ISSR分子标记与其在银杏系统分类研究上的应用

程勤贤程勤贤

2004.11.302004.11.30

银杏 (Ginkgo biloba) 是裸子植物银杏纲中唯一现存的中生代孑遗植物。雌雄异株 , 染色体数目为 2ｎ =24( 陈学森等 ,1996) 。银杏对气候的适应性较强 ,分布于温带、暖温带和亚热带地区，在中国被广泛栽培 , 至今已有近 1000 年的栽培史 (Dell Tredici et al,1992) 。现栽培银杏分布于我国的 24 个省区 , 国外现栽培的银杏都源自中国 (林协 ,1965) 。

我国银杏资源非常丰富，但并非取之不竭，个体之间的亲缘关系的鉴定可以为合理有效的利用银杏资源及培育新品种提供基础，有益于整个银杏产业的可持续发展。了解银杏亲缘关系还可以阐明植物界的自然系统，这也是植物分类学的任务之一，是保护生物遗传多样性的重要部分。

作为单科属植物 ,由于长期的天然杂交和人工选择 , 银杏的种子和叶片发生了明显的变异 ,根据这些变异 ,有的学者在种之下划分了变种、变型和类型。不同的学者从不同的变异角度考虑就有不同的品种划分。 Carriere 根据银杏冠形和枝、叶形态、叶的大小和颜色将银杏划为 8个种，有垂枝银杏，裂叶银杏，斑叶银杏，黄叶银杏，叶籽银杏等；曾勉根据银杏种子大小和形状将银杏分为 3个变种；何凤仁根据银杏种核的长度比例和两个中轴线交会点的位置划为 5大类 ,长子、佛子、马铃、梅核、圆子，每类包括若干品种。

这些分类方法为银杏研究和生产解决了许多基本问题，但是这些传统的形态学分类法如植物解剖学、植物胚胎学、孢粉学、植物化学、细胞学基本上停留在表型水平，这往往受环境因素、发育阶段等条件的限制，鉴定结果不可靠。

DNA分子标记技术是近年来才应用于植物分类研究的 , 它从分子水平上直接检测其差异，标记数量是无限的，而且稳定性高。与其他分类方法相比分子标记具有以下优点 :①直接以ＤＮＡ的形式表现 ,不受组织特异性、发育阶 段、季节、环境等限制 ; ②数量多 ,遍及整个基因组 ;③多态性高 ;④表现为中性 ,不影响目标性状的表达 ,与不良性状无必然的连锁 ;⑤有些分子标记表现为共显性 ,能够鉴别物种的杂合、纯合状态。 近年来 ,该技术发展迅猛 ,成为研究林木系统的有力工具。

目前广泛应用的分子标记主要有 :

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism ) 限制性片段长度多态性RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs) 随机扩增多态

性ＤＮＡAFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)扩增片段

长度多态性SSR(Simple Sequence Repeats)简单序列重复亦称微卫星ISSR(Inter Simple Sequence Repeat) 锚定微卫星SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 单核苷酸多态性

1.ISSR 的技术原理 ISSR 标记即简单重复间序列，是 Zietkiewicz等(1994）发展的一种新的分子标记。基因组中分布有大量的重复序列，根据其分布特征可分为散在重复序列和串联重复序列，微卫星（即 SSR ）是一种高度串联重复序列，重复基序仅 2～ 6bp，分布于常染色质区，是真核生物基因组重复序列的主要组成部分，均匀分布于基因组中，正是基于基因组这种特点才出现了 SSR和 ISSR 技术。

ISSR分子标记是在 SSR 标记基础上发展起来的，其基本原理 (示意图如下 )在 SSR的 5’或 3’端加锚 l～ 4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组 DNA 序列进行扩增。在 SSR的 3,端或 5,

端锚定 1-4 个简并碱基的优点是在基因组上只有那些与锚定的核苷酸匹配的位点才能被靶定，因而避免了 SSR在基因组上的滑动大大提高了 PCR 扩增的专一性。

ISSR的重复序列和锚定碱基是随机选择的，扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，每个引物可以产生比 RAPD 方法更多的扩增片段，它在引物设计上比 SSR 技术简单得多，不需知道 DNA 序列即可用引物进行扩增，又可以揭示比 RFLP、 RAPD 、SSR 更多的多态性。因此， ISSR 标记是一种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的 DNA 指纹技术。 ISSR 标记呈孟德尔式遗传，在多数物种中是显性的，目前己广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中。

