Syto- ja molekyyli-

genetiikka perinteisen

patologian tukena

täsmentää

histopatologista

luokitusta joissakin

tilanteissa. Erityisesti

hematologisissa

maligniteeteissa ja

sarkoomissa on

sytogeneettisiä ja

molekulaarisia

muutoksia, joilla on

itsenäistä kliinistä

merkitystä. Geenien

toimintaa laaja-

alaisesti mittaava

mikrolevyanalytiikka

avaa uusia näköaloja

histologisesti

yhtäläisten syöpä-

tyyppien jaotteluun

ennusteen tai

hoitovasteen suhteen

erilaisiin geeni-

ekspressioryhmiin.

S yto- ja molekyyligeneettistenmenetelmien kehitys on ollutnopeaa viime vuosien aikana.

Fluoresoivien koettimien käyttö insitu -hybridisaatiossa ja digitaalinenkuvankäsittely ovat tarkentaneet,täsmentäneet ja ennen muuta herkis-täneet perinteistä kromosomiraitoi-hin perustuvaa sytogeneettistä tutki-musta. Perinteisessä sytogenetiikassaon tutkittavien solujen oltava mitoo-sissa ja tutkimuksen työläydenvuoksi voidaan yleensä analysoidavain 20 solua (herkkyys kärsii) japoikkeavuuksien yksityiskohtainentulkinta on hankalaa. Näiden rajoi-tusten vuoksi menetelmästä on hyö-tyä lähinnä hematologisten maligni-teettien ja sarkoomien diagnostiikas-sa. Syto- ja molekyyligeneettiset tut-kimukset varmentavat ja täsmentä-vät leukemioiden ja myös lymfoo-mien ja sarkoomien diagnostiikkaaja ennusteen arviointia, ja menetel-millä on erityinen merkitys taudinseurannassa.

Tässä katsauksessa tarkastelenuuden sytogenetiikan ja molekyyli-genetiikan hyötyä ensisijaisesti lym-foomien ja sarkoomien valossa. Tar-kastelu pohjautuu paljolti vuosienkuluessa rakennetun syto- ja mole-kyyligenetiikan (CMG) laboratorionkokemuksiin. Kuva 1 esittää syto- jamolekyyligeneettisten menetelmienviimeaikaisen kehityskulun. Portai-kon menetelmät ovat rutiininomai-sesti käytössä HYKS-Laboratorio-diagnostiikan CMG-laboratoriossa.

KROMOSOMIRAITA-TUTKIMUS,TRANSLOKAATIONPALJASTAVA MENETELMÄ

Kromosomiraitoihin perustuva me-tafaasivaiheisten kromosomien mor-fologinen tutkimus on perusmene-telmä, joka paljastaa sekä lukumää-räiset että rakenteelliset kromoso-

mien poikkeavuudet (kuva 2). Ra-kenteellisista poikkeavuuksista dia-gnostiikan kannalta keskeisimpiäovat kromosomien translokaatiot.Näillä poikkeavuuksilla on hämmäs-tyttävä syöpätyyppispesifisyys. Mo-net leukemioiden spesifisistä trans-lokaatioista ovat niin merkittäviä, et-tä leukemioita jo puolittain luokitel-laan translokaatioiden mukaisesti:Philadelphia- (9;22-translokaatio),15;17-translokaatio- tai 8;14-translo-kaatio-positiiviset leukemiat. Taulu-kossa 1 on esitetty lymfooma- ja sar-koomaspesifisiä translokaatioita.Hodgkinin taudissa ei toistaiseksitunneta erityisen spesifisiä kromoso-mipoikkeavuuksia. Sarkoomat jakau-tuvat spesifisten poikkeavuuksiensuhteen kahtia siten, että joissakinalatyypeissä on hyvinkin spesifisiätranslokaatioita (taulukko 1), kuntaas joissakin, esimerkiksi osteo- jakondrosarkoomassa sekä malignissafibroosisessa histiosytoomassa ja leio-myosarkoomassa, ei tyyppipoikkea-vuuksia todeta.

Useimpien translokaatioiden mo-lekulaarinen tausta on selvitetty.Translokaatiossa kromosomin osienvaihtaessa paikkaansa tapahtuu gee-nien uudelleenjärjestymistä. Geeni-fuusiossa aktivoituu useimmiten so-lun kasvua, DNA:n kahdentumista,transkriptiota, solusykliä tai solu-kuolemaa säätelevä geeni. Lymfaat-tisten kasvainten kohdalla toisenaosapuolena on useasti jokin immu-noglobuliini- tai T-solureseptorigee-neistä: B-soluisessa maligniteetissayleensä immunoglobuliinigeeni ja T-soluisessa T-solureseptorigeeni.Näyttää siltä, että sellainen antigee-nireseptorigeeni, joka on aktiivinen(tapahtuu normaalifysiologista uu-delleenjärjestymistä), on osallisenatranslokaatiossa aktivoimalla so-luonkogeenin. Antigeenireseptori-geenin muodostamat geenifuusiot

1831S U O M E N L Ä Ä K Ä R I L E H T I 1 7 / 2 0 0 0 V S K 5 5

LÄ

ÄK

ET

IE

DE

Sytogenetiikka ja molekyylipatologiasyöpätautien diagnostiikassa

– esimerkkeinä lymfoomat ja sarkoomat

S A K A R I K N U U T I L A

K a t s a u s a r t i k k e l i

rajoittuvat lymfaattisiin maligniteet-teihin eikä lymfaattisen malignitee-tin geenifuusiossa ole aina osallisenaantigeenireseptorigeeni.

KROMOSOMI-TRANSLOKAATIO DNA- JA RNA-TUTKIMUKSESSA

Kromosomitranslokaatioiden aiheut-tamat geenifuusiot voidaan todetaSouthern blotting -hybridisaa-tiomenetelmällä ja käänteistran-skriptaasipolymeraasiketjureaktio-eli RT-PCR-menetelmällä. Southernblottingissa sopivilla DNA:ta pilkko-villa entsyymeillä fuusiogeenistäpilkkoutuu normaaliin geeniin ver-rattuna poikkeavan kokoinen DNA-pätkä, joka voidaan havaita geenintunnistavalla koettimella elektrofo-reesiajon jälkeen (1) (kuva 3).

