karakterisasi dan pemurnian xilanase dari bakteri rayap reticulitermes santonesis
DESCRIPTION
Seminar Tugas Akhir 26 Mei 2010. KARAKTERISASI DAN PEMURNIAN XILANASE DARI BAKTERI RAYAP Reticulitermes santonesis. Gde Sutawijaya Pembimbing : Zeily Nurachman , D.Sc. Institut Teknologi Bandung. Agenda Presentasi. Pendahuluan Tinjauan Pustaka Metodologi Hasil Kesimpulan. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
KARAKTERISASI DAN PEMURNIAN XILANASE DARI BAKTERI RAYAP Reticulitermes santonesis
Gde SutawijayaPembimbing: Zeily Nurachman, D.Sc
Institut Teknologi Bandung
Seminar Tugas Akhir26 Mei 2010
Agenda Presentasi
• Pendahuluan• Tinjauan Pustaka• Metodologi• Hasil• Kesimpulan
Pendahuluan
• Adanya kemampuan hemiselulotik dari rayap• Kebutuhan akan adanya agen bleaching kertas
yang ramah lingkungan• Kebutuhan energi yang meningkat
Tujuan
• Mengekstraksi xilan dari tongkol jagung• Memproduksi enzim xilanase menggunakan
substrat xylan tongkol jagung• Memurnikan enzim xilanase menggunakan
FPLC dengan kolom DEAE
Tinjauan Pustaka
Xilanase (EC 3.2.1.8)
Xilanase menghidrolisis ikatan (1->4)-beta-D-xylosidic pada xilanXilanase menghasilkan xiloligosakarida dan xilosa
Tinjauan Pustaka
Tinjauan Pustaka
Kandungan tongkol jagung : selulosa 44,9%, hemiselulosa (31,8%), dan lignin 23,3%, dan komponen lainnya (Titi Sunarti (IPB) dan Nur Richana (BB Pasca Panen Pertanian)).
Tongkol jagung
Metodologi
• Persiapan tongkol jagung• Ekstraksi xilan dari tongkol jagung• Produksi xilanase• Pemurnian xilanase• Karakterisasi xilanase
MetodologiTongkol jagung
Kering
Tongkol jagung yang telah dipotong
Tongkol Jagung halus
Dipotong kecil-kecil
Digiling
1. Persiapan tongkol jagung
Metodologi
Delignifikasi dengan NaOCl 1% (10:1), 5 jam,
suhu kamar
Ekstraksi xilan menggunakan NaOH
Padatan diambil, dan dikeringkan
Supernatan diambil dengan cara sentrifugasi
filtrasi
Pengasaman dengan HCl
2.Ekstraksi xilan dari tongkol jagung
Metodologi
Xilan dikeringkan
dihaluskan
Xilan
Metodologi3.Produksi xilanasePembuatan media padat dan cair
• 1.Komposisi media padat• K2HPO4 1,5%• MgSO4.7H2O 0,025%• NaCl 0,25%• NH4Cl 0,5 %• NH4PO4 0,5 %• Yeast 0,2%• Xilan 0.5%• Bacto agar 2% • 2. Media cair untuk produksi enzim • Komposisi • K2HPO4 1,5%• MgSO4.7H2O 0,025% • NaCl 0,25% • NH4Cl 0,5%• NH4PO4 0,5 %• Yeast 0,2% • Xilan 0,5%
Metodologi
• Penanaman bakteri/pembuatan koloni tunggal
Metodologi
20 mL kultur starter dishaker selama 12 -15 jam pada 150 rpm, 37°C, setelah itu dimasukan ke dalam media produksi enzim 200 mL (dalam erlenmeyer 1L). Media produksi di-shaker dalam 20 jam pada
150 rpm, 37°C. Enzim yang dipanen disentrifuga pada 5000 rpm untuk menghilangkan debris sel
Produksi xilanase
Fraksinasi Enzim dengan (NH4)2SO4
Enzim hasil dialisis
Padatan Supernatan
Crude Enzim Xylanase 1L
*Diresuspensi dengan buffer tris-HCl pH 8.0 20 mM* Didialisis
+106g(NH4)2SO4 (Fraksi 0-20)*Disentrifugasi pada 11000 rpm, 30 menit
Tujuannya untuk mengendapkan protein dengan prinsip salting out
Dialisis
Dialisis bertujuan untuk membersihkan amonium sulfat dari protein, prinsipnya dengan perbedaan konsentrasi, dimana konsentrasi garam di dalam membran lebih besar daripada di luar membran
FPLC
Fast Performance Liquid Chromatography Merupakan pemisahan dengan memanfaatkan
perbedaan migrasi suatu dari senyawa pada fasa diam dan fasa gerak. Digunakan kolom penukar anion DEAE-Sepharosa yang bekerja berdasarkan perbedaan muatan dalam protein
Uji Aktivitas Xilanase Dari Bakteri Rayap
Pembuatan DNS0,05 gr DNS ditimbang dan dilarutkan dalam 25 ml NaOH 2 M, ditambahkan Na-K
tartarat 15 gram, diencerkan dengan aqua dm hingga 50 ml, dan disimpan dalam suhu 4⁰C.
