VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ

ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ

FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

IZOLACE OBSAHOVÝCH LÁTEK CANNABIS SATIVA A JEJICH ANTIFLOGISTICKÝ ÚČINEK ISOLATION OF COMPOUNDS FROM CANNABIS SATIVA AND THEIR ANTI-INFLAMMATORY

EFFECT

DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER´S THESIS

AUTOR PRÁCE Bc. ZUZANA BARANOVÁ

AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE PharmDr. Daniela VESELÁ

SUPERVISOR

BRNO 2015

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická

Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání diplomové práce

Číslo diplomové práce: FCH-DIP0892/2014 Akademický rok: 2014/2015

Ústav: Ústav chemie potravin a biotechnologií

Student(ka): Bc. Zuzana Baranová

Studijní program: Chemie a technologie potravin (N2901)

Studijní obor: Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010)

Vedoucí práce PharmDr.Daniela Veselá

Konzultanti: doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc.

Název diplomové práce: Izolace obsahových látek Cannabis sativa a jejich antiflogistický účinek

Zadání diplomové práce: 1.Vypracujte literární přehled k dané problematice

2.Popište použité metody hodnocení 3.Zpracujte naměřené výsledky z experimentů

4.Zhodnoťte získané výsledky formou diskuse

Termín odevzdání diplomové práce: 11.5.2015 Diplomová práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v

elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Bc. Zuzana Baranová PharmDr.Daniela Veselá prof. RNDr. Ivana Márová, CSc.

Student(ka) Vedoucí práce Ředitel ústavu

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - V Brně, dne 30.1.2015 prof. Ing. Martin Weiter, Ph.D. Děkan fakulty

3

ABSTRAKT

Predmetom záujmu tejto práce je tradičná a zároveň kontroverzná rastlina Cannabis sativa.

V teoretickej časti sú popísané ubikvitárne polyfenolické látky – flavonoidy, taktiež prítomné

v mnou študovanej rastline. Podrobnejšie sú popísané doposiaľ preskúmané a potvrdené rôzne

účinky na ľudský organizmus a taktiež synergia s inými látkami. Experimentálna časť práce sa

zaoberá izoláciou a identifikáciou látok chloroformového a hexánového podielu extraktu

získaného z tejto rastliny. Pre izoláciu boli použité chromatografické metódy – tenskovrstvová

a stĺpcová chromatografia a semipreparatívna HPLC. Získané látky boli identifikované

pomocou UV, IR spektrofotometrie a NMR. Následne bola skúmaná antiflogistická aktivita

získaných látok, ako aj celkového etanolického extraktu a jednotlivých podielov. Výsledkom

experimentu bola izolácia jednej čistej látky, ktorá bola identifikovaná ako kyselina

cannabidiolová. Experimentom na THP 1 bunkách bola demonštrovaná mierna antiflogistická

aktivita nepolárnych frakcií a z nich izolovanej CBDA.

ABSTRACT

The object of this thesis is a traditional and also controversial plant Cannabis sativa. The

theoretical part is focused on ubiquitous polyphenolic compounds – flavonoids, also present in

the studied plant. All previously researched and confirmed effects on human body are described

in detail. The experimental part of this thesis describes the isolation and identification of

substances of the chloroform and hexane yields of extract obtained from this plant.

Chromatographic methods were used for isolation – thin layer and column chromatography and

semipreparative HPLC. Obtained substances were characterized using UV, IR

spectrophotometry and NMR. Then the anti-inflammatory activity of obtained substances and

also of the ethanolic extract and its yields was observed. The result of the experimental part was

the isolation of one pure substance which was identified as the cannabidiolic acid. Using the

THP 1 assay, we demonstrated mild anti-inflammatory effect of the non-polar yields and

isolated CBDA.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ

Cannabis sativa, flavonoidy, izolácia, identifikácia, antiflogistická aktivita

KEYWORDS

Cannabis sativa, flavonoids, isolation, identification, anti-inflammatory activity

4

BARANOVÁ, Z. Izolace obsahových látek Cannabis sativa a jejich antiflogistický

účinek. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2015. 73 s. Vedoucí

bakalářské práce PharmDr. Daniela Veselá.

PREHLÁSENIE

Prehlasujem, že som diplomovú prácu vypracovala samostatne a že všetky použité literárne

zdroje som citovala správne a úplne. Diplomová práca je z hľadiska obsahu majetkom Fakulty

chemickej VUT v Brne a môže byť využitá ku komerčným účelom len so súhlasom vedúceho

diplomovej práce a dekana FCH VUT.

….….………………………

podpis študenta

Poďakovanie:

Rada by som poďakovala PharmDr. Daniele Veselej za čas, ktorý mi

venovala, a rady, ktoré ma posúvali vo vypracovávaní mojej

diplomovej práce. Moje ďakujem patrí taktiež RNDr. Janovi

Hoškovi, Ph.D., ktorý ma sprevádzal pri meraní antiflogistickej

aktivity a oboznámil ma s danou problematikou.

5

OBSAH

1 Úvod ............................................................................................................................... 7

2 Teoretická časť – Flavonoidy, Antiflogistický účinok ................................................... 8

2.1 História flavonoidov ............................................................................................... 8

2.2 Výskyt flavonoidov ̶ distribúcia v prírode .............................................................. 8

2.3 Identifikácia flavonoidov ........................................................................................ 9

2.4 Chémia flavonoidov ................................................................................................ 9

2.4.1 Hlavné podskupiny flavonoidov ................................................................ 11

2.5 Biosyntéza flavonoidov ........................................................................................ 14

2.6 Absorpcia a metabolizmus .................................................................................... 15

2.7 Farmakológia flavonoidov v živočíchoch ............................................................. 15

2.7.1 Farmakodynamika ...................................................................................... 15

2.7.2 Akútna toxicita flavonoidov ....................................................................... 16

2.7.3 Flavonoidy ako antioxidanty ...................................................................... 16

2.7.4 Prooxidačná aktivita ................................................................................... 17

2.7.5 Antimikrobiálna aktivita ............................................................................ 18

2.7.6 Antiflogistická aktivita flavonoidov .......................................................... 19

2.7.7 Neurostimulačný účinok flavonoidov ....................................................... 21

2.7.8 Analgetický účinok .................................................................................... 21

2.8 Interakcie flavonoidov s inými liekmi .................................................................. 21

2.8.1 Flavonoidy izolované z rastliny Cannabis sativa ...................................... 22

3 Praktická časť ............................................................................................................... 30

3.1 Cieľ ....................................................................................................................... 30

3.2 Prvá časť: Izolácia a identifikácia obsahových látok C. sativa............................. 30

3.2.1 Použitý materiál a prístroje ........................................................................ 30

3.2.2 Metódy ...................................................................................................... 32

3.3 Druhá časť: Antiflogistický účinok celkového extraktu, jednotlivých

podielov a čistých izolovaných látok .............................................................. 35

3.3.1 Rozpúšťadlá, kultivačné médiá a iné použité chemikálie ................. 35

3.3.2 Prístroje ..................................................................................................... 35

3.3.3 Pomôcky.................................................................................................... 36

3.3.4 Komerčný kit použitý pre stanovenie antiflogistickej aktivity ........ 36

3.3.5 Charakteristika bunkovej línie a štruktúr sprostredkujúcich zápalovú

odpoveď ..................................................................................................... 37

3.3.6 Kolorimetrické stanovenie aktivity ............................................................ 38

3.3.7 Princíp stanovenia antiflogistickej aktivity ................................................ 38

4 Výsledky a diskusia ...................................................................................................... 40

4.1 Analýza a separácia extraktu ................................................................................ 40

4.1.1 Rozdelenie chloroformového podielu stĺpcovou chromatografiou ............ 43

4.1.2 Výber frakcií pre ďalšiu separáciu ............................................................. 43

4.1.3 Rozdelenie hexánového podielu stĺpcovou chromatografiou .................... 44

4.1.4 Výber frakcií pre ďalšiu separáciu ............................................................. 45

4.1.5 Rozdelenie frakcie CS-H 15–16 stĺpcovou chromatografiou ..................... 46

6

4.1.6 Separácia frakcií ......................................................................................... 47

4.2 Identifikácia .......................................................................................................... 52

4.2.1 Analýza UV spektier .................................................................................. 52

4.2.2 Analýza IR spektier .................................................................................... 53

4.2.3 Identifikácia pomocou NMR ...................................................................... 54

4.2.4 Výsledky identifikácie izolovaných látok .................................................. 55

4.3 Príprava THP1 buniek ........................................................................................... 56

4.3.1 Metódy ....................................................................................................... 56

5 Záver ............................................................................................................................. 60

6 Citovaná literatúra ........................................................................................................ 63

7 Zoznam skratiek ........................................................................................................... 71

7

1 ÚVOD

Flavonoidy sú ubikvitárne látky fotosyntetizujúcich buniek rastlín. Keďže sa vyskytujú

v zelených rastlinách v značnom množstve, reprezentujú bežnú zložku ľudskej potravy. Patria

do triedy polyfenolických látok tvorených v sekundárnom metabolizme. Ich prítomnosť

v rastline má niekoľko opodstatnení. Jednou z funkcií je poskytovať rastlinám farby atraktívne

pre ich opeľovateľov. Prítomnosť flavonoidov v listoch sa v čoraz väčšej miere pripisuje

schopnosti napomáhať fyziologickému prežitiu rastliny, jej uchránením pred fungálnymi

patogénmi a UV-B radiáciou. Flavonoidy sú taktiež zahrnuté v procese fotosenzibility, prenosu

energie, reguláciách rastlinných hormónov a rastových regulátorov, riadení respirácie

a fotosyntézy, morfogenézy a pohlavnej determinácii [1].

V posledných rokoch rapídne stúpol záujem o výskum tejto triedy prírodných produktov

ako predmetu skúmania aktimikrobiálnej aktivity [1]. Boli izolované a identifikované štruktúry

mnohých skupín flavonoidov vykazujúcich antifungálnu, antivirálnu a antibakteriálnu aktivitu.

Okrem toho niektoré skupiny demonštrovali synergiu medzi aktívnymi flavonoidmi, ako aj

medzi flavonoidmi s už existujúcimi chemoterapeutikami [2].

Rezistencia na antimikrobiálne činidlá sa stáva čoraz dôležitejším a naliehavým globálnym

problémom. Štruktúrna modifikácia antimikrobiálnych liečiv, na ktoré bola vyvinutá

rezistencia, sa preukázala ako efektívny prostriedok predlžovania životnosti antifungálnych,

antivirálnych a rôznych antibakteriálnych látok. Avšak vedci hľadajú aj iné spôsoby, respektíve

iné látky, ktoré by boli vhodnou náhradou [1,2].

Prírodné produkty boli zvlášť bohatým zdrojom antiinfektívnych látok; počínajúc

penicilínmi v roku 1940, tetracyklínmi v roku 1948 a glykopeptidmi v roku 1955. Práve vďaka

svojmu farmakologickému potenciálu sa aj flavonoidy dostali do pozornosti vedcov [1].

Vzrastajúca činnosť v oblasti biochémie flavonoidov je pretrvávajúce presvedčenie mnohých

alternatívnych medikov o priaznivých účinkoch liečenia prírodnými produktmi, ktoré sú bohaté

na tieto látky [3].

Z vyššie uvedených dôvodov som sa rozhodla spracovať práve problematiku flavonoidov

a ich využitia ako medicínskych prostriedkov. V prírodných látkach tkvie veľký potenciál,

ktorý je potrebné naďalej skúmať a rozvíjať pomocou dostupných technológií. Až v prípade

neúspechu dostupných prírodných zdrojov v liečebnom procese by sa malo siahať po

syntetických chemických liečivách.

8

2 TEORETICKÁ ČASŤ – FLAVONOIDY, ANTIFLOGISTICKÝ

ÚČINOK

2.1 História flavonoidov

Prvé štúdie zamerané na flavonoidné pigmenty, ktoré robila skupina Roberta Boyla v roku

1664, popisovali účinok zásad a kyselín na farbu extraktov z rastlinných kvetov. V roku 1936

obdržal Nobelovu cenu za fyziológiu a medicínu Dr. Albert Szent-Györgyi, významný

maďarský biochemik, a jeho spolupracovníci, ktorí prehlásili, že flavonoidný preparát z papriky

a citrusovej kôry môže kompletne navrátiť zdravie skorbutickým guinejským prascom.

Samotný vitamín C to totiž nedokázal, no flavonoidy jeho účinok podporili. Albert Szent-

Györgyi preukázal existenciu redukujúcich látok v rastlinných pletivách a živočíšnych

tkanivách [4].

Albert Szent-Györgyi a jeho spolupracovníci najskôr označili skupinu flavonoidov ako

vitamín P. Avšak chemická diverzita flavonoidov vylúčila možnosť ich klasifikácie ako jedinej

zlúčeniny. Neskôr bol preto vitamín P premenovaný na flavonoidy. Od tohto objavu vedci

izolovali viac ako 6000 flavonoidov [4].

Medzi prvé biologicky študované flavonoidy patria izoflavóny, pretože ich štruktúra

s hydroxylovou skupinou v pozícii 7 a 4' na základnom kruhu zabezpečuje ich afinitu

k estrogénnym receptorom. Ďalšia skupina, antokyaníny, bola v histórii ľudstva používaná

komerčne ako farbivá [4].

2.2 Výskyt flavonoidov ̶ distribúcia v prírode

Flavonoidy sú kvalitatívne aj kvantitatívne jednou z najväčších skupín známych prírodných

produktov. Biologický účinok v rastlinách je rôzny. Flavonoidy sa podieľajú na produkcii

pigmentácie, napríklad modrá farba je dôsledkom prítomnosti antokyanínu v okvetných

lístkoch. Antokyaníny sú tiež zodpovedné za jesenné farby mnohých druhov rastlín

a fotoprotekciu buniek listov. Ich schopnosť správať sa ako prirodzené UV filtre je daná

absorpciou v oblasti 280 ̶315 nm [1,5]. Rôzne rastlinné polyfenoly majú taktiež dôležitú úlohu

v ochrane pred mikróbmi a hmyzom. Niektoré z nich (izoflavóny, flavóny a flavanóny) sú

uznávané ako podstatné antifungálne rastlinné činidlá. Iné (flavonoidy, taníny) sú dôležitými

látkami pre ochranu rastlín pred hmyzom a bylinožravými cicavcami. Okrem toho majú mnohé

flavonoidy schopnosť pozmeňovať enzymatické a chemické reakcie a tým pozitívne alebo

negatívne zasahujú ľudské zdravie [1,5,6].

Flavonoidy hrajú dôležitú úlohu v metabolizme dusíka u rastlín viažucich dusík, pretože

indukujú noduláciu ich koreňov. Tieto noduly obsahujú baktérie fixujúce molekulu dusíka N2,

ako napríklad rod Rhizobium, ktorý žije v symbióze so strukovitými rastlinami. Rastlina

zabraňuje inhibícii transformácie molekuly dusíka na amoniak udržiavaním nízkej hladiny

kyslíka O2 a baktérie tvoria 3 proteíny, ktoré sú požadované pre fixáciu dusíka:

nitrogenázareduktáza, nitrogenáza a koenzým FeMo-co [1,3,5]. Hlavným účinkom flavonoidov

je pravdepodobne indukcia génovej expresie proteínov vyžadovaných bunkami nodúl, ale sú

tiež vhodné na to, aby sa podieľali na eliminácii kyslíka, keďže pôsobia antioxidatívne [5,6,7].

9

Táto trieda prírodných látok ohromuje svojou variabilitou a počtom členov. Na pozíciach

v charakteristickom flavonoidnom jadre sú deriváty tvorené najčastejšie hydroxyláciou,

metyláciou, acetyláciou, glykozyláciou alebo izoprenyláciou; je preto možné jednoduchou

permutáciou stanoviť počet flavonoidov, ktorých výskyt sa v prírode očakáva [3,5,7].

Flavonoidy sú často hydroxylované v pozíciách 3, 5, 7, 3', 4' a 5'. Niektoré z týchto

hydroxylových skupín sú mnohokrát metylované, acetylované alebo sulfátované. Keď sa tvoria

glykozidy, glykozidická väzba je za normálnych podmienok lokalizovaná v pozícii 3 alebo 7

a sacharidmi sú zvyčajne ramnóza, galaktóza, glukóza, glukoramnóza alebo arabinóza.

Prenylácia sa vyskytuje spravidla priamo na uhlíkovom atóme v aromatickom kruhu, ale už

bola objavená aj O-prenylácia [3,5,7].

Relatívne veľké množstvo zástupcov tejto skupiny je rozšírené chiralitou podjednotiek a ich

spojení. Z tohto hľadiska sa predpokladá výskyt až 6102 rôznych foriem flavonoidov.

Doposiaľ bolo identifikovaných viac ako 3102 a toto číslo veľmi rýchlo rastie. Vzhľadom na

relatívne vysokú molekulovú hmotnosť a komplikovanú štruktúru týchto zlúčenín ich

identifikácia a chemická syntéza predstavuje pre organických chemikov výzvu aj napriek

využitiu moderného vybavenia [1,6,7].

2.3 Identifikácia flavonoidov

Kompletná analýza štruktúry a absolútnej konfigurácie flavonoidov je zvyčajne zložitou

úlohou, ktorá vyžaduje aplikáciu progresívnych techník ako sú [1H]- a [13C]-NMR

spektroskopia, [1H-1H]-korelačná spektroskopia, kruhový dichroizmus, optická rotačná

disperzia, hmotnostná spektrometria a RTG difrakcia. Keďže je iba niekoľko laboratórií

vybavených týmito drahými prístrojmi, sú požadované iné prístupy k charakterizácii

flavonoidov. Štandardným vybavením biochemických laboratórií sa stala moderná

chromatografická technika HPLC. Menej finančne náročnou metódou je TLC v kombinácii

s fluorescenciou, pri ktorej sa dajú získať dobré výsledky. Ako referenčná vzorka sa používa

štandardný roztok známych flavonoidov. Pozície jednotlivých flavonoidov môžeme pozorovať

pod UV lampou. Charakteristické farby emitované jednotlivými flavonoidmi v roztoku, pri

použití UV žiarenia, slúžia a napomáhajú ich identifikácii. Presné postupy systematickej

identifikácie flavonoidov boli publikované niekoľkými autormi [1].

Príprava vzorky pre analýzu môže predstavovať problém, keďže flavonoidné glykozidy sú

prevažne polárne štruktúry, a teda vo vode rozpustné, zatiaľ čo aglykóny sú nepolárne. Tie preto

musia byť extrahované nepolárnymi rozpúšťadlami. Vhodným kompromisom je často metanol,

ktorý umožňuje extrakciu väčšiny flavonoidov. Čiastočne miernou a účinnou extrakčnou

technikou pre lipofilné flavonoidy je superkritická extrakcia pomocou CO2. Tento proces si

veľmi rýchlo získal uznanie [1].

2.4 Chémia flavonoidov

Flavonoidy ako sekundárne metabolity majú základnú štruktúru tvorenú 2-fenyl-

benzo[α]pyránovým alebo flavánovým jadrom, ktoré pozostáva z dvoch benzénových kruhov

(A, B) spojených pomocou heterocyklického pyránového kruhu (C) [1,6]. Skupina flavonoidov

10

je rozdelená na základe substituentov. Líšia sa v usporiadaní hydroxylovej, metoxy

a glykozidickej vedľajšej skupiny a v konjugácii medzi prvým a druhým benzénovým jadrom

[1,6,7]. Na obrázku (viď Obrázok č. 1) je zobrazená základná štruktúra, z ktorej vychádzajú

všetky flavonoidy.