Molekyylitasolla geenifuusionsyntyessä DNA:n katkoskohdat vaih-televat potilaasta toiseen siinä mää-rin, ettei PCR:ssa yhdellä eikä edesmuutamalla alukeparilla pystytä jäl-jittämään eikä monistamaan fuusio-aluetta. DNA:ta ei tällöin voida käyt-tää tutkimuksessa. Sen sijaan RNA:nsyntyessä DNA:sta pilkkoutuvat ei-koodaavat intronialueet pois, jotenlyhyempään RNA:han voidaan ra-kentaa fuusiokohdan tunnistavatalukkeet. RNA:n hajoamisen vuoksitutkimuksessa käytetään RNA:stakäänteiskopioijaentsyymillä (reversetranscriptase) rakennettua komple-mentaarista DNA:ta (cDNA).

Follikulaarisen lymfooman 14;18-translokaation aiheuttamassa IGH-BCL2-geenifuusiossa katkoskohdateri potilailla rajoittuvat lähinnä kah-delle suppealle alueelle, jolloinPCR:lla voidaan kahta erillistä alu-keparia käyttämällä tunnistaa fuu-sioalue suoraan DNA:sta (kuva 4) yli80 %:lta kaikista translokaatioposi-tiivisista potilaista (1).

Näitä DNA- ja RNA-menetelmiäkäytetään diagnostiikan tukena ta-vanomaisen kromosomiraita-analyy-sin tuloksen mukaan. Tärkeää on ai-na pakastaa näytettä –80 °C:n läm-pötilaan, jotta tutkimus voidaan tar-vittaessa tehdä myöhemmin. Etenkinsilloin, kun taudin seurannassa tuleetarve käyttää geenifuusiota, on seu-rannan välttämättömänä perustana,että diagnosointihetken näytteestäon osoitettu geenien uudelleenjärjes-tymä eli geenifuusio.

RNA:n eristäminen ei ole nykyi-sin hankalaa, mutta se edellyttää

1832 S U O M E N L Ä Ä K Ä R I L E H T I 1 7 / 2 0 0 0 V S K 5 5

LÄ

ÄK

ET

IE

DE

Taulukko 1. Lymfoomien ja sarkoomien toistuviakromosomipoikkeavuuksia.

Syöpätyyppi Kromosomipoikkeavuus Geenimuutos1

LymfoomatBurkitt t(8;14)(q24;q32) CMYC;IGH (80 %)B-solu t(14q32), t(2p12), t(22q11) IGH, IGK, IGLManttelisolu t(11;14)(q13;q32) BCL1;IGH

del(11q22) ?Pienilymfosyyttinen t(9;14)(p13;q32) ?; IGH

+12 ?MALT t(11;18)(q21:q21) API2;MLTFollikulaarinen t(14;18)(q32;q21) IGH;BCL2Ki-1 t(2;5)(p23;q35) ALK;NPMPlasmasolu t(14q32) IGH

del(13q) ?T-solu t(7q34), t(14q11), t(7p15) TCRB, TCRD, TCRG

SarkoomatOsteosarkooma kompleksinenKondrosarkooma useitaEkstraskeletaalinen

kondrosarkooma t(9;22)(q22;q12) CHN;EWSt(9;17)(q22;q11) CHN;TAF2N

Ewingin sarkooma t(11;22)(q24;q12) FLI1;EWS (n. 90 %)t(21;22)(q22;q12) ERG;EWS (n. 5 %)t(7;22)(p22;q12) ETV1;EWS (< 5 %)t(2;22)(q33;q12) FEV;EWSt(17;22)(q12;q12) EIAF;EWS

Lipooma t(3;12)(q27-29;q14-15) LPP;HMGICNeurilemmooma del(22q) BCH (puutos)Dermatofibrosarkooma t(17;22)(q22;q13) COL1A1;PDGFBKirkassolusarkooma (clear cell) t(12;22)(q13;q12) ATF1;EWSDesmoplastinen pieni

pyöreätumainen t(11;22)(p13;q12) WT1;EWSJuveniili fibrosarkooma t(12;15)(p13;q25-26) ETV6;NTRK3Leiomyosarkooma kompleksinenMyksoidinen liposarkooma t(12;16)(q13;p11) CHOP;FUS (n. 90 %)

t(12;22)(q13;q12) CHOP;EWS (n. 5 %)MFH (maligni fibroottinen

histiosytooma) kompleksinenAlveolaarinen rabdomyo-

sarkooma t(2;13)(q35;q14) PAX3;FKHR (n. 70 %)t(1;13)(q36;q14) PAX7;FKHR (n. 5 %)

Synoviaalisarkooma t(X;18)(p11;q11) SYT;SSX1, SSX2Alveolaarinen pehmytosa-

sarkooma t(X;17)(p11;q25) ?Aneurysmaattinen luukysta t(16;17)(q22;p13) ?

1puolipiste erottaa geenifuusioon osallistuvat geenit; t = kromosomien translokaatio; del = kromosomideleetio

Tuumori-mikrolevytesti/Syöpägeenienkliinisen merkityksen selvittäminen

cDNA-mikrolevytesti/Syövän molekulaarinen luokittelu

PCR/Luuytimensiirronjälkeinen kimerismi

24-väri-FISH/Perusmenetelmän täydentäminen

VGH/Perusmenetelmän täydentäminen

Geenifuusion osoittaminen PCR:llä/Jäännöstauti

FISH/Jäännöstauti

Southern blotting/Antigeenireseptorien klonaliteetti

Geenifuusion osoittaminen Southern blottingilla/Kromosomitranslokaation varmentaminen

MAC/Immunofenotyypin yhdistäminen/Linjaspesifisyyden osoittaminen

Kromosomien raidoitus/Perusmenetelmä

2000–01

2000–01

1999

1999

1994

1993

1990

1984

1984

1982

1979

Kuva 1. Syöpätautien syto- ja molekyyligeneettinendiagnostiikkaportaikko HYKS-Laboratoriodiagnostiikassa.

