ispitivanje fenolnog sastava i antioksidativne … · uključujući fenolna jedinjenja, flavonoide,...

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA HEMIJU

ISPITIVANJE FENOLNOG SASTAVA I ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI

EKSTRAKATA BILJNE VRSTE JUGLANS REGIA L.

- MASTER RAD -

Mentor: Student:

Prof. dr Danijela Kostić Viktor Salić

Niš, 2019

2

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: Мастер рад

Аутор, АУ: Виктор Салић

Ментор, МН: Данијела Костић

Наслов рада, НР: Испитивање фенолног састава и антиоксидативне активности екстраката биљне врсте Juglans regia L.

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2019.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт Ниш

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО:

(поглавља/страна/

цитата/табела/слика/графика/прилога)

Стране 47, слика 4, табела 5, графикона 7, референце 61

Научна област, НО:

Хемија

Научна дисциплина, НД: Хемија природних производа

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Juglans regia L., UV/Vis спектрофотометрија, феноли, флавоноиди, антиоксидативна активност

УДК 547.56:582.628.091

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ:

У овом мастер раду, спроведено је одређивње укупног садржаја фенола, флавоноида, као и испитивање антиоксидативне активности етанолних екстраката биљне врсте Juglans regia L. Испитани су екстракти осушених ресица , свежег лишћа, младог (зеленог) плода ораха и суве љуске плода ораха применом погодних спектрофотометријских метода.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан:

3

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: тextual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Viktor Salić

Mentor, MN: Danijela Kostić

Title, TI: Examination of the phenolic and antioxidant activity of extracts of the plant

species Juglans regia L.

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2019

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/ appendixes)

Pages 46, chapters, pictures 4, graphs 7, tables 5, references 61

Scientific field, SF: Chemistry

Scientific discipline, SD: Chemistry of natural products

Subject/Key words, S/KW: Juglans regiaL., UV/Vis spectrophotometry, phenols, flavonoids, antioxidant

activity

UDC 547.56:582.628.091

Holding data, HD: Library

Note, N:

Abstract, AB:

In this master thesis, the total content of phenols, flavonoids, as well as antioxidant activities of ethanol extracts of the plant species Juglans regia L. were determined.

The extracts of dried male flover, fresh leaves, young (green) walnut fruit and

dried walnut shell were examined using suitable spectrophotometric

methods.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

4

Eksperimentalni deo ovog rada odvijao se u laboratoriji Departmana za hemiju

Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu.

Iskreno se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Danijeli Kostić na velikoj podršci,

strpljenju, razumevanju i pružanju nesebične pomoći u ovom radu.

Zahvaljujem se svima onima koji su mi pružali podršku i pomoć u mom

školovanju.

5

SadržajUVOD ...................................................................................................................................................... 7

1. TEORIJSKI DEO ...................................................................................................................................... 9

Biljka Juglans regia L.................................................................................................................... 10

1.Tradicionalna upotreba oraha .............................................................................................. 14

1.1.2. Lekovita svojstva oraha ........................................................................................................ 15

FENOLNA JEDINJENJA .................................................................................................................. 17

Flavonoidi ............................................................................................................................... 19

Antioksidativna aktivnost polifenolnih jedinjenja ..................................................................... 20

METODE EKSTRAKCIJE ................................................................................................................. 21

Ekstrakcija ultrazvukom ........................................................................................................... 22

UV/Vis SPEKTROFOTOMETRIJA .................................................................................................... 22

2. EKSPERIMENTALNI DEO ...................................................................................................................... 24

MATERJAL................................................................................................................................... 25

REAGENSI .................................................................................................................................... 25

APARATI ...................................................................................................................................... 27

METODE ..................................................................................................................................... 27

Određivanje sadržaja ukupnih fenola ....................................................................................... 27

Određivanje sadržaja flavonoida .............................................................................................. 28

Primena UV/Vis spektrofotometrije za određivanje antioksidativne aktivnosti ...................... 29

3. REZULTATI I DISKUSIJA........................................................................................................................ 32

Određivanje sadržaja ukupnih fenola, flavonoida i antioksidativne aktivnosti u ekstraktima

osušene resice oraha ......................................................................................................................... 33

Određivanje sadržaja ukupnih fenola, flavonoida i antioksidativne aktivnosti u ekstraktima svežih

listova oraha ..................................................................................................................................... 34

6

Određivanje sadržaja fenola, flavonoida i antioksidativne aktivnosti ekstrakata svežih oraščića .. 36

Određivanje sadržaja fenola, flavonoida i antioksidativne aktivnosti ekstrakata ljuske oraha ...... 37

Uporedna analiza sadržaja ukupnih fenola, flavonoida i antioksidatvne aktivnosti u ispitivanim

ekstraktima ....................................................................................................................................... 39

4. ZAKLJUČAK ........................................................................................................................................ 42

Reference .............................................................................................................................................. 43

7

UVOD

8

Istorija korišćenja lekovitih biljaka je duga koliko i istorija čoveka, tako da ima istoriju od

nekoliko hiljada godina u nekim zemljama (Cragg GM, Newman DJ, 2005; Silva NCC,

Fernandes A, 2010). U prošlosti, lekovite biljke i prirodni lekovi predstavljali su osnovni vid

lečenja. Tradicionalna medicina ukazuje da lekovite biljke mogu da izleče sve bolesti samo ako

se upotrebe na pravi način. Za lekovitim biljkama oduvek se pokazuje veliko interesovanje.

Rastu svuda oko nas, lako se uzgajaju i prerađuju, ne zagađuju i nisu opasne za okolinu, a što je

najvažnije prouzrokuju mnogo manje štete od mnogih sintetičkih supstanci koje nalazimo u

skoro svim lekovima, kozmetičkim preparatima i industrijskoj hrani. Poslednjih decenija

povećana je tendencija korišćenja prirodnih materijala (Oliveira i sar., 2008), zbog toga što

sintetičke supstance pokazuju pored korisnih čitav niz štetnih efekata na zdravlje.

Ispitivanje biološke aktivnosti i hemijska karakterizacija do sad neispitanih biljnih vrsta

je od izuzetnog naučnog i praktičnog interesa. Svaka biljka daje sekundarne metabolite

uključujući fenolna jedinjenja, flavonoide, esencijalna ulja, terpenoide, glikozide, terpene,

alkaloide, tanine, koji mogu biti odgovorni za različite terapeutske efekte (Devkota i sar., 2015).

Prirodni antioksidansi poput fenolnih jedinjenja imaju značajnu i veliku vrednost za ljudsko

zdravlje, jer smanjuju rizik od degenerativnih bolesti. ( Mohammadi i sar., 2014; Silva i sar.,

2004)

Prisustvo antioksidanata u živim organizmima je od vitalnog značaja, jer aerobni

organizmi, in vivo kontinualno stvaraju slobodne radikale i reaktivne kiseonične vrste. Slobodni

radikali su najčešće vrlo reaktivni i u povećanim koncentracijama mogu da dovedu do oštećenja

ćelija i tkiva što može biti uzrok velikog broja oboljenja (Nikolić i sar., 1998).

Predmet ovog rada bio je sprovođenje hemijskog ispitivanja biljne vrste 'Orah' (lat.

Juglans regia), kao i njegovih delova: resica, listova, mladih (nezrelih) plodova oraha i ljuspe, u

cilju dobijanja više informacija o sadržaju fenolnih jedninjenja i njihovoj antioksidativnoj

aktivnosti, kao i o sadržaju flavonoida.

Sadržaj ukupnih fenola je određen spektrofotometrijski metodom po Folin-Ciocalteu.

Sadržaj flavonoida je određen građenjem kompleksa sa AlCl3, antioksidativna aktivnost je

određena primenom DPPH metode (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil).

9

1. TEORIJSKI DEO

10

1.1. Biljka Juglans regia L.

Običan, domaći persijski ili grčki orah jeste voćka oblasti severne Zemljine polulopte sa

umerenom i suptropskom klimom. Filogeneza oraha je veoma duga. Na osnovu iskopina zna se

da je rastao pre više desetina miliona godina u šumskim oblastima Kine, Indije, Avganistana,

Irana, Turske i zemalja balkanskog poluostrva. (Korać, 1986)

Prema navodima mnogih autora (Ghena, 1964; Stančević i Bugarčić, 1975; Forte, 1975)

orah se počeo prvo gajiti u Kini, zatim u Japanu i Indiji, a potom na obalama Sredozemnog mora

gde ga prvo gaje Grci (zbog čega se naziva 'grčki orah'), od kojih su ga preuzeli Rimljani i

raširili po čitavoj Evropi (Korać, 1986). Rana istorija ukazuje da su engleski orasi nastali iz

drevne Persije, gde su bili rezervisani za vernost. Stoga je orah poznat kao i 'Persijski orah'.

(Shah i sar., 2014)

U sistematici biljaka orah zauzima sledeće mesto (Korać, 1986):

Tip: Angiospermae (skrivenosemenice)

Klasa: Dicotyledonae (dikotiledone)

Red: Juglandales

Familija: Juglandaceae

Rod: Juglans

Vrsta: Juglans regia

Latinski naziv 'Juglans' potiče od reči 'Jovis' i 'Glans' što znači 'Jupiterov žir' (Korać,

1986). To je veliko listopadno drvo visine do 35 m, obim stabla može biti i do 3 m. Orah živi i

preko 100 godina, dok kalemljeni orasi imaju kraći životni vek. Orah ima punu krošnju širine 10-

15 m.

Koren oraha je dobro razvijen, osovinski sa okolo razvijenim bočnim korenom. Zato u

prirodnim uslovima orah ima jako razvijenu sržnu žilu koja duboko prodire u zemlju. Ova

osobina čini orah pogodnim za pošumljavanje i vezivanje nestabilnih terena (klizišta). (Godet,

Jean-Denis, 2010)

Kora ove biljke je smeđa ili tamno zelena koja sa starošću biljke počinje da puca.

Pupoljci su zeleno-sivi. (Godet, Jean-Denis, 2010)

Listovi su neparno perasto deljeni, dužine 20-40 cm, i sadrže 3-11 liski, dužine 5-18 cm i

širine oko 5 cm. Raspored listova je naspraman i imaju intenzivan miris. Period listanja je april.

