Biochimica et Biophysica .4cta, 446 (1976) 77-86 © Elsevier/North-Holland Biomedical Press

BBA 37424

1SOLEMENT ET CARACTERISATION DE DEUX SUBUNITES CONSTITU- TIVES DES GLYCOPROTEINES DE STRUCTURE DU TISSU SOUS CUTANE DE LAPIN

A. RANDOUX, J. CORNILLET-STOUPY, M. DESANTI and J. P. BOREL

Laboratoire de Biochimie, U.E.R. de M~decine, 51 rue Cognacq Jay, 51095 Reims Cedex (France)

(Regu le 24 f6vrier, 1976)

SUMMARY

Isolation and characterization of two subunits .from structural glycoproteins of rabbit dermis

Structural glycoproteins have been extracted by 8 M urea from the insoluble residue remaining after collagenase digestion of rabbit dermis and purified by Sepha- rose 4 B chromatography. After reduction and alkylation, Dowex 1 × 2 chromato- graphy allowed separation of two structural glycoproteins (D~ and D2) in an homog- enous state as shown by chromatographic and electrophoretic behaviour as well as N terminal amino acid determination.

These two glycoproteins have a molecular weight of about 16 000. Their amino acid compositions (very similar), are characterized by a high level of dicar- boxylic amino acids and the absence of hydroxyproline and hydroxylysine. The less acidic glycoprotein (D~) has glycine for N terminal amino acid and contains 10.4 percent of bound carbohydrates. The glycoprotein Dz contains 5.1 percent of bound carbohydrates and its N terminal amino acid is glutamic acid.

INTRODUCTION

Des glycoprot6ines non collag6niques ont 6t6 isoWes sous des noms divers/t partir de nombreuses vari&6s de tissus conjonctifs, corn6e [1], aorte [2], derme [3, 4, 5], tendon [6], cartilage [7], tissu pulmonaire [8]. La plupart d'entre elles sont pr6sentes dans les fractions du collag+ne insoluble auquel elles sont peut-6tre unies. Adelmann a montr6 qu'elles favorisaient la fibrillog6n6se du collagbne [9]. Pour Robert, elles joueraient un r61e dans l'organisation de la trame insoluble [10]. Elles poss6dent une sp6cificit6 d'esp6ce et de tissu [11 ]. Quelle que soit leur origine, leurs compositions en acides amin6s sont tr~s voisines et caract6risfes par la forte proportion d'acides amin6s dicarboxyliques et d'acides amin6s hydrophobes. Par contre, les compositions gluci- diques paraissent tr6s variables. Elles ont 6t6 d6crites sous diff6rents noms: prot6ines acides [3], glycoproWines de structure [7]. Leur s6paration difficile du collag~ne in- soluble, la facilit6 avec laquelle elles s'associent in vitro pour former des complexes macromol6culaires, probablement par des liaisons hydrophobes et des ponts disulfure rendent leur purification difficile et bien peu de ces glycoprot6ines de structure ont

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6t6 isol6es dans un 6tat de puret6 satisfaisant. Dans le tissu sous cutan6, ce groupe de glycoprot6ines parait complexe.

Des 6tudes pr61iminaires ont montr6 que cette grande h6t6rog6n6it6 pourrait s'expliquer en admettant l'existence de subunit6s de masses mol6culaires 6gales/l 15 000 [3, 12] combin6es selon des proportions multiples. A partir du tissu sous cutan6 de lapin, nous avons pu isoler deux types de subunitds conformes 5. cette hypoth6se et diff6rant entre elles par certaines caract6ristiques structurales.