1833S U O M E N L Ä Ä K Ä R I L E H T I 1 7 / 2 0 0 0 V S K 5 5

LÄ

ÄK

ET

IE

DE

Kuva 2. Epätyypillisellä (follikulaarisen lymfooman piirteitä) Burkittinlymfoomapotilaalla todettu kromosomipoikkeavuus imusolmukkeensoluissa. Nuolet osoittavat Burkittin lymfoomaan liittyvän 8;22-translokaation ja follikulaarisen lymfooman 14;18-translokaation. Lisäksikromosomi 1 on poikkeava ja kromosomi 7 on ylimääräinen.Karyotyyppipoikkeavuus merkitään: 47,XX,add(1)(q32),+7,t(8;22)(q24;q11),t(14;18)(q32;q21).

Kuva 3. Autoradiografian antamatulos Ph-translokaation DNA-analyysista. Näytteissä 4, 5 ja 8(kroonista myelooista leukemiaasairastavia potilaita) nähdäännormaali BCR-signaali sekämuuttuneet BCR-signaalit, jotkaon merkitty kuvaan nuolilla.Näytteissä 1–3 ja 6–7 (akuuttiamyelooista leukemiaa sairastaviapotilaita) nähdään ainoastaannormaali BCR-signaali. KustannusOy Duodecimin luvalla (1)

Kuva 4. Seitsemän lymfooma-potilaan imusolmukenäytteidentutkiminen PCR-menetelmälläpääkatkosalueen (MBR) alukkeilla(kaistat 1–7). Kahdeksas näyte onnegatiivinen reagenssikontrolliilman DNA:ta, ja laitimmaisenkaistan juovat ovat DNA-fragmenttien kokoa ilmaiseviaverrokkeja. Näytteissä 1, 4 ja 6on uudelleenjärjestymäjuova.Kustannus Oy Duodecimin luvalla (1)

kasvainbiopsian nopeaa (alle 2 tun-tia) kuljettamista laboratorioon.Luuydinnäyte tulee ottaa RNA:n ha-joamista estävään liuokseen.

9;22-Philadelphia-translokaati-oon ja 11;22-Ewing-translokaatioonliittyviä ABL/BCR- ja EWS/FLI1-fuu-siogeenejä tutkitaan HYKS:n CMG-laboratoriossa ensisijaisesti RT-PCR-menetelmällä ja tarvittaessa Sout-hern blotting -menetelmällä. 14;18-translokaatioon liittyvä IGH/BCL2-fuusiogeeni tutkitaan DNA:sta her-kennetyllä polymeraasiketjureaktiol-la (nested PCR).

DNA- JA RNA-TUTKIMUSPALJASTAA KLONAALISENSOLUKON LYMFAATTISISSAMALIGNITEETEISSA

Southern blotting- ja RT-PCR-ana-lyyseillä voidaan siis todeta spesifi-nen kromosomipoikkeavuus ja sii-hen liittyvä geenien uudelleenjärjes-tyminen. Muista kuin kromoso-mitranslokaatioiden aiheuttamistageenitason muutoksista kliinistämerkitystä on immunoglobuliini- jaT-solureseptorigeenien normaaliinfysiologiaan liittyvällä uudelleenjär-jestymisellä. Vaikka viime aikoinaon kuvattu valtava määrä erilaisiageenimuutoksia erityyppisissä syö-

Antigeenireseptorigeenin uudel-leenjärjestymän osoittamisessa voi-daan käyttää myös PCR-menetelmää,joko suoraan DNA:sta tai cDNA:sta.DNA:n PCR:ssa tarvitaan useita alu-kepareja, jotta uudelleenjärjestymävoidaan löytää, ja parhaimmillaannoin 80 % uudelleenjärjestymistä onlöydettävissä.

Jotta antigeenireseptorin uudel-leenjärjestymän toteaminen RT-PCR-menetelmällä on mahdollista, on jo-kaiselle potilaalle rakennettavaDNA-sekvensointia apuna käyttäenkloonispesifiset alukkeet. Menetel-mä on vaativa ja tulkinta aiheuttaavaikeuksia; on mm. havaintoja, että

vissä, ei tämä tieto ole vielä varsinai-sesti kliinisen hyödyntämisen tasollalymfoomissa eikä sarkoomissa. Eräi-den geenien monistumisella, kutenNMYC neuroblastoomassa, ja P53-mutaatioilla erityyppisissä syövissäsaattaa olla kliinistä merkitystä. Täs-sä katsauksessa en käsittele periyty-vän rintasyövän, paksusuolen syövänenkä muiden periytyvien syöpiengeenimutaatioita ja niiden toteami-seen käytettäviä testejä; niitä on käsi-telty mm. Mecklinin ym. katsaukses-sa (2).

Immunoglobuliinigeenien ja T-so-lureseptorigeenien uudelleenjärjesty-minen kuuluu B- ja T-solujen nor-maaliin fysiologiaan (1) (kuva 5).Koska uudelleenjärjestymät normaa-listi vaihtelevat soluittain – näin taa-taan suunnaton vasta-aineiden kirjotarvitsematta tuhansia erillisiä geene-jä – ei Southern blotting -menetelmähavaitse niitä. Vain mikäli soluja,joissa on samanlainen uudelleenjär-jestymä, on vähintään 5 %, voidaanuudelleenjärjestymä todeta Southernblotting -menetelmällä. Koska lym-faattiset maligniteetit, kuten muutkinsyövät, ovat monoklonaalisia tauteja,ovat syöpäsolut samankaltaisia myösuudelleenjärjestymisen suhteen jaSouthern blottingissa voidaan todetauudelleenjärjestymäraita.

taudin edetessä uudelleenjärjestymävoi muuttua toisenlaiseksi, jolloinalun perin rakennetuilla alukkeillaei enää voidakaan todeta uudelleen-järjestymistä.

HYKS:n CMG-laboratoriossa onkäytössä Southern blotting -pohjai-nen menetelmä sekä immunoglobu-liinigeenin raskaan ketjun että T-so-lureseptorigeenin (b) uudelleenjär-jestymän katsomiseksi ja lisäksiPCR-menetelmä IGH:n uudelleenjär-jestymien katsomiseksi. Southernblottingia voidaan käyttää vain tuo-re- ja pakastusnäytteiden tutkimuk-siin, kun taas PCR-menetelmää voi-daan käyttää myös parafiinileikema-teriaaliin.