Cveta pre listanja.

Razlikuju se muški i ženski cvetovi.

Muški cvetovi su grupisani u cvastima (resama) dužine do 10 cm, u kojima je smešten

veliki broj prašnika, dok su ženski cvetovi sitni, zelene boje, nalik pupoljcima (Janković D. i

sar., 2014). Period cvetanja se takođe razlikuje kod muških i ženskih cvetova, muški cvetovi se

javljaju pre pojave listića, u aprilu, ženski kasnije, u period od aprila do maja.

11

Plod oraha je koštunica, okruglog oblika prečnika 3-5 cm koja tokom sazrevanja menja

boju od zelene do braon.

Seme je beličasto do žuto, izbrazdano, sa puno masnih kiselina i ulja. (Godet, Jean-

Denis, 2010)

Do sada je rasprostranjenost oraha i leske u Srbiji i Crnoj Gori više bila posledica povoljnih

prirodnih uslova nego organizovanog uticaja nauke. (Šoškić, 2011)

Slika 1.1. Orah i njegovi delovi

Orah potiče sa Dalekog istoka i iz Male Azije, ali postoje podaci i da potiče sa

Mediterana tako da se njegovo tačno poreklo ne zna. Od oraha se mogu koristiti listovi, mladi

plod i zreo plod. Lekovita dejstva ove biljke imaju: lišće koje se sakuplja u proleće, nezreo plod

koji se sakuplja u junu i zreo plod koji se sakuplja u jesen. Poznato je da su ljudi od davnina

koristili orah za pripremanje različitih melema, likera, kako za spoljnu upotrebu (ispiranje u

slučaju infekcije), tako i unutrašnju (pripremanjem čajeva od lišća) za jačanje organizma i

čišćenje krvi. (Čađenović, Milovanović i Vlajković, 2012)

12

Plod oraha

Rezultati ispitivanja su pokazali da u plodu oraha ima 7-10% ugljenih hidrata, do 63%

lipida, 17,8% proteina uz neznatan sadržaj vode i dijetnih vlakana -7,8%. Od vitamina prisutni su

vitamin A i E, vitamini B grupe i to: B1, B2, B3, B5 i B6 kao i vitamin C.

Orah sadrži 2-3% minerala i to kalijum, kalcijum, fosfor, magnezijum, natrijum, gvožđe,

mangan, bakar i cink. Najveća vrednost oraha se ogleda u velikom sadržaju omega-3-masnih

kiselina i antioksidanata. Od masnih kiselina u orahu su najzastupljenije nezasićene masne

kiseline oleinska, linolna i α-linoleinska, gde je dokazano da nivo linolne kiseline dominira u

odnosu na α-linoleinsku kiselinu. Mada se u tragovima u orahu pojavljuju i zasićene masne

kiseline kao što su palmitinska, stearinska, miristinska i druge. Orah teško podleže reakciji

oksidacije poredeći ga sa drugim plodovima, što je ukazuje na pojačano prisustvo

antioksidativnih jedinjenja, koja smanjuju autooksidaciju lipida. Jedina biljka čiji plod ima jača

antioksidativna svojstva od oraha jeste šipurak. Najveća antioksidativna svojstva ispoljava opna

oraha, što je utvrđeno na osnovu prisustva fenolnih jedinjenja u različitim delovima oraha.

Različite analize i ispitivanja pokazala su da fenoli iz biljaka utiču na smanjenje rizika od

nastanka kancera i različitih srčanih bolesti. Sadržaj fenola u biljci zavisi od zrelosti oraha.

Glavna fenolna komponenta oraha jeste juglon, jedinjenje poznato po antimikrobnom

dejstvu. To je aromatično jedinjenje koje se nalazi u lišću, korenju, ljusci i kori biljaka iz

porodice Juglandaceae. Juglon je otrovan za mnoge druge biljke i sprečava njihov rast, zbog čega

se ponekad koristi i kao herbicid. Takođe, koristi se i kao dodatak bojama za tekstil i farbama za

kosu. Tokoferol (Vitamin E) se najvećim delom nalazi u ulju koje se dobija hladnim ceđenjem.

Ekstrakcijom ceđenog oraha, takođe se dobija znatan procenat tokoferola koji ispoljava

znatno jače antioksidativno dejstvo od samog ulja. Tokoferol kao antioksidant može da

stabilizuje masne kiseline u ulju i na taj način spreči užeglost ulja tokom skladištenja.

Treba takođe napomenuti da naučnici još nisu sigurni da li orasi deluju kao

hemopreventivni agent protiv karcinoma, efekat koji može biti posledica visokih vrednosti

fenolnih jedinjenja u voću, antioksidativne aktivnosti kao i snažne „in vitro“ antiproliferativne

aktivnosti. Ipak treba biti umeren pri konzumiranju oraha obzirom na energetsku vrednost i

činjenicu da ga mnogi nazivaju „energetskom bombom”. Tako, nakon svega se preporučuje

korišćenje oraha u svakodnevnoj ishrani doduše u malim količinama (4-5 komada), kao

13

preventiva protiv raznih bolesti i zadovoljenja dnevnih potreba za esencijalnim nezasićenim

masnim kiselinama.

List oraha

Listovi oraha korišćeni su kako u kozmetičkoj tako i u farmaceutskoj industriji. Koristi

se u narodnoj medicini za lečenje venske insuficijencije i hemoroida, a takođe ima

antidijaretično, antihelmintsko, depurativno i adstrigentno dejstvo. Sadržaj fenola u orahu je

promenljiv. Koncentracije fenola zavise od sorte, od ontogenetskog stadijuma izdanaka ,

klimatskih uslova i poljoprivredne prakse i datuma berbe (Amaral i sar., 2008).

Ukupni fenoli se povećavaju tokom juna i meseca jula, zatim smanjuju se u avgustu,

novo povećanje beleži se od početka septembra; vrednosti se kreću između 9,94 mgGAE / 100 g

(1. juna) i 30.07 mgGAE / 100g (1. septembra).

Amaral i sar. (2004) su odredili da količina ukupnih fenola u lišću šest sorti oraha je

varirala od 12,4 do 34,5 g / kg i sve sorte su pokazali nešto veće vrednosti ukupnih fenolna

jedinjenja tokom maja i jula.

Ova činjenica pokazuje da ukupni sadržaj fenola zavisi od vremena uzorkovanja i to

podržavaju drugi autori. Biosinteza fenolnih jedinjenja može se indukovati jačom sunčevom

svetlošću i dužinom dana, dakle sadržaj fenola se povećava do početka avgusta. Visoki

temperaturni stres podstiče proizvodnju fenolnih jedinjenja; povećanja koja su primećena u

fenolnom sadržaju orahovog lišća u julu mogu se pripisati višim temperaturama. (Comulescu i

Trandafir, 2011)

Zeleni omotač oraha

Zelena ljuska je otpadni proizvod koji se široko koristi u narodnoj medicini za lečenje

kožnih bolesti i ublažavanje bola. Međutim, poslednjih godina privlače sve veću pažnju njihova

antioksidativna svojstva. Zelene ljuske su sporedni proizvodi u berbi plodova oraha i u poslednje

vreme cenjene su kao izvor prirodnih jedinjenja sa antioksidativnim i antimikrobnim svojstvima.

(Fernandez i sar., 2013)

14

Resice oraha

Muški cvetovi se sastoje od jedne brahteje i jednog perijanta od pet sraslih listića.

Brahteja i perijant su srasli da bi bolje štitili prašnike. Cvetovi pri osnovi rese mogu imati i do 30

prašnika, a pri vrhu rese znatno manje. Većina sorti oraha u punom rodu formira više resa nego

ženskih cvetova. (Korać, 1986)

Ljuska oraha

Ljuska oraha je hemijski inertan, tvrd, biorazgradiv i netoksičan materijal koji se

uglavnom koristi kao abraziv. Ona čini značajan procenat ukupne težine i ima širok spektar

primene. Kao nusproizvod dostupna je u velikim količinama. Može da se koristi za sagorevanje

kao obnovljivi izvor energije. Koristi se kao abraziv, čisti i polira meke metale, kamen, fiberglas,

plastiku i drvo. Takođe služi kao efikasan medijum za prečišćavanje voda koje su zagadjene

sirovom naftom (Owens i sar., 2007), opasnim materijama (Altun i sar., 2012; Ding i sar., 2013;

Kazemipour i sar., 2008; Köhler i sar., 2007; Pehlivan i sar., 2008) i teškim metalima (Saadat i

sar., 2011; Saifuddin i sar., 2005; Saqib i sar., 2013; Shah i sar., 2013; Soleimani i sar., 2014).

Poslednjih godina izolovanje antioksidansa i antimikrobnih pirolignih kiselina iz ljuske oraha

opisano je u nekim istraživanjima. (Jahanban-Esfahlan, 2018; Wei i sar., 2010; Zhai i sar.,

2015)

1.Tradicionalna upotreba oraha

Arheološki dokazi za prikupljanje i konzumiranje oraha potiču iz 7300 god p.n.e u

blizini Sredozemlja. Istorijski posmatrano, korišćeni su različiti delovi biljke, uključujući plod,

koru, list i zelene ljuske. kao lekovi u narodnoj medicini. Jestivi deo ploda (seme ili zrno) je

konzumiran, svež ili pečen, sam ili sa drugim jestivim proizvodima zbog njihovih hranljivih

sastojaka.

Listovi oraha su se široko koristili u tradicionalnoj medicini za lečenje upale kože,

venskih insuficijencija, hemoroida, čireva, za dijareju. List oraha ima antihelmintska,

depurativna, antioksidantivna, antiseptička, antibakterijska, adstrigentna i hemopreventivna

svojstva.

Koren i kora stabljike korišćeni su kao antihementski, adstrigentni i deterdžentni agensi.

Kora stabljike se osuši i koristi se kao sredstvo za čišćenje zuba i sredstvo za čišćenje. Dekokti

lišća i kore korišćena je sa alumom za bojenje vune u braon boju.