O8

7

6

5 4

3

2

6'

5'

4'

3'

2'

B

A C

Obrázok č. 1: Základná štruktúra flavonoidu

V priebehu metabolizmu sú pridané hydroxylové skupiny, flavonoidy sú metylované,

sulfátované alebo glukuronidované. V potrave flavonoidy existujú primárne ako O-glykozidy

a polyméry. Najbežnejšou glykozidickou jednotkou je glukóza, inými príkladmi sú

glukoramnóza, galaktóza, arabinóza a ramnóza. Iba malá časť sa nachádza v podobe aglykónov

[1,6,7].

Flavonoidy môžu byť klasifikované podľa biosyntetického pôvodu. Niektoré triedy, ako

napríklad chalkóny (prekurzory vlastných flavonoidov), flavanóny, flavan-3-oly a flavan-3,4-

dioly, sú intermediátmi v biosyntéze a zároveň konečnými produktami a môžu sa hromadiť

v rastlinnom tkanive [1,7]. Iné triedy sú známe iba ako konečné produkty biosyntézy; príkladom

sú antokyanidíny, proantokyanidíny, flavóny a flavonoly. Dve ďalšie skupiny vznikajú

izomerizáciou flavanónu, kde 2-fenylový postranný reťazec sa presunie na pozíciu 3. Tým tvorí

skupinu izoflavónov a príbuzných izoflavonoidov. Neoflavonoidy sú vytvorené ďalšou

izomerizáciou na pozíciu 4 [1,7,9].

Jednotlivé flavonoidy môžu byť pomenované 3 rôznymi spôsobmi. V najväčšej miere sa

využíva triviálny názov, ktorý indikuje triedu alebo rastlinný zdroj. Taktiež sa využíva

semisystematický názov a zriedkavo systematický chemický názov. V nižšie uvedenej tabuľke

(viď Tabuľka č. 1) je základné rozdelenie flavonoidov a hlavní zástupcovia jednotlivých tried

s príslušnou substitučnou charakteristikou [7,8,9].

Tabuľka č. 1: Klasifikácia flavonoidov do základných skupín a ich hlavní zástupcovia

Trieda Flavonoid Substitučná charakteristika

Flavanol

epigallolkatechín

epigallolkatechín gallát

(-)-epikatechín

(+)-katechín

3,5,7,3',4',5'-OH

3,5,7,3',4',5'-OH; 3-R1

3,5,7,3',4'-OH

3,5,7,3',4'-OH

11

Flavón apigenín

luteolín

5,7,4'-OH

5,7,3',4'-OH

Flavonol

kaempferol

morín

quercetín

rutín

3,5,7,4'-OH

3,7,2',4',5'-OH

3,5,7,3',4'-OH

5,7, 3',4'-OH; 3- R2

Flavanón

(dihydroflavón)

hesperidín

naringenín

taxifolín

5,7,3',4'-OH

5,7,4'-OH

3,5,7,3',4'-OH

Izoflavón genistín 5,4'-OH; 7- R3

Antokyanidín apigenidín

kyanidín

5,7,4'-OH

3,5,7,4'-OH; 3,5-OCH3

*Chalkón trihydroxychalkón 2,4,2'-OH

R1: gallát; R2: ramnoglukóza; R3: glukóza

*Chalkóny sú prekurzormi flavonoidov, no niektorí autori ich zaraďujú do celkového

rozdelenia flavonoidov do skupín [10].

2.4.1 Hlavné podskupiny flavonoidov

2.4.1.1 Chalkóny

Chalkóny sú prekurzormi flavonoidov. Sú charakteristické absenciou C-kruhu v základnej

štruktúre flavonoidnej kostry. Preto sú tiež označované ako flavonoidy s otvoreným reťazcom.

Chalkóny zahŕňajú napríklad floridzín, floretín a chalkonaringenín. Vyskytujú sa v značných

množstvách v rajčinách, hruškách, jahodách a určitých vlákninových produktoch. Chalkóny

a ich deriváty si zasluhujú pozornosť vzhľadom na mnoho nutričných a biologických prínosov

[11,12]. Na obrázku pod odstavcom (viď Obrázok č. 2) je zobrazená základná štruktúra, od

ktorej sú odvodené všetky chalkóny.

Obrázok č. 2: Základná štruktúra chalkónu

Chalkón

O

12

2.4.1.2 Flavóny

Flavóny (viď Obrázok č. 3) sú jednou z najdôležitejších podskupín flavonoidov. Sú rozšírené

v listoch, kvetoch a ovocí ako glukozidy. Do tejto podskupiny patria napríklad luteolín,

apigenín a tangeritín. Tieto látky vykazujú rôzne biologické funkcie [12,14].

Obrázok č. 3: Základná štruktúra flavónu

2.4.1.3 Flavanóny

Flavanóny (viď Obrázok č. 4) sú ďalšou dôležitou skupinou flavonoidov, ktorá sa všeobecne

vyskytuje vo všetkých citrusoch. Hesperetín, naringenín a eriodiktoyl sú príklady tejto triedy.

Flavanóny sú spojené s mnohými benefitmi pre zdravie vďaka ich vlastnostiam očisťovať telo

od voľných radikálov. Hesperidín a naringín sú dva glykozidy flavanónov hesperetínu

a naringenínu, vyskytujúce sa vo vyššej miere. Tieto látky sú zodpovedné za trpkú príchuť

džúsov a šupiek citrusových plodov [12,13,14,15].

Obrázok č. 4: Príklady štruktúr niektorých flavanónov

2.4.1.4 Flavonoly

Flavonoly sú flavonoidy obsahujúce ketónovú skupinu a hydroxylovú skupinu v polohe 3

na C kruhu. Sú to stavebné častice proantokyanínov. Flavonoly sa vo veľkom množstve

nachádzajú v zelenine a ovocí. Najviac študovanými flavonolmi sú kaempferol, quercetín,

myricetín a fisetín. Bolo zistené, že príjem flavonolov je spojený so širokým spektrom

zdravotných benefitov, ktoré zahŕňajú antioxidačný potenciál a znížené riziko vaskulárnych

ochorení. Na obrázku (viď Obrázok č. 5) je zobrazená základná štruktúra flavonolu [13].

O

O

Flavón

O

O

Flavanón

13

Obrázok č. 5: Základná štruktúra flavonolu

2.4.1.5 Antokyaníny

Antokyaníny sú svetlé pigmenty zodpovedné za sfarbenie v rastlinách, kvetoch a ovocí.

Chemicky sú klasifikované ako vodorozpustné glykozidy, ktoré sú derivátmi

polyhydroxylových a polymetoxylových zložiek 2-fenylbenzopyrýlia. Najbežnejším

predmetom štúdií sú kyanidín, delfinidín, malvidín, pelargonidín a peonidín. Antokyaníny

vykazujú širokú škálu biologických aktivít zahŕňajúc antioxidačnú, antiflogistickú,

antimikróbnu a antikarcinogénnu aktivitu. Dokonca majú značný efekt na krvné cievy a krvné

doštičky a redukujú riziko koronárneho srdcového ochorenia [13,15]. Základná štruktúra je

zobrazená na obrázku pod odstavcom (viď Obrázok č. 6).

Obrázok č. 6: Základná štruktúra antokyanínu

2.4.1.6 Izoflavonoidy

Izoflavonoidy sú veľmi rozsiahlou osobitou podskupinou. Ich distribúcia v rastlinnej ríši je

veľmi obmedzená. Vyskytujú sa najmä v strukovitých rastlinách, no ich výskyt bol potvrdený

dokonca aj v miroorganizmoch. Vedci zistili, že majú významnú úlohu ako prekurzory pre

vznik fytoalexínov počas interakcie rastlina-mikróby. Izoflavonoidy vykazujú obrovský

potenciál pre porazenie množstva ochorení [13].

Izoflavonoidy sú druhom fytoestrogénov, s chemickou štruktúrou podobnou živočíšnemu

hormónu estrogénu. Izoflavóny ako genisteín a daidzeín sú spoločne považované za

fytoestrogény vďaka svojej estrogénnej aktivite v určitých živočíšnych modeloch. Aj keď boli

izoflavonoidy izolované už z mnohých rastlín, najväčšia pozornosť je venovaná sójovým

izoflavonoidom. Hrajú dôležitú úlohu napríklad v ochrane a zachovaní silných a zdravých kostí

zlepšením kostnej hmoty a znížením jej resorpcie. Taktiež sa správajú ako antioxidanty, ich

konzumáciou je možné znížiť tvorbu arteriálneho povlaku, čím sa ďalej znižuje riziko

O

O

OH

Flavonol

O

OH

Antokyanidín

14

koronárnych srdečných ochorení a s tým spojených kardiovaskulárnych komplikácií. Môžu

zabrániť rakovine pľúc a taktiež rakovine prostaty a zabrániť rastu buniek. Napomáhajú

uvoľňovať menopauzálne symptómy, znižujú krvný tlak a napomáhajú funkcii žíl [13,15].

Na obrázku uvedenom nižšie je zobrazená základná štruktúra izoflavónu (viď Obrázok č. 7).

Obrázok č. 7: Základná štruktúra izoflavónu

2.5 Biosyntéza flavonoidov

Hoci biosyntetická dráha flavonoidov bola značne študovaná a popísaná u mnohých rastlín,

doposiaľ neexistujú údaje o biosyntéze flavonoidov v konope. Mnohé štúdie iba predpokladajú

dráhu, podľa ktorej by mala syntéza prebiehať [1,7,16].

Prekurzormi biosyntézy sú fenylalanín zo šikimátovej dráhy a malonyl-CoA, ktorý je

syntetizovaný karboxyláciou acetyl-CoA, centrálneho intermediátu v Krebsovom cykle.

Fenylalanín je prevedený na p-cinnamovú kyselinu pomocou fenylalanín-amoniaklyázy (PAL),

táto kyselina je hydroxylovaná pomocou cinnamát 4-hydroxylázy (C4H) na kyselinu kumarovú

a CoA je pripojený pomocou 4-kumarát-CoA ligázy (4CL). Jedna molekula p-kumaryl-CoA

a 3 molekuly malonyl-CoA sú kondenzované pomocou chalkónsyntázy (CHS)

a polyketidsyntázy (PKS), za vzniku chalkónu naringenínu. Tento chalkón je izomerizovaný

chalkónizomerázou (CHI) na naringenín flavanón. Naringenín je spoločným substrátom pre

biosyntézu flavónov aj flavanolov. Pre biosyntézu luteolínu a cannflavínu A/B bola navrhnutá

dráha, ktorá začína reakciou feruloyl-CoA alebo caffeoyl-CoA s malonyl-CoA [16].

Ďalšie substitučné a modifikačné reakcie ako je hydroxylácia, metylácia, prenylácia či

glykozilácia prebiehajú pod dohľadom rôznych enzýmov, ktoré zabezpečujú syntézu ďalších

flavonoidov z daných intermediátov [16].

Metylácia hydroxylových skupín sa najpravdepodobnejšie vyskytuje s metanolom,

katalyzovaná špecifickou metylázou. Cukry, ktoré sú pripojené k hydroxylovej skupine, ktorá

sa preferenčne vyskytuje v pozícii C3, sú k dispozícii v podobe monosacharidu aktivovaného

pomocou UDP na anomérnom uhlíku a sú nastálo pripojené k aglykónu. Izoprenoidné

konjugáty flavonoidov sú tvorené pôsobením biologickej izoprénovej jednotky, izopentenyl

pyrofosfátu. Toto spojenie sa najčastejšie vyskytuje na pozícii C3 γ-chromónu [1,7].

Bolo zistené, že konope, ktoré neobsahuje kanabinoidy, neprodukuje prenylované

flavonoidy v kvetoch a listoch, čo idikuje, že biosyntéza flavonoidov v rastline Cannabis by

mohla byť spojená s kanabinoidnou, a preto tieto dve polyketidové biosyntetické dráhy môžu

byť kompetitívne [1,7,16].

O

O

Izoflavón

15

2.6 Absorpcia a metabolizmus

Okrem štruktúrnych a fyzikálno-chemických vlastností flavonoidov, absorpcia,

farmakokinetika, biotransformácia a príbuzné aktivity metabolitov sú kritickými determinantmi

biologického účinku v organizme. In vitro údaje dokazujú pozitívny antioxidačný účinok

štruktúrne odlišných flavonoidov za rôznych podmienok oxidačného stresu. Avšak, aktuálne

porozumenie absorpcie a metabolizmu u ľudí je obmedzené len na niekoľko dietárnych

flavonoidov [17].

Ako už bolo uvedené, väčšina flavonoidov v strave sa vyskytuje v podobe O-glykozidov.

Najbežnejšou glykozidickou jednotkou je glukóza, no vyskytujú sa v menšej miere aj iné

sacharidy. β-väzba týchto cukrov odoláva hydrolýze pankreatickými enzýmami, takže sa dlho

predpokladalo, že za β-hydrolýzu cukorných zvyškov bola zodpovedná intestinálna mikroflóra.

Odvtedy však boli charakterizované dve β-glukozidázy v tenkom čreve človeka schopné

hydrolýzy flavonoidných glykozidov, vrátane laktáza-florizínhydrolázy a nešpecifického

cytozolického enzýmu zodpovedného za deglykoziláciu flavonoidov a tým umožnenie

konjugácie. Výskumy ukázali, že luteolín-7-glukozid, kaempferol-3-glukozid a quercetín-3-

glukozid sú hydrolyzované a absorbované tenkým črevom za pomoci aktivity β-glukozidázy.

Iné štúdie ukázali, že extrakt z ľudského tenkého čreva rozštiepil 4'- a 7-monoglukozidy, no

nijak nezmenil radu ramnoglukozidov a diglukozidov, čim sa zistili rozdiely v biodisponzibilite

flavonoidov v závislosti na umiestnení a štruktúre cukorného zvyšku [2,17].

2.7 Farmakológia flavonoidov v živočíchoch

Doposiaľ boli snahy farmakológie zamerané na potenciálne rastlinné toxíny, ktoré boli

náhodne skonzumované, a lieky, ktoré boli určené na liečebné účely. Na druhú stranu, prírodné

produkty, ktoré sú pravidelne strávené vo veľkých množstvách ako komponenty bežnej ľudskej

stravy a sú iba jemne toxické, boli takmer úplne ignorované. Flavonoidy patria práve do tejto

kategórie [1].

Flavonoidy boli nedávno zahrnuté do výskumov, ktoré sa snažia preukázať dlhodobé účinky

na zdravie a zároveň môžnosť ovplyvnenia metabolizmu iných liečiv. Hlavnou príčinou nízkej

toxicity je nízka rozpustnosť aglykónu vo vode a rýchly rozklad pyrónového jadra v pečeni.

Nízka rozpustnosť flavonoidov vo vode často predstavuje problém pre medicínske aplikácie

týchto látok. Z tohto dôvodu je dôležitým pokrokom vývoj semi-syntetických, vo vode

rozpustných flavonoidov, napríklad na upravenie hypertenzie a mikrokrvácania. Príkladom

takýchto flavonoidov sú hydroxyetylrutozidy a inozitol-2-fosfátquercetín [1].

2.7.1 Farmakodynamika

Nutričné flavonoidy sú absorbované z gastrointestinálneho traktu, zatiaľ čo liečivé

flavonoidy sú riadené priamo do poškodeného tkaniva, ak je prístupné (napríklad pokožka,

sliznica) alebo pozdĺž dráhy vedúcej okamžite k cieľu (nazálny alebo vaskulárny systém). Po

uvoľnení glykozidov z aglykónu bakteriálnymi enzýmami v žalúdku je asi 15 % flavonoidných

aglykónov absorbovaných žlčovými micelami do epitelových buniek a prenesených do lymfy.

Dôležitým faktorom rozhodujúcim o účinnosti absorpcie flavonoidného glykozidu zo žalúdka

16

je podiel cukru. Niektoré štúdie ukazujú, že glykozidy sú absorbované lepšie ako čisté aglykóny

[1,2].

Pozostatky flavonoidov sú exkrétované stolicou a niektoré močom. Lymfa nesúca

flavonoidy vstupuje do krvi blízko pečene a väčšina (asi 80 %) je absorbovaná už pri prvom

prechode. Časť flavonoidov je pravdepodobne napojená na sérový albumín. Ďalšia časť sa

nachádza v konjugátoch, ktoré si zachovali svoje antioxidačné vlastnosti. Hepatocyty prenášajú

flavonoidy do Golgiho aparátu a tiež do peroxizómov, kde sú oxidačne degradované. Časť

oxidačnej degradácie flavonoidných aglykónov prebieha už v žalúdku, pretože niektoré

bakteriálne enzýmy sú schopné otvoriť C-kruh flavonoidnej kostry [1,2].

Produkty sú sekretované pomocou transportérov organických kyselín do krvi a následne

vylučované obličkami. Polčas života typického flavonoidu v tele bol stanovený na 1 ̶ 2 hodiny.

Flavonoidy nie sú akumulované v pečeni a ich dekompozičné produkty (kyselina kávová,

cinnamová, ako aj ich deriváty) sú kompletne vylučované močom s intenzitou podobnou

vylučovaniu kofeínu [1].

2.7.2 Akútna toxicita flavonoidov

Vzhľadom na nízku rozpustnosť flavonoidných aglykónov vo vode, krátky pobyt

flavonoidov v žalúdku a nízky absorpčný koeficient, u ľudí nie je možné, aby trpeli následkami

akútnej toxicity konzumovaním flavonoidov, s výnimkou vzácnych prípadov výskytu alergií

[1,9].

2.7.3 Flavonoidy ako antioxidanty

Antioxidanty sú látky, ktoré zabraňujú či predchádzajú oxidatívnemu poškodeniu cieľovej

molekuly alebo odstraňujú vzniknuté reaktívne molekuly. Hlavný mechanizmus účinku

antioxidantov zahŕňa potlačenie vzniku reaktívnych kyslíkatých foriem (ROS) chelatáciou

stopových prvkov, inhibíciou enzýmov podieľajúcich sa na tvorbe voľných radikálov,

odoberaním ROS a pozitívnou reguláciou ochranných antioxidačných enzýmov [2,9,18].

Protektívne účinky flavonoidov v biologických systémoch sú pripisované ich antioxidačnej

kapacite. Bolo zistené, že predchádzajú poškodeniam spôsobeným voľnými radikálmi

niekoľkými mechanizmami:

1) priame odstraňovanie ROS ‒ flavonoidy sú schopné vychytať voľné radikály priamo

donáciou atómu vodíka,

2) inhibícia oxidáz zodpovedných za tvorbu superoxidového aniónu ako xantínoxidáza,

cyklooxygenáza, lipoxygenáza, mikrozomálna monooxygenáza, glutatión S-transferáza,

mitochondriálna sukcínoxidáza a NADH oxidáza,

3) aktivácia antioxidačných enzýmov umocňujúcich indukciu detoxifikujúcich enzýmov

(NAD(P)H-quinón oxidoreduktáza, glutatión S-transferáza a UDP-glukuronozyltransferáza),

ktoré sú hlavnými obrannými enzýmami proti elektrofilným toxínom a oxidačnému stresu [2,9],

4) chelatácia stopových kovov,

17

5) zmiernenie oxidačného stresu zapríčineného oxidom dusným [2,18].

2.7.3.1 Faktory ovplyvňujúce antioxidačnú kapacitu

Doposiaľ bolo vedené značné množstvo in vivo a in vitro štúdií, ktoré využívali prírodné

flavonoidy, aby sa zistila súvislosť medzi štruktúrou flavonoidov a ich antioxidačnou aktivitou.

Možno popísať niekoľko špecifických štruktúrnych elementov flavonoidov, ktoré sú

kľúčovými determinantmi odstraňovania voľných radikálov, chelatácie a prooxidačnej aktivity

[12,18,19].