Pembuatan Enzim Sampelenzim 50 µL dan substrat 450 µL diinkubasi pada 60oC selama 5 menit. Kemudian
ditambah dengan DNS 500 µL dan diinkubasi di dalam air mendidih 5 menit Pembuatan Enzim Kontrolsubstrat 450 µL dan diinkubasi pada 60oC selama 5 menit kemudian dicampurkan
dengan DNS 500 µL dan ienzim 50 µL, dan diinkubasi di dalam air mendidih 5 menit
Hasil
• Kromatogram dari FPLC• Aktivitas enzim• Kadar protein
Puncak-puncak kromatogram menunjukan adanya aktivitas enzim
Uji Aktivitas dengan metoda gula pereduksi (reagen DNS)
Sampel A1 A1 A3 Median Faktor
Pengenceran Akktivitas
(U)
fraksi 24 0.02 0.014 0.018 0.017 51.89 6.77 kali 1.381 9.349
fraksi 23 0.008 0.012 0.009 0.01 50.61 6.77 kali 1.347 9.119
fraksi 11 0.164 0.179 0.172 0.172 77.61 6.77 kali 2.065 13.98
Fraksi 7 0.621 0.646 0.626 0.631 154.2 6.77 kali 4.103 27.78
Crude 0.71 0.68 0.69 0.693 164.66.77 kali 4.379 29.65
Dialisis 1 0.624 0.61 0.01 0.415 118.1100 kali 3.143 314.3
Terjadi peningkatan aktivitas setelah fraksinasi 0-20% sebesar 10,8 kali
Penentuan kadar protein
0 5 10 15 20 250
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
f(x) = 0.0156190476190476 x + 0.00158730158730153R² = 0.998688021387727
Kurva standar bradford
Series1Linear (Series1)
Konsentrasi proten (µg/ml)
Absorban
Penentuan kadar protein
Konsentrasi protein A1 A2 A3 A
4 0.072 0.07 0.078 0.071
8 0.121 0.119 0.12 0.12
12 0.189 0.191 0.188 0.189
16 0.238 0.25 0.268 0.252
20 0.328 0.311 0.305 0.315
Ekstrak kasar = 1.00 = 66 µg/mLFraksi 6 = 0.113 = 7,2 µg/mLFraksi 7 = 0.14 = 9 µg/mL
Pembahasan
Puncak-puncak pada kromatogram menunjukan adanya aktivitas enzim, namun untuk memastika nenzim tersebut adalah xilanase, perlu diuji dengan metoda DNS. Sebelumnya juga telah diuji aktivitas xilanase terhadap tongkol jagung, dan ternyata xilanase ini tidak dapat menguraikan tongkol jagung mentah
Kesimpulan
• Aktivitas xilanase dari bakteri rayap tergolong besar
• Dari data bisa dilihat bahwa terjadi peningkatan aktivitas dengan fraksinasi amonium sulfat.
Ucapan Terimakasih
• Pak Zelly, teh Inda, bu Iis, pak Yayat, kak Edo untuk bimbingan dan motivasinya
• Teman-teman 2006 sebimbingan, Tita, Ricky, Asro
• Teman-teman kimia untuk bantuan dan semangatnya
• Peserta seminar ini
Diskusi
Knowledge only gained through coriousity