U Kašmiru na Himalajima lišće je korišćeno kao sredstvo protiv komaraca, za lečenje

svraba, hronične dizenterije i promrzline. Plod se koristio za bolje pamćenje, kao afrodizijak, kod

zatvora i za lečenje reumatizma. Ulje oraha se koristi protiv peruti, kod bolova u mišićima, za

15

poboljšanje vida i poboljšanje memorije; dok su koreni korišćeni protiv opadanje kose, bolesti

zuba, kao antiseptik i za zarastanje rana.

U turskoj narodnoj medicini, sveže lišće primenjuje se na golom telu ili čelu kako bi se

smanjila temperatura ili ublažio reumatski bol.

Plod oraha korišćen je za lečenje upale creva i dijabetesa u iranskoj tradicionalnoj

medicini.

Kora, grane i egzokarp zelenog ploda dugo su se koristili za lečenje raka želuca, jetre i

pluća u Kini. Orah je korišćen u severoistočnom delu Meksika za lečenje oštećenja jetre. U

Nepalu pasta kore se koristila kod artritisa, kožnih bolesti i zubobolje. Ljuska oraha korišćena

je u Kalabriji kao lek za lečenje malarije. Drvo je veoma kvalitetno, a koristilo se za pravljenje

nameštaja i baruta. (Ali Esmail Al-Snafi, 2018)

1.1.2. Lekovita svojstva oraha

Antibakterijsko delovanje

Vodeni ekstrakti lišća, kore, ploda i zelene ljuske oraha iz različitih zemalja su pokazali

antibakterijsko delovanje širokog spektra protiv gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija, tj.

Bacillus careus, Bacillus subtilis, Staphilococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Salmonella

tiphimurium, Enterococcus faecalis, Bacillus, thuringiensis, Protomonas ektrokuens i Proteus sp.

(Deshpande i sar., 2011; Poirazolu i sar., 2010; Pereira i sar., 2008; Oliveira i sar., 2008;

Pereira i sar., 2007; Qa'dan i sar., 2005; Citoglu i Altanlar, 2003; Upadhyay i sar., 2010)

Antigljivično delovanje

Vodeni ekstrakti plodova, lišća i kore oraha pokazali su antigljivično delovanje protiv

širokog spektra gljivica koristeći disk-difuzijsku metodu, metodu razblaživanja agara i dr.

Pereira i sar., (2008) su utvrdili da su sve vrste oraha pokazale antigljivično delovanje

protiv Candida albicans i Cryptococcus neoformans kada su bile mešane sa petroletrom.

Hladni ekstrakti plodova, lišća i kore sprečavali su rast gljivica Microsporum canis,

Trichophyton mentagrophytes i Trichophyton violaceum. (Ali-Shtayah i sar., 1999)

S druge strane, vodeni ekstrakt ljuske zelene kore nije pokazao antigljivično delovanje protiv C.

albicans i C. neoformans. ( Oliveira i sar., 2008)

16

Antivirusno delovanje

Mei Zhi i sar., (2007), su utvrdili da 95% etanolni i etil-acetatni ekstrakti lišća inhibiraju

dejstvo mozaičnog virusa duvana (VMD). Metanolni ekstrakt oraha inhibira dejstvo Sindbis

virusa pri minimalnoj koncentraciji od 1,5 µg/ml. (Mouhajir i sar., 2001)

Antioksidativno delovanje

Ekstrakti orahovog jezgra, lišća i ljuspe (etil-acetatni, butanolni, metanolni, etarski

ekstrakti) pokazali su antioksidativno delovanje mereno različitim metodama (scavenging

activity na 2,2-difenyl-1-pikrilhidrazil (DPPH), inhibicija oksidacije lipida pomoću β- karoten-

linoleata i dr.). Svi ekstrakti su pokazali jaku antioksidativnu aktivnost (Qamar i Sultana, 2011;

Carvalho i sar., 2010; Abbasi i sar., 2010; Rahimipanah i sar., 2010; Zhang i sar, 2009;

Almeida i sar, 2008; Oliveira i sar., 2008; Pereira i sar., 2008; Pereira i sar., 2007; Fukuda

i sar., 2003)

Antidijabetičko delovanje

Fukuda i sar., (2004) su ukazali na jaku inhibitornu aktivnost polifenola iz oraha i

polifenolnih komponenti poput kasuarictina, telimagradina 2 i telimagradina 1 na različite

enzime, poput glikozidaze, saharidaze, maltaze i amilaze. Pored ovog navedenog otkrića,

istraživači su primetili da frakcija bogata polifenolima, ima efekat na smanjene triglicerida kod

pacijenata sa Dijabetes melitusom tipa 2.

Konzumiranje listova oraha kod pacova dijabetičara koji je izazvan aloksanom u dozi od

185 mg/kg, značajno je smanjilo sadržaj šečera u krvi, a morfometrijskom studijom pankreasa

pokazala se regeneracija β-ćelija. (Jelodar i sar., 2007)

Antidepresivno delovanje

Eksperimenti sprovedeni na miševima su pokazali da macerirani heksanski ekstrakt ploda

oraha ima značajnu antidepresivnu aktivnost, u dozama od 100 i 150 mg/kg telesne mase, u

poređenju sa uobičajenim lekom fluoksetinom. (Rath i Pradhan, 2009)

17

Antikancerogeno delovanje

Istraživanjima sprovedenim na miševima pokazalo se da je orah inhibirao karcinogenezu

creva indukovanu azoksimetanom, i mogao bi da bude obećavajući hemopreventivni agens za čoveka.

(Sugie i sar., 1998)

Dokazano je da je orah moćan citotoksični agens ‘in vitro’ u ćelijama ljudskog tumora,

uključujući ćelije humanog karcinoma debelog creva (HCT-15), humane ćelije leukemije (HL-60), i

humane ćelije leukemije otporne na doksorubicin (HL-60 R). (Kamei i sar., 1998; Segura-

Aguilaretal, 1992)

Antitirozinazno delovanje

Ozer i sar., (2007 ) su sugerisali da gel koji sadrži elaginsku kiselinu i ekstrakt lišća oraha

efikasan je u lečenju neujednačene pigmentacije kože. Kao novi izbeljivač kože može se

predstaviti etanolni ekstrakt lišća oraha.

Aitani i Shimoda (2005) su izvestili da je stvaranje melanina inhibirano u koncentraciji od

1 do 30 μg/cm3 u predkultiviranim ćelijama melanoma B16, inkubiranim sa medijumom koji

sadrži polifenole oraha, i rezultat je pokazao da su polifenoli oraha, kao sredstvo za

posvetljivanje kože, efikasniji i superiorniji u poređenju sa askorbinskom kiselinom i arbutinom.

FENOLNA JEDINJENJA

Fenolna jedinjenja predstavljaju široko rasprostranjenu grupu biljnih metabolita koja

mogu biti vrlo jednostavne strukture, kao što su fenolne kiseline, ili vrlo složene strukture,

odnosno, polikondenzovana jedinjenja kao što su proantocijanidoli. Zajednička karakteristika

fenolnih jedinjenja je da sadrže aromatičan prsten sa jednom ili više hidroksilnih grupa.

Najvažnije klase fenolnih jedinjenja su prikazane u Tabeli 1.

Fenoli imaju kiseo karakter usled disocijacije hidroksilne grupe. Oni su slabo reaktivna

jedinjenja i obično grade vodonične veze. Druga njihova veoma važna osobina je da mogu da

grade komplekse sa teškim metalima. Takođe se mogu lako oksidovati i mogu graditi polimere

tamne boje. Tamnjenje biljnih delova na mestu preseka je posledica ovih reakcija kojima podležu

fenolna jedinjenja. Fenolna jedinjenja se veoma retko nalaze slobodna u biljnim ćelijama. Ona se

18

najčešće kupluju sa drugim molekulima, kao što su ostaci šećera (glikozidi), ostaci sumporne

kiseline i sirćetne kiseline.

Tabela 1. Najvažnije klase fenolnih jedinjenja.

Broj C-atoma

Osnovni skelet Klasa Jedinjenje

6 C6 Prosti fenoli,

Benzohinoni

Katehol, hidrohinon, resorcinol

7 C6 - C1 Fenolne kiseline p-hidroksibenzoeva kiselina

8 C6 - C2 Fenilsirćetne kiseline p-hidroksifenilsirćetna

9 C6 - C3 Cimetne kiseline Kafena kiselina, ferulna

kiselina

Fenilpropeni Eugenol, miristicin

Kumarini Umbeliferon, skopolin

Hromoni Eugenin

10 C6 - C4 Naftohinoni Juglon

13 C6 - C1 - C6 Hantoni Mangostin, magniferin

14 C6 - C2 - C6 Stilbeni, Razveratrol

Antrahinoni Apigenin, luteolin, sinensitin,

nobiletin, izosinensitin,

tangeretin, diosmin

15 C6 - C3 - C6 Flavanoli Dihidrokvarcetin i dihidrokamferol glikozidi

Flavanoni Hesperidin, naringenin Flavanon glikozidi Hesperidin, neohesperidin,

narirutin, naringinin, eriocitrin Antocijanini Glikozidi peralgonidina,

peonidina, delfinidina, petunidina, cijanidina

Katehini Katehin, epikatehin, galokatehin, epigalokatehin

Halkoni Floridţin, arbutin, halkonarigenin

18 (C6 - C3)2 Lignani, neolignani Pinorezinol 30 (C6 - C3 - C6)2 Biflavonoidi Agatisflavon, amentoflavon

19

Flavonoidi

Flavonoidi su polifenolna jedinjenja koja imaju 15 C-atoma, sadrže dva benzenova jezgra

koja su međusobno povezana tročlanim ugljovodoničnim nizom (slika 1.2.).

Slika 1.2. Skelet flavonoida (C6 - C3 - C6 sistem).

Flavonoidna jedinjenja su veoma značajni biljni pigmenti. Različito vezivanje

flavonoida i ostataka šećera daje različite derivate, koji se znatno razlikuju po nijansama boja.