Celkový počet hydroxylových skupín a taktiež umiestnenie týchto substituentov podstatne

ovplyvňuje niekoľko mechanizmov antioxidačnej aktivity. Kapacita odstraňovania voľných

radikálov je primárne prisudzovaná vysokej reaktivite hydroxylových substituentov, ktoré sa

podieľajú na nasledujúcej reakcii [12,18]:

F-OH + R• → F-O• + RH

O-glykozylácia, ako aj O-metylácia flavonoidov, redukuje ich in vitro antioxidačnú aktivitu

v porovnaní s príslušnými aglykónmi. Tento jav je zapríčinený pravdepodobne vytvorením

stérickej zábrany. Okrem hydroxylových skupín naviac niektoré štúdie zdôrazňujú význam

nenasýtenosti v pozícii 2, 3 a substitúciu 4-karbonylovej skupiny. Tieto javy môžu taktiež

negatívne ovplyvniť antioxidačnú aktivitu flavonoidov. Posledným faktorom je polymerizácia.

Nárast stupňa polymerizácie zlepšuje účinnosť prokyanidínov proti rôznym radikálovým

formám [9,18,19,20].

V najnovších výskumoch bola demonštrovaná synergia antioxidačního efektu medzi α-

tokoferolom, epikatechínom a epikatechín-galátom v modeloch in vivo. Tieto štúdie ukázali,

že inklúzia quercetínu, katechínu alebo epikatechínu v strave potkanov zvýšila koncentráciu α-

tokoferolu prítomného v krvnej plazme a v pečeni [19,20,21].

V niektorých prípadoch sa predpokladajú možné synergické alebo antagonistické efekty

medzi rôznymi antioxidantmi prítomnými v rastline a odvodenými produktami, no len málo

štúdií sa sústredilo na určenie interakcií flavonoid-flavonoid vo vzťahu k antioxidačnej aktivite

[18,19,20,21].

2.7.4 Prooxidačná aktivita

Zatiaľ čo antioxidačné vlastnosti podporujú pozitívnu úlohu flavonoidov v ľudskej výžive

a prevencii pred rôznymi ochoreniami, určité štúdie sa zaoberali skúmaním možnej

prooxidačnej aktivity in vitro [1,2,18].

Prooxidačná aktivita je zodpovedná za cytotoxické a proapoptotické efekty flavonoidov

izolovaných z rôznych liečivých bylín [2]. V prítomnosti reaktívnych dusíkatých foriem (RNS)

flavonoidy s konfiguráciou obsahujúcou pyrogallol na A alebo B kruhu indukujú rozpad

jednovláknovej DNA. Je tiež dokázané, že nenasýtená väzba v polohe 2, 3 a usporiadanie 4-

oxo u flavónov môže podporovať tvorbu ROS indukovanú divalentnou meďou v prítomnosti

kyslíka [2,18].

18

2.7.5 Antimikrobiálna aktivita

2.7.5.1 Antifugálna aktivita flavonoidov

Z dôvodu rozsiahlej schopnosti flavonoidov inhibovať klíčenie spór rastlinných patogénov

boli navrhnuté na použitie proti fugálnym patogénom človeka. 5,7,4'-trihydroxy-8-metyl-6-(3-

metyl-[2-butenyl])-2S-flavanón vykazoval pozitívnu antifugálnu aktivitu proti

oportunistickému patogénu Candida albicans. Taktiež flavonoid 7-hydroxy-3',4'-

metylendioxyflaván inhiboval rast tohto mikroorganizmu [1,22]. Inhibičnú aktivitu proti

Aspergillus flavus, rodu mikroskopických húb, ktorý spôsobuje invazívne ochorenia

u imunosupresívnych pacientov, vykazovali flavonoidy 6,7,4'-trihydroxy-3',5'5-

dimetoxyflavón a 5,5'-dihydroxy-8,2',4'-trimetoxyflavón. Aktivita propolisu proti

dermatofytom a Candida spp. bola prisúdená aspoň z časti vysokému obsahu flavonoidov.

Galangín, flavonol bežne prítomný v propolise, vykazoval inhibičnú aktivitu proti Aspergillus

tamari, A. flavus, Cladosporium sphaerospermum, Penicillium digitatum a P. italicum [1,8,22].

2.7.5.2 Antivirálna aktivita

Nedávne štúdie boli zamerané takmer výhradne na ľudský imunodeficienčný vírus HIV.

In vitro štúdie ukázali, že baikalín dokázal inhibovať HIV-1 infekciu a replikáciu. Baikaleín,

robustaflavón a hinokiflavón, ako aj niektoré katechíny, taktiež vykazovali inhibičnú aktivitu

proti HIV-1 reverznej transkriptáze. Katechíny ale inhibovali aj iné DNA polymerázy a ich

interakcia s HIV-1 enzýmom je preto považovaná za nešpecifickú. Navyše bolo

demonštrované, že niektoré flavonoidy inhibujú HIV-1 proteinázu (vrátane demetylovaného

gardenínu A a 3,2'-dihydroxyflavónu) [8,22,23].

Flavonoidy majú tiež inhibičnú aktivitu proti rôznym ďalším vírusom. Niektoré štúdie

ukazujú, že quercetín, morín, rutín, dihydrofisetín, pelargonidín chlorid a katechín disponujú

inhibičnou aktivitou proti niektorým typom vírusov ako herpes simplex (HSV), respiračný

syncytiálny vírus, poliovírus a Sindbis vírus. Daný mechanizmus antivirálneho účinku zahŕňa

inhibíciu virálnej polymerázy a väzby virálnej nukleovej kysleiny alebo proteínu virálneho

kapsidu [8,22,23]. Napriek tomu, že antivirálny účinok bol poprvýkrát zistený už v 40. rokoch

20. storočia, iba v posledných 25 rokoch boli použité na tieto pokusy synteticky modifikované

flavonoidy. Jednou z takýchto syntetizovaných látok bol 6,4'-dichloroflaván. Hoci v in vitro

podmienkach vykazoval silnú aktivitu, klinické pokusy boli neúspešné [8,23].

Synergizmus bol demonštrovaný medzi rôznymi kombináciami flavónov a flavonolov.

Napríklad kaempferol a luteolín vykazovali synergiu proti HSV. Synergizmus bol taktiež

preukázaný medzi flavonoidmi a inými antivirálnymi činidlami. Apigenín zlepšuje antivirálnu

aktivitu acykloviru proti HSV a besnote [23].

2.7.5.3 Baktericídna a bakteriostatická aktivita

Antibakteriálna aktivita bola skúmaná na jednotlivých izolovaných flavonoidoch, ako aj na

syntetických. Široká škála týchto látok disponuje antibakteriálnou aktivitou. Niektorí

výskumníci udávajú synergiu medzi prirodzene sa vyskytujúcimi flavonoidmi a inými

19

antibakteriálnymi látkami proti rezistentným rodom baktérií. Príkladom sú epikatechín gallát

a sophoraflavanón G. Niektorí skúmali synergiu medzi rôznymi flavonoidmi, iní synteticky

modifikovali prirodzené flavóny a analyzovali účinok proti baktériam. Skupina vedcov

potvrdila, že antibakteriálna aktivita 3-metylénflavanónov sa zvyšuje, ak sú v B kruhu prítomné

substituenty chlóru a brómu [1,22,23].

S narastajúcim počtom ľudí s oslabenou imunitou je pochopiteľný záujem o identifikáciu

látok, ktoré baktérie skôr zabíjajú, ako len inhibujú ich rast. Baktericídna aktivita v tomto

kontexte je definovaná ako aktivita majúca za následok 99,9 % redukciu počtu baktérií, a je

určovaná použitím metódy čas-úmrtie alebo metódy minimálnej baktericídnej koncentrácie

(MBC) [22]. Štúdie s modelovými membránami dokazujú, že flavonoidy spôsobujú agregáciu,

a v roku 2007 bolo potvrdené, že flavonol galangín vykazuje tento účinok na bakteriálne bunky.

Podobné účinky boli preukázané aj u flavan-3-olu a epikatechínu [8,22,23].

Prvé výskumy flavonoidov ukazujú, že priama atibakteriálna aktivita flavonoidov môže

prispievať až k trom rôznym mechanizmom. Týmito sú poškodenie cytoplazmatickej

membrány (spôsobené perforáciou alebo znížením membránovej fluidity), inhibícia syntézy

nukleových kyselín (spôsobené inhibíciou topoizomerázy) a inhibícia energetického

metabolizmu (spôsobené inhibíciou NADH-cytochróm c reduktázy). V rokoch 2005 ̶ 2010 boli

vedené ďalšie výskumy, ktoré podporili navrhnuté mechanizmy. Práca s triedou flavonolov,

flavan-3-olov a flavolanov preukázala, že spôsobujú poškodenie cytoplazmatickej membrány

(je možné, že kvoli tvorbe peroxidu vodíka). Trieda flavan-3-olov a izoflavónov vykazuje

inhibíciu syntézy nukleových kyselín (inhibíciou topoizomerázy a/alebo

dihydrofolátreduktázy) [8,22].

2.7.6 Antiflogistická aktivita flavonoidov

Ďalším dôležitým bodom terapeutickej aplikácie flavonoidov, ktorým sa táto práca zaoberá

v praktickej časti, je zápal (z gréckeho flogósis). Tento proces je integrovaná odozva mnohých

obranných systémov organizmu na inváziu cudzorodého telesa akéhokoľvek druhu, či už sa

jedná abiotickú časticu, bakteriálnu bunku alebo vírusy [1,24,25]. Okrem iného záhŕňa proces

zápalu pôsobenie doplnkového systému, koagulácie krvi, humorálnej a bunkovej imunity

cytokínov, tkanivových hormónov, angiogenézu (vývoj krvných a lymfatických tkanív)

a nápravné procesy [1,19,24,25].

Hlavným spúšťačom zápalu je rozpoznanie cudzorodej bunky (mikróbu) špecifickými

receptormi vrodeného imunitného systému, ktorý zohráva rozhodujúcu úlohu v indukcii

iniciácie prvotných signálov a vytvorení aparátu. Hlavnou funkciou zápalu je odstrániť infekciu

a napraviť poškodenia, ku ktorým došlo, za účelom opäť dosiahnuť homeostázu organizmu.

Ideálna zápalová odozva je preto rýchla a deštruktívna, špecifická a seba-limitujúca. Dôležitosť

tejto rovnováhy je demonštrovaná na nálezoch určitých chronických a infekčných a zápalových

poruchách, pri ktorých zápalová odozva spôsobí viac škody hostiteľovi ako mikróbu

[12,19,25,26].

Zápal je veľmi úzko spätý s imunitným systémom. Vskutku môže prehnaná aktivácia odozvy

vrodeného imunitného systému spôsobiť chronickú infekciu alebo chronický zápal v dôsledku

20

neefektívnej regulácie alebo rozpadu zápalovej odozvy. Z mnohých štúdií bolo preukázané, že

chronický zápal je čoraz viac zapojený v rozvoji niektorých patologických porúch ako je

ateroskleróza, obezita, diabetes, neurodegeneratívne ochorenia a tiež rakovina. Z nich

kardiovaskulárne ochorenia a rakovina sú hlavnými príčinami úmrtí v mnohých krajinách

[19,25]. Mnohé epidemiologické štúdie poukazujú na to, že vzrast konzumácie ovocia

a zeleniny bohatých na flavonoidy je spojený so znížením výskytu kardiovaskulárnych ochorení

rôznych typov rakoviny [19,25,26].

Hoci sa už dnes využívajú na liečenie akútneho zápalu steroidné protizápalové lieky, neboli

tieto lieky úplne úspešné v liečbe chronických zápalových porúch, pretože látky tohto druhu sú

doprevádzané nečakanými účinkami. Preto je potreba nájsť bezpečnejšie protizápalové zložky

[1,24,25,26].

2.7.6.1 Protizápalový mechanizmus flavonoidov

V nedávnych štúdiach bolo popísaných niekoľko mechanizmov vysvetľujúcich

protizápalovú aktivitu flavonoidov, vrátane antioxidačnej aktivity a odstraňovania voľných

radikálov, regulácií bunečnej aktivity buniek spojených so zápalom, modulácie aktivity

enzýmov metabolizmu arachidonovej kyseliny (fosfolipáza A2, cyklooxygenáza,

lipooxygenáza) a NO-syntázy, modulácie produkcie proinflamačných molekúl a modulácie

expresie proinflamačných génov [1,25,26].

2.7.6.2 Modulácia bunečných funkcií spojených so zápalom

Imunitný systém je integrovaný komplexne regulovanou skupinou buniek, ktoré možu

interagovať spôsobom bunka-bunka a taktiež môžu vytvoriť odozvu na intracelulárne signály

vrátane hormónov a cytokínov. Imunitná odpoveď môže byť modifikovaná stravou,

farmakologickými činidlami, environmentálnymi polutantmi a prirodzene sa vyskytujúcimi

potravinovými chemickými látkami ako sú vitamíny a flavonoidy. Niektoré flavonoidy

vykazujú pozoruhodný rad biochemických a farmakologických aktivít, ktoré ovplyvňujú

funkciu imunitných a zápalových buniek ako sú T- a B-lymfocyty, makrofágy, neutrofily, žírne

bunky alebo bazofily [24,25,26].

Niektoré flavonoidy špecificky ovplyvňujú enzýmový systém kriticky zapojený v generácii

protizápalového procesu, najmä tyrozín- a serín-treonín-proteínkinázu. Tieto enzýmy sú

zapojené v signálnej transdukcii a procesoch aktivujúcich bunky ako je proliferácia

T-lymfocytov, aktivácia B-lymfocytov alebo produkcia cytokínov stimulovaná monocytmi

[25,26]. Genisteín, izoflavón, bol preukázaný ako špecifický inhibítor tyrozín-proteínkinázy.

Táto aktivita sa môže podieľať na niektorých protizápalových účinkoch, keďže proliferácia T-

lymfocytov je spojená s fosforyláciou tyrozínu príslušných proteínov T-lymfocytov [1,25,26].

2.7.6.3 Modulácia aktivity proinflamačných enzýmov

Mnohé výskumy ukázali, že rôzne flavonoidné molekuly modulujú aktivitu enzýmov

metabolizujúcich kyselinu arachidonovú (AA) ako fosfolipáza A2 (PLA2), cyklooxygenáza

(COX) a lipooxygenáza (LOX) a enzými produkujúce oxid dusnatý (NOS). Inhibícia týchto

enzýmov redukuje produkciu AA, prostaglandínov, leukotriénov a NO, ktoré sú rozhodujúcimi

21

mediátormi zápalu. Preto inhibícia týchto enzýmov flavonoidmi môže byť jedným

z najdôležitejších mechanizmov ich protizápalovej aktivity [1,25,26].

2.7.7 Neurostimulačný účinok flavonoidov

Nielen periférny nervový systém, ale aj CNS je ovplyvňovaný flavonoidmi. Flavonoidy sú

antagonisti k adenozínovým receptorom v mozgu. Sú taktiež ligandmi benzodiazepínových

receptorov. Výsledkom je stimulácia príbuzná tej po požití kávy, čaju alebo tabaku. Keďže tieto

stimulanty obsahujú značné koncentrácie flavonoidov, pravdepodobne najviac prispievajú

k danému účinku [1,9].

Flavonoidy majú okamžitý účinok uvoľnovania bolesti pri kožných ranách spôsobených

hmyzom alebo po uhryznutí hadom, popálením alebo porezaním. Tento mechanizmus môže

byť veľmi jednoducho vysvetlený inhibíciou tvorby prostaglandínov (PG). Daný enzým

tvoriaci PG je inhibovaný mnohými flavonoidmi [1,9,17].

Lokálny anestetický efekt flavonoidov sa podobá na efekt acetylsalicylátu. Korešponduje

s účinkom kodeínu, čo je látka patriaca do skupiny opiátov. Ak by bolo možné nahradiť

novokaín a iné anestetiká založené na opiátoch, mohlo by sa predísť vedľajším neurologickým

účinkom ako sú dlhodobé závrate [1,9,17].

2.7.8 Analgetický účinok

Analgézia znamená uvoľnenie od bolesti. Dôležitou dráhou tohto druhu je zvýšená

biosyntéza proopiomelanokortínu, z ktorého sú proteázami uvoľnované endogénne opiáty

enkefalín, endorfín a dynorfín. Oprávnenie klasifikácie týchto látok ako opiátov nie je

opodstatnené len schopnosťou indukovať anestéziu, ale skladajú sa do rovnakej priestorovej

štruktúry ako členovia skupiny morfia. Okrem toho obe skupiny, endogénne opiáty aj tie

rastlinného pôvodu, obsadzujú rovnaké neuronálne receptory. Efekty flavonoidov

a endogénnych opiátov sú veľmi podobné, preto aj tu sa predpokladá priame spojenie. Obe

triedy látok zvyšujú koncentráciu cAMP, flavonoidy (quercetín, kaempferol) inhibujú cAMP

fosfodiesterázu. Flavonoidy sa môžu priamo viazať na opiátne receptory alebo môžu inhibovať

neurónové transmiterové receptory, aby aktivovali neuróny bolesti [1,6,22].

2.8 Interakcie flavonoidov s inými liekmi

Interakcie liečiv predstavujú narastajúci problém pri vytváraní a kontrole moderných

liečebných metód, keďže nové nahliadnutie na patogenézu vedie k predstavovaniu ešte

komplexnejších liečiv. Preto vzájomné interakcie medzi liekmi alebo liekmi a komponentmi

stravy, poprípade alkoholom, može drasticky vyradiť terapeutický účinok jedného alebo oboch

liečiv, čím sa stávajú zbytočnými alebo nebezpečnými. Hoci flavonoidy sú považované za

netoxické komponenty bežnej stravy, môžu podstatne ovplyvniť farmakologický potenciál

určitých liekov [2,27].

Jeden z prvých príkladov tejto komplikácie bol pozorovaný pri obličkovej dialýze, ktorej

pacienti so stabilnou transplantáciou obličiek dostávali lieky na zlepšenie krvnej cirkulácie.

22

Niektorí z týchto pacientov konzumovali so svojím jedlom grepový džús, no krátko na to trpeli

škodlivými efektmi zvýšenej potencie ich medikácie. Po tomto zistení sa začali touto témou

zaoberať aj iní vedci a tento výsledok bol opať potvrdený. Vedci zistili, že komponent džúsu,

pravdepodobne naringenín, ktorý je prítomný v značnej koncentrácii, aktivuje

fosfoglykoproteín v epitelových bunkách žalúdka a potláča expresiu génu cytochrómu P450

3A4. Uvedený proteín zlepšuje vstrebávanie mnohých liekov zo žalúdka, vrátane vinblastínu,

cyklosporínu, digoxínu, fexofenadínu a lozartánu, ten druhý naopak iniciuje oxidačnú

dekompozíciu liekov. Keďže sa jedná najmä o lieky často využívané v terapii rakoviny,

hypertenzie, HIV, imunitných ochorení a iných závažných porúch, interferencie týkajúce sa ich

funkčnosti musia byť lekármi brané v úvahu [2,27].

Mechanizmus zvýšenia aktivity liekov pre zlepšenie krvnej cirkulácie bol identifikovaný ako

inhibícia cytochróm P450-dependentnej monooxygenázy, ktorá iniciuje deštrukciu

vaskulárnych činidiel násobením hydroxylácií ich aromatického jadra [2,27].