MATERIEL ET METHODES

(1) Prdparation des glycoprot~ines associ@s au collag~ne insoluble Le derme de lapins de race Fauve de Bourgogne pesant entre 2 et 2.5 kg est

obtenu par dissection soigneuse de la peau en 6vitant toute atteinte 6pidermique et d6coup6 en fines lamelles. 100 g de tissu frais sont extraits 5- trois reprises pendant 24 h par deux litres d'une solution de NaC1 0.2 M puis soumis b, trois extractions de 24 h par deux litres d'une solution d'acide ac6tique 0.1 M. Le r6sidu est ensuite d61i- pid6 par un m61ange de chloroforme/m6thanol (2:1, v/v) centrifug6 et s6ch6 sous un courant d'air froid. L'ensemble de ces extractions est effectu6 ~t ÷ 4 °C. Le r6sidu sec de collag~ne insoluble brut ainsi obtenu est homog6n6is6 dans un litre de tampon Tris .HCl 0.05 M de pH 7.4 contenant de l'ac6tate de calcium 0.01 M, 300 000 uait6s de p6nicilline et 10 mg de streptomycine. Apr~s addition de 3 mg de collag6nase de Clostridium histolyticum (Worthington CLSPA) repurifi6e par gel filtration scion la m6thode de Peterkofsky [13], le m61ange est incub6 ~t + 37 °C pendant 24 h, puis centrifug6. Le culot est repris dans une nouvelle quantit6 de tampon contenant de la collag6nase et soumis 5- nouveau 5- une hydrolyse de 24 h dans les m~mes conditions. Le r6sidu recueilli par centrifugation est alors trait6 par 200 ml de tampon phosphate disodique et monopotassique 0.01 M de pH 7.1 contenant de l'ur6e 8 M. Deux ex- tractions successives de 24 h 5- ÷ 4 °C sont effectu6es. Les extraits obtenus, contenant les glycoprot6ines de structure associ6es au collag~ne insoluble sont ensuite dialys6s contre de l'eau distill6e et lyophilis6s. Ce mat6riel brut est appel6 extrait ur6e. 100 g de tissu frais conduisent h environ 500 mg d'extrait ur6e.

(2) Chromatographie de gel filtration sur colonne de Sepharose 4 B Pour chaque chromatographie, 50 mg d'extrait ur6e lyophilis6 sont dissous

dans 5 ml de tampon phosphate disodique et monopotassique 0.01 M de pH 7.1 contenant 1 ~/o (p/v) de dodecyl sulfate de sodium et 1 ~o (v/v) de mercapto6thanol puis incubus 5- 37 °C pendant 16 h. La solution est ensuite fractionn6e sur une colonne (2.6 × 40 cm) de Sepharose 4 B e n tampon phosphate 0.01 M contenant 0.1 ~o de dod6cyl sulfate de sodium et 0.1 ~o de mercapto6thanol. La colonne est thermostat6e /l +30 °C pour 6viter la pr6cipitation du dod6cyl sulfate de sodium. L'61ution est suivie par lecture des absorbances ~t 280 nm; des fractions de 3 ml sont recueillies. Les fractions correspondant 5- chacun des pics sont rassembl6es, la plus grande partie du dod6cyl sulfate de sodium est 61imin6e par pr6cipitation b. + 4 °C et les solutions sur- nageantes sont dialys6es contre de l'eau distill6e et lyophilis6es.

Dans certaines exp6riences, les glycoprot6ines r6duites ont 6t6 fractionn6es sur colonne de S6pharose 4 B apr6s alkylation par l'iodoac6tate de sodium. Darts ce cas, le tampon d'61ution ne contenait pas de mercapto6thanol.

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(3) Rdduction et alkylation des glycoprotdines de structure Les glycoprot6ines purifi6es par chromatographie sur S6pharose 4 B sont ~t

nouveau r6duites par le mercapto6thanol dans les conditions d~crites ci-dessus puis alkyl6es ~ + 4 °C pendant 1 h par dialyse contre une solution de phosphate disodique 0.05 M contenant 1 ~ de dod6cyl sulfate de sodium et de l'iodoac6tate de sodium (Calbiochem) en exc6s 3 fois molaire par rapport au mercapto6thanol utilis6 pour la r6duction.

(4) Chromatographie d¥change ionique sur Dowex 1 x 2 La solution contenant les glycoprot6ines r6duites et alkyl6es est d6barass6e de

la plus grande partie de son dod6cyl sulfate de sodium par pr6cipitation de celui-ci + 4 °C. Apr6s addition d'ur6ejusqu'h une concentration finale de 8 M, le m61ange est fractionn6 sur une colonne (2.6 x 30 cm) de Dowex 1 x 2 (50-100 mesh) 6quilibr6e en tampon phosphate disodique et monopotassique 0.01 M de pH 7.1 et contenant de l'ur6e 8 M. L'61ution est obtenue par 100 ml du m~me tampon puis par un gradient lin6aire de concentration en NaCI de 0 h 1.5 M (volume total du gradient: 300 ml) et enfin par 100 ml de tampon phosphate 0.01 M contenant de l'ur6e 8 M e t du NaC1 1.5M.