Nalaze se u svim delovima biljaka. Hemijska struktura flavonoida bazira se na C15 skeletu sa

hromanovim prstenom za koji je vezan bezenov prsten u položajima najčešće 2, ređe 3 ili 4.

Klase flavonoida međusobno se razlikuju prema oksidacionom statusu heterocikličnog

prstena i poziciji vezivanja B-prstena. Šest najznačajnijih grupa flavonoida su:

Halkoni-B prsten je vezan za aciklični tročlani niz;

Auroni-B prsten je vezan za petočlani izomerni niz;

Flavoni;

Flavonoli;

Flavanoni;

Antocijanidini-B prsten je vezan u položaju 2.

Postoje još dve klase flavonoida a to su izoflavonoidi i neoflavonoidi koji se nazivaju

abnormalni flavonoidi. Kod izoflavonoida (izoflavoni i izoflavonoli) - prsten B je vezan za

heterociklični prsten u položaju 3, dok je kod neoflavonoida B prsten vezan u položaju 4.

Flavonoidi su prisutni u svim zelenim biljkama, dok u životinjskom svetu nisu prisutni.

Flavonoidi u biljkama imaju različite uloge: privlače insekte koji učestvuju u oprašivanju biljaka,

20

imaju ulogu zaštite biljaka od mikroba i štetnog UV zračenja, katalizatora u fotosintezi i

regulatora metabolizma gvožđa u fosforilaciji.

Flavonoidi su većinom biljni pigmenti, koji su odgovorni za boju cvetova, listova i

plodova biljaka. Boja se kreće od žute do bele, osim kod antocijanidina kod kojih se boja kreće

od ružičaste do ljubićaste (Petri i sar., 1997).

U prirodi se najčešće nalaze u obliku monoglikozida, a ređe u obliku di i tri glikozida.

Glikozidi se najčešće grade sa D-glukozom, D-galaktozom i L-ramnozom. Ostali monosaharidi

su manje zastupljeni. (Dimitrijević, 2014)

Velika upotreba biljnih flavonoida je značajna zbog njihovog pozitivnog efekta na

zdravlje ljudi. Antioksidativno delovanje flavonoida podrazumeva sakupljanje i odstranjivanje

slobodnih radikala.

Flavonoidi su najveću ulogu pronašli u sprečavanju bolesti arteroskleroze (bolest

mišićnih arterija koje se nalaze na prednjoj strani vrata i imaju ulogu u transportu krvi od srca do

mozga), kao i u prevenciji i lečenju kardiovaskularnih bolesti. Njihova pozitivna svojstva se

ispoljavaju u prevenciji raka gušterače i jajnika kod žena. Poseduju i antivirusno dejstvo.

Antioksidativna aktivnost polifenolnih jedinjenja

Iz stabljika, lišća, cvetova i plodova raznih biljaka, zobi, pirinčanog semena, kao i

mnogih začinskih biljaka ekstrahovni su sirovi ekstrakti jakih antioksidacionih osobina. U ovim

ekstraktima, raznim instrumentalnim metodama su identifikovana različita organska jedinjenja,

od kojih glavnu ulogu u oksidativnom delovanju imaju polifenolna jedinjenja.

U biološkim sistemima polifenolna jedinjenja svoju antioksidativnu aktivnost ispoljavaju na više

načina, i to:

1) predajom H-atoma, direktnim vezivanjem (“hvatanjem”) slobodnih radikala i azotnih

radikala,

2) heliranjem prooksidativnih metalnih jona (Fe2+, Cu2+, Zn2+ i Mg2+),

3) aktiviranjem antioksidacijskih enzima,

4) inhibicijom prooksidativnih enzima (lipoksigenaza, ksantin-oksidaza, oksidaza, enzim

citohroma P-450 i dr.).

Zbog antiradikalse i antioksidativne aktivnosti, u zadnje vreme pažnju privlače i

flavonoidi. Istraživanjima se pokazalo da su za visoku antioksidativnu aktivnost flavonoida

značajne strukturne osobine i da sposobnost hvatanja radikala zavisi od strukture i supstituenta u

heterocikličnom prstenu B. Poznato je da orto supstituenti na prstenu B, posebno oni sa elektron-

21

donorskim osobinama, redukuju redoks potencijal molekula i povećavaju sposobnost gašenja

slobodnih radikala.

Za dobru antioksidativnu aktivnost značajno je prisustvo karbonilne grupe u C4 položaju

flavonoida, dvostruke veze između C2 i C3 koja je konjugovana sa okso grupom u položaju C4 i

koja omogućava veću delokalizaciju elektrona, kao i prisustvo C3 hidroksilne grupe. (Fiorani i

sar., 2002; Fernandez i sar., 2002) . Takođe su istraživanja pokazala da su flavonoidi dobri

“hvatači” slobodnih radikala, pa imaju značajnu ulogu u farmaceutskoj i prehrambrenoj

industriji. Oni inhibiraju oksidaciju lipida, koja se u biološkim sistemima dovodi u vezu sa

pojavom hroničnih oboljenja i starenjem ćelija.

(http://agroekonomija.wordpress.com/2011/02/01/antioksidativna-i-antiradikalna-aktivnost-

polifen/)

METODE EKSTRAKCIJE

Ekstrakcija je metoda razdvajanja komponenata iz smeše u cilju prečišćavanja, a radi

lakše identifikacije ili određivanja sadržaja. Cilj i zadatak ekstrakcije je da se korisna

komponenta koja se nalazi u materiji, pomoću pogodnog rastvarača izoluje, odnosno prerastvara,

a nakon toga odstranjivanjem rastvarača, dobije u čistom stanju.

Ekstrakcija može biti jednostepena (maceracija) ili višestepena (remaceracija).

Prema najjednostavnijem mehanizamu, proces ekstrakcije ekstraktivnih materija iz biljne

sirovine odigrava se kroz dve faze:

Ispiranje (brza ekstrakcija), kada neposredno po potapanju biljnog materijala u rastvarač

dolazi do brzog spiranja i rastvaranja ekstraktivnih materija iz biljnih ćelija koje se nalaze na

površini čestica biljnog materijala i čija brzina zavisi uglavnom od njihove rastvorljivosti u

rastvaraču i hidrodinamičkih uslova u suspenziji.

Unutrašnja difuzija (spora ekstrakcija), kada dolazi do prenosa mase ekstraktivnih

materija iz nerazorenih ćelija u unutrašnjost čestica biljnog materijala prema rastvoru. Ovaj

prenos mase kroz čestice biljnog materijala, natopljenog rastvorom, i graničnog sloja rastvora

oko čvrstih čestica vrši se difuzijom.

U ovom radu korišćena je ekstrakcija ultrazvukom.

http://agroekonomija.wordpress.com/2011/02/01/antioksidativna-i-antiradikalna-aktivnost-polifen/


22

Ekstrakcija ultrazvukom

Ultrazvučna ekstrakcija je jednostavan postupak koji uključuje upotrebu zvučnih talasa

kako bi se ekstrahovao uzorak uronjen u organskom rastvaraču. Uzorak sa odgovarajućim

rastvaračem stavlja se u ultrazvučno kupatilo. Ultrazvučna ekstrakcija omogućava delotvorniju

ekstrakciju od mućkanja i Soxhlet ekstrakcije. Uzrok povećanoj delotvornosti ultrazvučne

ekstrakcije je mnogo bolji kontakt između čvrste komponente i rastvarača. Ultrazvuk je po

definiciji zvuk iznad gornje granice čujnosti za normalno ljudsko uho. Ljudsko uho čuje

frekvencije između 20 Hz i 20 kHz.

Ultrazvučna kupatila se često koriste u laboratorijima jer su lako dostupnai relativno su

jeftina. Ultrazvučna kupatila rade na frekvenciji od 20-40 kH. Prednosti postupka ultrazvučne

ekstrakcije su njena relativna brzina, jednostavnost, smanjenje čestica, ubrzani prenos mase i to

što ne zahteva skupe instrumente, a nedostaci veliki volumen rastvarača i moguća potreba

višestruke ekstrakcije. Ekstrakti se nakon završene ekstrakcije moraju filtrirati. (Drmić i

Jambrak, 2010)

UV/Vis SPEKTROFOTOMETRIJA

Ultraljubičasta/Vidljiva (UV/Vis) spektrofotometrija je spektroskopska metoda koja

obuhvata proučavanje apsorpcije elektromagnetnog zračenja u oblasti između 200 i 800 nm.

Koristi se za kvantitativno određivanje organskih jedinjenja u rastvoru. Ona je nezamenljiva

metoda za identifikaciju prirodnih konjugovanih jedinjenja, kao što su: biljni pigmenti

(karotenoidi), poliacetileni, porfirini, flavonoidi, itd. Njene prednosti nad ostalim

metodama su u izuzetno velikoj osetljivosti i jednostavnom rukovanju instrumentom.

Instrument koji se koristi u UV/Vis spektrofotometriji zove se UV/Vis

spektrofotometar. On meri intenzitet svetla koji je prošao kroz analizirani uzorak i

upoređuje ga sa intenzitetom upadnog svetla. Spektrofotometar se sastoji iz svetlosnog

izvora iz koga se svetlost deli na dva jednaka zraka (referentni i analitički), monohromatora,

detektora i uređaja za pojačavanje, merenje i beleženje signala (pisača). Kao izvor zračenja

23

koristi se kombinacija volframove (za vidljivu oblast) i deuterijumske lampe (za blisku

ultraljubičastu oblast). Kao detektor se najčešće koristi fotomultiplikator(slika 1.3.)

Slika1.3. Šema spektrofotometra.

Prolaskom zračenja iz vidljivog dela spektra kroz obojeni rastvor, joni prelaznih metala

apsorbuju deo svetlosti pri čemu se pobuđuju elektoni iz d-orbitale, dok se kod organskih

molekula najčešće pobuđuju π-elektroni. Najčešće se snimaju spektri razblaženih rastvora, a

mogu se snimati i spektri gasova ili para.

Kvantitativna spektrofotometrijska analiza zasniva se na Beer-ovom zakonu (A=ε·l·c),

koji glasi: apsorbanca rastvora direktno je proporcionalna koncentraciji apsorbujuće vrste i

debljini sloja kroz koje zračenje prolazi. Za kvantitativnu analizu je bitno da se merenja

apsorbance vrše sa najvećom mogućom tačnošću i osetljivošću.