2.8.1 Flavonoidy izolované z rastliny Cannabis sativa

Celkovo bolo doposiaľ izolovaných 26 flavonoidov z rastliny Cannabis sativa. Boli robené

štúdie bioaktivít týchto flavonoidov, no nie do takej miery ako štúdie kanabinoidov alebo

terpenoidov. Synergicky zlepšujú niektoré prospešné účinky alebo redukujú nechcené vedľajšie

účinky kanabinoidov, keď je Cannabis prijímaný v podobe hrubého extraktu. Je ešte mnoho

nepreštudovaných oblastí, nielen vo vzťahu ku konzumentom tejto rastliny, ale aj vo vzťahu

k ich úlohe v rastline [12,17,27].

Flavonoidy boli extrahované z listov, kvetov, peľu a stonky rastliny. Boli získané aglykóny

alebo konjugované O-glykozidy kaempferolu, quercetínu, apigenínu a luteolínu, ako aj C-

glykozidy vitexínu, izovitexínu, orientínu a ich O-glykozidy. Okrem toho sa vyskytujú rôzne

metylované, prenylované a geranylované deriváty týchto flavonoidov. Cannflavín

A a cannflavín B, dva metylované izoprenoidné flavóny, reprezentujú prvé aglykóny

flavonoidov unikátne izolované z rastliny Cannabis sativa [12,17,27].

2.8.1.1 6-prenylapigenín

U niektorých flavonoidov spolu s 6-prenylapigenínom (viď Obrázok č. 8), ktorý bol taktiež

izolovaný z Cannabis sativa, bolo dokázané, že inhibuje biosyntézu melanínu v B16

melanómových bunkách bez toho, aby inhiboval tyrozinázu. Výskumy zamerané na štruktúrnu

aktivitu indikovali, že prítomnosť izoprenoidom substituovaného zvyšku zvyšuje inhibičnú

aktivitu produkcie melanínu v týchto bunkách [29].

23

Obrázok č. 8: Štruktúra 6-prenylapigenínu

2.8.1.2 Apigenín

Apigenín (5,7,4’-trihydroxyflavón) je bežný flavonoid nájdený v mnohých rastlinách.

Apigenín (viď Obrázok č. 9) je popísaný ako nemutagénny flavonoid, ktorý má významný

chemopreventívny účinok proti UV žiareniu. Nedávne výskumy ukázali, že môže znížiť

oxidatívne poškodenie DNA, inhibuje rast abnormálnych bielych krviniek u leukemikov

a indukuje ich diferenciáciu. Navyše inhibuje transdukciu signálu rakovinových buniek

a indukuje apoptózu. Bol preukázaný antikarcinogénny účinok na rakovinových bunkách

prostaty a vaječníkov. Prejavuje protizápaľový, antispazmatický alebo spazmolytický účinok.

Je slabo estrogénnym flavonoidom. Ďalšie štúdie ukázali, že dokáže zlepšovať aterosklerózu

[30,31,32,33].

Obrázok č. 9: Štruktúra apigenínu

2.8.1.3 Cannflavín A a B

U cannflavínov A a B (viď Obrázok č. 10) bolo dokázané, že inhibujú prostaglandín E2

v ľudských reumatických synoviálnych bunkách. Cannflavín A tu má 30-násobne väčší

potenciál ako aspirín. Cannflavín A inhiboval cyklooxygenázu (COX) a lipooxygenázu, a preto

má protizápaľové účinky. Je zvláštne, že tieto zlúčeniny majú takú silnú biologickú aktivitu,

pretože substitúcia prenylovou skupinou zvyšuje lipofilnosť flavonoidov a tým dáva týmto

molekulám silnú afinitu k biologickým membránam. Prenylované flavonoidy priťahujú stále

väčšiu pozornosť vedeckých komunít, pretože majú potenciálny antioxidačný

a antikarcinogénny účinok a sú účinné v liečbe menopauzálnych problémov. Preto je možné,

že u cannflavínov budú v budúcnosti dokázané aj ďalšie biologické vlastnosti [34,35,36].

O

OH

OOH

HO

Apigenín

OH

O

OH

O

HO

CH3

H3C

6-prenylapigenín

24

V najnovších výskumoch a štúdiach bola prezentovaná ich antimikrobiálna a antiprotozoálna

aktivita, konkrétne antileishmanická aktivita (antileishmanický = pôsobiaci proti Leishmania

parazitom; Leishmania = taxonomický rod v rodine Trypanosomatidae – parazitárne prvoky,

trypanozómy; prenášané muškami, ktoré spôsobujú ochorenia u ľudí a iných stavovcov)

[34,35,36].

Obrázok č. 10: Štruktúra cannflavínu A a B

2.8.1.4 Chryzoeriol

Chryzoeriol (viď Obrázok č. 11) a jeho glykozid (chryzoeriol-6-O-acetyl-4’-β-D-glukozid)

vykazujú ako flavonoidy antioxidačnú aktivitu. Niekoľko rôznych metód bolo použitých na

zistenie efektu O-glykozilácie. Glykozilácia chryzoeriolu znižuje jeho schopnosť inhibovať

lipoperoxidáciu a reakciu s peroxylovými radikálmi. Naopak glykozid je efektívnejším

vychytávačom DPPH radikálov (stabilné radikály, ktoré strácajú charakter voľných radikálov

v prítomnosti molekúl, ktoré sú donorom vodíkového atómu) a lepším inhibítorom

xantínoxidázy ako aglykón [37].

Chryzoeriol pôsobí chemoprotektívne tým, že selektívne inhibuje aktivitu CYP1B1 (enzým,

ktorý sa zúčastňuje aktivácie prokarcinogénov na karcinogény). Ďalšie štúdie potvrdili, že

chryzoeriol je schopný zabrániť tvorbe aduktov DNA-benzo[a]pyrén v rakovinových bunkách

Canniflavón 2 = Cannflavín A

O

O OH

OH

HO

O

Canniflavón 1 = Cannflavín B

O

O OH

OH

HO

O

25

prsníka. Chryzoeriol sa teda môže podielať na chemoprevencii proti environmentálnym

prokarcinogénom ako je benzo[a]pyrén [37].

Obrázok č. 11: Štruktúra chryzoeriolu

2.8.1.5 Kaempferol

Niektoré epidemiologické štúdie zistili pozitívne spojenie medzi konzumáciou potravín

obsahujúcich kaempferol a zníženým rizikom vývoja niektorých porúch ako rakovina

a kardiovaskulárne ochorenia. Mnohé predklinické štúdie dokázali, že kaempferol a jeho

glykozidy majú širokú škálu farmakologických účinkov, vrátane antioxidačnej, protizápalovej,

antimikrobiálnej, antikarcinogénnej, kardioprotektívnej, neuroprotektívnej, antidiabetickej,

antiosteoporotickej, etrogénnej/antiestrogénnej, anxiolytickej, analgetickej a protialergickej

aktivity. Kaempferol (viď Obrázok č. 12) je silný antioxidant a pomáha predchádzať

oxidatívnemu poškodeniu buniek, lipidov a DNA. Pomáha predchádzať ateroskleróze

inhibíciou oxidácie LDL častíc a tvorby krvných doštičiek. Štúdie taktiež potvrdili, že sa správa

ako chemopreventívne činidlo, čo znamená, že inhibuje tvorbu rakovinových buniek.

Synergicky pôsobí s quercetínom v redukcii proliferácie rakovinových buniek. Z rastliny

Cannabis sativa bol izolovaný glykozylovaný kaempferol-3-O-soforozid (KPOS)

z metanolovej frakcie [38,39].

Obrázok č. 12: Štruktúra kaempferolu

Kaempferol-3-O-soforozid (viď Obrázok č. 13) má protinádorový, antioxidačný,

antialergický a antidiabetický účinok, ale mechanizmy dnes ešte nie sú známe. V nedávnych

štúdiach bol študovaný a potvrdený protektívny účinok proti zápalovým ochoreniam. Výsledky

OHO

OH O

OH

OH

Kaempferol

O

OH

OOH

HO

OCH3

Chryzoeriol

26

štúdií ukázali, že KPOS dokáže inhibovať lipopolysacharidom (LPS) indukovanú prozápalovú

odpoveď zvýšením bariérovej integrity, blokovaním adhézie neutrofilov a transepitelovou

migráciou cez epitelové bunky [40,41].

Obrázok č. 13: Štruktúra kaempferol-3-O-soforozidu

2.8.1.6 Luteolín

Luteolín (5,7,3’,4’-tetrahydroxyflavón), klasifikovaný chemicky ako flavón, sa vyskytuje

v mnohých typoch rastlín vrátane ovocia, zeleniny a liečivých rastlín. Rastliny bohaté na

luteolín sa používali v tradičnej čínskej medicíne na liečenie rakoviny, zápalu a hypertenzie.

Svoju pozornosť si získal svojim širokým spektrom biologických a farmakologických

vlastností. Mnohé štúdie preukázali jeho protizápaľový, protialergický a antikarcinogénny

účinok. Tieto vlastnosti sú čiastočne zapríčenené antioxidačnou kapacitou a schopnosťou

vychytávať voľné radikály. Luteolín aktivuje antioxidačné enzýmy a potláča proinflamačné

zložky. Biologické účinky môžu byť funkčne prepojené. Napríklad protizápalový účinok môže

byť spojený s jeho vlastnosťou pôsobiť proti rakovinovým bunkám. Luteolín (viď Obrázok

č. 14) je najefekívnejším flavonoidom v inhibícii proliferácie nádorových buniek. Používa sa

na liečenie rakoviny kože. Okrem tohto vykazuje antimikrobiálne a imunomodulačné účinky

[42,43,44].

Mnohé štúdie ukázali pozitívny vplyv na centrálny nervový systém (CNS). Okrem iného

pomáha luteolín zamedziť hromadeniu plaku. Môže pomôcť zachovať zdravé kognitívne

funkcie ako učenie a pamäť v živočíšnych modeloch [42,43,44,45].

Kaempferol-3-O-soforozid

O

O

OH

HO

OH O

O

OO

OH

OH

OH

OH

OH

OHOH

27

Obrázok č. 14: Štruktúra luteoliínu

2.8.1.7 Orientín a izoorientín

U orientínu je známa anxiolytická a antioxidačná aktivita, ktorá je silnejšia ako u vitexínu

(popísaný nižšie). Orientín ako aj izoorientín (viď Obrázok č. 15) inhibuje LPS-indukovanú

disrupciu bariéry, expresiu molekúl adherujúcich na povrch buniek (CAM)

a adhéziu/transendoteliálnu migráciu monocytov na/do ľudských endoteliálnych buniek.

Taktiež potláča hyperpermeabilitu a migráciu leukocytov in vivo indukovanú LPS. Ďalej bola

dokázaná jeho schopnosť potláčať tvorbu faktoru nádorovej nekrózy α (TNF-α) alebo

interleukínu (IL)-6. Dlhodobá liečba orientínom spôsobila redukciu LPS-indukovanej letálnej

endotoxémie. Tento výsledok potvrdil, že orientín chráni vaskulárnu bariérnu integritu a tým je

vhodný ako terapia pre vaskulárne zápalové ochorenia [46,47,48].

Popritom bola skúmaná aj vaskulárna aktivita a možné mechanizmy účinku orientínu.

Orietntín uvoľňuje fenylefrínom-indukované kontrakcie, ale tento vazorelaxačný efekt je

zoslabený oxidom dusnatým. Orientín inhibuje noradrenalínom, CaCl2- a KCl- indukovanú

vazorestrikciu. Orientín dokáže stimulovať produkciu NO endoteliálnymi bunkami. Zvyšuje

koncentráciu cyklického guanozínmonofosfátu (cGMP) bez toho, aby sa zmenila koncentrácia

cyklického adenozínmonofosfátu [46,47,48].

O

OH

OOH

HO

OH

Luteolín

O

OH

OOH

HO

OH

O

OH

OH

HO

HO

Orientín

28

Obrázok č. 15: Štruktúra orientínu a izoorientínu

2.8.1.8 Quercetín

Quercetín (viď Obrázok č. 16) je kategorizovaný ako flavonol. Je to aglykón, z ktorého

substitúciou hydroxylovej skupiny (väčšinou v polohe 3) cukrom (glukóza, ramnóza, rutinóza)

vznikajú glykozidy. Touto substitúciou sa môže zmeniť rozpustnosť, absorpcia ale aj účinky

in vivo. Quercetín sa javí ako veľmi prospešný pre ľudské zdravie v mnohých ohľadoch.

Antioxidačná aktivita quercetínu poskytuje ochranu mozgu, srdca a iných tkanív pred

ischemicko-reperfúznymi poškodeniami, toxickými látkami alebo inými faktormi, ktoré môžu

indukovať oxidatávny stres [49,50].

In vitro quercetín inhibuje histamín uvoľnený žírnymi bunkami a bazofilmi, čo naznačuje

antialergénny efekt. Taktiež pomáha čeliť aspektom spôsobujúcim anafylaktické reakcie tým,

že potláča imunologlobulín E [49,50,51].

Početné in vitro a in vivo experimenty pomohli vysvetliť antikarcinogénny účinok

quercetínu. In vitro dôkazy indikujú, že existuje rada antikarcinogénnych mechanizmov,

vrátane antioxidačného, antiproliferatívneho, pre-apoptotického, efekt signalízácie buniek

a potlačenie rastového faktora, ako aj potenciálny synergizmus s niektorými

chemoterapeutickými činidlami [49,50,51].

U ľudí bolo zistené, že príjem quercetínu inhibuje agregáciu krvných doštičiek a tvorbu

trombov. Z niektorých štúdií vyplýva, že pozitívne upravuje krvný tlak a môže mať efekt aj na

hladinu cholesterolu. Quercetín znižuje glukózu krvnej plazmy, zachováva integritu

pankreatických β-buniek a ich funkciu a pomáha chrániť proti úpadkom v rozpoznávaní, nálade

a vo funkcii ľadvín indukovaným diabetom v modelových potkanoch pre diabetes. Niektoré

štúdie robené na zvieratách dokazujú gastroprotektívne účinky. Quercetín slabo inhibuje rast

Helicobacter pyroli in vitro [50,51,52,53].

O

OH

OOH

HO

OH

O

OH

HO OH

OH

Izoorientín

29

Obrázok č. 16: Štruktúra quercetínu

2.8.1.9 Vitexín

Vitexín (viď Obrázok č. 17) kategorizovaný ako flavonoidný C-glukozid. In vivo

metabolizmus vitexínu bol zisťovaný na potkanoch. Vitexín indukuje apoptózu a potláča rast

nádorových buniek, má potenciálny antioxidačný účinok a môže byť efektívne využitý na

prevenciu pred nepriaznivými reakciami v koži indukovanými UV žiarením ako napríklad

produkcia voľných radikálov a poškodenie kožných buniek [54,55].

Vitexín má potenciálny hypotenzný efekt, ktorý vzniká blokáciou ganglií. Má značný

protektívny účinok proti myokardiálnym poraneniam. Protizápaľový účinok bol indikovaný na

základe jeho antihistaminických, antibradykinínových a antiserotonínových vlastností. Ďaľšie

klinické využitia zahŕňajú antivirálnu, antityroidnú, antisklerotickú a antihepatotoxickú

aktivitu. Schopnosť vitexínu inhibovať superoxidové radikály vedie k potenciálnej aplikácii

jeho anti-aging účinku v kozmetickom priemysle [54,55].

Vitexín spolu s izovitexínom podávané orálne značne znižujú postprandiálny krvný cukor.

Oba stimulujú sekréciu inzulínu a inhibujú α-glukozidázu, čím pomáhajú pacietom, ktorí trpia

na diabetes [54,55].

Obrázok č. 17: Štruktúra vitexínu

OHO

OH O

OH

OH

OH

Quercetín

O

OH

HO

HO

OH

O

OH

OOH

HO

Vitexín

30

3 PRAKTICKÁ ČASŤ

3.1 Cieľ

Cieľom mojej práce bolo izolovať rôzne látky obsiahnuté v rastline Cannabis sativa,

identifikovať ich a klasifikovať pomocou dostupných analytických metód. V druhej časti som

sa zaoberala skúmaním antiflogistickej aktivity látok, ktoré sa mi podarilo vyizolovať

v dostatočnom množstve, ako aj celkového rastlinného extraktu a podielov rozpustných

v jednotlivých organických rozpúšťadlách, respektíve vo vode.

Pri svojej práci som sa zamerala na flavonoidy – ubikvitárne biologicky aktívne látky

obsiahnuté v rastline C. sativa, a využila doposiaľ zistené informácie z výskumov o synergii

týchto látok.

3.2 Prvá časť: Izolácia a identifikácia obsahových látok C. sativa

3.2.1 Použitý materiál a prístroje

3.2.1.1 Rastlinný materiál

Rastlinný materiál, Cannabis sativa z čeľade Cannabaceae, bol zozbieraný začiatkom roku

2014 v Brne. Tento materiál bol ďalej spracovaný, aby mohla byť vykonaná jeho expertíza.

Z celej rastliny bol získaný etanolický extrakt, z ktorého sa odobrala časť na vlastnú analýzu

v množstve 18,591 g. Tento extrakt som spracovávala od začiatku až do získania jednotlivých

izolovaných látok.

Prvým krokom bola extrakcia kvapalina-kvapalina, ktorá bola realizovaná v oddeľovacej

kónickej nádobe. Pre prehľadnosť nižšie uvádzam schému celého postupu (viď Schéma č. 1).

Schéma č. 1: Spracovanie etanolického extraktu rastliny (čísla v zátvorkách označujú

objemové pomery rozpúšťadiel)

31

Vytrepávaním do rôznych rozpúšťadiel som dosiahla rozdelenie látok do 4 podielov.

Jednotlivé podiely boli odparené na odparke, respektíve lyofilizované v prípade vody, a získaná

sušina bola zvážená.

3.2.1.2 Chemikálie

Acetonitril gradient grade (Scharlau)

Benzén p.a. (Penta)

Chloroform p.a. (Penta)

Ethylacetát p.a. (Penta)

Kyselina octová p.a. (Penta)

Metanol p.a. (Penta)

Metanol gradient (Scharlau)

Voda pre HPLC – pripravení pomocou nižšie uvedeného prístroja

Recyklát – zmes zložená približne z 10 % vody, 10 % metanolu a 80 % acetonitrilu

3.2.1.3 Materiál pre chromatografiu

TLC

hliníková fólia Silikagel 60, F254 20 cm × 20 cm, tloušťka vrstvy 0,2 mm (Merck)

HPLC

analytická kolóna: Acentis ®Express C8, 15cm × 2,1 mm, veľkosť častíc 2,7 μm

preparatívna kolóna: Supelcosil TM LC-8 SEMI-PREP, 25 cm × 10 mm, veľkosť častíc

5 µm

LC-stĺpcová

náplň kolóny: silikagél Sigma-Aldrich 60 Å, veľkosť častíc 0,04–0,63 mm

3.2.1.4 Prístroje

Vákuová rotačná odparka

BŰCHI Waterbath B-480, Rotavapor R-114 (Bűchi, Switzerland)

BŰCHI Vacuum pump V-700, Vacuum controler V-850, Rotavapor R-3 (Bűchi,

Switzerland)

Lyofilizátor

CHRIST Alfa 1 – 2 LD (Christ, Germany)

32

HPLC a UV detekcia

analytická HPLC: Agilent 1100, detektor DAD UV/VIS (Agilent Technologies, USA)

preparatívna HPLC: YL9100 HPLC Systém Clarity – YL9101 Vacuum Degasser,

YL9110 Quarternary Pump, YL9130 Column Compartment, YL9160 PDA Detector,

YL9150 Autosampler (Young Lin Instrument, Korea)

IR spektrofotometer

Nicolet Impact 400D FT-IR (Thermo Nicolet Corporation, USA)

Prístroj na prípravu vody pre HPLC

Aqua MAX BASIC 360 series (Young Lin Instrument, Korea)

Analytické váhy

KERN EW 620-3NM (Kern, Germany)

3.2.2 Metódy

3.2.2.1 Separačné

Analytická tenkovrstvová chromatografia (TLC)

Stacionárna fáza: hliníková fólia Silikagel 60 F254, hrúbka vrstvy 0,2 mm (Merck)

Mobilná fáza: zložená z benzénu, chloroformu, etylacetátu a metanolu v rôznom

pomere

Detekcia: UV 254 nm a 356 nm

Postup: Po vyvinutí TLC som silikagel vysušila a pod UV svetlom s vlnovou

dĺžkou 254 nm vyznačila jednotlivé škvrny. Takto označené TLC slúžilo

pre zistenie čistoty frakcie a pre porovnanie podobnosti frakcií pri ich

spájaní.