IN SITU -MONIVÄRI-FLUORESENSSI-HYBRIDISAATIO JAVERTAILEVA GENOMINENHYBRIDISAATIOTÄYDENTÄVÄTKROMOSOMIRAITA-TUTKIMUSTA

Tavanomaiseen kromosomitutki-mukseen liittyy kolme keskeistäheikkoutta: interfaasisoluja ei voidatutkia, kromosomien raidoituksenlaatu ei aina riitä kyllin yksityiskoh-taiseen analyysiin ja todettu poik-keavuus on liian monimutkainentulkittavaksi. In situ -fluoresenssi-hybridisaatiomenetelmät ja vertaile-va genominen hybridisaatio tuovatratkaisun mainittuihin ongelmiin.Ne täydentävät kromosomiraitatut-kimusta mutta eivät korvaa sitä.

1834 S U O M E N L Ä Ä K Ä R I L E H T I 1 7 / 2 0 0 0 V S K 5 5

LÄ

ÄK

ET

IE

DE

TEL

AML1

Normaali

12 12

21 21

TEL-AML1-fuusio

12 12

21 21Normaali

Vn Vn+1 Vn+2 Vn+3 Vn+4 Vn+5 Dn–n+5 J1–6 C

Vn Vn+1 Vn+2 Dn J3–6

Uudelleenjärjestymä

+

—

Uudelleenjärjestymä

Kantalinja (germ line)

Kantalinja (germ line)

A. B.C

Kuva 5 A. Hypoteettinen esimerkki yhdessä B-solussa tapahtuvasta immunoglobuliinigeenin normaalistafysiologisesta uudelleenjärjestymästä. Ylhäällä on esitetty V-, D-, J- ja C-osat IGH-geenissä ja alaosassamuokkautunut uudelleenjärjestynyt geeni. Nuolet osoittavat restriktioentsyymin katkaisukohtia. Vn, V+1 ja Vn+5 ovatviimeiset sadoista V-geeneistä, jotka ovat kromosomeissa peräkkäin. Kun solut erilaistuvat B-lymfosyyteiksi, jokinviidestä D-geenistä saa kylkiinsä yhden V-geeneistä ja yhden J-geeneistä. Tällöin välissä olevat osat häviävät.Normaalisti samalla tavalla uudelleenjärjestyneitä soluja esiintyy vain harvoin, mistä johtuen SB-menetelmänherkkyys ei riitä osoittamaan uudelleenjärjestymiä. B. Klonaaliseen yhdestä solusta lähtöisin olevaanlymfosyyttipopulaatioon viittaava uudelleenjärjestymä. Kustannus Oy Duodecimin luvalla (1)

Kuva 6. Lasten akuutin lymfaattisen leukemian yleisimmän translokaationt(12;21) osoittaminen in situ -kaksivärifluoresenssihybridisaatiolla. A.Koettimet on valittu niin, että translokaation tapahtuessa TEL-geeninvihreä signaali sulautuu punaiseen AML-geenin signaaliin muodostaenkeltaisen signaalin. Lisäksi AML-geenistä jää pieni fragmenttisignaali,sillä koetin on valittu keskeltä geeniä, jolloin se translokaation myötähalkeaa. B. 12;21-translokaation osoittavia sinisiä interfaasisoluja.

A.

B.

Interfaasisytogenetiikassaei tarvita mitoottisiasoluja

Fluoresoivilla paikkaspesifisilläDNA-koettimilla in situ -hybridisaa-tiossa voidaan tutkia kromosomienlukumäärää, geenikopioita ja kro-mosomitranslokaatioita (kuva 6),myös interfaasisoluista.

HYKS:n CMG-laboratoriossa onkäytössä lähes jokaisen kromosominsentromeerikoettimet, joilla voidaantunnistaa näiden kromosomien lu-kumääräiset poikkeavuudet. Taulu-kossa 2 on esitetty käytettävissä ole-vat interfaasisytogenetiikkaan sovel-tuvat translokaatio-, geenideleetio-ja geenimonistumaspesifiset koetti-met.

Vertailevalla genomisellahybridisaatiolla voidaanselvittää kromosomaalisiamuutoksia DNA:sta

Käänteinen kromosomimaalaus elivertaileva genominen in situ -hybri-disaatio (VGH) on avannut merkit-täviä mahdollisuuksia syöpätautien,myös lymfoomien ja sarkoomiensyöpägeenien monistumisen ja syö-vän suojageenien häviämisen tutki-misessa. Tässä menetelmässä kas-vain- ja vertailukudoksen eri väreillämerkittyä DNA:ta käytetään sa-manaikaisesti testikromosomival-misteiden koettimina (3) (kuva 7).Mikäli kahden värin – esimerkiksipunaisen kasvainkudoksen ja vih-reän vertailu-DNA:n – sävykarttamuuttuu, voidaan osoittaa kromoso-mialueet, joissa on tapahtunut gee-niaineksen määrän muutoksia. Ana-lyysiin tarvitaan fluoresenssimikro-skoopin lisäksi puna-viherintensi-teetit herkästi paljastava CCD-kame-ra ja tietokoneohjelma, joka esittääkunkin kromosomin ja kromosomi-raidan osalta DNA:n kopiomääränkäyränä ja osoittaa normaalit raja-arvot ylittävät kohdat (kuva 8).

Sen jälkeen kun menetelmä 1992kuvattiin, on eri syöpien DNA:n ko-piomääristä ilmestynyt yli 300 jul-kaisua (4). Tutkimusryhmämmewww-sivuille on syöpätyypeittäintaulukoitu tiedot DNA:n kopiomää-rien muutoksista (http://www.helsin-ki.fi/~lgl_www/CMG.html).

Parafiiniblokkien hyväksikäyttöon mahdollistanut monista syövistäensimmäistä kertaa kromosomaalis-ten muutoksien kuvaamisen. Mene-telmän avulla on kuvattu huomatta-

1835S U O M E N L Ä Ä K Ä R I L E H T I 1 7 / 2 0 0 0 V S K 5 5

LÄ

ÄK

ET

IE

DE

VGH-1

Nick-translaatio Nick-translaatio

In situ -hybridisaatio

Vertailu-DNA800 emäsparinpätkinä punai-seksi leimattuna

Tutkittava DNA800 emäsparinpätkinä vihreäksileimattuna

Fluoresoivakromosomi

0,85-raja-arvoDNA-puutos

1,17-raja-arvoDNA-ylimäärä

1

Kuva 7. Vertaileva genominen hybridisaatio kaavamaisesti esitettynä.Punainen ja vihreä fluoresenssi mitataan fluoresenssimikroskoopissadigitaalisella kuvankäsittelyohjelmalla ja tulos esitetään kunkinkromosomin osalta suhdekäyrällä. Kromosomit tunnistetaan DAPI-fluoresenssilla. Kustannus Oy Duodecimin luvalla (3)

Taulukko 2. Spesifisten kromosomi- ja geenimuutosten osoittamineninterfaasisoluista (poikkeavuus voidaan luonnollisesti todeta myösmetafaasivaiheen solusta).