24

EKSPERIMENTALNI DEO

25

MATERJAL

Za ovaj rad korišćene su osušene resice oraha, mladi plodovi oraha veličine 2 cm, sveži

list oraha i ljuska jezgra oraha. Sveži uzorci su brani 2019. godine. Za ekstrakciju različitih

biljnih delova su korišćeni rastvarači: 25% etanol, 50% etanol, 75% etanol.

Priprema ekstrakata

Odmereno je 10 g : osušenih resica; svežeg lišća; mladih plodova oraha prečnika 2 cm;

ljuske plodova oraha. Materijal je usitnjen blenderom. Ekstrakcija je vršena na ultrazvučnom

kupatilu (u termostatiranom ultrazvučnom kupatilu (Sonic, Niš, Srbija; ukupna nominalna

snaga: 3x50 W; dimenzije kupatila: 30x15x20 cm) pri frekvenciji od 40 kHz. tri puta u trajanju

od 10 min sa po 30 ml etanola (25%, 50%, 75%). Dobijena suspenzija je profiltrirana kroz

Bihnerov levak na vakuum pumpi. Ekstrakti su prebačeni u normalne sudove zapremine 100 cm3

i dopunjeni do crte odgovarajućim rastvorom etanola, vraćeni u označene posude za uzorke koje

su odložene u frižideru do analize. Isti postupak je ponovljen za ljuske, listove i mlade plodove

oraha. (Dean, 2009)

REAGENSI

U radu su korišćeni sledeći reagensi:

Etanol (96 % v/v (Centrohem,Stara Pazova),

Rastvor Folin-Ciocalteu reagensa sadrži smešu fosfovolframove (H3PW12O40) i

fosfomolibdenove kiseline (H3PMo12O40) (komercijalni proizvod).

Rastvor Na-karbonata (20%) pripremljen rastvaranjem 200 g anhidrovanog Na2CO3 u

800 ml vode. Rastvor se zagreva dok se celokupna količina soli ne rastvori. Nakon

hlađenja doda se par kristalića Na2CO3. Nakon inkubacije od 24 h rastvor se filtrira i

dopuni dejonizvanom vodom do 1dm3.

Standardni rastvor galne kiseline je pripremljen na sledeći način: 50 mg galne kiseline se

rastvori u 10 cm3 metanola, prenese u normalni sud od 100 ml i dopuni dejonizovanom

vodom do crte. Dobijena koncentracija iznosi 5 mg/cm3. Da bi se dobila koncentracija od

26

0,05 mg/cm3, 1cm3 prethodno pripremljenog rastvora prenese se u normalni sud od 100

cm3 i dopuni dejonizovanom vodom do crte.

Radni rastvor NaNO2 (5%), pripremljen je odmeravanjem određene mase NaNO2 i

rastvaranjem u dejonizovanoj vodi.

Radni rastvor AlCl3 (2%) pripremljen je odmeravanjem određene mase AlCl3 i

rastvaranjem u dejonizovanoj vodi.

Standardni rastvor katehina: 5 mg katehina rastvoreno je u 5 cm3 etanola, preneto u

odmerni sud od 10cm3 koji je dopunjen do crte dejonizovanom vodom. Rastvor je

koncentracije 0,5 mg/cm3. Jedan cm3 ovog rastvora je prenet u normalni sud od 10 cm3 i

dopunjen vodom do crte, tako da je dobijen rastvor koncentracije 0,05 mg/cm3. Iz ovog

rastvora je pripremljena serija razblaženja pomoću koga je konstruisana kalibraciona

kriva.

Radni rastvor Na-hidroksida, c=1 mol/dm3 pripremljen je odmeravanjem određene mase

NaOH i rastvaranjem u dejonizovanoj vodi.

Sve hemikalije i rastvarači koji su korišćeni bili su p.a. čistoće nabavljeni od Merck

(Darmstadt, Germany) i Sigma-Aldrich (GmbH, Sterbeim, Germany).

Svi rastvori, koji se nisu mogli pripremiti kao primarni standardni rastvori, standardizovani su

poznatim metodama u cilju određivanja tačne koncentracije.

Sudovi koji su korišćeni prani su etanolnim rastvorom KOH, zatim rastvorom HCl (1:1),

isprani česmenskom, destilovanom i dejonizovanom vodom. Vodeni rastvori su pripremani

dejonizovanom vodom specifične provodljivosti 0,05 μS/cm.

27

APARATI

Za ispitivanje sadržaja fenolnih komponenti u ekstraktima delova oraha korišćena je

sledeća oprema:

1. Blender za homogenizovanje materijala;

2. Analitička vaga Mettler Toledo AB-204-S za odmeravanje uzoraka i čvrstih supstanci;

3. Ultrazvučna kada;

4. MicroMed high purity water system TKAWasseraufbereitungsszsteGmbH za dobijanje

demineralizovane vode;

5. Varijabilne automatske pipette Lab Mate+ za pipetiranje rastvora;

6. Hronometar za merenje vremena;

7. UV/Vis spektrofotometar Agilent 8453 sa kivetom dužine optičkog puta 1 cm za

merenje apsorbancije.

METODE

2.4.1.Određivanje sadržaja ukupnih fenola

Za određivanje sadržaja ukupnih fenola u pripremljenim uzorcima korišćena je

modifikovana metoda po Folin-Ciocalteu (12). Metoda se zasniva na oksidaciji fenolnih

jedinjenja pomoću reagensa, odnosno rastvora Folin-Ciocalteu. Rastvor Folin-Ciocalteu sadrži

smešu fosfovolframove i fosfomolibdenske kiseline. Ovaj reagens oksidiše fenolna jedinjenja, a

sam se redukuje u smešu volfram-oksida i molibden-oksida.

Na2WO4/Na2MoO4 + Fenol → (fenol-MoW11O40)4-

Mo(VI) (žuto obojen) + e- → Mo(V) (plavo obojen)

Rastvor postaje intenzivno plave boje, a intenzitet boje srazmeran je količini fenolnih

jedinjenja. Plava boja oksida je stabilna i intenzitet boje je meren spektrofotometrijski, na

talasnoj dužini λ = 760 nm . Kao standardno fenolno jedinjenje korišćena je galna kiselina i

ukuipan sadržaj fenolnih jedinjenja u ispitivanim ekstraktima izražavan je kao ekvivalent mase u

28

miligramima galne kiseline na 100 grama biljnog materijala (mg GAE/100 g). (Singleton i Rossi,

1965)

Određivanje sadržaja fenola: U normalne sudove od 10 cm3, dodato je 0,5 cm3 uzoraka

ekstrakta resice (za plod, ljuspe i list po 1 cm3). Zatim je dodata mala količina vode, 0,5 cm3

Folinovog reagensa, 2 cm3 rasvora natrijum-karbonata, i dopunjeno je destilovanom vodom do

crte. Prebačen je sadržaj u epruvete i stoji 2 h u mraku pre analize. Merenje se vrši na talasnoj

dužini od 760 nm.

Kao standard korišćena je galna kiselina i dobijeni rezultati su izrađeni kao ekvivalenti

galne kiseline (mgGAE/100g) korišćenjem jednačine iz kalibracione krive. Primenom

kompjuterskog programa ORIGIN 7.0 dobijena je jednačina prave:

A = 0,0855cx + 0,0065 R = 0,99978

gde je cx nepoznata koncentracija u mg/ml, a R koeficijenat korelacije.

Određivanje sadržaja flavonoida

Sadržaj ukupnih flavonoida određivan je korišćenjem spektrofotometrijske metode koja

je zasnovana na formiranju kompleksa između flavonoida i aluminijuma .

Reakciona smeša je pripremljena mešanjem zapremine uzorka od 0,5 cm3, 3 cm3

dejonizovane vode i 0,3 cm3 5% NaNO2. Nakon 5 min stajanja na sobnoj temperaturi dodato je 3

cm3 1% AlCl3, nakon 5 min još 2 cm3 1mol/dm3 NaOH i dejonizovana voda do 10 cm3.

Apsorbanca je merena na λ = 510 nm, u odnosu na dejonizovanu vodu kao slepu probu. Za svaki

uzorak rađene su tri probe.

Ukupni sadržaj flavonoida izražen je kao katehin ekvivalent (mg CE/100g) korišćenjem

jednačine iz kalibracione krive. (Ordom i sar., 2006)

Ukupni sadržaj flavonoida izražen je kao katehin ekvivalent (mgCE/100g) korišćenjem

jednačine iz kalibracione krive. Primenom kompjuterskog programa ORIGIN 7.0 dobijena je

jednačina prave:

A = 0,02486cx + 0,0507 R = 0,99941

gde je cx nepoznata koncentracija u mg/ml, a R koeficijenat korelacije.

29

Primena UV/Vis spektrofotometrije za određivanje antioksidativne

aktivnosti

Elektron-transfer metode (ET) su metode koje se koriste za određivanje antioksidativne

aktivnosti i one podrazumevaju prisustvo oksidansa (proba) i antioksidansa u reakcionoj smeši.

Elektron-transfer reakcija koja se odigrava je:

Oksidans (proba) + e- (antioksidans) → Redukovani oksidans + Oksidovani antioksidans

Kada oksidans, odnosno proba, uzme elektron iz antioksidansa dolazi do promene boje

rastvora. Promena intenziteta obojenosti rastvora je proporcionalna koncentraciji antioksidansa, a

reakcija između oksidansa i antioksidansa je završena kada se boja rastvora više ne menja.

Spektrofotometrijska analiza se zasniva na merenju apsorbance ispitivanog rastvora i

prati njena zavisnost od molarne koncentracije. Zavisnost promene apsorbance i koncentracije

antioksidansa je linearna. Iz nagiba krive se određuje antioksidativni kapacitet.

U ovom radu korišćena je DPPH metoda za određivanje antioksidativne aktivnosti.

