jornada epa - mª isabel prieto

HERRAMIENTAS PARA LA DETECCIÓN DE ALÉRGENOS: ESTADO ACTUAL, RETOS Y NECESIDADES

ACTUACIONES DEL CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN

CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN

Mª Isabel Prieto SantosServicio de Biotecnología

Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos FIAB Madrid, 18 de octubre de 2016

CentroNacional deAlimentación

Métodos de detección de alérgenos Características y limitaciones

Posibles soluciones Retos Conclusiones

Índice:

Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB , Madrid 18 de octubre de 2016


REGLAMENTO (UE) Nº 1169/2011 (Anexo II): Sustancias que causan alergias o intolerancia:

Cereales con glutenCrustáceos

Huevos Pescado Cacahuetes

Soja Leche Frutos de cáscaraApio Mostaza

Sésamo Sulfitos Altramuces Moluscos



Estado ActualLimitaciones en la aplicación de la legislación UE en el etiquetado de alérgenos

• Falta de criterios normativos para la detección (Métodos de detección)

• Falta de umbrales de alérgenos (Límite de detección)

Involuntaria - Contaminación cruzada Excesivo etiquetado de precaución, sin relación con el riesgo real:

´puede contener trazas de …‘producido en una fabrica que utiliza….…



Detección de ADN del alimento alergénico

Métodos inmunológicos

Métodos Cromatográficos

Métodos de Análisis de Alérgenos

Métodos Biología Molecular

Detección proteína o proteínas alergénicas

Detección proteína o fracciones de proteínas (péptidos)

Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB. Madrid 18 de octubre de 2016


Métodos Inmunológicos: La mayoría de los kits comercialesdisponibles para el análisis en rutina de alérgenos de alimentos sebasan en métodos inmunológicos. Los Ensayos inmunoenzimático(ELISA) son los más ampliamente utilizados debido a que sonsensibles y específicos para la detección de proteínas alergénicas yfáciles de usar.Sin embargo, los kits comerciales para análisis cuantitativos utilizandiferentes tampones de extracción y diferentes calibrantes, sediferencian en la calidad de los anticuerpos utilizados y losresultados varían entre marcas comerciales y lotes.Las principales limitaciones incluyen efectos de la matriz, laextracción insuficiente de la proteína, la insuficiente especificidaddebido a reacciones cruzadas y la insuficiente reproducibilidad delos resultados.

Scientific Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes, EFSA Journal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf

Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016


Métodos basados en la detección de una o más proteínas o fragmentos proteicos (alérgeno), mediante la uniónespecífica antígeno-anticuerpo

Métodos Inmunológicos

Enzimoinmunoensayo ELISA

TIRAS Inmunoreactivas (LFD)



Características de los sistemas Inmunológicos

• Alta sensibilidad• Cuantitativos• Aplicación Materias Primas y

Producto Procesado• Equipamiento: Lector de microplacas• Experiencia su realización

• Muy sencillos• Cualitativos/semicuantitativos• Rápidos ( 5-10 minutos)• Útiles “Control de Riesgo” (APPCC)• Materias primas• Sensibilidad declarada

(entre 1 mg/kg - 10 mg/kg )• Requieren confirmación

ELISATiras (FDL)

• Detectan Proteínas Alergénicas• Especificidad• Sensibilidad• Fácil Realización• Gran disponibilidad en el mercado



Limitaciones analíticas de los Métodos Inmunológicos-1

Extracción de proteínas alergénicas

Efecto de la matriz (grasas, taninos, acidez, etc...)

Efecto del procesado (tratamiento térmico, hidrólisis, fermentación etc…)

Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB.. Madrid 18 de octubre de 2016


1.‐ Solución Cocktail con Etanol al 80% ‐‐ 2.‐ Solución de Guanidina / ‐mercaptoetanol / Isopropanol ‐‐3.‐ Solución 1 con Gelatina de pescado ‐‐ 4.‐ Solución 1 con leche desnatada

Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB.. Madrid 18 de octubre de 2016

Estudio del efecto de los taninos de la fruta (CNA)

Matriz ricas en taninosMatriz libre de taninos

mg/kg de gluten


▄ Sin desengrasar▄ Desengrasado

Efecto del pH en la detección de huevo en salsas

▄ pH ácido▄ pH neutro

Determinación de caseína



Diferencias de los Resultados en los distintos sistemas ELISA

Detectan diferentes proteínasDiferente anticuerposDiferentes calibrantes Diferentes unidades de expresión de resultadosDiferencia en los límites de detecciónVariación entre marcas comerciales y lotes

Limitaciones analíticas de los Métodos Inmunológicos-2



0

5

10

15

20

25

30

35

Cac

ahue

te (m

g/kg

)

BioKits Romer Labs R-Biopharm Neogen

Resultados diferentes ELISAS

FAPAS Proficiency Test 2776C

FAPAS 2776‐ C Cacahuete en chocolate

•Biokits 11,8 mg/kg• Romer Labs 8,7 mg/kg• R‐Biopharm 24,2 mg/kg • Neogen 15,0 mg/kg