(5) M dthodes ~lectrophor~tiques Les 61ectrophor6ses en gel d'agarose ~t 1 ~o sont effectu6es selon la microm6thode

de Scheidegger [14] en tampon v6ronal 0.025 M de pH 8.2 pendant une heure sous une diff6rence de potentiel de 25 V ~ l'extr6mit6 des lames. Elles sont ensuite r6v616es par l 'Amidoschwarz le r6actif de Schiff apr6s oxydation periodique [15] ou le bleu de toluidine selon la m6thode de van Arkel [16].

Les 61ectrophor6ses en gel d'acrylamide agarose selon la m6thode d'Uriel [17] sont effectu~es apr6s dansylation des prot6ines selon le protocole de Talbot et Yphan- tis [18]. Trois concentrations en acrylamide ont 6t6 utilis6es: 5, 7 et 10 ~ . Les d&ails de la m6thode ont 6t6 publi6s ant6rieurement [12].

(6) M~thodes analytiques Les compositions en acides amin6s sont effectu6es apr6s hydrolyse par l'acide

chlorhydrique 5.6 N ~ 110 °C sous azote pendant les temps de 24, 48 et 72 h. Les r~- sultats ont 6t6 extrapol6s au temps 0 pour la s6rine et la thr6onine. La s6paration des acides amin6s est effectu6e sur un autoanalyseur Technicon. Les acides amin6s sont dos6s par la r6action h la ninhydrine selon Rosen [19]. Les hexoses sont d6termin6s par la m6thode ~t l'orcinol [20], les hexosamines apr6s hydrolyse en tubes scell6s par HC1 4 N pendant 4 h ~t 110 °C selon Neuhauss [21], l'acide sialique selon Aminoff [22], le fucose seion Dische et Shettles [23] les acides uroniques par la m&hode au car- bazole [24].

Pour l'identification des hexoses et des osamines, les glycoprot~ines sont hy- drolys6es ~i 110 °C respectivement par HCI 2 N pendant 2 h et par HCI 4 N pendant 4 h. La chromatographie sur papier des oses neutres est effectu6e selon la m&hode de Bourrillon [25]. La s6paration des hexosamines est r6alis6e sur une colonne (60 x 0.6 cm) de r6sine P (Technicon) 6quilibr6e en tampon citrate de sodium 0.05 M, NaC1 0.15 M. L'61ution est assur6e par le m~me tampon.

Les acides amin6s N terminaux sont identifi6s apr6s dansylation par la techni-

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que de Talbot et Yphantis [18]. Les acides amin6s dansyl6s sont s6par6s selon la m6- thode de Briel [26].

RESULTATS

(1) M~thode d'extraction La composi t ion en acides amin6s de la fraction solubilis6e par l 'act ion de la

collag6nase de Clostridium histolyticium (Tableau I) montre qu'elle est presque

TABLEAU 1

Composition en acides amin6s du surnageant collag6nasique, des extraits ur6e (UI), des fractions F1 et F2 obtenues par chromatographie sur Sepharose 4 Bet des fractions D1 et D2 obtenues par chro- matographie sur Dowex 1 × 2. Les r6sultats sont exprim6s en nombre de r6sidus d'acides amin6s pour 100 r6sidus. CmCys: S-carboxym6thylcyst6ine, Hyp: hydroxyproline, Hyl: hydroxylysine.

