izotopska analiza organskih spojin: osnove, praksa in...
TRANSCRIPT
Izotopska analiza
organskih spojin:
osnove, praksa in izzivi
Nives Ogrinc, Doris
Potočnik, Lidija Strojnik
Pomladna šola 4.4.-7.4.2017
Potvorbe - terminologija
Potvorbeživil
Nadomestki
Redčenje
Goljufije
Nedovoljenaobogatitev
Napačnooznačevanje
Prikrivanje
Črni market/ kraja/diversio
n
o Dodatek vode
(sadni sokovi,
mleko)
o Oljčno olje
razredčeno z
toksičnim oljem iz
čajev
Kopije določenih
živil – niso
pridelani z
priporočljivo
varnostjo
o Melamin dodan
mleku, za povečanje
proteinske vsebnosti
o Uporaba
nedovoljenih
dodatkov
Sončnično olje
nadomestimo z
mineralnimi olji
Hidrolizirani proteini
iz usnja v mleku
Prodaja izdelkov, ki
niso zavedeni
o Prisotnost
hormonov
(piščančje meso)
Dodatek barvil
svežemu sadju za
prekrivanje napak
o Geografsko poreklo
o Nepravilno označeno
reciklirano olje
Izdelki najbolj izpostavljeni potvorbam
Oljčno oljeRibe in morskisadeži
Mleko in mlečniizdelki
Med, javorjev sirupin ostala sladila
Sadni sokovi Kava in čaji
Arome in začimbeOrganska pridelavaživil
Dodatki za motnost
Izvor
Moore in sod., J. Food Sci., 2012
“Tradicionalne”
Preverjanje pristnosti
Ali je živilo naravnega izvora, ali mu je bilo kaj dodano?
Naravno ali sintetično
Ali je vanilin sintetiziran iz fižola ali iz lignina?
“Novi pristopi”
Pravilna deklaracija na živilu
konvencionalno ali “organsko”živilo
Določitev geografskegaporekla živila
sir in šunka iz Parme
Vrste analiz
Elementni in izotopski “fingerprinting”
KlasifikacijaVzorec
Elementna in
izotopska
analiza
Kemometrija
Ustreza bazi
podatkov
Država X
Področje Y
Vrsta Z
…..
Država X
Področje Y
Vrsta Z
…..
Elemental and
isotope
fingerprinting
PCA, CA, SIMCA,
LDA, PLS-DA ….
Izotopska karakterizacija vina
H2O
morje
CO2
ozračje
oblaki
tladež
transpiracija
fotosinteza
fermentacija
listi
glukoza + voda
etanol + voda
Slovenska baza podatkov
Baza podatkov izotopske sestave slovenskih vin:
od leta 1996 in ustanovitev konzorcija 2004 (KIS, KI, IJS)
EU baza podatkov od leta 2005
25 vzorcev slovenskih vin iz treh vinorodnih področij
vsako leto 5-10 inšpekcijskih vzorcev
ugotavljanje geografskega porekla
določila o dovoljenem mešanju vin pridelanih iz različnih sort
vinske trte
prepoved dosladkanja drozge ali mošta brez predpisanega
dovoljenja oziroma popolna prepoved v primeru drozge ali
mošta namenjenega za pridelavo vrhunskega vina
ugotavljanje letnika pridelave
e
Pet principov izotopskih parametrov z informacijo, ki jo
podajajo
Informacijao sorti
Informacija o fermentaciji
Informacija o vodnem
okolju in klimi
o (D/H)II – Specifično razmerje na metilenskem
mestu v etanolu vinskega destilata
o (D/H)I – Razmerje na metilnem mestu
v etanolu vinskega destilata
o C-13 vinskega destilata
o (D/H)w, d2H – Povprečno D/H
razmerje v vodi
o Povprečna vsebnost 18O v vinu
Site-specific Natural Isotopic Fractionation -
Nuclear Magnetic Resonance
Complementarna analitska metoda – SNIF-NMR
2H na metilnem mestu:
Pesni sladkor 92 ppm
Trsni sladkor 110 ppm
Wine 98 – 105 ppm
Definicija mejnih vrednosti in skladnosti
o Selekcija referenčnih vrednosti
o Povprečna vrednost, mediana, STD
o Izračuna se 95% interval zaupanja za pristnost (t-student test)
Bivariantni testi,
multivariantne analize)
Potvorbe/analitska metoda
Nedeklariran dodatek drugega sadja Sestava (+ DNA določenega sadja)
Nedeklariran dodatek sladkorja SNIF-NMR + GC sladkorjev in
oligosaharidov
Nedeklariran dodatek vode d18O z IRMS in etanol kot interno
referenco
Nedeklariran dodatek vitamina C d13C – IRMS askorbinske kisline
Nedeklariran dodatek citronske
kisline
d13C in d2H citronske kisline kisline
Nedeklariran dodatek jabolčne
kisline
d13C – IRMS jabolčne kisline
Geografsko poreklo Multi-elementna sestava in stabilni
izotopi
Nedeklariran dodatek arom GC-MS in GC-C-IRMS
Kakšna je situacija na slovenskem tržišču?
