formulaciones basadas en el dsRNA, que favorecerían una

mayor distribución de los productos interferentes,

desencadenando una protección sistémica contra las infeciones

víricas.


3. Duración de la actividad de los tratamientos basados en el iRNA.

Dado que la actividad interferente el dsRNA sobre la planta se mantiene

sobre periodos de tiempo transitorios, y que su aplicación asidua sobre los cultivos resulta

económicamente inviable, la aplicación de las preparaciones de dsRNA en los periodos adecuados,

como la época de crecimiento, coincidiendo con las epidemias de

los vectores, podrían solventar estos problemas.

Conclusiones

Con todo ello, las estrategias basadas en el iRNA se están erigiendo como una importante alternativa en el control de fitopatógenas, por encima de

la generación de organismos genéticamente modificados, dado que no requiere de un sofisticado equipamiento y es barata , en comparación con

la producción de plantas transgénicas .

Otra ventaja adicional es la facilidad proporcionar protección mediante una enorme diversidad de patógenos, mediante el diseño de

formulaciones que contengan distintos dsRNAs frente a dianas diversas, algo que se antoja complejo en el caso de las plantas transgénicas.

Además, el empleo adecuado de la tecnología del iRNA reduciría el

empleo de pesticidas en agricultura , minimizando los riesgos ambientales y ecológicos, además de estar exenta de las diversas implicaciones éticas y

ecológicas asociadas e los organismos genéticamente modificados.

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irna in phytopathology

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