Acides amin6s Surnageant Ut F1 F: Dt D2 collag6nasique

CmCys 0.0 0.0 0.0 0.0 1.6 1.2 Hyp 11.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Asp 7.3 10.5 10 .2 10.7 10.5 11.0 Thr 1.9 3.4 5.1 6.0 6.2 5.8 Ser 3.5 6.0 6.8 6.2 7.9 8.1 Glu 9.9 17.2 11.8 13.9 13.8 16.8 Pro 7.0 8.9 7.3 5.8 4.6 4.0 Gly 29.5 8.8 11.9 8.9 8.8 7.9 Ala 8.6 8.6 7.6 8.1 9.7 9.6 Val 2.6 5.6 4.6 5.3 5.7 5.2 Cys 0.2 0.6 3.3 1.0 0.0 0.0 Met 0.1 0.7 1.8 1.1 0.6 1.8 lie 1.4 4.5 3.9 5.0 5.1 5.2 Leu 2.6 7.7 7.7 8.6 8.7 8.4 Tyr 0.7 2.0 1.6 2.3 2.2 2.2 Phe 1.4 2.8 3.1 3.4 2.7 3.2 Hyl 1.0 0.2 0.8 0.2 0.0 0.0 Lys 4.4 6.6 5.5 6.6 6.6 5.1 His 0.9 1.5 1.8 1.8 1.7 1.5 Arg 5.0 4.8 4.9 5.1 3.5 2.9

exclusivement consitu6e de peptides collag6niques. Cette fraction cont ient 6galement une quantit6 de glycoprot6ines de structure tr~s faible, non compatible avec une purifi- cation ult6rieure.

L 'act ion de l 'ur6e 8 M e n tampon phosphate 0.01 M de pH 7.1 sur le r6sidu insoluble permet d'extraire les glycoprot6ines de structure associ6es au collag~ne insoluble. Leur composi t ion en acides amin6s (Tableau I) est caract6ristique de ce groupe de glycoprot6ines par leur richesse en acides amin6s dicarboxyliques et en leucine. EUes ne cont iennent qu 'une faible quanti t6 d 'hydroxylysine. L 'hydroxyprol ine est absente. L'6tude 61ectrophor6tique en gel d 'acrylamide agarose ~ 5-7 ou 10% d'acrylamide en pr6sence de dod6cyl sulfate de sodium montre l 'extence de trois ban- des principales dont les masses mol6culaires peuvent ~tre 6valu6es h 15 000, 30 000 et 75 000.

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A280nrn

sb 16o 16o 26o mr'

Fig. 1. Fractionnement sur Sepharose 4 B des extraits (Ua) r6duits.

(2) Fractionnement des glycoprotdines de structure rdduites sur S~pharose 4 B La chromatographie sur S6pharose 4 B des glycoprot6ines de structure r6-

duites du derme de lapin permet de s6parer trois pics (Fig. 1). La fraction F 1 est 61u6e au niveau du volume mort de la colonne et repr6sente 5 ~ de l'ensemble de la pr6pa- ration. La seconde fraction F2 est 61u6e sous forme d'un pic sym6trique. Elle corre- spond ~t la plus grande partie des glycoprot6ines extraites par l'ur6e. L'6talonnage de la colonne h l'aide de prot6ines globulaires permet d'estimer sa masse mol6culaire 16 000. Ce r6sultat a 6t6 confirm6 par des chromatographies de gel filtration sur S6- phadex G 150 et G 200 et par 61ectrophor~,se en gel de polyacrylamide agarose con- tenant 5, 7 et 10~ d'acrylamide en pr6sence de dod6cyl sulfate de sodium. La trois- i6me fraction F3 contient des compos6s de faible masse mol6culaire, pr6sents en faible quantit6 et qui, pour cette raison, n 'ont pas 6t6 6tudi6s.

L'61ectrophor6se en gel d'agarose ~t pH 8.2 de F2 montre l'existence d'une bande homog6ne color6e par l 'Amidoschwarz et le r6actif de Schiff apr6s oxydation periodique. La coloration par le bleu de toluidine r6v61e en outre, une bande de mi- gration anodique rapide dans la zone des mucopolysaccharides acides. Etudi6e dans les m~mes conditions, FI donne une bande de migration 61ectrophor6tique comparable

Fig. 2. Etude dectrophor6tique en agarose des fractions F~ et F2 ~lu6es sur Sepharose 4 Bet des frac- tions D, et D2 61u~es sur Dowex I × 2 (A. S. Amidoschwarz, P. A .S. R6actif de Schiff apr~.s oxyda- tion periodique, B. T. Bleu de toluidine). L'anode est h droite.