DPPH – metoda (Scavenging of 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil Radical Assay)

DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) radikal predstavlja tamni kristalni prah koga čine

stabilni slobodni radikali. Određivanje antioksidantnog slobodno-radikalskog kapaciteta prema

DPPH radikalu zasniva se na redukciji ljubičastog radikala (DPPH•) odgovarajućim

antioksidansima do bledo-žutog neutralnog jedinjenja. (Slika 2.1.).

Slika 2.1. Redukcija DPPH•

30

Antioksidativna aktivnost se određuje u organskom sistemu praćenjem promene

apsorpcije na 515 do 528 nm, sve dok apsorpcija ne postane konstantna ili ESR-om (elektron-

spin rezonancom) (Brand-Williams i sar., 1995; Fuhrman i sar., 2001; Lachman i sar., 2007).

Reakcioni mehanizam se bazira na elektron-transfer reakciji (ET). Antioksidativni

kapacitet u odnosu na DPPH• je pod jakim uticajem rastvarača i pH reakcije. Stark (1969) je

zaključio da je smeša vode i etanola u odnosu 1:1 (50%) dobar izbor za lipofilne i hidrofilne

antioksidanse i brzina reakcije DPPH• i antioksidansa može značajno da raste sa povećanjem

količine vode. Za sadržaj vode veći od 60% antioksidativni kapacitet opada, jer deo DPPH•

koaguliše što otežava reakciju sa antioksidansima.

DPPH test nije pogodan za merenje antioksidativnog kapaciteta plazme, jer se proteini

precipituju u alkoholnom reakcionom medijumu. DPPH reakcija je „vremenska“ i može da traje

od 20 minuta do 6 sati.

Postupak za određivanje antioksidativnog kapaciteta i antioksidativne aktivnosti pomoću

DPPH

Metoda se zasniva na praćenju transformacije ljubičasto obojenog rastvora DPPH

radikala (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) u redukovanu, neutralnu, žuto obojenu formu. Koristeći

DPPH radikal izračunava se vrednost antioksidativnog kapaciteta i antioksidativne aktivnosti.

Priprema rastvora

Rastvor DPPH pripremljen je na sledeći način: 0,0039 g DPPH je rastvoreno u metanolu

u normalnom sudu od 100 cm3 da bi se dobila koncentracija 10-4 mol/dm3.

Kontrolni rastvor se priprema tako što se uzme 4 cm3 rastvora DPPH i 1 cm3vode.

Postupak rada:

Prvi radni rastvor se priprema odmeravanjem 4 cm3 rastvora DPPH, 0,1 cm3 uzorka

ekstrakta (za resice i oraščiće) i 0,9 cm3 vode. Drugi radni rastvor je pripremljen odmeravanjem

0,5 cm3 uzorka (za ljuspu i lišće), 0,5 cm3 vode i 4 cm3DPPH. Za svaki uzorak rađene su tri

probe.

Rastvor se ostavi 30 minuta da se uravnoteži i meri se apsorbanca na λ=515 nm.

Apsorbanca se obeležava kao Asample – apsorbanca uzorka (radnog rastvora). Takođe se meri i

apsorbanca kontrolnog rastvora 10 minuta nakon pravljenja (Ablank – apsorbanca kontrolnog

rastvora).

Na osnovu vrednosti apsorbance radnog i kontrolnog rastvora izračunat je antioksidativni

kapacitet za sve ispitivane ekstrakte.

Antioksidativni kapacitet predstavlja kapacitet hvatanja slobodnih radikala (Radical

Scavenging Capacity - RSC) i računat je na osnovu sledeće jednačine:

RSC (%)=(1 - Asample / Ablank) x 100%

31

Asample – apsorbanca uzorka (radnog rastvora)

Ablank – apsorbanca kontrolnog rastvora

Antioksidativna aktivnost se izražava kao ekvivalent troloksa (μgTE/g suvog uzorka).

32

3. REZULTATI I DISKUSIJA

33

Određivanje sadržaja ukupnih fenola, flavonoida i antioksidativne

aktivnosti u ekstraktima osušene resice oraha

Pregledom literature utvrdili smo da su naučnici ispitivali uticaj polarnosti rastvarača

(heksan, hloroform, etilacetat, metanol i etanol) na ekstrakciju fenolnih jedninjenja iz lišća oraha

i utvrdili su da je najbolji rastvarač metanol. Zbog toksičnosti metanola za ekstrakciju smo

odabrali etanol i pripremili ekstrakte sa 25%, 50% i 75% etanola (Salimi i sar, 2012)

Za kvantitativno određivanje ukupnih fenola u etanolnim ekstraktima osušenih resica

oraha primenjena je Folinova metoda, a kao standard korišćena je galna kiselina i sadržaj

ukupnih fenola izražen je kao ekvivalent galne kiseline (GAE) na gram suve materije (Singleton i

Rossi, 1965). Postupak za kvantitativno određivanje flavonoida opisan je u poglavlju

Eksperimentalni deo, a sadržaj flavonoida izražen je kao ekvivalent katehina (CE) na gram suve

materije (DW). Antioksidativna aktivnost izražena je u procentima. Rezultati određivanja

ukupnih fenolnih jedinjenja, flavonoida u etanolnim ekstraktima osušenih resica oraha i njihove

antioksidativne aktivnosti prikazani su na slici 3.1.

Slika 3.1. Sadržaj ukupnih fenola, flavonoida u etanolnim ekstraktima osušenih resica oraha

i njihove antioksidativne aktivnosti

Sadržaju ukupnih fenola u etanolnim ekstraktima kretao se od 72.6 do 94.2 mg GAE/g

suvih resica, a sadržaj flavonoida se kretao od 38.98 do 50.40 mg CE/g suvih resica. Sadržaj

ukupnih fenola i flavonoida je najveći u 50% etanolu. Ekstrakti pokazuju značajnu

antioksidativnu aktivnost. Najveću antioksidativnu aktivnost pokazuje 50 % ekstrakt suvih

34

resica oraha. Koeficijenti korelacije između parametara koji karakterišu ekstrakte prikazani

su u Tabeli 3.2.

Tabela 3.2. Koeficijenti korelacije ukupnih fenola, flavonoida i antioksidativne aktivnosti u

etanolnim ekstraktima svežih listova oraha

Koeficijent korelacije Flavonoidi Antioksidativna aktivnost

Ukupni fenoli 0,997 0,812

Flavonoidi 1 0,765

Rezultati pokazuju visoke koeficijente korelacije između ukupnih fenola i flavonoida,

ako i između ukupnih fenola, flavonoida i antioksidativne aktivnosti.

Određivanje sadržaja ukupnih fenola, flavonoida i antioksidativne

aktivnosti u ekstraktima svežih listova oraha

Rezultati određivanja ukupnih fenolnih jedinjenja, flavonoida u etanolnim ekstraktima

svežih listova oraha i njihove antioksidativne aktivnosti prikazani su na slici 3.2.

Slika 3.2. Sadržaj ukupnih fenola, flavonoida u etanolnim ekstraktima svežih listova oraha i

njihove antioksidativne aktivnosti

35

Sadržaju ukupnih fenola u etanolnim ekstraktima svežih listova oraha kretao se od 30 do

60 mg GAE/g svežeg lišća oraha, a sadržaj flavonoida se kretao od 13,8 do 23,5mg CE/g

svežih listova oraha. Lišće je brano u junu, u fazi kada je sadržaj fenolnih jedinjenja po

literaturnim podacima najveći. Sadržaj ukupnih fenola je najveći u 75% etanolu, a flavonoida

u 50%. Ekstrakti pokazuju značajnu antioksidativnu aktivnost. Najveću antioksidativnu

aktivnost pokazuje 50 % ekstrakt svežih listova oraha. Koeficijenti korelacije između

parametara koji karakterišu ekstrakte prikazani su u Tabeli 3.2.


etanolnim ekstraktima svežih listova oraha



Flavonoidi 1 0,768

Postoji visok stepen korelacije u sadržaju ukupnih fenola i flavonoida, tako i sadržaja

ukupnih fenola i antioksidativne aktivnosti , sadržaja flavonoida i antioksidativne aktivnosti.

Najveća korelacija je u sadržaju ukupnih fenola i antioksidativne aktivnosti. Ti rezultati se

dobro slažu sa rezulatatima drugih autora.

Shah i saradnici su ispitivali sadržaj ukupnih fenola i dobili 46,47±0,89 mg GAE/g

osušenih listova oraha, a za sadržaj flavonoida 28,48±0,1mg CE/g osušenih listova oraha.

(Shah i sar.,2018)

Einali i saradnici su ispitivali sadržaj ukupnih fenola i dobili 52,82±0,73 mg GAE/g

osušenih listova oraha, a za sadržaj flavonoida 20,06±1,07mg CE/g osušenih listova oraha.

(Einali i sar., 2018)

U različitim radovima sadržaj ukupnih fenola se kretali od 34 do 194 mg GAE /g suve

mase lišća, flavonoida od 20 do 149 mg CE/g suve mase lišća. Nema podataka o sadržaju

ukupnih fenola i flavonoida u svežim listovima oraha.

36

Ispitivanja sadržaja ukupnih fenola i flavonoida u lišću koje je ubrano u različitim

periodima pokazuju da se sadržaj menja i da je najveći u julu, a najmanji u septembru.

(Cosmulescu i Trandafir, 2011)

Određivanje sadržaja fenola, flavonoida i antioksidativne aktivnosti

ekstrakata svežih oraščića


svežih listova oraha i njihove antioksidativne aktivnosti prikazani su na slici 3.3.

Slika 3.3. Sadržaj ukupnih fenola, flavonoida u etanolnim ekstraktima svežih oraščića i


Sadržaj ukupnih fenola u etanolnim ekstraktima kretao se od 37 do 73 mg GAE/g svežih

orašćića, a sadržaj flavonoida se kretao od 15 do 23 mg CE/g svežih oraščića. Sadržaj

ukupnih fenola i flavonoida je najveći u 75% etanolu.