Vrednost izotopske
sestave
Območje
vrednosti
(‰)
Opomba
d13C - sladkorju -27 do -24
d18O - vodi Ustrezna baza podatkov
d13C – citronski kislini -28 do -24 Razlika med kislino in
sladkorjem:
-2 do 0 ‰
d13C – pulpi -28 do -24 Razlika med sladkorjem in
pulpo: -2 do +0.5 ‰
AIJN mejne vrednosti
Parametri: TA, FRU, GLU, d13C, d2H, d18O,
10% vzorcev
-28 -26 -24 -22 -20 -18
-2
0
2
4 r = 0,95
d1
3C
ho
n -
d1
3C
pro
t [‰
V-P
DB
]
d13
C honey [‰ V-PDB]
Metoda internega standarda – med
-27.5
-23.5
-21.5
-17.5
d13C
Interni
standard
Pristni
Potvorjen
Kropf et al., Food Chem 2010; Kropf et al., JAFC, 2010
Velja za potvorbe ≥ 7 %
From bulk to specific compound!
Bulk
Isotope
Analysis
Compound
Specific
Isotope
Analysis
GC-C-IRMS
Zakaj “compound-specific” namesto “bulk”?
Prednosti
❍ Povezava na molekularno
strukturo-določitev izotopske
sestave - izvor ali proces
❍ Količina vzorca; potrebujemo le
nekaj nanogramov posamezne
spojine
❍ Kompleksne materiale ali
mešanice; živi organizmi so
sestavljeni iz različnih spojin, ki so
odvisni od strukture in izvora
❍ Informacije o izotopski sestavi
posameznih spojin sestavlja
informacijo o celotni strukturi –
posamezne aminokisline v
proteinih
Slabosti
❍ Posamezne analize so zamudne
❍ Izguba vzorca med samo pripravo
❍ Tehnično bolj zahtevne meritve;
izkušen kader na področju organske
kemije, dražje in potrebno več
materiala
❍ Analitska natančnost je v primerjavi
z “bulk” analizami manjša – večja
napaka meritev
Metrološke težave
❍ Ni ustreznih referenčnih materialov
❍ Referenčni materiali ne ustrezajo matriki vzorca
❍ Pojavljanje izotopske frakcionacije med samo
pripravo vzorca, derivatizacijo, nepravilno uvajanje
vzorca in nepopolnim sežigom
❍ Popravki glede na uporabo topil
❍ Linearnost
❍ Možnost transformacijskih procesov
in vpliv na frakcionacijo
Priprava vzorca
Namen: izolacija kompleksnih ekstraktov, ki vsebujejo
stotine spojin in jih ločiti po skupinah spojin za GC analizo
Primer analitskega protokola
Vzorec
Ekstrakcijalipidov in
kromatografija
Kisla
frakcija
Neutralnafrakcija
Polarnafrakcija
Biopolimernaanaliza
Prvi korak 1 – priprava vzorca
Vzorec mora biti posušen in zdrobljen
Liofiliziran – odstranitev vode, pospeši
učinkovitost topil in penetracijo topil v
matriko
Lahko ga zdrobimo tudi s tekočim dušikom,
večja površina in homogenost
Vpliv anorganskih spojin, na primer S – se
odstrani z aktivnim Cu
Kontaminacija
Steklo
zelo čisto (v peči pri visoki T, uporaba topil)
Plastika
Mi sami!