Valor asignado:



TEPNEL BIOKITSAgraQuant®

A B C DHuevo 0,4 mg/kg 0,25 mg/kg 0,5 mg/kg 1 mg/kg

Caseína 0,2 mg/kg 0,25 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg

Β-lactoglobulina 10 μg/kg 0,2 mg/kg 5 mg/kg 0,1 mg/kg

Soja 40 μg/kg 0,3 mg/kg 2,5 mg/kg 2,5 mg/kg

Cacahuete 1 mg/kg 1,5 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg

Diferente LD/LC



β-lactoglobulina en un alimento :

Sistema A : < 10 µg/kgSistema C: < 5 mg/kg

RESULTADO : NO DETECTADO

Cacahuete en un alimento (1,5 mg/kg) :

Sistema A (LC 1 mg/kg): 1,5 mg/kg Sistema C (LC 2,5 mg/kg): < 2,5 mg/kg ?

DETECTADO NO DETECTADO

ETIQUETAR

NO ETIQUETAR

Ejemplos :

Qué pasa entre 10 µg/kg y 5 mg/kg ???



rente expresión de resultados

función de la solución calibrante utilizada

s sistemas proponen conversiones en la expresión de resultados

HUEVO LECHE CACAHUETE huevo entero en mg/kg proteína de leche cacahuete

proteína clara de mg/kg leche entera en polvo

Proteína de cacahuete

ovomucoide mg/kg caseína

mg/kg β lactoglobulina


ción de muestras fortificadas con NIST SRM 8445

Comparativo kits ELISA Determinación de huevo

RAS Valor Esperado mg/kg

1 2 3 4mg/kg (ppm) proteína

clara de huevomg/kg (ppm) mg/kg (ppm) mg/kg (ppm)

Huevo entero en polvo Huevo entero en polvo Huevo entero en polvo

do 1,5 0,53 3,4 1,72 1,6

a 1,5 0, 75 2,4 1,7 1,6

do 3 1,1 5,6 3,15 4

a 3 1,21 6,8 3,05 3

do 6 3,2 9,5 6,1 5,6


o Comparativo kits ELISA Determinación de Avellana1 2 3 4LC LC LC LC

z ETIQUETADO0,5 mg/kg de Proteína de avellana

1 mg/kg de Avellana

2,5 mg/kg de Avellana

2,5 mg/kg de Avellana

NO ETIQUETADO > 5 mg/kg 35 mg/kg 15,5 mg/kg > 20 mg/kg

inasNO ETIQUETADO 0,7 mg/kg 2,9 mg/kg 4,9 mg/kg 8,3 mg/kg

Avellana 2% NO DETECTADO NO DETECTADO 3,6 mg/kg NO DETECTADO

Rastros de avellana NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO

Puede contener trazas de nueces, almendras y soja

NO DETECTADO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO

Trazas de frutos secos NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO

d


s Indirecto : Amplificación de un fragmento del gen del alérgeno o na secuencia genética específica presente en el Alimento o ente

aciónados

PCR tiempo final

odos Biología Molecular


R tiempo real


os basados en la detección de ADN permiten laón del alimento alergénico, en lugar de la proteína

nica y son complementarios a ensayos inmunológicos. ADNeralmente más estables que las proteínas y por lo tantodo para el análisis de alimentos procesados. Losimientos de extracción y amplificación están biencidos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tanto afinal como en tiempo real permiten el análisis que varios

nos a la vez. El análisis del ADN se convierte en el método den siempre que no están disponibles kits de ELISA o no seanicos para el análisis de un alimento alergénico/ingredienteico (por ejemplo el apio). PCR en tiempo real puedecionar resultados cuantitativos y permite el análisis de

kit i l tá di ibl

Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes, nal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf


blemas en la extracción (presencia de inhibición en mentos procesados)ultados cualitativos / semicuantitativos

• Cuantificación ng ADN (número de copias)unos alérgenos no pueden diferenciarse por PCR Carne vacuno /lecheaves /huevo

rente distribución entre ADN y proteína ADN en baja concentración, leche, proteína de clara de huevo,concentrados de proteína: Falsos negativos

ciones analíticas de los métodos biológicos:


AD DE MEDIDA/EXPRESIÓN DE RESULTADOS

PROTEÍNAS ADN

Cantidad de ADN (nº de copias) detectado

dad de ingrediente énico o proteína énica por kilo de ento (mg/kg)

No se puede establecer una correlación entre cantidad de PROTEÍNA y cantidad


SULTADOS PCR

stras fortificadas con 5 mg/kgde Soja

Bollería Líquidos Salsas Postres


ación ELISA/PCR sobre muestras reales (Detección de Avellana)