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5- celle de F2, mais une partie importante de la prdparation ne pdn6tre pas dans le gel (Fig. 2).

Les compositions en acides aminds des fractions F1 et F 2 (Tableau I) sont assez comparables et prdsentent les caract~res communs ddfinis plus haut pour les glyco- protdines de structure. Les principales diff6rences entre ces deux fractions portent sur la cysWine, l'hydroxylysine et 5. un moindre degrd, le glycocolle dont les taux sont plus dlevds dans F~. Au contraire, F2 est plus riche en acide glutamique (ouen gluta- mine).

La fraction F~ est prdsente en quantitd insuffisante pour une analyse plus pois- sde. La suite de notre dtude a done portd sur la fraction F2, plus abondante. Celle-ci est homog6ne dans son comportement chromatographique et dlectrophordtique. Par dansylation, deux acides aminds N terminaux sont ddceWs: le glycocolle et l'acide glu- tamique. I1 existe done au moins deux chaines peptidiques qui ont pu ~tre sdpardes par chromatographic d'dchange ionique.

(3) Fractionnement sur Dowex 1 × 2 Le fractionnement sur Dowex 1 × 2 de la fraction F2 rdduite et alkylde est

reprdsentd sur la Fig. 3. Deux pics principaux sont obtenus. La premiere glycopro- tdine D1 n'est pas fixde sur la colonne. Elle est assez riche en oses combinds d&ectds par la rdaction 5- l'orcinol. Un gradient lindaire de concentration en NaCi permet d'isoler une seconde glycoprotdine Dz, moins riche en oses combinds, dlude pour une concentration en NaC1 de 0.6 N. Enfin, un constituant mineur D3 est dlud lorsque la concentration en NaC1 atteint 1.5 M. I1 est prdsent en tr~s faible quantitd et n'a pu ~tre dtudid.

L'dlectrophor6se en agarose des glycoprotdines D1 et D2 dissoutes dans une solution de doddcyl sulfate de sodium 5- 1 ~ montre pour D1 une seule bande de mi- gration anodique rdvdlde 5- la lois par l'Amidoschwarz et par le rdactif de Schiff apr~s oxydation periodique. La glycoprotdine DE est rdvdlde par ces deux rdactifs mais la coloration par le rdactif de Schiff apr~s oxydation periodique est moins intense que pour D1 (Fig. 2). L'dlectrophor~se en gel d'acrylamide agarose contenant 5, 7 ou l0 d'acrylamide en prdsence de doddcyl sulfate de sodium 5- 1 ~ ne donne pour chaque fraction qu'une seule bande correspondant 5- une masse moldculaire d'environ 16 000.

A280 nr'n

A.orcinot L 1,5 M

0.5 D~ ~ ~ ~ ] I.,, 50 1(J0 150 200 250 300 350 mL

Fig. 3. Fractionnerncnt sur Dowex 1 x 2 de la fraction F2 rdduite et alkylde - - - - A orcinol.

, A2so ..i; -- --

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Un seul acide amin6 N terminal est d6cel6 dans chaque cas: le glycocolle pour D~, l ' ac ide g lu tamique pou r D~.

Les compos i t ions en acides amin6s (Tableau I) sont dans l ' ensemble voisines pou r D~ et D2. La glycoprot6ine D2 est toutefois plus fiche en acides amin6s dicar- boxyl iques (ou en leurs amides) et en m6thionine.

Les compos i t ions glucidiques font appara i t r e des diff6rences plus impor tan tes entre ces deux mol6cules (Tableau II). La teneur en hexoses et hexosamines est 2 fois

TABLEAU II

Nombre de r6sidus par mole des fractions DIe t D2 obtenues par chromatographie sur Dowex 1 × 2. 1 ~re colonne: valeur calcul6e pour une masse mol6culaire de 16 000. 2 i6me colonne: nombre entier le plus proche. CmCys: S-carboxym6thylcysteine, Hyp: hydroxyproline, Hyl: hydroxylysine.

