mBỘ Y T Ế

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ

L-CYSTIN TỪ TÓC, SỪNG

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c SỸ KHOÁ 200# - 2005)s ' ị i ^ - x

/ ' ) ' ■ - \

V u CụGiáo viên hướng dẫn ': Ths. ̂ Nguyễn Đình Luyện

Ths. Nguyễn Thị Trinh Lan

Sình viên thực hiện : Nghiêm Thanh Hoàng

Nơi thực hiện : Bộ món Công nghiệp - Dược, phòng GMP

Trường ĐH Dược HN

Thời gianthực hiện : 3/2005 - 5/2005

■■ ■'g '

HÀ NỔI, THÁNG 5 - 2é05 K . v ; ; -MÓ

V - ý

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp “Khảo sát một số phương

pháp điều chế L-cystin từ tóc, sừng”, được sự giúp đỡ hết sức tận tình của

thầy Nguyễn Đình Luyện và cô Nguyễn Thị Trinh Lan, tôi đã hoàn thành

khóa luận tốt nghiệp với mục đích và nội dung đề ra đúng thời gian qui định.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Đình Luyện và cô

Nguyễn Thị Trinh Lan cùng toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật

viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược, phòng thí nghiệm GMP - Trường Đại

học Dược Hà nội.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các phòng ban, bộ môn của

trường đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đc tài.

Xin kính chúc các thầy cô luôn luôn mạnh khỏe và ngày càng thu được

nhiều thành tích mới trong công tác nghiên cứu cũng như trong giảng dạy.

Hà nội, ngày 27 tháng 5 năm 2005.

Sinh viên

Nghiêm Thanh Hoàng

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VÂN ĐỂ 1

PHẨN 1 : TỔNG QUAN 2

1. ĐẠI CƯƠNG 2

1.1. Tổng quan về acid amin 2

1.1.1. Acid amin 2

1.1.2. Cấu tạo hóa học của acid amin 3

1.1.3. Phân loại acid amin 3

1.1.4. Tính chất của acid amin 4

1.2. Cấu trúc hóa học của nguyên liệu Keratin 4

1.2.1. Cấu dạng xoắn a 5

1.2.2. Cấu dạng gấp nếp p 6

1.3. Lịch sư nghiên cứu, tính chất lý hóa và ứng dụng của

L-cvstin 7

1.3.1. Lịch sử nghiên cứu 7

1.3.2. Cấu tạo hoá học 9

1.3.3. Tính chất lý hóa 10

1.3.3.1. Lý tính 10

1.3.3.2. Hóa tính 11

1.3.4. Cách xác định L-cystin tạo thành 13

1.3.5. Tác dụng sinh học và ứng dụng 15

2. PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ 16

2.1. Điều chế theo Vogel 16

2.2. Điều chế theo Gortner và Hoffman 17

2.3. Các phương pháp điều chẻ khác 17

PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ NGHIÊN c ứ u 20

1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

1.1. Nguyên liệu 20

1.2. Hoá chất và thuốc thử 20

1.3. Thiết bị và máy móc 21

1.4. Phương pháp nghiên cứu và cách xác định

hàm lượng L-cystin tạo thành 21

2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 23

2.1. Khao sát sự ảnh hưởng của nồng độ acid

tới hiệu suất của phản ứng thủy phân 23

2.2. Khảo sát anh hương của thời gian thủy phân

tới hiệu suất của phản ứng thủy phân 26

2.3. Khảo sát và tối ưu hóa giai đoạn tách

và tinh chế L-cystin 29

2.4. Kết quả phân tích phổ và biện giải các phổ 31

2.5. Kiểm nghiệm một sỏ tiêu chuẩn của L-cystin điều chê

được theo tiêu chuẩn Dược điển Anh BP 1998 33

3. BÀN LUẬN 33

PH Ầ N 3 : K Ế T L U Ậ N V À Đ Ể X U Â T 35

T À I L IỆ U T H A M K H Ả O 37

PHỤ LỤC

ĐẶT VÂN ĐỂCystin là một acid amin chiếm tỷ lệ đáng kể trong thành phần của tóc,

sừng, móng... thuộc nhóm acid amin có chứa lưu huỳnh [8].