Maligniteetti Kromosomipoikkeavuus Geeni

Krooninen myelooinen ja akuuttilymfaattinen leukemia t(9;22)(q34;q11) ABL; BCR

Akuutti myelooinenleukemia AML-M3 t(15;17)(q22;q21) PML; RARA

Akuutti lymfaattinen leukemia t(12;21)(p13;q22) TEL; AML1

Anaplastinen suurisoluinen lymfooma t(2;5)(p23;q35) ALK;NPM

Myelodysplastinen oireyhtymä/akuutti myelooinen leukemia del(5)(q31) EGR1

Myelodysplastinen oireyhtymä/akuutti myelooinen leukemia del(5)(q33-q34) CSFIR

B-solutyypin krooninenlymfaattinen leukemia del(13)(14.3) RB1

Akuutti myelooinen leukemia del(7)(q31) ?

Myeloproliferatiiviset taudit,

myelodysplastinen oireyhtymä del(20)(q12) ?

Useat tuumorit del(17p13.1) P53

Neuroblastooma amp 2p23-p24 MYCN

Eturauhassyöpä amp Xq12 AR

Useat tuumorit amp 8q24 MYC

Rintasyöpä, useat muut amp 17q11.2-q12 ERBB2/HER2/ neu

Useat tuumorit amp 20q13.2 ZNF217

Rintasyöpä, useat muut amp 11q13 Cyclin D, PRAD1, CCND1

amp ≈ DNA:n kopiomäärän monistuminen; t≈ kromosomien translokaatio; del ≈ kromosomideleetio

va määrä uusia kromosomaalisiaalueita, joissa on joko DNA:n puu-tosta tai monistumaa. Mikrodissek-toimalla parafiinileikkeestä haluttualue ja monistamalla DNA:ta ns.DOP-PCR:lla on tutkimus voitu koh-distaa muutaman solun suuruisellealueelle, jolloin on saatu uutta tietoasyövän progressioon liittyvistä ge-neettisistä muutoksista.

Menetelmä on niin ikään tuonutuutta tietoa monien syöpien moleku-laarisista mekanismeista. Se on pal-jastanut kromosomialueita, joilta onmuilla menetelmillä myöhemminkloonattu syöpägeenejä; esimerkkitästä on LKB1-geeni Peutz–Jeghersinoireyhtymän polyypeissä.

Kliinistä hyötyä menetelmästäolemme todenneet lasten akuutissalymfaattisessa leukemiassa tavan-omaisen kromosomitutkimuksentäsmentäjänä. VGH-tutkimuksellavoidaan paljastaa tässä leukemiatyy-pissä usein olevat ylimääräiset kro-mosomit (kuva 9). Ilman varmuuttasiitä, mitkä kromosomit ovat ylimää-räisiä, ei in situ -fluoresenssihybridi-saatioon ole valittavissa luotettaviakoettimia (markkereita).

Useilla syöpätyypeillä on tyypilli-nen DNA:n kopiomäärään perustuvaprofiili. Esimerkiksi manttelisolu-lymfoomassa on tyypillisesti kro-mosomin 3 monistuma ja kro-mosomin 11 puutos. Näitä muutok-sia ei nähdä diffuusissa suurisolui-sessa B-solulymfoomassa, muttanähdään 18q (BCL2)-monistuma.Mesoteliooman DNA-kopiomäärän

1836 S U O M E N L Ä Ä K Ä R I L E H T I 1 7 / 2 0 0 0 V S K 5 5

LÄ

ÄK

ET

IE

DE

Kuva 9. Vertaileva genominenhybridisaatio (vasemmallaalhaalla) varmentaaongelmallisissa tilanteissa G-raita-analyysia (ylhäällä).Kuvassa on VGH:n avullavarmennettu kromosomin 5ylimäärä. Tätä poikkeavuutta onkäytetty taudin seurannassa insitu -hybridisaatiomenetelmässä(vasemmalla alhaallakromosomin 5 ylimäärämetafaasivaiheisessa solussa).

Kuva 8. Vertailevassagenomisessa hybridisaatiossanähdään DNA:n kopiomääränmuutokset koko kromosomistonosalta (yläosa). Digitaalinenkuvankäsittelyohjelma paljastaavihreän (kopiomääränlisääntyminen) ja punaisen(kopiomäärän puuttuminen) raja-arvon ylittävät kopiomääränmuutokset.

1837S U O M E N L Ä Ä K Ä R I L E H T I 1 7 / 2 0 0 0 V S K 5 5

LÄ

ÄK

ET

IE

DE

1 1 2 2 33 4 4 5 5

99887766

10 10 11 11 12 12 X X

13 13 1514 14 15 16 16 17 17 18 18

21 21 22 22

Amplifikaatio, lisäys ≥1,3 ja <1,5

Korkea-asteinen amplifikaatio, lisäys ≥1,5

Kuva 10. DNA:n kopiomäärän profilointi mesotelioomassa (MM) onmerkittävästi erilainen kuin keuhkojen adenokarsinoomassa (LC). Erostaon erotusdiagnostista hyötyä. Viiva kuvaa potilasta, jolla on kyseiselläkromosomialueella DNA:n kopiomäärän lisääntymistä (kromosominoikealla puolella) ja puuttumista (vasemmalla). British Journal of Cancerinluvalla (5)

profiili poikkeaa siinä määrin keuh-kojen adenokarsinooman profiilista,että nämä kaksi toisinaan erotus-diagnostisen ongelman aiheuttavaasyöpää voidaan erottaa toisistaan yli90 %:n todennäköisyydellä (5) (kuva10). Sarkoomissa on toistuvia spesi-fisiä monistuma-alueita, joiden mer-kitys ei ole ainoastaan biologinenvaan myös diagnostinen ja ennus-teellinen (taulukko 3).