Acides amines D1 D2

1 2 1 2

CmCys 2.2 2 1.4 1- 2 Asp 13.8 14 15.1 15 Thr 9.0 9 8.0 8 Ser 11.0 11 10.9 11 Glu 17.9 18 23.4 23-24 Pro 7.2 7 7.2 7 Gly 10.7 10-11 11.0 11 Ala 11.8 12 11.2 11 Val 7.3 7- 8 7.3 7- 8 Cys 0 0 0 0 Met 0.8 1 2.4 2- 3 lie 6.4 6- 7 7.3 7- 8 Leu 11.5 11-12 11.7 11-12 Tyr 2.9 3 3.0 3 Phe 3.3 3- 4 4.5 4- 5 Lys 7.9 8 6.5 6- 7 His 2.2 2 2.0 2 Arg 4.2 4 3.8 4 Hexoses 8.4 8- 9 4.5 4- 5 Hexosamines 2.1 2 1.0 1 Acide sialique 0.4 0- 1 0.3 0- 1 Fucose 1.0 1 0.8 1 Acide amin6 N terminal Gly Glu

plus impor tan te pou r D1. Dans chacune de ces fractions, la ch roma tog raph ie sur pap ie r des hexoses mont re la pr6sence de galactose, qui est l 'ose p r6dominan t mais 6galement de glucose et de mannose. La ch roma tog raph ie des hexosamines sur co- lonne 6changeuse d ' ions ne met en 6vidence dans D I e t D2 que de la glucosamine. Aucune des deux glycoprot6ines ne cont ient d 'ac ides uroniques.

DISCUSSION

Plusieurs types de m6thodes on t 6t6 utilis6s pour pr6parer les glycoprot6ines non collag6niques. Les ext rac t ions pa r des solut ions dissociantes comme le MgC12 3 M [6] conduisent h des m61anges de collag6ne, de prot6oglycannes et de g lycopro-

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t6ines dont le fractionnement ult6rieur est difficile. Deux autres types de m6thodes utilisent comme mat6riel de d6part le stroma insoluble restant apr~s extraction des prot6oglycannes et des formes neutro et acido extractibles du collag6ne.

A partir du stroma insoluble, le collag6ne "insoluble" peut 6tre solubilis6 par action de l'acide trichlorac6tique ~t chaud [27] ou de la collag6nase bact6rienne [3]. Ces deux derni6res m6thodes offrent un crit+re de l'association au collag~ne des glycoprot6ines 6tudi6es. Toutefois, l'utilisation de l'acide trichlorac6tique ~, chaud conduit 5. des coupures de liaisons covalentes [28]. L'action de la collag6nase bact6- rienne est tr+s sp6cifique 5. condition d'utiliser des pr6parations enzymatiques d6- pourvues d'activit6s prot6asiques non sp6cifiques [29]. Les pr6parations de colla- g6nase que nous avons utilis6es ont 6t6 purifi6es au laboratoire scion la m6thode de Peterkofsky [13] et nous avons v6rifi6 qu'elles ne contenaient plus d'activit6 prot6asi- que d6celable sur une pr6paration d'h6moglobine, ni d'activit6 neuraminidasique re- cherch6e sur une pr6paration d'orosomucoide.

Apr6s lyophilisation, les glycoprot6ines de structure extraites par l'ur6e ont une forte tendance 5. s'associer pour former des complexes macromol6culaires. Pour en isoter les unit6s 616mentaires, il est n6cessaire de faire appel 5. une 6tape de r6duc- tion. Au tours d'essais pr61iminaires, nous avons pr6cis6 les mei[leures conditions de dissociation de ces complexes. La r6duction par le mercapto6thanol 5. 1 ~ en pr6sence d'ur6e 8 M e n tampon phosphate disodique et monopotassique 0.01 M de pH 7.1 est insuflisante puisque dans ces conditions la plus grande partie de la pr6paration est 61u6e au niveau du volume mort d'une coionne de S6phadex G 200 6quilibr6e dans le m~me tampon. La r6duction en pr6sence de dod6cyl sulfate de sodium permet une dissociation beaucoup plus satisfaisante des glycoprot6ines, seule une faible quan- tit6 de la pr6paration demeure alors exclue sur S6pharose 4 B,