Kontaminacija – dominantni piki višji od raziskovalnih spojin
Prekrivanja – “co-elution” z raziskanimi spojinami
Drugi korak – ekstrakcija
Ekstrakcija lipidov iz vzorca (kaj želimo analizirati,
stabilnost, matrica in velikost)
Soxhlet (tla, sedimenti)
Ultrazvok (manjše vzorce)
Ekstrakcija tekoče/tekoče (tekoče vzorce)
Mikrovalovni
Tretji korak – separacija lipidnih
ekstraktov
Kromatografija – principi:
Stacionarna faza (silica, aluminijev oksid) in mobilna
faza (topilo)
Različne molekule imajo različno afiniteto za obe fazi
pri potovanju skozi kolono z različno hitrostjo
Odvisnost od velikosti in/ali funkcionalnih skupin
Specifična stacionarna faza lahko povzroči ionsko
afiniteto določene funkcionalne skupine
Kromatografija
Tretji korak – separacija lipidnih
ekstraktov
Kromatografija – principi:
Stacionarna faza (silica, aluminijev oksid) in mobilna
faza (topilo)
Različne molekule imajo različno afiniteto za obe fazi
pri potovanju skozi kolono z različno hitrostjo
Odvisnost od velikosti in/ali funkcionalnih skupin
Specifična stacionarna faza lahko povzroči ionsko
afiniteto določene funkcionalne skupine
Ekstrakcija na trdnem nosilcu
Primer analitskega protokola
Vzorec
Ekstrakcijalipidov in
kromatografija
Kisla
frakcija
Neutralnafrakcija
Polarna frakcija
Biopolimernaanaliza
n-alkanonskekisline
Ogljikovodiki, voski, estri,
n-alkoholi, steroli
PLFAs
derivatizacija
Vzorec
Ekstrakcijalipidov in
kromatografija
Kisla
frakcija
Neutralnafrakcija
Polarnafrakcija
Biopolimernaanaliza
n-alkanonskekisline
Ogljikovodiki, voski, estri,
n-alkoholi, steroli
PLFAs
GC-IRMS
n-Alkani
ni funkcionalnih skupin
ni potrebne derivatizacije
Derivatizacija
Hlapne spojine – funkcionalne skupine na GC se
lahko kemijsko modificirajo
Derivatizirat – blokiranje funkcionalnih skupin z
apolarnimi skupinami
Primeri funkcionalnih skupin: -COOH, -OH, -NH
Primeri derivatiziranih reakcij:
esterifikacija
sililiranje
acetiliranje
Na kaj moramo biti pozorni
Izotopski efekt
Dodat čimmanj C
Hitra reakcija
Dobra separacijaposameznih spojin
Nobene interference z vmesnimi produkti
Stabilni končniprodukt
Negotovost glede na dodan C
Med
Potvorjen
-27.4‰-27.0‰
-26.4‰
-24.3‰
-26.7‰
D13Cmax = 3.1‰
Predlagani kriterijiParameter
(‰)
Suggested value
Dd13C fru-glu ± 1.0 ‰
Dd13C fru-ds
Dd13C fru-ts
Dd13C fru-p
Dd13C glu-ds
Dd13C glu-ts Max difference
Dd13C glu-p ± 2.1 ‰
Dd13C ds-ts
Dd13C ds-p
Dd13C ts-p
Dd13C p-h -1.0 ‰
Prednosti:
Znižanje detekcije dodatka sladkorja
1 % C4- sladkorji
10 % C3- sladkorji
Prva metoda za detekcijo pesnega sladkorja
d13C
Natural aroma > synthetic aroma
Synthetic vanillin (petrochemical)
20 kg = 180 EUR
Natural vanillin (extract is 2% of bean)
20 kg = 18 000 EURGreule et al., Eur. Food Res Technol., 2010, 231, 933
CAM plant
natural
synthetic
Lamprecht & Blochberger, Food Chem., 2009