VGH-menetelmä on rutiininomai-sesti käytössä HYKS:n CMG-labora-toriossa. Tutkimus voidaan tehdämyös parafiiniblokeista tai -leikkeis-tä eristetystä ja monistuneestaDNA:sta.

In situ -monivärifluore-senssihybridisaatiotarkentaa komplisoitunuttakaryotyyppipoikkeavuutta

In situ -monivärifluoresenssihybridi-saatiossa (M-FISH) saadaan viidenfluoresoivan aineen erilaisia yhdis-telmiä käyttäen jokainen kromosomimaalattua eriväriseksi (kuva 11).Menetelmällä on suuri merkitysmääritettäessä komplisoituneita kro-mosomipoikkeavuuksia, alkuperäl-

Taulukko 3. Lymfoomien ja sarkoomien toistuvia DNA:n kopiomääränmuutoksia.

Syöpätyyppi Muutos Merkitys

Ewingin sarkooma amp 1q22amp 1q

Useat amp 2 RET-monistuma

Manttelisolulymfooma amp 3q

Non-Hodgkin-lymfooma loss 6q

Useat sarkoomat amp 8q24 ennustetta huonontava

Useat loss 9p

Manttelisolulymfooma, krooninenlymfaattinen leukemia loss 11q

Liposarkooma amp 12q

Krooninen lymfaattinen leukemia loss 13q ennustetta huonontava

Osteosarkooma, leiomyosarkooma amp 17p

Dermatofibrosarkooma amp 17q

Diffuusi suurisoluinen B-solulymfooma amp 18q BCL2-monistuma

amp = kopiomäärän monistuminen merkityllä kromosomialueella; loss = kopiomäärän vähentyminen; p = kromosomin lyhyt haara; q = kromosomin pitkä haara

tään tunnistamattomia marker-kro-mosomeja ja raitamenetelmän ulot-tumattomissa olevia kromosomi-poikkeavuuksia. Menetelmä täsmen-tää erityisesti lymfoomien sytoge-neettistä tutkimusta.

M-FISH on rutiininomaisesti käy-tössä. Se täydentää tarvittaessa kro-

mosomien raita-analyysiä. Tutki-mukseen ei useinkaan tarvita uuttanäytettä, vaan tavanomaisesta tutki-muksesta ylijääviä valmisteita voi-daan käyttää tutkimukseen (M-FISH-värjäykseen käytettävät valmis-teet ovat samanlaisia kuin raita-ana-lyysiin käytettävät valmisteet).

MIKROLEVYTESTEILLÄVOIDAAN TUTKIATUHANSIEN GEENIENTOIMINTAA JA TUHANSIANÄYTTEITÄSAMANAIKAISESTI

cDNA-mikrolevytestissä tuumoristaeristettyä vihreäksi leimattua jamuusta kudoksesta eristettyä punai-seksi leimattua RNA:ta (komplemen-taariseksi DNA:ksi muutettuna) hyb-ridisoidaan mikrolevyllä oleville tu-hansille geenejä edustaville cDNA-jaksoille (6) (kuva 12). Mitä voi-makkaammin geeni on ekspressoitu-nut, sitä voimakkaampi on vihreäksileimatun koettimen fluoresenssi, japunainen väri kuvastaa puolestaangeenin heikkoa ekspressiota (kuva13). Yhdellä hybridisaatiolla voidaannäin selvittää tuhansien geenien sa-manaikaista toimintaa syöpäkudok-sessa. Tehokkaiden bioinformaatio-ohjelmien avulla on ollut mahdollis-ta tarkastella ekspressiota geeniryh-mittäin. ”Gene clustering” onkin kä-site, joka on esiintynyt usein tuo-reimpien Nature Genetics -aikakau-silehtien sivuilla. Geeniklusterienavulla on voitu luokitella yhtenäinenhistologinen syöpätyyppi useaan en-nusteellisesti ja hoitovasteeltaan eri-laiseen molekulaariseen alatyyppiin.Diffuusi suurisoluinen B-solulym-fooma on tästä hyvä esimerkki (7)(kuva 14 A). Histologisesti tauti onsamankaltainen (homogeeninen)mutta kliiniseltä kulultaan, kutenennusteeltaan ja hoitovasteeltaan,heterogeeninen. Amerikkalaiset tut-kijaryhmät osoittivat, että gee-niekspressioklusteri, joka muistuttaaitukeskuksesta peräisin olevien solu-jen geeniekspressiota, on ennusteenkannalta suotuisa merkki, kun taasaktivoituneiden B-solujen ekspres-siota muistuttava geeniekspressio-klusteri on ennusteen kannalta huo-no merkki (kuva 14 B). Vastaavan-laista geeniryhmien ekspressioon pe-rustuvaa molekulaarista luokitteluaollaan tekemässä useista eri syöpä-tyypeistä monissa laboratorioissa.HYKS:n CMG-laboratoriossa on tut-kittu mm. kroonisen lymfaattisenleukemian geeniekspressiota ja to-dettu geeniekspressiossa eroja todet-tujen kromosomipoikkeavuuksiensuhteen.

Jo nyt on markkinoilla erityyppi-siä joko lasi- tai filtteripohjaisia mik-rolevystöjä, mm. yleissyöpälevystöjä,prostatamikrolevystö, hematologi-

1838 S U O M E N L Ä Ä K Ä R I L E H T I 1 7 / 2 0 0 0 V S K 5 5

LÄ

ÄK

ET

IE

DE

mRNA

cDNA

Mikrolevy

Vertailukudos Tuumorikudos

Kuva 12. cDNA-mikrolevytestin periaate.

Kuva 11. 24-värimaalatut kromosomit paljastavat luotettavastitranslokaatioita, mistä tässä esimerkkinä komplisoitunut t(9;13;22)-Philadelphia-translokaatio.