Taipa i saradnici su odredili da je najveći sadržaj ukupnih fenola u svežim oraščićima

86,67 mg GAE/g sveže mase. (Tapia i sar., 2013)

Dodeska i saradnci su odredili da je srednji sadržaj ukupnih fenola u svežim oraščićima

14,56 mg GAE/g sveže mase. (Dodeska i sar., 2015)

37

Thenmozhi je odredio da je srednji sadržaj ukupnih fenola u svežim oraščićima 58 mg

GAE/g sveže mase. (Thenmozhi, 2015)

Ekstrakti pokazuju sličnu i značajnu antioksidativnu aktivnost. Najveću antioksidativnu

aktivnost pokazuje 50% ekstrakt svežih listova oraha. Koeficijenti korelacije između

parametara koji karakterišu ekstrakte prikazani su u Tabeli 3.3.


etanolnim ekstraktima svežih oraščića



Flavonoidi 1 0,90

Postoji visok stepen korelacije u sadržaju ukupnih fenola i flavonoida. Korelacija između

sadržaja flavonoida i antioksidativne aktivnosti, korelacije između sadržaja ukupnih fenola i

antioksidativne aktivnosti je takođe visoka.

Određivanje sadržaja fenola, flavonoida i antioksidativne aktivnosti

ekstrakata ljuske oraha


suve ljuske oraha i njihove antioksidativne aktivnosti prikazani su na slici 3.4.

38

Slika 3.4 . Sadržaj ukupnih fenola, flavonoida u etanolnim ekstraktima suvih ljuski oraha i


Sadržaj ukupnih fenola u etanolnim ekstraktima kretao se od 34 do 63 mg GAE/g suvih

ljuski oraha, a sadržaj flavonoida se kretao od 8,55 do 12,94 mg CE/g suvih ljuski oraha. Sadržaj

ukupnih fenola i flavonoida je najveći u 75% etanolu.

U nedavnom istraživanju ekstrakcija fenolnih jedinjenja iz ljuske oraha vršena je pomoću

ultrazvučnog kupatila, ultrazvučne sonde i standardnog mućkanja. Za sva tri postupka ekstrakcije

korišćena 50% etanol kao rastvarač. Dobijeni prinos ekstrakcije ultrazvučnom sondom bio je

51,2 mg (GAE/g DW). Dobijen sadržaj ukupnih fenola je dvostruko veći od metode mućkanja

i ekstrakcije na ultrazvučnom kupatilu koje su bile 20,6 i 25,8 mg GAE/g DW, respektivno.

Usitnjavanjem ljuske oraha bila je poboljšana ekstrakcija fenolna jedinjenja. Kada je veličina

čestica bila između 45–100 mesha, dobijen je najveći ekstrakcioni prinos od 52,8 mg GAE /g

DW. Autori su otkrili da je primena ultrazvučne sonde najbolja metoda za ekstrakciju fenolnih

kiselina iz ljuske oraha.

39


etanolnim ekstraktima suvih ljuska oraha



Flavonoidi 1 0,996

Postoji visok stepen korelacije u sadržaju ukupnih fenola i flavonoida. Takođe postoji

visoka korelacija između sadržaja flavonoida i antioksidativne aktivnosti i korelacije između

sadržaja ukupnih fenola i antioksidativne aktivnosti.

Uporedna analiza sadržaja ukupnih fenola, flavonoida i antioksidatvne

aktivnosti u ispitivanim ekstraktima

Na slici 3.5. prikazan je uporedno sadržaj ukupnih fenola u etanolnim ekstraktima

različitih biljnih delova oraha. Pri upoređivanju treba imati u vidu da su resice i ljuska bili u

suvom stanju, a list i oraščići u svežem stanju, a mase uzoraka , postupak ekstrakcije i

ekstrakciono sredstvo su bili isti.

Slika 3.5. Uporedni sadržaj ukupnih fenola u etanolnim ekstraktima različitih biljnih delova

oraha

40

Analiza pokazuje da sadržaj ukupnih fenola varira u zavisnosti od biljnog dela i od

procenta etanola. Najveći sadržaj ukupnih fenola imaju osušene resice oraha u 50% etanolu.

Najmanji sadržaj ima ekstrakt svežih listova oraha u 25% etanolu. Za resice i mlade oraščiće

najbolji rastvarač je 50 % etanol, a za ljusku i list 75% etanol.

Na slici 3.6. prikazan je uporedno sadržaj flavonoida u etanolnim esktraktima različitih

biljnih delova oraha.

Slika 3.6. Uporedni sadržaj flavonoida u etanolnim esktraktima različitih biljnih delova oraha.

Analiza pokazuje da sadržaj flavonoida varira u zavisnosti od biljnog dela i od procenta

etanola. Najveći sadržaj flavonoida imaju osušene resice oraha u 50% etanolu. Najmanji sadržaj

ima ekstrakt ljuske u 25% etanolu. Za resice i list najbolji rastvarač je 50 % etanol, a za ljusku i

mlade oraščiće 75% etanol.

Na slici 3.7. prikazan je uporedno antioksidativni efekat etanolnih esktrakata različitih

biljnih delova oraha.

41

Slika 3.7. Uporedni antioksidativni efekat etanolnih esktrakata različitih biljnih delova oraha.

Najveću antioksidativnu aktivnost imaju 50 % etanolni ekstrakti mladih oraščića i resica,

a najmanji svi ekstrakti ljuske oraha.

42

4. ZAKLJUČAK

U ovom radu određen je sadržaj ukupnih fenola , flavonoida i antioksidativne aktivnosti

etanolnih ekstrakata razlitite koncentracije (25%, 50% i 75%) različitih biljnih delova oraha:

osušene resice, ljuske oraha , sveži listovi oraha i mladi oraščići.

Pri upoređivanju rezultata treba imati u vidu da su resice i ljuska bili u suvom stanju, a

list i oraščići u svežem stanju, a mase uzoraka , postupak ekstrakcije i ekstrakciono sredstvo su

bili isti.

Analiza pokazuje da sadržaj ukupnih fenola varira u zavisnosti od biljnog dela i od

procenta etanola. Najveći sadržaj ukupnih fenola imaju osušene resice oraha u 50% etanolu.

Najmanji sadržaj ima ekstrakt svežih listova oraha u 25% etanolu. Za resice i mlade oraščiće

najbolji rastvarač je 50 % etanol, a za ljuspu i list 75% etanol.

Analiza pokazuje da sadržaj flavonoida varira u zavisnosti od biljnog dela i od procenta

etanola. Najveći sadržaj flavonoida imaju osušene resice oraha u 50% etanolu. Najmanji sadržaj

ima ekstrakt ljuspe u 25% etanolu. Za resice i list je najbolji rastvarač je 50% etanol, a za ljuska i

mlade oraščiće 75% etanol.

Najveću antioksidativnu aktivnost imaju 50 % etanolni ekstrakti mladih oraščića i resica,

a najmanji svi ekstrakti ljuspe oraha.

Stepen korelacije između sadržaja ukupnih fenola i flavonoida, sadržaja ukupnh fenola i

antioksidativne aktivnosti, sadržaja flavonoida i antioksidativne aktivnosti je u najvećem broju

ekstrakata je visok.

S obzirom na visok sadržaj fenolnih jedinjenja, visoku antioksidativnu aktivnost i

lekovita svojstva oraha, ispitivani etanolni ekstrakti imaju značajan potencijal kao izvor fenolnih

jedinjenja i dijetetski suplementi.

43

Reference

(http://agroekonomija.wordpress.com/2011/02/01/antioksidativna-i-antiradikalna-

aktivnost-polifen/)

Abbasi MA, Raza A, Riaz T, Shahzadi T, Aziz-ur-Rehman, Jahangir M, Shahwar D,

Siddiqui SZ, Chaudhary AR, Ahmad N (2010). Investigation on the volatile constituents

of Juglans regia and their in vitro antioxidant potential. Pakistan Acad. Sci., 47:137-141

Aitani M, Shimoda H (2005).The Effect of Ascorbic Acid and Arbutin on B16 Melanoma

cells. Japan Food Sci.,44: 58-63.

Almeida IF, Fernandes E, Lima JLFC, Costa PC, Bahia MF (2008). Walnut (Juglans

regia) leaf extracts are strong scavengers of pro-oxidant reactive species. Food Chem.,

106:1014-1020.

Al-Snafi AE (2018), Chemical constituents, nutritional, pharmcological and therapeutic

importance of Juglans regia- A review, J. Pharm. 8(11): 1-21.

Amaral JS, Valentão P, Andrade PB, Martins RC, Seabra RM (2008). Do cultivar,

geographical location and crop season influence phenolic profile of walnut leaves?

Molecules,13: 1321-1332.

Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E., Berset, C., (1995). Use of the radical method to

evaluate antioxidant activity, Lebensmittel- Wissenschaft und Technologie, 28: 25-30.

Čađenović Milovanović JM, Vlajković V (2012). Lekovita svojstva oraha, PONS Med J,

10(1):33-34.

Carvalho M, Ferreira PJ, Mendes VS, Silva R, Pereira JA, Jenimo C. Silva BM (2010).

Human cancer cell antiproliferative and antioxidant activities of Juglans regia L. Food

Chem. Toxicol., 48: 441-447.

Citoglu GS, Altanlar N (2003). Antimicrobial activity of some plants used in folk medicine.

J. Fac. Pharm. Ankara., 32:159-163.

Cosmulescu S, Trandafir I.(2011) Seasonal variation of total phenols in leaves of walnut

(Juglans regia L.). J. Med. Plant. Res. 5: 4938–4942.

Cragg GM, Newman DJ. (2005). Biodiversity: A continuing source of novel drug leads. Pure

Appl Chem; 77:7–24.



44

Deshpande RR, Kale AR, Ruikar AD, Panvalkar PS. Kulkarni AA, Deshpande NR,

Salvekar JP (2011). Antimicrobial Activity Of different extracts of Juglans Regia L.

against Oral Microflora. Int. J. Pharm. Pharm. Sci., 3:200-201.

Devkota SR, Paudel KR, Sharma K, Baral A, Chhetri SB, Thapa PP et al. (2015).

Investigation of antioxidant and anti-inflammatory activity of roots of Rumex

nepalensis. World J Pharm Pharm Sci.; 4:582–94.