En 6tudiant les glycoprot6ines du tissu sous cutan6 en 61ectrophor6se en gel d'acrylamide, Wolff [3] a montr6 que l'h6t6rog6n6it6 constat6e pouvait s'expliquer en admettant l'existence de subunit6s de masse mol6culaire 6gale 5. environ 15 000. L'utilisation de notre m6thode de fractionnement conduit effectivement 5. isoler deux types de subunit6s dont la masse mol6culaire peut ~tre 6valu6e ~ 16 000. La m6thode de pr6paration utilis6e, faisant appel ~ une r6duction, permet d'6valuer la masse mol6culaire des chaines glycoprot6iques constituant les glycoprot6ines de structure sans pr6juger de leur masse mol6culaire r6elle dans le tissu natif. II est en effet possible que plusieurs subunit6s soient associ6es entre elles pour former des complexes de masse mol6culaire plus 61ev6e.

La plupart des glycoprot6ines de structure isol6es jusqu'ici ne satisfont pas 5. des crit+res de puret6 suitisants. Les 6tudes 61ectrophor6tiques sur cellogel, en gel d'agarose, ou en gel d'acrylamide apr6s r6duction et alkylation des pr6parations de glycoprot6ines du derme de lapin obtenues apr6s gel filtration sur S6pharose 4 B ne montrent en effet qu'une seule bande prot6ique alors que deux acides amin6s N ter- minaux sont identifi6s par dansylation. La d6termination des acides amin6s N ter- minaux apporte un crit6re de puret6 suppl6mentaire auquel satisfont les deux pr6- parations isol6es apr6s chromatographie sur Dowex 1 × 2. La pr6sence de ces deux glycoprot6ines a d6j~ 6t6 signal6e dans une note pr61iminaire [30]. Plus r6cemment, Serafini-Fracassini a isol6 du ligament nuehal de boeuf, une glycoprot6ine de structure ayant une masse mol6culaire de 14 5. 15 000 et dont l'acide amin6 N terminal est le glycocolle [31].

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Les compositions en acides amin6s des diff&entes glycoprot6ines de structure d6j~ ~tudi6es sont tr~s comparables mais il existe des diff6rences marquantes dans leur composition en oses. Junqua a soulign6 leur sp6cificit6 d'esp~ce et d'organe [11]. Ceci peut rendre compte de la plupart des diff6rences constat6es. Toutefois, en com- parant les pr6parations obtenues/t partir d'une m~me source comme le tissu sous cu- tan6 de lapin [32, 33], les 6carts demeurent tr6s sensibles. I1 est possible qu'il existe des variations de structure individuelles en relation avec les groupes tissulaires [34] mais certaines de ces diff6rences peuvent 6galement s'expliquer par un m61ange en quantit6 variable des deux types de glycoprot6ines D~ et D 2 puisque l'une d'elles (D1) a une teneur en oses deux fois plus 61ev6e que l'autre.

Le calcul du nombre de r6sidus d'acides amin6s et d'oses a 6t6 effectu6 pour Dx et D2 en prenant comme base de calcul une masse mol6culaire de 16 000 (Tableau 1I). Le nombre de r6sidus d'acides amin6s calcul6s est tr~s proche pour chacune de ces glycoprot6ines. Les diff&ences notables portent sur l'acide glutamique ou la glutamine (23/t 24 d6sidus pour Dz contre 18 pour DO et sur la m&hionine (1 r6sidu pour D~, 2 ou 3 pour D:). La pr6sence de 4 ou 5 r6sidus d'hexoses dans la glycopro- t6ine la moins glycosyl6e (Dz) est compatible avec la raise en 6vidence par chromato- graphic sur papier de galactose, de mannose et de glucose. La pr6sence d'un seul r6sidu de glucosamine la diff6rencie nettement des glycoprot6ines d'origine s6rique. Le calcul du nombre de r~sidus par mol6cule fait apparaitre une incertitude au niveau de l'acide sialique. II est possible que certaines mol6cules aient 6t6 d6sialid6es au cours des dif- f6rentes 6tapes pr6paratives/~ moins qu'il n'existe une microh&6rog6n6it6 au niveau de la p6riph&ie des chaines glucidiques.

BIBLIOGRAPHIE

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