Kuva 14 A. Normaalien B-solujenerilaistumiseen ja aktivaatioonperustuva geeniekspressio-ryhmittely diffuusissa suuri-soluisessa B-solulymfoomassa.Oranssi: itukeskusperäisten solujenkaltainen geeniekspressio; sininen:aktivoituneiden B-lymfosyyttienkaltainen geeniekspressio.Pystyrivit edustavat potilaita javaakarivit geenejä. Punainen värikuvaa geenin voimakastaekspressiota ja vihreä osoittaa etteigeeni ekspressoidu. Potilaatvoidaan jakaa geeniekspressionmukaan kahteen ryhmään:itukeskussolujen geeniekspressionkaltaisiin ja aktivoituneiden B-solujen geeniekspression kaltaisiin.B. Ensimmäiseen ryhmäänkuuluvilla potilailla (oranssi käyrä)on merkittävästi parempi ennustekuin jälkimmäiseen ryhmään(sininen käyrä) kuuluvilla. Naturenluvalla (7), copyright 2000 MacmillanMagazines Ltd

nen tai immunologinen tai hema-toimmunologinen levystö, onkogee-ni-, kasvutekijä- ja apoptoosilevystö-jä. On myös mahdollista teettää yk-silöllinen mikrolevystö valitsemallaomaan kysymyksen asetteluun tar-vittavat cDNA:t. Kaupalliset levystötovat suhteellisen kalliita. Siksi Mei-lahden kampusalueelle on perusteil-la tukilaboratorio, joka auttaa yksi-löllisten levystöjen suunnittelussa jatekemisessä. Toistaiseksi HYKS:nCMG-laboratorion useissa tutkimus-projekteissa on käytetty filtteripoh-jaista mikrolevytestiä. Tutkimustu-lokset ovat siinä määrin rohkaisevia,että olen vakuuttunut menetelmänolevan kliinisessä käytössä kahdenvuoden kuluttua.

Tuumorimikrolevystölläselviää tutkittavan geenin kliininen merkitys

Yhdelle tuumorimikrolevystölle voi-daan panna jopa tuhannen potilaanparafiinikudosnäytteet. Halutustatuumoriblokin kohdasta otetaan eri-tyislaitteistoon kiinnitetyllä neulalla0,6 mm:n levyinen näyte, joka siirre-tään tyhjään parafiiniblokkiin (8)(kuva 15). Blokkiin voidaan sijoittaanäytteet jopa tuhannesta tuumorista.Blokista voidaan leikata 4–5 µm:nviipale tavanomaisesti ja asettaa selasille. Näin aikaansaatu mikrolevys-tö voidaan värjätä periaatteessa kai-killa histokemiallisilla ja im-munohistokemiallisilla menetelmillätai sille voidaan tehdä in situ -fluo-resenssihybridisaatioanalyysi yhdel-lä tai useammalla geeni-, lokus- taikromosomispesifisellä koettimella(kuva 16). Myös geenien toiminnanselvittäminen RNA in situ -hybridi-saatiolla on mahdollista, joskin han-kalaa.

HYKS:n CMG-laboratoriossa ontehty tuumorimikrolevystöjä joille-kin tuumorityypeille; valmius tuu-morimikrolevystöjen tekemiseen onsiis olemassa. Lähinnä yhteistyössäon tehty levystöjä muillekin.

1839S U O M E N L Ä Ä K Ä R I L E H T I 1 7 / 2 0 0 0 V S K 5 5

LÄ

ÄK

ET

IE

DE

Kuva 13. Mikrolevystöllävihreänä fluoresoivat levytosoittavat geenin voimakastaekspressiota, punaiset levytheikkoa ja keltaiset normaaliaekspressiota käytettyynreferenssiin nähden.

Kaikki potilaat

GC B-kaltainen

19 potilasta 6 kuolemaa

21 potilasta 18 kuolemaa

Aktivoitu B-kaltainen

0 2 4 6 8 10 12

Eloo

njää

mis

en t

oden

näkö

isyy

s

1,0

0,5

0,0

A. B.

MIKÄ MENETELMÄLYMFOOMIEN JASARKOOMIENDIAGNOSTIIKKAAN?

Diagnostiikassa kromosomiraitatut-kimus antaa yleiskuvan perintö-aineksen muutoksista paljastaen klii-nispatologisesti merkittäviä, jopadiagnostisia poikkeavuuksia. Perus-menetelmän täydentämiseen ja täs-

mentämiseen käytetään tarvittaessamoniväri- ja muita in situ -fluore-senssihybridisaatiomenetelmiä javertailevaa genomista hybridisaatio-ta. Lymfooma- ja sarkoomaspesifis-ten translokaatioiden varmentami-seen ja toteamiseen voidaan käyttääSouthern blotting- ja PCR-menetel-miä tai jompaakumpaa niistä, elleikromosomiraitatutkimusta tuore-näytteen puuttuessa ole voitu tehdä.

Immunoglobuliini- ja T-soluresepto-rigeenien uudelleenjärjestymän tut-kimisesta on apua lymfooman jamuiden pieni- ja pyöreätumaistentuumorien (small round cell tumors)erotusdiagnostiikassa (lymfooma,Ewingin sarkooma ja neuroblastoo-ma).

MITÄ MENETELMIÄJÄÄNNÖSTAUDINTOTEAMISEEN JASEURANTAAN?

Perinteinen kromosomitutkimus eiole riittävän herkkä jäännöstaudintutkimiseen. In situ -fluoresenssi-hybridisaatio on jopa sata kertaaherkempi. Menetelmää voidaan kui-tenkin käyttää vain silloin, kun dia-gnoosivaiheessa todettu kromosomi-poikkeavuus on löydettävissä kro-mosomimaalauksella tai interfaasisy-togeneettisellä tutkimuksella taikummallakin. Molekyylisytogenetii-kan herkkyys löytää maligneja solujaon noin 1/1 000 (0,1 %); Southernblotting -analyysin vastaava herk-kyys on 2–5 %, joten siitä ei ole sa-nottavasti hyötyä jäännöstaudinosoittamisessa. PCR:n herkkyys onjopa 1/10 000, mutta sen käyttö ra-joittuu aiemmin mainittujen translo-kaatioiden toteamiseen. Molekyyli-sytogenetiikkaan verrattuna PCR-menetelmä ei ole kvantitatiivinen jakontaminaatio-ongelmat ovat mer-kittäviä.