Metódou TLC bolo taktiež zisťované vhodné zloženie mobilnej fázy pre

LC u jednotlivých podielov získaných z etanolického extraktu

vytrepávaním do organických rozpúšťadiel a vody.

Preparatívna tenkovrstvová chromatografia (TLC)

Stacionárna fáza: hliníková fólia Silikagel 60 F254, hrúbka vrstvy 0,2 mm (Merck)

Mobilná fáza: zložená z benzénu, chloroformu a metanolu v rôznom pomere

Detekcia: UV 254 nm a 356 nm

Postup: Po vyvinutí TLC som silikagel vysušila a pod UV svetlom s vlnovou

dĺžkou 254 nm vyznačila jednotlivé škvrny, potom ich zoškrabala do

vialiek a nasorbované látky eluovala metanolom. Získané eluáty som

následne analyzovala prostredníctvom HPLC.

33

Stĺpcová chromatografia

Stacionárna fáza: silikagel o veľkosti zŕn 0,040–0,063 mm

Mobilní fáze: chloroform, benzén, metanol v pomere 7 : 2 : 1 (v/v/v)

Postup: Frakcie z chloroformového podielu boli zbierané približne po 100–150

ml, frakcie z hexánového podielu asi po 40–50 ml, následne analyzované

pomocou TLC a HPLC. Na základe podobnosti zloženia boli pospájané

a potom odparené na vákuovej odparke.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) ‒ analytická

Prístroj: Agilent 1100, detektor DAD UV

Stacionárna fáza: Acentis ®Express C8, 15 cm × 2,1 mm, veľkosť častíc 2,7 μm

Elúcia: gradientová

Mobilná fáza: Metóda 1: 0. minúta: 50 % MeCN, 50 % HCOOH (0,2 %)

24. minúta: 83 % MeCN, 17 % HCOOH (0,2 %)

24,1. minúta: 100 % MeCN

Prietok: 0,3 ml/min

Objem nástreku: 1 μl

Teplota kolóny: 40 °C

Detekcia: UV pri vlnových dĺžkach λ 254 a 280 nm

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) – semipreparatívna

Prístroj: YL9100 HPLC System

Stacionárna fáza: Acentis ®Express C8, 25 cm × 10 mm, veľkosť častíc 5 µm

Elúcia: gradientová

Mobilná fáza: Metóda 2: 0. minúta: 90 % recyklát, 10 % HCOOH (0,2 %)

15. minúta: 95 % recyklát, 5 % HCOOH (0,2 %)

15,01. minúta: 100 % ACN

25,01. minúta: 100 % MeOH

40,01. minúta: 90 % recyklát, 10 % HCOOH (0,2 %)

Prietok: 5 ml/min

Objem nástreku: 25 μl

Teplota kolóny: 40 °C

Detekcia: UV pri vlnovej dĺžke λ 254 a 280 nm

34

3.2.2.2 Identifikačné

UV spektrofotometria

UV spektrá vyizolovaných látok boli zmerané pomocou prístroja DAD UV/VIS Agilent

zároveň s HPLC analýzou. Tieto spektrá boli použité k odhadu štruktúry zlúčenín. Výsledky

boli porovnané s UV spektrami založenými v školskej databáze VFU v Brne.

IČ spektrofotometria

IČ spektrá boli namerané pomocou prístroja Nicolet Impact 400D FT-IR, a to ako závislosť

transmitancie na vlnočete žiarenia. Vzorky boli merané v pevnej forme metódou ATR. Na

zmeranie spektra bola aplikovaná ATR korekcia, korekcia na H2O a CO2 a automatické

vyhladenie spektra. Vyhodnotením spektier boli získané informácie o prítomnosti rôznych

funkčných skupín v štruktúre analyzovanej vzorky.

Nukleárna magnetická rezonancia

Analýza pomocou nukleárnej magnetickej rezonancie bola robená v zahraničí, na Univerzite

v Mississippi.

35

3.3 Druhá časť: Antiflogistický účinok celkového extraktu, jednotlivých

podielov a čistých izolovaných látok

Cieľom experimentu bolo stanoviť antiflogistický účinok jednotlivých izolovaných látok,

celkového extraktu a podielov rozpustných v roznych rozpúšťadlách. Pred samotným

experimentom som si vyhľadala a naštudovala publikované zahraničné štúdie, ktoré sa

zaoberali skúmaním protizápalového účinku látok prítomných u rastliny Cannabis sativa.

Antiflogistická aktivita bola stanovovaná pomocou komerčne dostupných kitov. Kľúčovými

boli špeciálne skonštruované ľudské reportérové monocyty – THP1 bunková línia. Táto metóda

bola vybraná na základe niekoľkých aspektov. Metóda je relatívne jednoduchá a časovo

nenáročná a je vhodná na skríning protizápalového účinku látok izolovaných z prírodných

materiálov. Vzhľadom k tomu, že pri izolácii sa mi podarilo získať malé množstvo čistej látky

(v rádoch μg), je výhodou taktiež malá náročnosť na množstvo použitej látky, ktorej

antiflogistickú aktivitu stanovujeme.

Stanovenie prebieha na mikrotitračnej doštičke paralelne so stanovením aktivity

referenčného antiflogistika.

3.3.1 Rozpúšťadlá, kultivačné médiá a iné použité chemikálie

Dimetylsulfoxid (DMSO)

Erytrozín B

Forbolester

Kultivačné médiá potrebné pre rast a úchovu buniek:

rastové médium ‒ zloženie: RPMI 1640 (2 mM L-glutamín, 1,5 g/l hydrogénuhličitan

sodný, 4,5 g/l glukóza, 10 mM HEPES a 1,0 mM pyruvát sodný) s 10 % teplom

inaktivovaným plodovým bovinným sérom (30 min pri 56 °C), 100 µg/ml

NormocínTM, Penicilín-Streptomycín (50 U/ml – 50 µg/ml)

mraziace médium ‒ zloženie: 90 % plodové bovinné sérum (FBS), 10 % DMSO alebo

75 % IMDM (Iscoveovo modifikované Dulbeccovo médium), 20 % FBS, 5 % DMSO

Lipopolysacharid (LPS)

PBS fosfátový pufor s 0,15 M NaCl

QUANTI-BlueTM

Selektívne antibiotiká: G418 (Geneticín®) a ZeocínTM

WST 1

3.3.2 Prístroje

Automatické pipety

Eppendorf (Nemecko)

36

Trepačka

VELP® SCIENTIFICA, Advanced Vortex Mixer (Taliansko)

Laminárny box

Merci SCS 1-6, Faster (Taliansko)

Inkubátor

ESCO CelCulture CO2 INCUBATOR (Singapur)

Centrifúga

NF 800 R, Nüve (Turecko)

Váhy

Kern 440 – Ecotech (Nemecko)

Spektrofotometer

FluoStar Omega – BMG LABTECH (Nemecko)

Inverzný mikroskop

OPTIKA® Microscopes Italy (Taliansko)

3.3.3 Pomôcky

Jednorázové rukavice

Jednorázové špičky na mikropipety

Kultivačná banka pre tkanivové kultúry

Mikrotitračná doštička s víčkom

boli použité jednorazové plastové doštičky s 96 jamkami s plochým dnom, ktoré mali

rady jamiek označené písmenami A až H a stĺpce číslami 1 až 12, takže každá jednotlivá

jamka bola označená kombináciou písmena a čísla

Vialky na riedenie jednotlivých komponentov

3.3.4 Komerčný kit použitý pre stanovenie antiflogistickej aktivity

K stanoveniu antiflogistickej aktivity bola použitá in vitro upravená bunková línia THP1,

komerčne dostupná od firmy InvivoGen (firma). THP1-XBlue™-MD2-CD14 bunky stabilne

exprimujú MD2 a CD14 gény, ktoré sú zodpovedné za TLR4 odpoveď indukovanú LPS.

Zároveň exprimujú enzým SEAP (sekretovaná embryonálna alkalická fosfatáza) indukovateľný

NF-κB/AP-1 (alkalická fosfatáza 1). Stimulácia TLR vedie k indukcii signálnej kaskády, ktorá

vedie k aktivácii NF-κB a následnej produkcii SEAP. Je to umelý konštrukt, ktorý obsahuje

reportérový gén pre SEAP, aby sme boli schopný monitorovať aktiváciu NF-κB stanovením

aktivity alkalickej fosfatázy exprimovanej extracelulárne do média. Pre lepší prehľad aktivácie

37

zápalovej dráhy, ktorá vedie cez NF-κB, je tento dej zobrazený v schéme uvedenej nižšie (viď

Schéma č. 2).

3.3.5 Charakteristika bunkovej línie a štruktúr sprostredkujúcich zápalovú

odpoveď

3.3.5.1 THP1 bunková línia

THP1 sú bunky odvodené od ľudskej monocytickej bunkovej línie získanej z periférnej krvi

jednoročného dieťaťa mužského pohlavia s akútnou monocytickou leukémiou. Používajú sa na

testovanie leukemických buniek v imunocytochemickej analýze interakciou proteín-proteín.

Vykazujú priestorovú, okrúhlu, jednobunkovú morfológiu. Narozdiel od iných leukemických

bunkových línií majú normálny diploidný karyotyp. THP 1 poskytujú kontinuálnu kultúru, rastú

v suspenzii. Priemerný čas zdvojenia je 35 až 50 hodín. Môžu byť diferencované na

makrofágoidné bunky použitím chemických činidiel [56].

3.3.5.2 Toll-like receptory

TLR4 (toll-like receptor) patrí do skupiny membránových receptorov (TLR 1−14). Hrá

zásadnú úlohu v rámci vrodeného imunitného systému - jeho monomérová štruktúra

prechádzajúca plazmatickou membránou rozoznáva cudzorodé molekuly a spúšťa príslušnú

signálnu kaskádu [57]. Rozpoznanie LPS pomocou TLR4 vyžaduje MD2 [57,58].

3.3.5.3 MD2

MD2 proteín (glykoproteín bohatý na cysteín) zjavne asociuje s TLR4 na povrchu bunky

a zabezpečuje odpovedavosť na LPS, čím poskytuje spojenie medzi receptorom a LPS

signalizáciou [58,59].

3.3.5.4 CD14

CD14 je ľudský gén, makrofágovo-špecifický diferenciačný antigén. Proteín kódovaný

týmto génom je komponentom vrodeného imunitného systému. CD14 plní úlohu koreceptora

(popri TLR4 a MD2) pre detekciu bakteriálneho LPS [58,59,60].

3.3.5.5 NF-κB

NF-κB je skupina transkripčných faktorov, ktoré sa viažu na promótory RNA polymerázy II

a ovplyvňujú tak expresiu génov dôležitých pre imunitu, zápalovú odpoveď, bunečný rast

a bunečnú smrť. Stimulácia receptorov spustí signalizačnú dráhu, ktorá spôsobí rozklad

komplexu I-κB/NF-κB a uvoľnenie inhibítora z komplexu, čo umožní transkripčným faktorom

NF-κB vstúpiť do jadra a regulovať prepis určitých génov.

38

Schéma č. 2: Aktivácia zápalovej dráhy v THP1 bunkovej línii bakteriálnym

lipopolysacharidom

3.3.6 Kolorimetrické stanovenie aktivity

K stanoveniu aktivity SEAP sa používa QUANTI-BlueTM, čo je kolorimetrický testovací

enzým vyvinutý k rozpoznaniu akejkoľvek aktivity AP v biologických vzorkách ako sú

supernatanty bunečných kultúr. Poskytuje jednoduchú a rýchlu cestu detekcie a kvantifikácie

embryonálnej alkalickej fosfatázy, ktorá je reportérom so širokým využitím pre in vivo a in vitro

analytické štúdie.

V prítomnosti AP sa zmení farba tohto enzýmu z ružovej na purpurovú. Intenzita tohto

odtieňa odráža aktivitu AP. Hladina alkalickej fosfatázy može byť určená kvalitatívne voľným

okom alebo kvantitatívne použitím spektrofotometra pri 620‒655 nm.

3.3.7 Princíp stanovenia antiflogistickej aktivity

Bunky inkubujeme v rastovom médiu a následne indukujeme ich diferenciáciu z monocytov

na makrofágy. Bunky sa potom inkubujú s látkami, ktorých aktivitu stanovujeme a in vitro

prídavkom LPS aktivujeme zápalovú dráhu, ktorá vedie cez TLR4

receptory. Spektrofotometricky stanovujeme kvantitatívne hladinu SEAP 3‒4 hodiny po

pridaní QUANTI-BlueTM. Látky s antiflogistickou aktivitou inhibujú zápalovú dráhu a tým

produkciu SEAP, čo sa prejaví znížením absorbancie. Ako referenčná látka je použitý

prednizón.

39

3.3.7.1 Prednizón ako referenčné antiflogistikum

Prednizón (viď Obrázok č. 18) je syntetické kortikosteroidné liečivo, ktoré má čiastočný

imunosupresívny účinok. Používa sa k liečbe niektorých zápalových ochorení (ako napríklad

reumatické poruchy, Crohnova choroba, laryngitída, astma, atď.) a niektorých typov rakoviny.

Pri stanovení antiflogistickej aktivity slúži ako referenčná vzorka k porovnaniu s testovanými

látkami/zmesami látok.

H

H H

O

O

OH

O

OH

Obrázok č. 18 : Štruktúra prednizónu

40

4 VÝSLEDKY A DISKUSIA

4.1 Analýza a separácia extraktu

Rastlinný materiál bol macerovaný v etanole a vytrepávaný s ďalšími rozpúšťadlami. Pre

ďalšie spracovanie bol použitý chloroformový a hexánový podiel. Vodný a etylacetátový podiel

sa ďalej nespracovávali, merala sa iba ich antiflogistická aktivita.

Na začiatku uvádzam chromatogram celkového etanolického extraktu, aby bolo zreteľné,

z čoho táto analýza vychádzala (viď Obrázok č. 19).

Obrázok č. 19: HPLC chromatogram etanolického extraktu CS-celkový (UV detekcia pri

280 nm)

Nižšie sú uvedené chromatogramy jednotlivých podielov získaných vytrepávaním do

organických rozpúšťadiel a vodného podielu, z čoho je viditeľná distribúcia látok z celkového

extraktu (viď Obrázok č. 20‒23).

min0 5 10 15 20 25 30

Norm.

0

50

100

150

200

250

41

min0 5 10 15 20 25 30

Norm.

0

50

100

150

200

250

300

350

n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0

m A U

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

min0 5 10 15 20 25 30

Norm.

0

50

100

150

200

250

300

350

n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0

m A U

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0

m A U

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

Obrázok č. 20: HPLC chromatogram chloroformového podielu CS-CH (UV detekcia pri

280 nm) a UV spektrá

Obrázok č. 21: HPLC chromatogram hexánového podielu CS-H (UV detekcia pri 280 nm)

a UV spektrá

n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0

m A U

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

42

Obrázok č. 22: HPLC chromatogram etylacetátového podielu CS-etyalcetát (UV detekcia

pri 280 nm) a UV spektrá

Obrázok č. 23: HPLC chromatogram vodného podielu CS-voda (UV detekcia pri 280 nm)

a UV spektrá

min2 4 6 8 10 12 14 16 18

Norm.

0

500

1000

1500

2000

2500

min0 2 4 6 8 10 12 14

Norm.

0

100

200

300

400

1.0

51

1.2

24

n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0

m A U

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

7 0 0

n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0

m A U

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

7 0 0

8 0 0

n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0

m A U

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

1 2 0 0

1 4 0 0

n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0

m A U

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

1 2 0 0

43

4.1.1 Rozdelenie chloroformového podielu stĺpcovou chromatografiou

Kolónu s výškou stĺpca 62 cm a priemerom 4,5 cm som naplnila 400 g silikagélu, ktorý bol

vopred zmiešaný s mobilnou fázou, aby som eliminovala prípadné vzduchové bubliny, ktoré

by mohli znemožniť správne rozdelenie na kolóne. Mobilná fáza obsahovala chloroform,

benzén a metanol v pomere 7:2:1 (v/v/v). Silikagél bol prekrytý filtračným papierom, ktorý som

zaťažila malým množstvom morského piesku, aby priliehal k stacionárnej fáze. Nakoniec som

naniesla 3,683 g vzorky rozpustenej v minimálnom množstve mobilnej fázy. Pri neustálom

dopĺňaní mobilnej fázy som zbierala frakcie približne po 100–150 ml. Celkový počet frakcií

bol 37. Pri zbieraní posledných 7 frakcií bol ako mobilná fáza použitý čistý metanol, aby sa

z kolóny vymyli zvyšky vzorky.

Po rozdelení na kolóne som odparila rozpúšťadlá na vákuovej odparke, tuhé vzorky

rozpustila v metanole a uskutočnila som TLC analýzu. Ako mobilná fáza bola použitá zmes

chloroform, benzén a metanol v pomere 7:2:1 (v/v/v), na posledné frakcie 25–37 som zvýšila

pomer metanolu na 7:2:1,5 (v/v/v). Detekciu chromatogramov som previedla pod UV lampou

a vyznačila jednotlivé škvrny. Posúdila som ich čistotu a na základe podobnosti retenčných

faktorov som spojila jednotlivé frakcie. Frakcie získané z chloroformového podielu boli

označované CS-CH 1–37 (viď Tabuľka č. 2).

Tabuľka č. 2: Spojené chloroformové frakcie po rozdelení na kolóne a ich hmotnosti

Spojené frakcie Hmotnosť [mg]

Spojené frakcie Hmotnosť [mg]

1–6 17,49 15–16 80,80

7 295,33 17–18 67,54

8 859,92 19–20 53,54

9–10 451,87 21–23 107,04

11 166,47 24–32 251,93

12–13 202,46 33–36 52,06

14 48,90 37 816,00

Už po prvom rozdelení vzorky na kolóne bola získaná čistá látka, a to frakcia CS-CH 8, ktorá

mohla byť následne bez ďalších úprav či purifikačných krokov identifikovaná.

4.1.2 Výber frakcií pre ďalšiu separáciu

Výber frakcie pre ďalšiu analýzu a separáciu som učinila na základe HPLC analýzy. Na

základe získaných chromatogramov jednotlivých frakcií som vybrala také, u ktorých boli

viditeľné vysoké píky čo najmenšieho počtu látok. Prvé frakcie obsahovali rôzne zmesi látok,

ktorých separácia by bola náročná, pretože píky neboli jednoznačne rozlíšiteľné a množstvo

týchto látok bolo príliš malé.