表 1 葛永奇等对银杏 5 个群体 66 个个体进行扩增的 13 种有效 ISSR 引物的特点

图 2 引物 UBC845 扩增ＴＭ群体 15 棵植株基因组 DNA 的 ISSR 电泳图

2. ISSR 的操作步骤 2.1 银杏总 DNA 的提取 采用改良 CTAB法（ Doyle,1991）略加以改进，提取银杏叶片基因组 DNA。银杏叶中含有多种黄酮类、银杏内酯类、酚类、酸类、聚异戊烯醇类、甾类、叶蜡等复杂成分,给银杏ＤＮＡ的提取带来一定困难。经过一段时间的摸索并结合其他资料的提取方法发现：在ＤＮＡ提取液中添加具有抗氧化和稳定作用的ＰＶＰ，浓度以 6%为宜。并提高提取液中的 β—巯基乙醇浓度以排除杂质的干扰 ,如此得到的银杏ＤＮＡ粗提物中黄色物质即明显减少 ,因而获得的白色的总ＤＮＡ纯度较高。

2.2 ISSR-PCR 扩增

为了保持酶的活性，缩短扩增时间，提高效率。 ISSR 反应扩增条件参照葛永奇等的方法，并略加以改进。

2.2.1 反应体系ISSR 反应总体积为 25μL ：模板约 60ng, 1Ｕ Taq酶 , 1.5ｍ mol/ ＬＭ gCl2, 4 种ｄＮＴＰｓ各 0.25ｍｍｏｌ / Ｌ , 0.3μ ｍｏｌ / Ｌ引物 , 0.5ｍｍｏｌ /Ｌ亚精胺 , 2%甲酰胺。

2.2.2 反应条件预变性　 94℃ 5ｍｉｎ , 1 个循环 ;变　性　 94℃ 1ｍｉｎ ,52～ 55℃复性 45ｓ ,72℃延伸 2ｍｉｎ ,45 个循环 ;终变性 72℃ 5ｍｉｎ， 1个循环。

2.3 统计分析 PCR 反应产物用 2.0% 琼脂糖 (内含 EB)电泳，在紫外检测仪上观察并拍照记录。

最后利用 WINAMOVA1.55软件进行分析统计，位点的命名由所用引物和条带大小来确定。

3. 分子标记在银杏性别鉴定、遗传变异、系统分类与进化中的研究进展

目前从国内外发表的文章来看，人们主要对银杏的性别基因进行标记。王晓梅等 (2001)应用 RAPD和 AFLP 技术 ,筛选与银杏性别相关的分子标记， RAPD标记中应用 150个 10bp 随机单引物及 110对随机引物组合 ,检测了雌雄基因组 DNA,获得 1 个与雄性相关的 RAPD标记。 AFLP 标记应用 48个引物组合 ,检测雌雄银杏基因组 DNA的多态性 ,其中 3个引物组合各提供了 1个与雌性相关的分子标记，经 Southern 点杂交证实有两个标记为银杏雌性基因组所特有。这些分子标记的获得为寻找性别特异的探针或 PCR引物 ,用于银杏的性别鉴定奠定了基础。

　　姜凌等也利用 RAPD技术寻找银杏中与性别相关的分子标记，得出一条大小为 682bp、雄性特异的分子标记。同时，刘叔倩等 (2001) 也用 RAPD标记方法对 28个银杏变异类型进行遗传多样性检测和遗传分析。分析了银杏变异类型的遗传分化及其遗传多样性水平。

　葛永奇、邱英雄等 (2003)采用 ISSR分子标记技术 , 对江苏泰兴、美国纽约的栽培银杏群体和中国 3个可能为野生的银杏自然群体 (浙江西天目山、贵州务川、湖北大洪山区 ) 的遗传多样性水平和群体遗传结构进行了研究。用 13个引物对 5个群体共 66个样品进行扩增 ,共得到 88 个清晰的扩增位点 ,其中多态性位点 62 个 ,多态位点百分率 (PPB) 为 70.45%。可见从 DNA分子水平对银杏遗传变异的研究是行之有效的，但这方面的研究主要集中于研究银杏雌雄基因组间的差异性及主要栽培雌株的 DNA分析 ,而对银杏雄株的基因研究尚未见报道。而随着社会发展，银杏雄株的经济价值凸现，银杏雄株期待着科学的系统分类和进一步研究。

4.    展望 DNA分子标记技术应用于银杏分类研究的时间并不长 ,

但其在这一领域的成果却是有目共睹的。不过这项技术尚处于起步探索阶段 , 在实际研究中还有一定的局限性。比如对银杏等一些含有大量多糖如酚、酯、萜等其他二次代谢产物的植物，要从其组织中提取高质量的基因组 DNA一般比较困难。还有分子技术反应条件繁杂、严格 ,扩增产物稳定性难以控制等 ,这都限制了该技术的应用。但随着植物分子生物学的飞速发展及分子标记技术的逐步完善 ,相信在不久的将来 , 会发明创造 DＮＡ多态性高、重复性好、方法简便、可自动化、共显性及成本低的分子标记用于银杏的系统学研究及基因组研究中 ,为其提供更清楚的遗传背景 .使这一分子标记极大地对品种进行综合改造、检测、控制与数量性状有关的等位基因的遗传和变异 ,来推动银杏的分子标记辅助选择育种 ,为我国林业事业的发展发挥重要作用。

谢谢