Oljčno olje
Tip olja Enkrat-nenasičene
MK
Večkrat-nenasičene
MK
Nasičene MK
Orehovo olje 83 % 3 % 14 %
Oljčno olje 77 % 9 % 14 %
Konopljino olje 62 % 32 % 6 %
Arašidovo olje 49 % 33 % 18 %
Koruzno olje 25 % 62 % 13 %
Sojino olje 24 % 61 % 15 %
Sončnično olje 20 % 69 % 11 %
Olje iz žafranike 13 % 77 % 10 %
Ključni parametri za karakterizacijo in kakovost oljčnega olja: (1)
kislost; (2) senzorična ocena; (3) maščobnokislinska (MK) sestava
Compound-specific δ13C maščobnih kislin
Transesterifikacija trigliceridovNaOH v metanolu 2 M, 1 min
Piki: Heneikozan (1), metil-palmitat (2), metil-stearat (3), metil-oleat (4), metil-linoleat (5)
GC-c-IRMS analize13C/12C razmerje
Internal standard
-34.1‰
-34.3‰
-30.8‰
-31.2‰
GC/MS chromatogram
palmitic
oleic
palmitoleic
stearic linoleic
d13C (‰)16:0
d13C
(‰)
18:1
Vegetables
Rape
Olive
Olive-cake
Pumpkin
Sunflower
Canola -38
-36
-34
-32
-30
-28
-26
-24
-22
-38 -36 -34 -32 -30 -28 -26 -24 -22 -20
Hazelnut
Groundnut
Walnut
Pumpkin
Avocado
Maize
Sesame
Soy
1 SD
Spangenberg & Ogrinc, 2001
-32 -31 -30 -29 -28 -27 -26 -25 -24
-32
-31
-30
-29
-28
-27
-26
-25
-24
Slovene Istra
Croatia
Brda
Monte Negro
Italy
Spain
Greece
y=0.8*x-4.2
d13C
18:1 (‰
)
d13
C16:0
(‰)
70 % deviškega OO
10 % rafiniranega OT
20 % sončničnega olja
80 % deviškega OO
20 % palmovega olja
Mleko in
mlečni izdelki
Metode za določanje potvorjenosti
⇒ izotopska sestava O v mleku (IRMS)
⇒vsebnost in izotopske sestava maščobnih kislin v
mleku (GC-FID, GC-C-IRMS)
⇒PCR v realnem času
⇒ identifikacija proteinskih profilov (MALDI Q-
TOF)
⇒ iso-električno fokusiranje
⇒komercialno dostopna ELISA
Makroregije v Sloveniji
Izotopska sestava kisika v mleku
Jan Feb Mar Maj Jun Jul Avg Sep Okt Nov Dec Jan Feb Mar Apr May
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
Jan Feb Mar Maj Jun Jul Avg Sep Okt Nov Dec Jan Feb Mar Apr May
-12
-11
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
d1
8O
[‰
]
mleko
podzemna voda
⇒δ18O v mleku in podzemni vodi - potvorjenost
⇒δ18O v mleku – geografsko poreklo
Določimo lahko med 7 do 34 % dodatka vode
Analiza stanja v praksi in na slovenskem
tržišču
Mleko na tržišču
Ustreznost deklaracije sirov
- siri višje cenovni
- siri nižje cenovni
Potrebe mlekarske industrije (elementi v sledovih, maslo)
Mleko na tržišču
Rezultat: vzorci mleka na tržišču junija 2012 podobno izotopsko sestavo kot
vzorci mleka v trenutni bazi podatkov
Analiza stanja v praksi in na slovenskem
tržišču
Ustreznost deklaracije sirov - siri višje cenovni (ovčji in kozji siri – 28 vzorcev) – PCR v realnem času
(BF UNI-LJ)- siri nižje cenovni (dodatek palmove masti) – MK
Rezultat:o največje nepravilnosti prisotne pri označbah ovčjih oziroma kozjih
sirih. V naši raziskavi je bilo kar 20 % vzorcev sira višjega cenovnega razreda, ki niso ustrezali deklaraciji.