44

Posledná frakcia CS-CH 37 danou metódou nebola dobre rozdelená, no na základe relatívne

veľkého množstva danej frakcie (816 mg) som sa rozhodla ju ďalej analyzovať. Pomocou TLC

som skúšala rôzne zloženia mobilnej fázy, aby som zistila, v ktorej by sa daná frakcia dobre

rozdelila na jednotlivé látky. Nepodarilo sa mi však nájsť vhodné zloženie, v ktorom by došlo

k rozdeleniu do takej miery, že by som ich mohla od seba odseparovať. Nižšie je uvedený

chromatogram frakcie, ktorú som chcela spracovať (viď Obrázok č. 23).

Obrázok č. 24: HPLC chromatogram frakcie CS-CH 37 (UV detekcia pri 254 nm) a UV

spektrá

4.1.3 Rozdelenie hexánového podielu stĺpcovou chromatografiou

Kolónu s výškou stĺpca 62 cm a priemerom 4,5 cm som naplnila 402 g silikagélu, ktorý bol

vopred dobre premiešaný s mobilnou fázou, aby som eliminovala prípadné vzduchové bubliny,

ktoré by ovplyvnili správne rozdelenie na kolóne. Mobilná fáza obsahovala chloroform, benzén

a metanol v pomere 7:2:1 (v/v/v). Silikagél bol prekrytý filtračným papierom, ktorý bol

zaťažený malým množstvom morského piesku, aby dokonale priliehal k stacionárnej fáze.

Následne som naniesla 7,959 g vzorky rozpustenej v minimálnom množstve mobilnej fázy. Pri

neustálom dopĺňaní mobilnej fázy som zbierala frakcie približne po 40–50 ml. Celkový počet

frakcií bol 28. Pri zbieraní posledných 4 frakcií bol ako mobilná fáza použitý čistý metanol,

aby sa z kolóny vymyli zvyšky nanesenej vzorky.

m in0 5 10 15 20 25 30 35

N o rm .

0

10

20

30

40

50

45

Po rozdelení na kolóne som odparila rozpúšťadlá na vákuovej odparke, tuhé vzorky

rozpustila v metanole a uskutočnila som TLC analýzu. Ako mobilná fáza bola použitá zmes

chloroform, benzén a metanol v pomere 7:2:1 (v/v/v), na posledné frakcie 25–28 som zvýšila

pomer metanolu na 7:2:1,5 (v/v/v). Detekciu chromatogramov som previedla pod UV lampou

a vyznačila jednotlivé škvrny. Posúdila som ich čistotu a na základe podobnosti retenčných

faktorov som spojila jednotlivé frakcie. Frakcie získané z chloroformového podielu boli

označované CS-H 1–28 (viď Tabuľka č. 3).

Tabuľka č. 3: Spojené hexánové frakcie po rozdelení na kolóne a ich hmotnosti

Spojené frakcie Hmotnosť [mg]

Spojené frakcie Hmotnosť [mg]

1–6 86,94 17–21 2 718,73

7–9 1 368,04 22 93,40

10–12 1 398,78 23–25 102,02

13 587,47 26 17,86

14 631,60 27 11,85

15–16 1 576,25 28 58,36

4.1.4 Výber frakcií pre ďalšiu separáciu

Frakcie vhodné pre ďalšiu analýzu a separáciu som vyberala na základe HPLC analýzy.

Vyhodnotením a posúdením získaných chromatogramov jednotlivých frakcií som vybrala tie,

u ktorých boli viditeľné výrazné píky čo najmenšieho počtu látok. Ako v prípade

chloroformového podielu, aj v tomto prípade prvé a posledné frakcie obsahovali rôzne zmesi

látok, ktorých separácia by bola náročná, pretože jednotlivé píky sa prekrývali, neboli

jednoznačne oddeliteľné a množstvá týchto látok boli príliš malé.

Na základe HPLC analýzy som na ďalšie spracovanie vybrala frakciu CS-H 15–16, ktorá

bola v dostatočnom množstve a na chromatograme boli viditeľné relatívne vysoké píky

niekoľkých látok. Na Obrázku č. 25 je uvedený chromatogram tejto frakcie.

46

Obrázok č. 25: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16 (UV detekcia pri 280 nm) a UV

spektrá

4.1.5 Rozdelenie frakcie CS-H 15–16 stĺpcovou chromatografiou

Kolónu s výškou stĺpca 58 cm a priemerom 3,5 cm som naplnila 259 g silikagélu, ktorý bol

vopred zmiešaný s mobilnou fázou, aby v kolóne nezostali vzduchové bubliny, ktoré by mohli

negatívne ovplyvniť rozdelenie látok. Mobilná fáza obsahovala etylacetát, benzén a metanol

v pomere 3:2:1 (v/v/v). Silikagél bol prekrytý filtračným papierom, ktorý bol zaťažený

morksým pieskom. Následne som naniesla 1,576 g vzorky rozpustenej v minimálnom množstve

mobilnej fázy. Pri neustálom dopĺňaní mobilnej fázy som zbierala frakcie, prvých asi 7 priližne

po 50 ml, ďalšie približne po 10–20 ml. Celkový počet frakcií bol 26. Pri zbieraní posledných

3 frakcií bol ako mobilná fáza použitý čistý metanol, aby sa z kolóny vymyli zvyšky nanesenej

vzorky.

Po rozdelení na kolóne som odparila rozpúšťadlá na vákuovej odparke, tuhé vzorky

rozpustila v metanole a uskutočnila som TLC analýzu. Ako mobilná fáza bola použitá zmes

etylacetát, benzén a metanol v pomere 3:2:1 (v/v/v), na posledné frakcie 25–28 som zvýšila

pomer metanolu na 3:2:1,5 (v/v/v). Chromatogramy som podrobila UV analýze a vyznačila

som viditeľné škvrny. Posúdila som ich čistotu a na základe podobnosti retenčných faktorov

som spojila jednotlivé frakcie. Frakcie získané z frakcie CS-H 15–16 boli označované CS-H 15–

16/1–26 (viď Tabuľka č.4).

min0 5 10 15 20 25 30

Norm.

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0

m A U

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

1 2 0 0

1 4 0 0

n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0

m A U

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0

m A U

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

1 2 0 0

1 4 0 0

47

Tabuľka č.4: Spojené frakcie získané z CS-H 15–16 po rozdelení na kolóne a ich hmotnosti

Spojené frakcie Hmotnosť [mg]

Spojené frakcie Hmotnosť [mg]

1–8 28,90 15–17 294,07

9 104,10 18–20 171,29

10 19,11 21–23 220,42

11 23,69 24 134,97

12 74,93 25 30,98

13 108,33 26 11,01

14 214,61

4.1.6 Separácia frakcií

Po rozdelení na kolóne a vyhodnotení chromatogramov som vybrala frakciu vhodnú pre

rozdelenie pomocou preparatívnej HPLC. Chromatogram frakcie CS-H 15–16/24 (viď Obrázok

č. 26Obrázok č. 26) obsahoval diskrétne vysoké píky, ktoré mohli byť od seba oddelené bez

rizika kontaminácie. Metóda bola niekoľkokrát prispôsobená, aby boli výsledky čo

najpresnejšie, bolo zmenené zloženie mobilnej fázy. Z každého nástreku frakcie CS-H 15–

16/24 bolo získaných 5 frakcií. Po zozbieraní som odparila rozpúšťadlá a zvážila množstvo

získaných látok. Dostatočné množstvo, s ktorým by sa dalo ďalej pracovať, obsahovala iba

frakcia 2 označená ako CS-H 15–16/24/2. Nižšie uvádzam chromatogram z preparatívnej

HPLC, na ktorom sú vyznačené časové úseky, v ktorých boli zozbieravané frakcie (viď

Obrázok č. 27).

m in0 5 10 15 20 25 30

N o rm .

0

200

400

600

800

1000

48

Obrázok č. 26: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24 (UV detekcia pri 254 nm)

a UV spektrá

Obrázok č. 27: HPLC chromatogram separácie frakcie CS-H 15–16/24 (UV detekcia pri

280 nm, červenou sú vyznačené zbierané frakcie)

V tabuľke (viď Tabuľka č.5) je uvedené presné množstvo získaných frakcií, z čoho frakcie

2 a 4 sú relatívne čisté látky, no vzhľadom k ich malému množstvu nie je možná ďalšia analýza.

Príslušné chormatogramy sú uvedené nižšie (viď Obrázok č. 28).

Tabuľka č.5: Frakcie získané po rozdelení pomocou preparatívnej HPLC označené

CS-H 15–16/24/1–5 a ich hmotnosti

Spojené frakcie Hmotnosť [mg]

1 4,49

2 3,56

3 1,36

4 1,36

5 3,58

[min.]Time

0 5 10 15 20 25

[V]

Volt

age

0

1

2

3

4

CH15-16_24_11.4.2014 12_21_00_00404 - Channel 1

CH15-16_24_11.4.2014 12_21_00_00404 - Channel 2

6,2

0

6,8

0 V

ial 1 -

1

8,1

09,0

1 V

ial 2 -

2

10,1

0

10,9

1 V

ial 3 -

3

13,4

1

14,2

0 V

ial 4 -

4

15,5

016,5

0 V

ial 5 -

5

49

Obrázok č. 28: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24/1 (UV detekcia pri 254 nm)

a UV spektrum

Obrázok č. 29: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24/2 (UV detekcia pri 254 nm)

a UV spektrum

m in0 5 10 15 20 25 30

N o rm .

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

m in0 5 10 15 20 25 30

N o rm .

0

100

200

300

400

500

600

700

nm200 250 300 350 400 450

m AU

0

100

200

300

400

500

600

50

Obrázok č. 30: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24/3 (UV detekcia pri 254 nm)

a UV spektrum

Obrázok č. 31: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24/4 (UV detekcia pri 254 nm)

a UV spektrum

m in0 5 10 15 20 25 30

N o rm .

0

20

40

60

80

100

120

m in0 5 10 15 20 25 30

N o rm .

0

100

200

300

400

nm200 250 300 350 400 450

m AU

0

200

400

600

800

nm200 250 300 350 400 450

m AU

0

20

40

60

80

51

Obrázok č. 32: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24/5 (UV detekcia pri 254 nm)

a UV spektrum

m in0 5 10 15 20 25 30

N o rm .

0

100

200

300

400

500

600

700

nm200 250 300 350 400 450

m AU

0

200

400

600

800

1000

52

4.2 Identifikácia

4.2.1 Analýza UV spektier

Orientačné UV spektrá boli zmerané pri analýze HPLC, chromatogramy boli

zaznamenávané pri 280 a 254 nm. Látka CS-CH 8 vykazovala tri pásy s absorpčnými

maximami okolo 220, 270 a 310 nm. Najkôr bola vyhľadávaná podobnosť spektier s niektorým

v databáze látok VFU. Keďže nebola nájdená zhoda, spektrum som porovnala so spektrom

látky, ktorú som izolovala v rámci svojej bakalárskej práce. Spektrum látky CS-CH 8

vykazovalo podobnosť s cannabinolom (viď Obrázok č. 34)

Obrázok č. 33: HPLC chromatogram a UV spektrum látky CS-CH 8 pri 254 nm (HPLC,

metóda 2)

Obrázok č. 34: UV spektrum látky CH 8–10/3–4/7 pri 254 nm (cannabinol)

m in0 5 10 15 20 25 30

N o rm .

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0

m A U

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

7 0 0

n m200 250 300 350 400 450

m AU

0

200

400

600

800

53

m in0 5 10 15 20 25 30

N o rm .

0

100

200

300

400

500

600

700

UV spektrum kannabinolu vykazuje dve maximá v oblasti približne 230 a 280 nm a rameno

v oblasti okolo 310 nm.

Látka CS-H 15–16/24/2 vykazuje v UV spektre tri pásy s maximami okolo 230, 270

a 310 nm. Z podobnosti spektier sa dá predpokladať štruktúrna podobnosť s látkou CS-CH 8.

Obrázok č. 35: HPLC chromatogram a UV spektrum látky CS-H 15–16/24/2 pri 254 nm

(HPLC, metóda 2)

4.2.2 Analýza IR spektier

Široký absorpčný pás strednej intenzity v oblasti 3550‒3200 cm-1 odpovedá vibráciám –OH

skupín. Intenzívne absorpčné pásy v oblasti 2940‒2850 cm-1 sú spôsobené vibráciami

metylových (-CH3) a metylenových (-CH2-) skupín. V oblasti okolo 1614 a 1574 cm-1 sa

nachádza dublet odpovedajúci aromatickej C=C skupine. V oblasti s nižším vlnočetom okolo

1151 cm-1 môže vychádzať z C-O vibrácií alkoholovej skupiny.

nm200 250 300 350 400 450

m AU

0

100

200

300

400

500

600

54

82

88

86

10

26

10

51

11

72

12

35

13

75

14

28

15

74

16

14

28

54

29

22

33

93

CS_CH8

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100%

Tra

nsm

itta

nce

1000 2000 3000 4000

Wavenumbers (cm-1)

Obrázok č. 36: IR spektrum látky CS-CH 8

4.2.3 Identifikácia pomocou NMR

Meranie NMR spektier a ich následná interpretácia bola prevedená na partnerskej Univerzite

v Mississippi, pretože škola nemá k dispozícii tento prístroj. Na univerzitu bolo zaslaných 4,71

mg látky CS-CH 8 a 3,56 mg látky CS-H 15–16/24/2. U látky CS-H 15–16/24/2 bohužiaľ

nepostačovalo vyizolované množstvo na to, aby mohla prebehnúť jeho identifikácia. Nižšie

uvádzam spektrum, ktoré mi posyktla Univerzita v Mississippi k látke CS-CH 8 (viď Obrázok

č. 37). Kvalita spektra je veľmi nízka, pretože výsledky boli zaslané vo formáte PDF.

Obrázok č. 37: Proton-NMR spektrum látky CS-CH 8

55

Výsledky identifikácie poopisujúce štruktúru a názov látky sú uvedené v nasledujúcej

kapitole.

4.2.4 Výsledky identifikácie izolovaných látok

Izolované látky boli zaslané na identifikáciu do laboratória na Univerzite v Mississippi.

Štruktúra analyzovanej látky bola zisťovaná vyhľadávaním získaného spektra v databáze látok,

ktorú mali k dispozícii. Látka CS-CH 8 bola identifikovaná ako cannabidiolová kyselina (viď

Obrázok č. 38), z ktorej neenzymatickou dekarboxyláciou vzniká cannabinol, najviac

zastúpená biologicky aktívna látka obsiahnutá v rastline Cannabis sativa.

OH

HO

OH

O

H H

Obrázok č. 38: Štruktúra identifikovanej kyseliny cannabidiolovej

56

4.3 Príprava THP1 buniek

4.3.1 Metódy

4.3.1.1 Propagácia a uchovávanie kultúry

Zakúpené bunky sú uchovávané v pôvodnej vialke v kryoprotektívnom médiu pri teplote

-20 °C. Prvá propagácia buniek slúži k vytvoreniu zásob do budúcna. To nám zabezpečí

stabilitu a chovanie buniek v prípade potreby experiment opakovať.

Vialku s bunkami necháme roztopiť pri miernom miešaní vo vodnom kúpeli s teplotou

37 °C. Vytiahneme ju z kúpeľa a ošetríme 70% etanolom, aby sme ju dekontaminovali. Ďalšie

kroky prebiehajú v striktne aseptickom prostredí.

Bunky prenesieme do vialky obsahujúcej 15 ml predhriateho živného média. Vialku

centrifugujeme pri 1000‒1500 rpm asi 5 minút. Odstránime supernatant obsahujúci

kryoprotektívne činidlo a resuspendujeme bunky v 1 ml rastového média. Obsah vialky

prenesieme do 25 cm2 nádoby pre tkanivové kultúry obsahujúcej 5 ml rastového média. Kultúru

umiestnime do špeciálneho boxu s teplotou 37 °C a atmosférou 5 % CO2.

4.3.1.2 Stanovenie cytotoxicity

Pred samotným experimentom musíme určiť cytotoxicitu látok, ktorých antiflogistickú

aktivitu budeme stanovovať. Toto stanovenie prebieha ako 24-hodinová kultivácia buniek na

96-jamkovej mikrotitračnej doštičke v médiu bez séra (aby sme nedostali falošne pozitívne

výsledky z dôvodu prítomnosti látok, ktoré môžu podporiť rast buniek) v prítomnosti

testovaných látok. Použijeme niekoľko koncentrácií, aby sme zistili, aký je limit, v ktorom sa

môžeme pohybovať pri vlastnom experimente. V našom prípade boli použité tri koncentrácie:

25/5/1 μg/ml. Stanovenie prebehlo v tripletoch; ako blank bolo použité médium, ktoré bolo

taktiež nariedené na dané koncentrácie. Okrem toho bola pripravená kontrola, ktorou boli bunky

bez testovanej látky a vehikulum, ktoré neobsahovalo DMSO, čím sa odtestuje potenciálny

cytotoxický vplyv rozpúšťadla na bunky.

Po 24 hodinách inkubácie pridáme do každej jamky WST 1 od Roche. Je to tetrazoliová soľ,

ktorá je enzýmami živých buniek štiepená na formazán. Dochádza k zmene farby zo slabo

ružovej na oranžovo-žltú (viď Obrázok č. 39). Intenzita formazánu je priamo úmerná

koncentrácii živých buniek a stanovuje sa spektrofotometricky pri 440 nm (viď Obrázok č. 40).

Obrázok č. 39: Stanovenie cytotoxicity pomocou WST 1

57

Obrázok č. 40: Graf závislosti viability buniek na koncentrácii testovanej látky (chybové

úsečky sú vyjadrené ako štandardná chyba)

4.3.1.3 Príprava vzoriek

Všetky testované látky sú vo forme prášku. Presne navážené množstvo sa resuspenduje

v DMSO a uskladňuje pri -20 °C.

4.3.1.4 Príprava a inokulácia mikrotitračnej doštičky pre stanovenie antiflogistickej aktivity

THP1 bunky počítame pod mikroskopom s prídavkom erytrozínu, ktorý zafarbí mŕtve

bunky. Bunky scentrifugujeme pri 1000‒1500 rpm 5 minút. Odstránime supernatant,

premyjeme PBS a po scentrifugovaní resuspendujeme na hustotu 5 x 105 buniek/ml v čerstvom

rastovom médiu. Na stanovenie použijeme 96-jamkovú mikrotitračnú doštičku s plochým

dnom. Do každej jamky napipetujeme 100 μl suspenzie, to znamená asi 50 000 buniek/jamka.

K bunkám pridáme forbolester v koncentrácii podľa doporučenia výrobcu a kultivujeme

24 hodín pri teplote 37 °C v CO2 (viď Obrázok č. 41). V tomto kroku dochádza k diferenciácii

buniek z monocytov na makrofágy, suspenzná kultúra sa mení na prisadlé bunky [61]. Médium

odsajeme a vymeníme ho za komplexné médium so sérom; opäť kultivujeme 24 hodín pri

rovnakých podmienkach. Tretí deň odsajeme médium a bunky inkubujeme v médiu bez séra,

po 24 hodinách máme bunky pripravené na vlastný experiment.

58

Obrázok č. 41: Diferenciácia monocytov (vľavo) na makrofágy (vpravo)

Po predošlej príprave sa k bunkám pridajú testované frakcie s koncentráciou 1 μg/ml, iba

u látky CS-CH 8 bola použitá koncentrácia 0,1 μg/ml. Po 1-hodinovej inkubácii aktivujeme

zápalovú dráhu prídavkom LPS do každej jamky. LPS, ktorý bol dostupný ako lyofilizát, bol

vopred rozpustený v PBS. Doštička bola inkubovaná pri teplote 37 °C v CO2 inkubátore

20 hodín.