Dimitrijević, D. (2014). Analisys of chemical composition and antioxidant activity of

mulberry extracts (Morus spp., Moraceae). Doktorski rad. Niš: Prirodno-matematiĉki

fakultet.

Dodevska M, Šobajic S, Djordjevic B. (2015) Fibre and polyphenols of selected fruits, nuts

and green leafy vegetables used in Serbian diet. J. Serb. Chem. Soc. 80: 21–33

Drmić H., Režek Jambrak A. (2010), Ultrazvučna ekstrakcija bioaktivnih spojeva,

Prehrambeno-biotehnološki fakultet, Zagreb, 45.

Einali A, Azizian-Shermeh O, Ghasemi A. (2018)Phytochemical screening and antimicrobial

activities of Periploca aphylla Decne, Persian walnut (Juglans regia L.) and oleander

(Nerium indicum Mill.) Leaf extracts. J. Food Meas. Charact., 12: 1350–1359

Essa MM, Subash S , Dhanalakshmi C, Manivasagam T, Al-Adawi S, Guillemin GJ,

Thenmozhi AJ (2015), Dietary supplementation of walnut partially reverses 1-methyl-4-

phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine induced neurodegeneration in a mouse model of

Parkinson’s disease. Neurochem. Res. 40: 1283–1293.

Fernandez MT, Mira ML, Florenco MH, Jenings KR. (2002). Iron and copper chelation by

flavonoids: an electrospray mass spectrometry study. J. Inorg. Biochem. 92: 105–111.

Fernández-Agulló A, Pereira E, Freire MS, Valentão P, Andrade PB, González-Álvarez J,

Pereira JA (2013). Influence of solvent on the antioxidant and antimicrobial properties of

walnut (Juglans regia L.) green husk extracts. Ind. Crops Prod., 42:126–132.

Fiorani M, De Sancitis R, De Bellis R, Dacha M. (2002). Intracellular flavonoids as electron

donors for extracellular ferricyanide reduc tion in human erythrocytes. Free Rad. Biol. &

Med., 32: 64–72.

45

Fuhrman B, Volkova N, Suraski A, Aviram M , (2001). White wine with red wine-like

properties: Increased extraction of grape skin polyphenols improves the antioxidant capacity

of the derived white wine. J. Agric. Food Chem., 49:3164-3168.

Fukuda T, Ito H, Yoshida T (2004). Effect of the walnut polyphenol fraction on

oxidative stress in type 33 2 diabetes mice. Biofactors, 2: 251-253.

Fukuda T, Ito H, Yoshida Y (2003). Antioxidative polyphenols from walnuts (Juglans

regia L.) Phytochem., 63: 795-801.

Godet, Jean-Denis (2000). Drveće i grmlje, cvjetovi, listovi, pupovi i kora: Godetov vodič.

Pavletić, Zinka, Brepols. (Zagreb): Naklada

https://sr.wikipedia.org/sr-ec/%D0%9E%D1%80%D0%B0%D1%85

J Agric Food Chem.; 52(15):4705-12.

J. R. Dean, Extraction Techniques in Analytical Sciences, WILEY, 2009, str. 49-53

Janković D, Janković S, Paunović G, Paunović S, Miletić R. (2014). Biologija cvetanja i

oprašivanja oraha. Zbornik radova, 19, 189-190.

Jelodar G, Mohsen M, Shahram S (2007). Effect of walnut leaf, coriander and

pomegranate on blood glucose and histopathology of pancreas of alloxan induced diabetic

rats. Afr. J. Trad. 43: 299-305.

Kamei H, Koide T, Kojima T, Hashimoto Y, Hasegawa M (1998). Inhibition of cell

growth in culture by quinones. Cancer Biother. Radiopharm., 13:185–8.

Korać, M. (1986), Orah, 7-12, 27, Nolit, Beograd

Lachman J, Šulc M, Schilla M, (2007). Comparison of the total antioxidant status of

Bohemian wines during the wine – making process. Food Chem., 103: 802-807.

Mei-zhi Z, Bing-nian J, Cai-xia J, Chao-bin L (2007). Study on Extraction Conditions

of Active Antiviral Substance from Walnut Leaves. Chem. Ind. Forest Prod. 02

[Abstract].

Mohammadi J, Chatrroz B, Delaviz H. (2014). The effect of hydroalcoholic extract

of Capparis spinosa on quality of sperm and rate of testosterone following induction of

diabetes in rats. J Isfahan Med Sch. 31:1–11.

Mouhajir F, Hudson JB, Rejdali M, Towers GHN (2001) Multiple antiviral activities

of endemic medicinal plants used by Berber people of Morocco. Pharm. Biol., 39: 364-374.

https://sr.wikipedia.org/sr-ec/%D0%9E%D1%80%D0%B0%D1%85

46

Nikolić, G., Nikolić, S., Milić, B., Ĉanadanović-Brunet, J. (1998). Primena metode

elektronske spinske rezonance za prouĉavanje antioksidantnih svojstava prirodnih fenolnih

jedinjenja. Acta Fac. Med. Naiss., 15 (4), 183-188.

Oliveira I, Sousa A, Ferreira IC, Bento A, Estevinho L, Pereira (2008) J A Food Chem

Toxicol; 46(7):2326-31.

Oliveira I, Sousa A, Ferreira ICFR, Bento A, Stevinhol LE, Pereira JA, (2008). Total

phenols, antioxidant potential and antimicrobial activity of walnut (Juglans regia L.) green

husks. Food Chem. Toxicol., 46: 2326-2331.

Ordom EZ, Gomez JD, Attuone MA, Isla ML,(2006) Antioxidant activities of Sechium

(Jacq.) Swart extracts, Food Chem. 97: 452–458

Ozer B, Kivc MB (2007). Antityrosinase activity of some plant extracts and formulations

containing ellagic acid. Pharm. Biol., 45: 519-524.

Pereira JA, Oliveira I, Sousa A, Ferreira ICFR, Bento A, Estevinho L (2008). Bioactive

properties and chemical composition of six walnut (Juglans regia L.) cultivars. Food Chem.

Toxicol., 46: 2103-2111.

Petri G, Krawczyk U, Kery A, (1997). Spectrophotometric and chromatographic

investigation of bilberry anthocyanins for quantification purposes. Microchem. J., 55: 12-23.

Poyrazolu EC, Biyik H (2010). Antimicrobial activity of the ethanol extracts of some

plants natural growing in Aydin, Turkey. Afr. J. Microbiol. Res., 4: 2318-2323.

Qa’dan F, Al-Adham IS, Nahrstedt A. (2005). Characterization of antimicrobial polymeric

procyanidins from Juglans regia leaf extract. Eur. J. Sci. Res., 11:438-443.

Qamar W, Sultana S (2011). Polyphenols from Juglans regia L. (Walnut) kernel

modulate cigarette smoke extract induced acute inflammation, oxidative stress and lung

injury in Wistar rats. Hum. Exp. Toxicol., 30:499-506.

Rahimipanah M, Hamedi M, Mirzapour M (2010). Antioxidant activity and phenolic

contents of Persian walnut (Juglans regia L.) green husk extract. Afr. J. Food Sci.

Technol., 1:105-111.

Rath BP, Pradhan D (2009). Antidepressant Activity of Juglans regia L. fruit extract. Int. J.

Toxicol. Pharmacol. Res., 1: 24-26.

47

Salimi M, Majd A, Sepahdar Z, Azadmanesh K, Irian S, Ardestaniyan MH, Hedayati MH,

Rastkari N. (2012) Cytotoxicity effects of various Juglans regia (walnut) leaf extracts in

human cancer cell lines. Pharm. Biol., 50:1416–1422

Segura-Aguilar J, Jonsson K, Tidefelt U, Paul C (1992). The cytotoxic effects of 5-OH-1, 4-

naphthoquinone and 5,8-diOH-1,4-naphthoquinone on doxorubicin-resistant human leukemia

cells (HL-60). Leuk Res., 16: 631–637.

Shah TI, Sharma E., Ahmad G. (2014), Juglans regia Linn: A phytopharmacological

Rewiew, World J. Pharm. Sci. 2321-3310.

Shah UN, Mir JI, Ahmed N, Jan S, Fazili KM, (2018) Bioefficacy potential of different

genotypes of walnut Juglans regia L., J. Food Sci. Technol. 55, 605–618.

Silva BM, Andrade PB, Valentão P, Ferreres F, Seabra RM, Ferreira MA (2004). Quince

(Cydonia oblonga Miller) fruit (pulp, peel, and seed) and jam: Antioxidant activity. J Agric

Food Chem. 2004;52:4705–12.

Silva NCC, Fernandes A, Júnior (2010). Biological properties of medicinal plants: A review

of their antimicrobial activity. Venom Anim Toxins incl Trop Dis, 16:402–13.

Singelton VL, Rossi JA, Colorimerty of total phenolics with phosphomolybdic-

phosphotungstic acid reagents, Am. J. Enol.Viticult., 1965;16: 144-158.

Šoškić MM.(2007).Orah i lijeska. Beograd: Partenon

Sugie S, Okamoto K, Rahman KM, Tanaka T, Kawai K, Yamahara J (1998). Inhibitory

effects of plumbagin and juglone on azoxymethane- induced intestinal carcinogenesis in rats.

Cancer Lett., 127:177–183.

Tapia MI, Sanchez-Morgado JR, Garcıa-Parra J, Ramırez R, Hernandez T, Gonzalez-Gomez

D. (2013) Comparative study of the nutritional and bioactive compounds content of four

walnut (Juglans regia L.) cultivars. J. Food Compos. Anal. 31:232–237.

Upadhyay V, Kambhoja S, Leena HK (2010). Antibacterial activity and preliminary

phytochemical analysis of stem bark extract of Juglans regia linn. Pharmacology online

3: 274-279

Zhang Z, Liao L, Moore J, Wua T, Wang Z (2009). Antioxidant phenolic compounds

from walnut kernels (Juglans regia L.). Food Chem., 113: 160-165.

ispitivanje fenolnog sastava i antioksidativne … · uključujući fenolna jedinjenja, flavonoide,...

Documents