MUESTRAS ELISA (mg/kg) PCR Bollo 8 DETECTADOGalleta de chocolate > 20 DETECTADOGalletas < 2,5 NO DETECTADOBombón > 20 DETECTADOTurrón de cacahuete < 2,5 DETECTADOCereales de trigo y chocolate > 20 DETECTADOBarrita de cereales > 20 DETECTADOMuesli > 20 DETECTADOBarrita de trigo y chocolate > 20 DETECTADOCereales Fruta y fibra > 20 DETECTADOBarquillo relleno de cacao > 20 DETECTADOBizcocho cubierto de chocolate < 2,5 NO DETECTADOCopos de maíz < 2,5 NO DETECTADODesayuno a la taza < 2,5 NO DETECTADOGalleta < 2 5 NO DETECTADO

RAS DUDOSAS ontener trazas avellana)

UESTRAS VAS (No figura

RAS POSITIVAS avellana como rediente)


LC MS/MS

NAica

Digestión Enzimática

IONES:dificultad analíticaAS :dianas en un único análisis

Péptidos

Cromatografía:HPLCLC MS/MS

odos Cromatográficos


Qué queremos detectar ?• Detección del ingrediente:

Alimento

• Detección del alérgeno:Proteína alergénica

ción de un Método de análisis

do analizar? cto final: Cumplir la Legislación ia Prima: Identificar alérgenos

- Suficiente para cumplirla legislación

-Más información para el paciente


o de matriz- Matriz grasa ADN X ELISA

- Productos hidrolizados ADN ELISA X

uraleza del alérgeno buscado

Apio

S

vamos a analizar?

ADN I ifi id d


ETOS O DESAFIOS:

Determinar umbrales tóxicos

Materiales de Referencia Certificados

EuroPrevall

VITAL


SPONIBILIDAD MATERIALES DE REFERENCIA

: MR disponibles

Alérgeno MATERIAL PROCEDENCIA CERTIFICACION

Huevo RM 8445 ( Whole egg powder) NIST Contenido proteico (ELISA)

mina/Gluten PWG standar Prolamin Group Alérgeno

Leche BCR-638 IRMM Contenido proteico


al de Referenciancipal problema para la cuantificación de alérgenos poros inmunológicos, espectrometría de masas o los métodoss en ADN es la falta de disponibilidad de materiales decia certificados (MRC).les de referencia (no certificados) desarrollados por diferentestores están disponibles comercialmente para los alérgenostarios más importantes, pero los resultados obtenidos puedencomparables.equiere la disponibilidad de MRC para laificación de alérgenos alimentarios.

Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes, nal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf


les soluciones

Muestras Fortificadas: muestra preparada por adición de una determinada cantidad de alérgeno

obrantes de ensayos de intercomparaciónValor de Referencia : Valor Asignado en el ensayo

(Con cada Kit ???)

tilización de reactivos químicos (cuando el alérgeno exista reactivo, Proteína purificada ej. caseína, β-lactoglobulina, etc…)

tilización del alimento alergénicoreparación de muestras control: Valor teórico

“Incurred”: muestra adicionada y sometida


QUETADO PRECAUTORIOaración voluntaria que usan los fabricantes en lasetas de los alimentos que indica la presenciancial y no intencionada de un alérgeno

77 % ‐ Puede contener trazas de…….6 % ‐ Puede contener indicios de….13 % ‐ Elaborado en fábrica que utiliza……3 % ‐ Aroma de …..

uestras analizadas con etiquetado precautorio:


BGL 28%

Caseína 39%

Avellana60%

Cacahuete

Huevo10%

Apio 13% Soja 30%

Total Muestras analizadas

Muestras Positivas %

18 5 28a 18 7 39a 10 6 60ete 18 4 22

10 1 108 1 1310 3 30


IÓN INTERNA :firmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se los requisitos particulares para un uso especifico previsto (Norma UNE/IEC 005)

o garantizar los resultados ?

Comprobarresultadospor el

sonbles en elo

• repetibilidad• Reproducibilidad

PRECISIÓN DEL MÉTODO

• Comprobar en distintas matrices• Aceptable (Recuperación 80% ‐120%)

EXACTITUD DEL MÉTODO

• LD Límites de detección• LC Límites de cuantificaciónLD/LC


nización de los métodos de detección

UNE‐ EN 15633‐1:2009. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos mediante métodos inmunológicos‐Parte 1: Consideraciones generales”

UNE‐ EN 15634‐1:2009. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos mediante métodos de biología molecular‐Parte 1: Consideraciones generales”

UNE‐ EN 16388 IN‐:2012. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos alimenticios. Formato para proporcionar información sobre métodos inmunológicos y métodos de biología molecular ”

DACION DE MÉTODOS POR ORGANISMOS INTERNACIONALES

UNE‐ EN 15842:2010. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos Consideraciones generales y Validación de métodos”


clusiones /Necesidades

eación de un Laboratorio Europeo de eferencia. Armonizar métodostablecer Umbrales de toxicidad / Límites gales ateriales de referencia


Muchas Gracias

Servicio de Biotecnología ‐ CNAMª Isabel Prieto Santos [email protected]ª del Camino Martín‐Forero Buendía [email protected]

jornada epa - mª isabel prieto

Food