1840 S U O M E N L Ä Ä K Ä R I L E H T I 1 7 / 2 0 0 0 V S K 5 5

LÄ

ÄK

ET

IE

DE

Tuumoriblokki Uusi blokki johon stanssatuttuumoripalat on sijoitettu

Leike stanssatuistatuumoripaloista

Kuva 15. Kudosmikrolevystön periaate Konosen ym. (8) mukaan. Parafiiniin valetusta tuumorinäytteestä otetaan0,6 mm levyinen näyte, joka siirretään tyhjään parafiiniblokkiin. Tästä voidaan tehdä tavanomaisia leikkeitähistokemiallisia, immunologisia ja sytogeneettisiä värjäyksiä varten (kuva 16).

Kuva 16. In situ -2-värihybridisaatiolla värjätty tuumorimikrolevystö(alla) diffuusista suurisoluisesta B-solulymfoomasta.

Maligneja jäännössoluja tutkitta-essa voidaan genotyypin määrityskohdistaa tiettyyn fenotyyppiin. Kro-mosomitutkimuksen spesifisyyttä jaherkkyyttä voidaan lisätä kohdista-malla se esimerkiksi B-solulymfoo-massa immunoglobuliini-kevytket-jun suhteen klonaalisiin soluihin.MAC-yhdistelmämenetelmään voi-daan liittää solujen rikastaminen esi-merkiksi immunomagneettihelmienavulla. Jäännöstaudin toteamisenohella MAC-menetelmää voidaankäyttää myös perifeerisen veren kan-tasolusiirrossa leukafereesillä ja kan-tasolurikastuksella saatujen solujenkarakterisointiin.

Metafaasikromosomien maalausin situ -hybridisaatiolla mahdollistaakromosomin morfologian toteamisen(kuva 17). Menetelmä onkin varsin

spesifinen ja luotettava jäännössolu-jen osoittamisessa.

Interfaasisytogenetiikassa arvioi-daan hybridisaatiosignaaleja. Koskasiinä ei voida suoraan nähdä poik-keavuutta, liittyy menetelmään noinprosentin suuruinen väärän positii-visen tulkinnan mahdollisuus. Vää-rien positiivisten signaalien määrävähenee merkittävästi, jos on mah-dollista käyttää kaksi eri poikkea-vuutta samanaikaisesti osoittavaakaksivärifluoresenssi in situ -hybri-disaatiota. Noin 30 %:lla non-Hodg-kin-lymfooma- ja sarkoomapotilaistaon sellainen poikkeavuusyhdistelmä,että kaksivärimenetelmää voidaankäyttää luotettavasti interfaasisyto-genetiikassa. Metafaasivaiheen in si-tu -hybridisaatioon soveltuu noin60 % non-Hodgkin-lymfoomapoti-

laista. Sarkoomat ovat translokaa-tioiden suhteen varsin erilaisia, jotenmyös metafaasi-FISH soveltuu seu-rantaan hyvin eri tavalla eri sarkoo-ma-alatyypeissä. Taulukossa 1 onesitetty ne sarkoomat, joihin liittyyspesifisiä translokaatioita.

SYTOGENETIIKKA JAMOLEKYYLIPATOLOGIA JO NYT KLIINISTÄPATOLOGIAA

Edellä esitetty sytogenetiikan ja mo-lekyylipatologian diagnostiikkapor-taikko on tullut mukaan kliiniseensyöpäpatologiaan. Lyhyesti kuvaa-mani esimerkit toivon mukaan valai-sivat sitä, kuinka sytogeneettisellä jamolekyyligeneettisellä alaluokittelul-la entistä kliinismorfologista luokit-telua täydentämällä voidaan morfo-logisesti tai histologisesti yhteneväi-sestä entiteetistä löytää molekulaari-sia alatyyppejä, joilla on erilainenkliininen käyttäytyminen ja hoito-vaste. Uskonkin, että lymfoomien jasarkoomien lisäksi myös muita syö-pätyyppejä on lähitulevaisuudessamahdollista jaotella täsmähoidonkannalta merkittäviin molekulaari-siin alatyyppeihin.

KIRJALLISUUTTA1 Knuutila S. Sytogeneettiset ja molekyylibiologiset

tutkimukset. Kirjassa: Ruutu T, Rajamäki A, KrusiusT, toim. Veritaudit. Jyväskylä: Kustannus OyDuodecim 1996;46–59.

2 Mecklin J-P, Peltomäki P, Aaltonen L, Kääriäinen H.Periytyvä syöpä. Suom Lääkäril 1995;50:2057–2064.

3 Knuutila S. Kromosomien rakenne ja toiminta.Kirjassa: Aula P, Kääriäinen H, Leisti J, toim.Perinnöllisyyslääketiede. Jyväskylä: Kustannus OyDuodecim 1998;44–62.

4 Knuutila S, Björkqvist A-M, Autio K ym. DNA copynumber amplifications in human neoplasms. Reviewof comparative genomic hybridization studies. Am JPathol 1998;152:1107–1123.

5 Björkqvist A-M, Tammilehto L, Nordling S ym.Comparison of DNA copy number changes inmalignant mesothelioma, adenocarcinoma and large-cell anaplastic carcinoma of the lung. Br J Cancer1998;77:260–269.

6 Nat Genet 1999;21 supplement.

7 Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE ym. Distinct typesof diffuse large B-cell lymphoma identified by geneexpression profiling. Nature 2000;403:503–511.

8 Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A ym. Tissuemicroarrays for high-throughput molecular profilingof tumor specimens. Nat Med 1998;4:844–847.

K i r j o i t t a j a

S A K A R I K N U U T I L AFT, professoriHaartman-instituutti ja HYKS,lääketieteellisen genetiikan osastosähköposti:Sakari.Knuutila@helsinki.fi

1841S U O M E N L Ä Ä K Ä R I L E H T I 1 7 / 2 0 0 0 V S K 5 5

LÄ

ÄK

ET

IE

DE

Kuva 17. 15;17-translokaation osoittaminen metafaasi-FISH:lla (oikeallaalhaalla). Kromosomit voidaan tunnistaa DAPI-kromosomientaustavärjäyksellä. Nuolet osoittavat translokaation.

Kromosomien taustavärjäysDAPI:lla

In situ -hydridisaatio kromosomin17 maalauskoettimella

Leukemiaspesifisen translokaation osoittaminen fluoresenssi in situ -hybridisaatiolla