Na ďalší deň pristupujeme ku kolorimetrickému stanoveniu. Môžeme použiť buď úplne

novú doštičku alebo QUANTI-BlueTM pipetujeme do voľných jamiek. Do každej jamky

napipetujeme 175 μl činidla a následne pridáme 19,5 μl bunkového supernatantu, ktorý

odoberieme pipetou nad prisadnutými bunkami. Doštičku inkubujeme pri teplote 37 °C

30 minút až 6 hodín. Hladinu SEAP určujeme použitím spektrofotometra pri vlnovej dĺžke

655 nm a približne v hodinových intervalech sledujeme priebeh reakcie.

4.3.1.5 Spektrofotometrická detekcia aktivity SEAP

Po jednodennej inkubácii doštičky, ktorá bola pripravená vyššie uvedeným spôsobom, boli

vizuálne odčítané výsledky. Namerané hodnoty sú vynesené do grafu (viď Obrázok č. 42) ako

množstvo, respektíve aktivita NF-κB vo vzorke.

Výsledky získané pomocou spektrofotometra boli štatisticky spracované a vyhodnotené

pomocou softwéru metódou OneWay ANOVA (variačná analýza) a Tukeyovým porovnávacím

multiplicitným testom. Aktivity podielov a izolovanej látky sú porovnané s vehikulom,

u ktorého je indukovaný zápal pomocou LPS a nie je v ňom prídavok látok, ktoré by ho

zmierňovali alebo iným spôsobom interagovali s bunkovým metabolizmom. Kontrola obsahuje

bunky, u ktorých nie je aktivovaná zápalová dráha. Predstavuje tak bazálnu zápalovú aktivitu

buniek.

59

Obrázok č. 42: Graf aktivít NF-κB jednotlivých vzoriek (chybové úsečky sú vyjadrené ako

štandardná chyba)

60

5 ZÁVER

Vo svojej diplomovej práci som sa zaoberala izoláciou a identifikáciou obsahových látok

chloroformového a hexánového extraktu z rastliny Cannabis sativa. Teoretická časť je

zameraná na flavonoidy ako ubikvitárne látky, ich popis, charakteristiku a biologický účinok.

V praktickej časti je popísaný postup separácie a identifikácie látok. Vysušená frakcia

chloroformového extraktu, označená CS-CH, bola rozdelená pomocou kolónovej

chromatografie za použitia mobilnej fázy zloženej z chloroformu, benzénu a metanolu v pomere

7:2:1 (v/v/v). Celkovo bolo získaných 37 frakcií po približne 100–150 ml. Získané frakcie boli

analyzované pomocou TLC a HPLC a na základe výsledkov spojené podľa podobnosti. Frakcia

CS-CH 8 bola čistou látkou a preto som bez použitia ďalších purifikačních krokov mohla

pristúpiť k jej identifikácii. Táto látka bola zastúpená v relatívne vysokej miere. Podiel danej

látky v celkovom extrakte činil 4,6 %. Ďalšou frakciou, ktorú som sa rozhodla spracovávať na

základe veľkého množstva, bola frakcia CS-CH 37. Nepodarilo sa mi však nájsť vhodnú

mobilnú fázu, v ktorej by sa jednotlivé látky od seba oddelili. Preto som v analýze ďalej

nepokračovala.

Pri spracovaní vysušenej frakcie hexánového extraktu, označenej ako CS-H, som

postupovala rovnako ako pri spracovávaní chloroformovej frakcie. Pomocou kolónovej

chromatografie bola rozdelená za použitia mobilnej fázy zloženej z chloroformu, benzénu

a metanolu v pomere 7:2:1 (v/v/v). Celkovo som získala 28 frakcií po 40–50 ml. Na základe

TLC a HPLC analýzy som vybrala frakciu CS-H 15–16, ktorá bola v dostatočnom množstve

a na chromatograme boli viditeľné vysoké píky len niekoľkých látok. Túto frakciu som

rozdelila pomocou stĺpcovej LC za použitia mobilnej fázy zloženej z etylacetátu, benzénu

a metanolu v pomere 3:2:1 (v/v/v). Celkovo som získala 26 frakcií po 10–20 ml.

Frakcia CS-H 15–16/24, ktorá obsahovala vysoké diskrétne píky, bola vhodná k rozdeleniu

pomocou preparatívnej HPLC. Zozbierala som celkovo 5 frakcií, z čoho len jedna bola čistá

látka, a to frakcia CS-H 15–16/24/2. Kvôli malému množstvu, asi 3,56 g, však nemohla byť

identifikovaná, ani ďalej skúmaná na potenciálny antiflogistický účinok.

Bola teda získaná iba jedna látka v relevantnom množstve, s čistotou približne 95 %, čo bolo

dostatočné pre následnú identifikáciu prevedenú na základe UV, IR a NMR. UV a IR spektrá

boli porovnané s dostupnou databázou VFU, aby bola stanovená ich približná štruktúra. UV

spektrum CS-CH 8 bolo podobné kannabinolu, ktorý som vyizolovala pri vypracovávaní

bakalárskej práce, a teda bolo charakteristické pre kanabinoidy. Z IR spektra boli odhadnuté

funkčné skupiny obsiahnuté v štruktúre látky. K analýze pomocou NMR bola vzorka

vyizolovanej látky zaslaná na Univerzitu v Mississippi. Frakcia CS-CH 8 bola identifikovaná

ako cannabidiolová kyslina, z ktorej neenzymatickou dekarboxyláciou vzniká cannabidiol,

ktorý je hlavným biologicky aktívnym komponentom rastliny Cannabis sativa.

Po vyizolovaní a analýze obsahových látok som sa zaoberala zisťovaním antiflogistického

účinku ako čistých látok, tak aj jednotlivých podielov získaných vytrepávaním do rozpúšťadiel

a celkového extraktu. Pre nedostatočné množstvo látky CS-H 15–16/24/2 som skúmala iba

účinok jednej čistej látky, a to frakcie CS-CH 8.

61

Antiflogistická aktivita bola stanovená inkubáciou THP 1 buniek, u ktorých bola aktivovaná

zápalová dráha pomocou LPS, v prítomnosti testovaných látok. Celé stanovenie prebiehalo na

96-jamkovej mikrotitračnej doštičke v podmienkach 37 °C v atmosfére 5 % CO2. Bunky boli

kultivované v médiu RPMI 1640 s 10 % teplom inaktivovaným plodovým bovinným sérom.

Po rozmrazení sa kultúra revitalizovala niekoľkonásobným pasážovaním, kým sa obnovila

metabolická aktivita buniek. Ako kultivačné médium bolo použité RPMI 1640 s 10 % FBS. Po

docielení dostatočnej metabolickej aktivity bolo médium odstránené a vymenené za RPMI 1640

bez FBS. Všetky biologické testy prebiehali v médiu bez FBS, pretože sérum obsahuje mnoho

organických zlúčenín, rastových faktorov a iónov, ktoré by mohli negatívne ovplyvniť merania.

Dôležitým krokom po revitalizácii buniek bolo zistiť cytotoxicitu testovaných vzoriek, a to

tak, že bunky boli inkubované 24 hodín v prítomnosti 3 rôznych koncentrácií. Po danom čase

bola spektrofotometricky stanovená viabilita buniek, ktorých enzýmy sú schopné

metabolizovať tatrazoliovú soľ na formazánové farbivo a tým meniť absorpčné spektrum. Na

základe tohto experimentu som zistila vhodnú koncentráciu látok, ktorú som použila pri

samotnom stanovení antiflogistického účinku.

Vlastné stanovenie antiflogistickej aktivity prebiehalo v niekoľkých krokoch celkovo asi

5 dní. Kľúčovou bola diferenciácia monocytov THP 1 na makrofágy účinkom forbolesteru.

Bunky boli následne inkubované v prítomnosti testovaných látok a bakteriálnym LPS

izolovaným z E.coli bola aktivovaná zápalová dráha. Markerom tejto zápalovej odpovede bola

alkalická fosfatáza SEAP, ktorá bola bunkami exprimovaná do média. Po prídavku

kolorimetrického indikátora sa spektrofotometricky merala hladina SEAP, ktorá je

ekvivalentná množsvu produkovaného NF-κB. Za hornú hranicu, teda 100 %, bola považovaná

aktivita SEAP v jamkách, ktoré neobsahovali žiadne látky, ktoré by mohli zmierniť zápalovú

odpoveď. Táto kontrola bola označovaná ako vehikulum – pozitívna kontrola. Ako negatívna

kontrola slúžila bazálna zápalová aktivita buniek, u ktorých nebol zámerne indukovaný zápal.

Namerané hodnoty testovaných vzoriek boli vzťahované k vehikulu. Zníženie množstva SEAP

vo vzorke znamenalo antiflogistickú aktivitu vzorky.

U frakcií CS-H, CS-CH a čistej látky CS-CH 8 bol viditeľný mierny pokles a teda vykazovali

miernu antiflogistickú aktivitu. Celkový extrakt a etylacetátový podiel nevykazovali žiadnu

aktivitu. Keďže celkový extrakt obsahuje niekoľko stoviek rôznych látok a štruktúr, je celkom

zjavné, že môže dochádzať k antagonistickému účinku a teda sa navonok žiadna aktivita

neprejaví. Vodný podiel prekvapujúco hladinu NF-κB mierne zvyšoval a teda pôsobil

prozápalovo.

Ako referenčná vzorka bol použitý prednizón, liečivo, ktoré sa v dnešnej dobe používa

k potlačeniu zápalových prejavov rôzneho druhu. Pri použití danej metódy vykazoval dokonca

o niečo nižšiu antiflogistickú aktivitu v porovnaní s látkou CS-CH 8.

Z týchto výsledkov je zrejmé, že daná metóda umožňuje urobiť iba akýsi skríning aktivity.

Použitú metódu ovplyvňuje mnoho faktorov, a teda sa nedá jednoznačne určiť presná

protizápalová aktivita daných látok a zmesí. Dôležitým faktorom je použitá koncentrácia látok

a koncentrácia použitého LPS. Je možné. že bol v bunkách indukovaný tak silný zápal, že

koncentrácia testovaných látok nebola dostačujúca na to, aby zápalové prejavy znížila. Táto

62

metóda je veľmi citlivá, a práve to nám umožnilo uskutočniť experiment v mikromnožstvách.

Keďže sa jedná o živé bunkové systémy, je veľmi ťažké predpokladať, ako by experiment

prebehol vo väčšej mierke. V celej dráhe je veľmi veľa regulačných krokov, ktoré ovplyvňujú

jej celkový priebeh.

Týmto experimentom sa mi podarilo demonštrovať mierny antiflogistický účinok niektorých

obsahových látok rastliny Cannabis sativa. Ďalšie výskumy podobného zámeru by mohli

pomôcť presnejšie objasniť ich účinok a mohli by byť získané ďalšie výsledky, ktoré by

podporili moje závery. Výsledky taktiež naznačujú, že niektoré látky alebo ich zmesi môžu

pôsobiť prozápalovo, preto je potreba brať ohľad na zloženie zmesi, ktorá by mohla byť použitá

ako prírodné antiflogistikum.

Merania boli v mojom prípade negatívne ovplyvnené najmä množstvom extraktu, ktorý som

pre daný experiment spracovávala. Bolo totiž náročné vyizolovať čisté látky v dostatočnom

množstve a teda som nemohla realizovať paralelné stanovenie rôznych kombinácií čistých

látok, čim by som dokázala synergický, poprípade antagonistický účinok obsahových látok.

Aj napriek menšiemu množstvu výsledkov by som chcela demonštrovať potenciálny účinok

týchto látok ako antiflogistík, ktoré by mohli nahradiť syntetické látky používané k liečbe v

súčasnosti frekventovaných zápalových ochorení.

63

6 CITOVANÁ LITERATÚRA

1. HAVSTEEN, Bent H, B. STAVRIC, T. I. MATULA a Kenneth R. MARKHAM. The

biochemistry and medical significance of the flavonoids: Their Significance for Nutrition

and Health. ISBN http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4899-2913-6_12.

2. HEIM, Kelly E, Anthony R TAGLIAFERRO, Dennis J BOBILYA, Wolf BORS, Werner

HELLER, Christa MICHEL a Manfred SARAN. Flavonoid antioxidants: chemistry,

metabolism and structure-activity relationships. ISBN http://dx.doi.org/10.1007/978-1-

4684-5730-8_25.

3. HOLLMAN, Peter C.H. Absorption, Bioavailability, and Metabolism of

Flavonoids. Archives Of Physiology And Biochemistry. 2004, vol. 42, s1, s. 74-83. DOI:

10.1080/13880200490893492. Dostupné

z: http://informahealthcare.com/doi/abs/10.1080/13880200490893492

4. RUSZNYÁK, ST. a A. SZENT-GYÖRGYI. Vitamin P: Flavonols as Vitamins. Nature.

1936-7-4, vol. 138, issue 3479, s. 27-27. DOI: 10.1038/138027a0. Dostupné

z:http://www.nature.com/doifinder/10.1038/138027a0

5. CUSHNIE, T.P. Tim, Andrew J. LAMB, Yan-Jing LI, Yun-Feng ZHENG a Ping LI.

Antimicrobial activity of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents.

2005, vol. 26, issue 5, s. 343-356. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2005.09.002. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0924857905002554

6. ANDERSEN, Øyvind M a Kenneth R MARKHAM. Flavonoids: chemistry,

biochemistry, and applications. Boca Raton, FL: CRC, Taylor, 2006, 1237 p. ISBN 08-

493-2021-6.

7. GROTEWOLD, Erich. The science of flavonoids. New York: Springer, c2006, vii, 273

p. ISBN 978-038-7288-215.

8. CUSHNIE, T.P. Tim, Andrew J. LAMB, Yan-Jing LI, Yun-Feng ZHENG a Ping LI.

Antimicrobial activity of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents.

2005, vol. 26, issue 5, s. 343-356. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2005.09.002. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0924857905002554

9. BERNHOFT, Ed.: Aksel. Bioactive compounds in plants: benefits and risks for man and

animals : proceedings from a symposium held in Norwegian Academy of Science and

Letters, Oslo, 13 - 14 November 2008 00. Oslo: Novus Forlag, 2010. ISBN 978-827-

0995-837.

10. SELEPE, Mamoalosi a Fanie VAN HEERDEN. Application of the Suzuki-Miyaura

Reaction in the Synthesis of Flavonoids. Molecules. 2013, vol. 18, issue 4, s. 4739-4765.

DOI: 10.3390/molecules18044739. Dostupné z: http://www.mdpi.com/1420-

3049/18/4/4739/

64

11. DETSI, Anastasia, Maya MAJDALANI, Christos A. KONTOGIORGIS, Dimitra

HADJIPAVLOU-LITINA a Panagiotis KEFALAS. Natural and synthetic 2′-hydroxy-

chalcones and aurones: Synthesis, characterization and evaluation of the antioxidant and

soybean lipoxygenase inhibitory activity.Bioorganic. 2009, vol. 17, issue 23, s. 8073-

8085. DOI: 10.1016/j.bmc.2009.10.002. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0968089609009171

12. ROSS, Julie A. a Christine M. KASUM. D IETARY F LAVONOIDS: Bioavailability,

Metabolic Effects, and Safety. Annual Review of Nutrition. 2002, vol. 22, issue 1, s. 19-

34. DOI: 10.1146/annurev.nutr.22.111401.144957. Dostupné

z:http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.nutr.22.111401.144957

13. TSAO, Rong. Chemistry and Biochemistry of Dietary Polyphenols. Nutrients. 2010, vol.

2, issue 12, s. 1231-1246. DOI: 10.3390/nu2121231. Dostupné

z: http://www.mdpi.com/2072-6643/2/12/1231/

14. YÁÑEZ, Jaime A., Connie M. REMSBERG, Nicole D. MIRANDA, Karina R. VEGA-

VILLA, Preston K. ANDREWS, Neal M. DAVIES a Joanne M. HOLDEN.

Pharmacokinetics of selected chiral flavonoids: hesperetin, naringenin and eriodictyol in

rats and their content in fruit juices.Biopharmaceutics. 2008, vol. 29, issue 2, s. 63-82.

DOI: 10.1002/bdd.588. Dostupné z:http://doi.wiley.com/10.1002/bdd.588

15. YANG, Hsin-Ling, Ssu-Ching CHEN, K. J. SENTHIL KUMAR, Kang-Ni YU, Pei-

Dawn LEE CHAO, Shang-Yuan TSAI, Yu-Chi HOU a You-Cheng HSEU. Antioxidant

and Anti-Inflammatory Potential of Hesperetin Metabolites Obtained from Hesperetin-

Administered Rat Serum: An Ex Vivo Approach. Journal of Agricultural and Food

Chemistry. 2012-01-11, vol. 60, issue 1, s. 522-532. DOI: 10.1021/jf2040675. Dostupné

z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf2040675

16. SANCHEZ, Isvett Josefina Flores. Polyketide synthases in Cannabis sativa L. [S.l: s.n.],

2008. ISBN 978-909-0234-465.

17. CROZIER, Alan, M CLIFFORD a Hiroshi ASHIHARA. Plant secondary metabolites:

occurrence, structure and role in the human diet. Ames, Iowa: Blackwell Pub., 2006, xii,

372 p. ISBN 978-140-5125-093.

18. MLADĚNKA, Přemysl, Libuše ZATLOUKALOVÁ, Tomáš FILIPSKÝ a Radomír

HRDINA. Cardiovascular effects of flavonoids are not caused only by direct antioxidant

activity. Free Radical Biology and Medicine. 2010-09-15, vol. 49, issue 6, s. 963-975.

DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2010.06.010. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S089158491000362X

19. RAVISHANKAR, Divyashree, Amit Kumar RAJORA, Francesca GRECO a Helen. M.I.

OSBORN. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The

International Journal of Biochemistry. 2013, vol. 45, issue 12, s. 2821-2831. DOI:

65

10.1016/j.biocel.2013.10.004. Dostupné

z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S135727251300321X

20. HIDALGO, Maria, Concepción SÁNCHEZ-MORENO, Sonia DE PASCUAL-TERESA

a T.W. WONG. Flavonoid–flavonoid interaction and its effect on their antioxidant

activity. Food Chemistry. 2010, vol. 121, issue 3, s. 691-696. DOI:

10.1016/j.foodchem.2009.12.097. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814610000464

21. GONZÁLEZ, Evangelina A., Mónica A. NAZARENO, Yan-Jing LI, Yun-Feng ZHENG

a Ping LI. Antiradical action of flavonoid–ascorbate mixtures. LWT - Food Science and

Technology. 2011, vol. 44, issue 2, s. 558-564. DOI: 10.1016/j.lwt.2010.09.017.

Dostupné z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S002364381000335X

22. CUSHNIE, T.P. Tim a Andrew J. LAMB. Recent advances in understanding the

antibacterial properties of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents.

2011, vol. 38, issue 2, s. 99-107. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2011.02.014. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0924857911001300

23. WU, Ting, Mengying HE, Xixi ZANG, Ying ZHOU, Tianfu QIU, Siyi PAN, Xiaoyun

XU, M.M RICCIARDI, L RICCIARDI, M.L VUOTTO, Z. ZÍDEK, K. MAŠEK, M.