o v sirih nižjega cenovnega razreda nismo zasledili dodatka drugih maščob
Maščobne kisline in izotopska sestava
REZULTATI:
Lahko ločimo geografsko poreklo na osnovi maščobnokislinske sestave mleka
Izotopska sestava posameznih maščobnih kislin za
Mediteransko in Panonsko regijo
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
-20 -10 0 10 20 30
Funct
2 (
2.1
%)
Funct 1 (97.6%)
Discriminant Plot A
D
M
P
Na podlagi uporabe LDA (linear discriminant analysis) smo
določili geografsko poreklo mleka.
Visoka ločljivost: 98,7 %
Najbolj pomembni parametri pri
ločitvi so: C20:4w-6, C20:3w-6,
C17:0, C18:3w-3 (sveža trava, laneno
seme)
Potrebujemo vsaj 6 vzorcev
iz vsake regije 2x letno
Italy (16)
Vzorci deviškega oljčnega
olja
Spain (11)Portugal (8)
Australia (9) Uruguay (2)
Turkey (2)Tunisia (1)
Argentina (1)
Paolini et al., TALANTA, under review
PCA in Box ploti po posameznih državah - “ bulk” analize
d13C
d2Hd18O
Multivariatna analiza δ13C maščobnih kislin
European
extra-virgin olive oils
non-European extra-virgin olive oil
Geografsko poreklo – sestava in izotopi MK
10 naključno zbranih vzorcev na slovenskem tržišču v letu 2007
- pristna oljčna olja
Italy (17)
Vzorci moke
Denmark (18)
3 tri različne vrste pridelave
Animal
manure
Green manure
(legume based)
Conventional
Kako lahko ločimo
d15N
bu
lk
Paolini et al., JAFC 25, 5841-5850, 2015
Compound-specific δ15N in δ13C analize
aminokislin
Hidroliza proteinov
HCl 6M, 110°C, 24h
Derivatizacija aminokislin
GC-c-IRMS analize
Peaks: Ala (1), Val (2), Ile (3), Leu (4), Gly (5), Nleu (6), Pro (7), Thr (8), Asx (9), Glx (10), Phe
(10)
15N/14N and 13C/12C Isotopic Fingerprints
Internal
standard
Glutaminska kislina
Prva aminokislina – proizvedena iz
kopenskih rastlin
CS conventional
OSA živalski gnoj
OSB zeleni gnoj (stročnice)
d13C
Glu
(‰)
d15NGlu (‰)
ORGANSKO
KONVENCIONALNA
Multivariatna analiza δ15N and δ13C aminokislin
CS
OSB
OSA
CS conventional
OSA animal manure
OSB green manure (legume
based)
Organsko vs. konvencionalna pridelava paradižnika
CONVENTIONAL
ORGANIC
Bontempo et al., RCMS 25, 899-909, 2011
Nacionalni in mednarodni projekti v teku
Program pametne specializacije: Živila prihodnosti,
koordinator Žito d.o.o.,
pristnost surovin - Frutarom Etol
MASSTWIN – Spreading excellence and widening
participation in support of mass spectrometry and
related techniques in Health, the Environment, and Food Analysis - Fondazione Edmund Mach di San Michele all'Adige
REALMed – Pursuing authenticity and valorization of
Mediterranean traditional products - tartufi
The Use of Stable Isotopes and Elemental Composition
for Determination of Authenticity and Geographical
Origin of Milk and Dairy Products
ARIMNet
IAEA
Stabilni izotopi pomembno
orodje za določanje pristnosti in
sledljivosti živil
Hvala za vašo pozornost!