SVOBODOVÁ, K. ŠŮLA, K. NOUZA a J. MÜLLER. A structure–activity relationship

study of flavonoids as inhibitors of E. coli by membrane interaction effect. Biochimica et

Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 2013, vol. 1828, issue 11, s. 2751-2756. DOI:

10.1016/j.bbamem.2013.07.029. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0005273613002757

24. FU, Yu, Jun CHEN, Yan-Jing LI, Yun-Feng ZHENG a Ping LI. Antioxidant and anti-

inflammatory activities of six flavonoids separated from licorice. Food Chemistry. 2013,

vol. 141, issue 2, s. 1063-1071. DOI: 10.1016/j.foodchem.2013.03.089. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814613004342

25. GARCÍA-LAFUENTE, Ana, Eva GUILLAMÓN, Ana VILLARES, Mauricio A.

ROSTAGNO a José Alfredo MARTÍNEZ. Flavonoids as anti-inflammatory agents:

implications in cancer and cardiovascular disease. Inflammation Research. 2009, vol. 58,

issue 9, s. 537-552. DOI: 10.1007/s00011-009-0037-3. Dostupné

z: http://link.springer.com/10.1007/s00011-009-0037-3

26. IELPO, M.T.L, A BASILE, R MIRANDA, V MOSCATIELLO, C NAPPO, S SORBO,

E LAGHI, M.M RICCIARDI, L RICCIARDI, M.L VUOTTO, Z. ZÍDEK, K. MAŠEK,

M. SVOBODOVÁ, K. ŠŮLA, K. NOUZA a J. MÜLLER. Immunopharmacological

properties of flavonoids. Fitoterapia. 2000, vol. 71, s. 363-366. DOI:

http://dx.doi.org/10.1007/978-3-642-76120-1_48.

27. HEMAISWARYA, Shanmugam, Anil Kumar KRUTHIVENTI a Mukesh DOBLE.

Synergism between natural products and antibiotics against infectious

diseases. Phytomedicine. 2008, vol. 15, issue 8, s. 639-652. DOI

66

28. FLORES-SANCHEZ, Isvett Josefina a Robert VERPOORTE. Secondary metabolism in

cannabis.Phytochemistry Reviews. 2008, vol. 7, issue 3, s. 615-639. DOI:

10.1007/s11101-008-9094-4. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s11101-008-

9094-4

29. ARUNG, Enos, Kuniyoshi SHIMIZU, Ryuichiro KONDO, Ying ZHANG a Huai-Liang

WANG. Inhibitory Effect of Isoprenoid-Substituted Flavonoids Isolated from Artocarpus

heterophyllus on Melanin Biosynthesis. Planta Medica. 2006, vol. 72, issue 09, s. 847-

850. DOI: 10.1055/s-2006-931606. Dostupné z: http://www.thieme-

connect.de/DOI/DOI?10.1055/s-2006-931606

30. CHOI, Jae Sue, Md. NURUL ISLAM, Md. YOUSOF ALI, Eon Ji KIM, Young Myeong

KIM a Hyun Ah JUNG. Effects of C-glycosylation on anti-diabetic, anti-Alzheimer’s

disease and anti-inflammatory potential of apigenin. Food and Chemical Toxicology.

2014, vol. 64, issue 6, s. 27-33. DOI: 10.1016/j.fct.2013.11.020. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0278691513007825

31. JUNG, Woon-Won, G M FUHLER, N BLOM, C V FERREIRA, H AOYAMA, M P

PEPPELENBOSCH a Tetsuo ADACHI. Protective effect of apigenin against oxidative

stress-induced damage in osteoblastic cells: implications for prevention and

therapy. International Journal of Molecular Medicine. 2014-02-25, vol. 1, issue 1, s. -.

DOI: 10.3892/ijmm.2014.1666. Dostupné z:http://www.spandidos-

publications.com/10.3892/ijmm.2014.1666

32. RUELA-DE-SOUSA, R R, G M FUHLER, N BLOM, C V FERREIRA, H AOYAMA,

M P PEPPELENBOSCH a Tetsuo ADACHI. Cytotoxicity of apigenin on leukemia cell

lines: implications for prevention and therapy. Cell Death and Disease. 2010, vol. 1, issue

1, e19-. DOI: 10.1038/cddis.2009.18. Dostupné

z: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/cddis.2009.18

33. WU, Ding-Guo, Peng YU, Jian-Wei LI, Peng JIANG, Jing SUN, Huai-Zhi WANG, Lei-

Da ZHANG, Ming-Bo WEN, Ping BIE a Ling ZHANG. Apigenin potentiates the growth

inhibitory effects by IKK-β-mediated NF-κB activation in pancreatic cancer

cells. Toxicology Letters. 2014, vol. 224, issue 1, s. 157-164. DOI:

10.1016/j.toxlet.2013.10.007. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0378427413013507

34. IBRAHIM, Amany K., Mohamed M. RADWAN, Safwat A. AHMED, Desmond

SLADE, Samir A. ROSS, Mahmoud A. ELSOHLY, Ikhlas A. KHAN, M.M

RICCIARDI, L RICCIARDI, M.L VUOTTO, Z. ZÍDEK, K. MAŠEK, M.

SVOBODOVÁ, K. ŠŮLA, K. NOUZA a J. MÜLLER. Microbial metabolism of

cannflavin A and B isolated from Cannabis sativa. Phytochemistry. 2010, vol. 71, 8-9, s.

1014-1019. DOI: 10.1016/j.phytochem.2010.02.011. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0031942210000555

67

35. BARRETT, M.L., D. GORDON, F.J. EVANS, Desmond SLADE, Samir A. ROSS,

Mahmoud A. ELSOHLY a Ikhlas A. KHAN. Isolation from cannabis sativa L. of

cannflavin—a novel inhibitor of prostaglandin production. Biochemical Pharmacology.

1985, vol. 34, issue 11, s. 2019-2024. DOI: 10.1016/0006-2952(85)90325-9. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0006295285903259

36. BARRETT, M. L., A. M. SCUTT, F. J. EVANS, Desmond SLADE, Samir A. ROSS,

Mahmoud A. ELSOHLY a Ikhlas A. KHAN. Cannflavin A and B, prenylated flavones

fromCannabis sativa L.Experientia. 1986, vol. 42, issue 4, s. 452-453. DOI:

10.1007/BF02118655. Dostupné z:http://link.springer.com/10.1007/BF02118655

37. MISHRA, Beena, K.Indira PRIYADARSINI, M.Sudheer KUMAR, M.K.

UNNIKRISHNAN, Hari MOHAN, Jia-You FANG, Lei-Da ZHANG, Ming-Bo WEN,

Ping BIE a Ling ZHANG. Effect of O-glycosilation on the antioxidant activity and free

radical reactions of a plant flavonoid, chrysoeriol: The relationships to chemical

structures. Bioorganic. 2003, vol. 11, issue 13, s. 2677-2685. DOI: 10.1016/S0968-

0896(03)00232-3. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0968089603002323

38. VELLOSA, José Carlos Rebuglio, Luis O. REGASINI, Najeh Maissar KHALIL,

Vanderlan da Silva BOLZANI, Omar A. K. KHALIL, Francine Alessandra MANENTE,

Harli PASQUINI NETTO a Olga M. M. de Faria OLIVEIRA. Antioxidant and cytotoxic

studies for kaempferol, quercetin and isoquercitrin: implications for prevention and

therapy. Eclética Química. 2011, vol. 36, issue 2, s. 07-20. DOI: 10.1590/S0100-

46702011000200001. Dostupné z: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext

39. M. CALDERON-MONTANO, J., E. BURGOS-MORON, C. PEREZ-GUERRERO, M.

LOPEZ-LAZARO, Omar A. K. KHALIL, Francine Alessandra MANENTE, Harli

PASQUINI NETTO a Olga M. M. de Faria OLIVEIRA. A Review on the Dietary

Flavonoid Kaempferol: implications for prevention and therapy. Mini-Reviews in

Medicinal Chemistry. 2011-04-01, vol. 11, issue 4, s. 298-344. DOI:

10.2174/138955711795305335. Dostupné

z: http://www.eurekaselect.com/openurl/content.php?genre=article

40. KIM, Tae Hoon, Sae-Kwang KU, In-Chul LEE, Jong-Sup BAE, Omar A. K. KHALIL,

Francine Alessandra MANENTE, Harli PASQUINI NETTO a Olga M. M. de Faria

OLIVEIRA. Anti-inflammatory effects of kaempferol-3-O-sophoroside in human

endothelial cells: A combined experimental and DFT approach. Inflammation Research.

2012, vol. 61, issue 3, s. 217-224. DOI: 10.1007/s00011-011-0403-9. Dostupné

z: http://link.springer.com/10.1007/s00011-011-0403-9

41. KIM, Tae Hoon, Sae-Kwang KU, Jong-Sup BAE, Sai LI, Jingzheng ZHANG, Shuaishuai

WANG, Cheng LI, Yanguo SHANG, Tonghui HUANG a Ling ZHANG. Inhibitory

effects of kaempferol-3-O-sophoroside on HMGB1-mediated proinflammatory

responses. Food and Chemical Toxicology. 2012, vol. 50, 3-4, s. 1118-1123. DOI:

68

10.1016/j.fct.2011.12.004. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0278691511006697

42. COLETA, Miguel, Maria Graça CAMPOS, Maria Dulce COTRIM, Thereza Christina M.

de LIMA a António Proença da CUNHA. Assessment of luteolin (3′,4′,5,7-

tetrahydroxyflavone) neuropharmacological activity. Behavioural Brain Research. 2008,

vol. 189, issue 1, s. 75-82. DOI: 10.1016/j.bbr.2007.12.010. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S016643280700664X

43. JOHNSON, Jodee L., Sanjeewa G. RUPASINGHE, Felicia STEFANI, Mary A.

SCHULER, Elvira GONZALEZ DE MEJIA, Mamoru KOKETSU a Tetsuo ADACHI.

Citrus Flavonoids Luteolin, Apigenin, and Quercetin Inhibit Glycogen Synthase Kinase-

3β Enzymatic Activity by Lowering the Interaction Energy Within the Binding

Cavity. Journal of Medicinal Food. 2011, vol. 14, issue 4, s. 325-333. DOI:

10.1089/jmf.2010.0310. Dostupné

z:http://www.liebertonline.com/doi/abs/10.1089/jmf.2010.0310

44. THEOHARIDES, Theoharis C, Ji-Young JIN, Jeom-Il CHOI, In Soon CHOI, Sung-Jo

KIM, Mamoru KOKETSU a Tetsuo ADACHI. Luteolin as a therapeutic option for

multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 2009, vol. 6, issue 1, s. 29-. DOI:

10.1186/1742-2094-6-29. Dostupné

z:http://www.jneuroinflammation.com/content/6/1/29

45. LIU, Yi, Xiaobin FU, Nuo LAN, Sai LI, Jingzheng ZHANG, Shuaishuai WANG, Cheng

LI, Yanguo SHANG, Tonghui HUANG a Ling ZHANG. Luteolin protects against high

fat diet-induced cognitive deficits in obesity mice. Behavioural Brain Research. 2014,

vol. 267, s. 178-188. DOI: 10.1016/j.bbr.2014.02.040. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0166432814001259

46. LEE, Wonhwa, Sae-Kwang KU, Jong-Sup BAE, M.K. UNNIKRISHNAN, Hari

MOHAN, Jia-You FANG, Lei-Da ZHANG, Ming-Bo WEN, Ping BIE a Ling ZHANG.

Vascular barrier protective effects of orientin and isoorientin in LPS-induced

inflammation in vitro and in vivo: The relationships to chemical structures. Vascular

Pharmacology. 2014, vol. 62, issue 1, s. 3-14. DOI: 10.1016/j.vph.2014.04.006.

Dostupné z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1537189114000780

47. PRAVEENA, R., K. SADASIVAM, V. DEEPHA, Raman SIVAKUMAR, Omar A. K.

KHALIL, Francine Alessandra MANENTE, Harli PASQUINI NETTO a Olga M. M. de

Faria OLIVEIRA. Antioxidant potential of orientin: A combined experimental and DFT

approach. Journal of Molecular Structure. 2014, vol. 1061, issue 4, s. 114-123. DOI:

10.1016/j.molstruc.2014.01.002. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022286014000192

48. FU, Xiao-Chun, Min-Wei WANG, Shao-Peng LI, Ying ZHANG a Huai-Liang WANG.

Vasodilatation Produced by Orientin and Its Mechanism Study. Biological. 2005, vol. 28,

69

issue 1, s. 37-41. DOI: 10.1248/bpb.28.37. Dostupné

z: http://joi.jlc.jst.go.jp/JST.JSTAGE/bpb/28.37?from=CrossRef

49. DÁVALOS, Alberto, Patricia CASTILLA, Carmen GÓMEZ-CORDOVÉS a Begoña

BARTOLOMÉ.Quercetin is bioavailable from a single ingestion of grape juice. ISBN

http://dx.doi.org/10.1080/09637480600858662.

50. NEMETH, K., M. K. PISKULA, Carmen GÓMEZ-CORDOVÉS a Begoña

BARTOLOMÉ. Food Content, Processing, Absorption and Metabolism of Onion

Flavonoids. ISBN http://dx.doi.org/10.1080/10408390600846291.

51. SCHOLZ, S., G. WILLIAMSON, Stéphanie DÉPREZ, Augustin SCALBERT a

Angélique STALMACH. Interactions Affecting the Bioavailability of Dietary

Polyphenols in Vivo. International Journal for Vitamin and Nutrition Research. 2007,

vol. 77, issue 3, s. 561-576. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/b978-0-12-398456-2.00042.

52. BORSKA, Sylwia, Malgorzata DRAG-ZALESINSKA, Teresa WYSOCKA, Miroslaw

SOPEL, Malgorzata DUMANSKA, Maciej ZABEL a Piotr DZIEGIEL. Antiproliferative

and pro-apoptotic effects of quercetin on human pancreatic carcinoma cell lines EPP85-

181P and EPP85-181RDB. Folia Histochemica et Cytobiologica. 2010, vol. 48, issue 2,

s. 561-576. DOI: http://dx.doi.org/10.2478/v10042-08-0109-1.

53. ROGERIO, Alexandre P., Cristiana L. DORA, Edinéia L. ANDRADE, Juliana S.

CHAVES, Luis F.C. SILVA, Elenara LEMOS-SENNA a João B. CALIXTO. Anti-

inflammatory effect of quercetin-loaded microemulsion in the airways allergic

inflammatory model in mice. Pharmacological Research. 2010, vol. 61, issue 4, s. 288-

297. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.phrs.2009.10.005.

54. CHOO, C.Y., N.Y. SULONG, F. MAN a T.W. WONG. Vitexin and isovitexin from the

Leaves of Ficus deltoidea with in-vivo α-glucosidase inhibition. Journal of

Ethnopharmacology. 2012, vol. 142, issue 3, s. 776-781. DOI: 10.1016/j.jep.2012.05.062.

Dostupné z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0378874112003844

55. DONG, Liuyi, Yifei FAN, Xu SHAO a Zhiwu CHEN. Vitexin protects against

myocardial ischemia/reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts by attenuating

inflammatory response and apoptosis. Food and Chemical Toxicology. 2011, vol. 49,

issue 12, s. 3211-3216. DOI: 10.1016/j.fct.2011.09.040. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0278691511004959

56. AUWERX, J. The human leukemia cell line, THP-1: A multifacetted model for the study

of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 1991, vol. 47, issue 1, s. 22-31.

DOI: 10.1007/bf02041244.

57. TAKEDA, Kiyoshi, Shizuo AKIRA, J. STENVIK, J. D. LAMBRIS, T. ESPEVIK a T.

E. MOLLNES. TLR signaling pathways. Seminars in Immunology. 2004, vol. 16, issue

1, s. 3-9. DOI: 10.1016/j.smim.2003.10.003. Dostupné

z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1044532303000964

70

58. SABROE, I, LC PARKER, SK DOWER, MKB WHYTE, T. ESPEVIK a T. E.

MOLLNES. The role of TLR activation in inflammation. The Journal of Pathology. 2008,

vol. 214, issue 2, s. 126-135. DOI: 10.1002/path.2264. Dostupné

z: http://doi.wiley.com/10.1002/path.2264

59. AKASHI, S., S.-i. SAITOH, Y. WAKABAYASHI, T. KIKUCHI, N. TAKAMURA, Y.

NAGAI, Y. KUSUMOTO, K. FUKASE, S. KUSUMOTO, Y. ADACHI, A. KOSUGI a

K. MIYAKE. Lipopolysaccharide Interaction with Cell Surface Toll-like Receptor 4-

MD-2: Higher Affinity than That with MD-2 or CD14. Journal of Experimental Medicine.

2003-10-06, vol. 198, issue 7, s. 1035-1042. DOI: 10.1084/jem.20031076. Dostupné

z:http://www.jem.org/cgi/doi/10.1084/jem.20031076

60. CHRISTIANSEN, D., O. L. BREKKE, J. STENVIK, J. D. LAMBRIS, T. ESPEVIK a T.

E. MOLLNES. Differential Effect of Inhibiting MD-2 and CD14 on LPS- Versus Whole

E. coli Bacteria-Induced Cytokine Responses in Human Blood. s. 237. DOI: 10.1007/978-

1-4614-0106-3_14. Dostupné z:http://link.springer.com/10.1007/978-1-4614-0106-3_14

61. GOEL, Gunjan, Harinder P. S. MAKKAR, George FRANCIS a Klaus BECKER. Phorbol

Esters: Structure, Biological Activity, and Toxicity in Animals. International Journal of

Toxicology. 2007, vol. 26, issue 4, s. 279-288. DOI: 10.1080/10915810701464641.

Dostupné z:http://ijt.sagepub.com/cgi/doi/10.1080/10915810701464641

71

7 ZOZNAM SKRATIEK

4CL 4-coumarate:CoA ligase – 4-kumarát:CoA ligáza

A. flavus Apergillus flavus

AA arachidonic acid (kyselina arachidonová)

ATP adenozíntrifosfát

cAMP cyklický adenozínmonofosfát

cGMP cyklický guanozínmonofosfát

C4H cinnamát 4-hydroxyláza

CAM molekuly adherujúce na povrch buniek

CBDA kyselina cannabidiolová

CHI chalkón izomeráza

CHS chalkón syntáza

CNS centrálna nervová sústava

COMT katechol-O-metyltransferáza

COX cyklooxygenáza

C. sativa Cannabis sativa

CYP1B1 cytochróm P4501B1 gén

DNA deoxyribonukleová kyselina

DPPH 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl

FAD flavín adenín dinukleotid

HIV ľudský imunodeficienčný vírus

HMG-CoA hydroxymetylglutaryl koenzýmA (reduktáza)

HPLC vysokoúčinná kvapalinová chromatografia

HSV vírus Herpes simplex

IL-6 interleukín 6

72

KPOS kaempferol-3-O-soforozid

LD50 letálna dávka, ktorá spôsobí úhyn 50 % jedincov

LDL nízkohustotný lipoproteín

LOX lipooxygenáza

LPS lipopolysacharid

NADH hydrogenovaný nikotín amid dinukleotid

NADPH hydrogenovaný nikotínamiddinukleotid fosfát

NMR nuclear magnetic resonance - nukleárna magnetická rezonancia

NO nitric oxide – oxid dusnatý

NOS NO-syntáza

PAL phenylalanine ammonia lyase – fenylalanín amonia klyáza

PG prostaglandín

PKS polyketide synthase – polyketid syntáza

PL fosfolipáza

RNS reactive nitrogen species - reaktívne dusíkaté formy

ROS reactive oxygen species - reaktívne kyslíkaté formy

RTG röntgen

THF tetrahydrofolát

TLC thin layer chromatography - tenkovrstvová chromatografia

TNF-α tumor necrosis factor – faktor nádorovej nekrózy

73

Tato práce vznikla za podpory projektu BiochemNet ‒ Vytvoření sítě pro podporu

spolupráce biomedicínských pracovišť a zvýšení uplatnitelnosti absolventů biochemických

oborů v praxi (registrační číslo CZ.1.07/2.4.00/31.0133). Projekt je realizován v rámci

Operačního programu vzdělávání pro konkurenceschopnost, který je spolufinancovaný

z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu ČR.