Về mặt hóa học, Cystin được cấu tạo từ hai phân tử Cystein liên kết với

nhau qua cầu nối disulfide. Trong tự nhiên Cystin thường tồn tại dưới dạng L-

cystin với tên khoa học là : L(-)-3,3'-Dithiobis(2-aminopropanoic acid).

Trong y học, người ta đã sử dụng L-cystin để điều trị một số bệnh da

liễu như: rụng tóc, trứng cá, bệnh vảy nến ... Gần đây L-cystin còn được dùng

trong các trường hợp tổn thương giác mạc, do tác dụng ức chế colagenaza làm

biểu mô giác mạc nhanh thành sẹo.

Ngoài ra, L-cystin còn được dùng để tổng hợp nhiều dẫn xuất có ứng

dụng trong lâm sàng như : N-acetylcystcin, L-cystein, S-carboxy-Metylcystein

... Đc điều chế L-cystin người ta có thể đi từ con đường tổng hợp hóa học

hoặc chiết từ dịch thủy phân protein [8J.

Trcn thế giới cũng như ở Việt nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu

điều chế L-cystin từ tóc, sừng, lông gà, lông cừu [11][15][19]... Nhằm hoàn

thiện quy trinh điều chế L-cystin, chúng tôi tiến hành đc tài nghicn cứu

“ Khảo sát inột sô phương pháp điều chê L-cystin từ tóc, sừng “ với những

inục tiêu sau :

1. Khảo sát 1 số điều kiện của phản ứng thủy phân ảnh hưởng đến hiệu

suất tạo thành L-cystin từ nguyên liệu ban đầu là tóc.

2. Khao sát 1 số điều kiện của phản ứng thủy phân ảnh hưởng đến hiệu

suất tạo thành L-cystin từ nguyên liệu ban đầu là sừng.

3. Nghiên cứu cải tiến các phương pháp tách và tinh chế L-cystin nhằm

tiết kiệm năng lượng và phụ liệu.

4. Điều chế một lượng L-cystin đạt tiêu chuẩn cho quá trình tổng hợp

Acetylcystein tiếp theo.

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Tổng quan về acid amin

1.1.1. Acid amin

Acid amin là sản phẩm thủy phân cuối cùng của pcptid và protein, là

đơn vị cấu tạo xây dựng nên các phân tử peptid và protein. Một số acid amin

có chức năng quan trọng như dẫn truyền thần kinh (glycin và acid glutamic)

hay đóng vai trò trung gian trong sinh tổng hợp urê (acid argininosuccinic,

citrulin). Người ta đã phân lập được trên 20 acid amin từ các dịch thủy phân

protein thiên nhiên, các chất này đều thuộc loại a-aminoacid. [4]

Thông thường người ta thu được các acid amin từ quá trình thủy phân

protein với các tác nhân khác nhau như: acid, kiềm, enzym...Để đánh giá chất

lượng các chế phẩm acid amin, người ta tiến hành kiểm nghiệm bằng nhiều

phương pháp khác nhau: phương pháp Kendan, phương pháp Ninhydrin,

phương pháp sắc ký giấy, phương pháp sắc ký trao đổi ion...

Ớ nước ta hiện nay, đa số các chế phẩm acid amin phải nhập từ nước

ngoài trong khi nhu cầu sử dụng các chế phẩm này làm thuốc lại rất lớn. Do

vậy việc nghiên cứu về acid amin đóng một vai trò quan trọng và có nhiều ý

nghĩa trong thực tế.

1.1.2. Cấu tạo hoá học của acid atnin

Acid amin là những hợp chất acid hữu cơ mạch thẳng trong đó một hay

hai nguyên tử hydro trên carbon a được thay thế bằng nhóm amin. Các acid

amin trong tự nhiên đều là acid L- a amin.

H

lĩ0

Acid a -amin

2

Tất cả các acid amin trừ glycin (R-H) đều có carbon a bất đối mang

hoạt tính quang học làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực.

Mặc dù trong tự nhiên có khoảng 300 acid amin nhưng cũng chỉ có 20

acid amin được tìm thấy trong protein. Người ta gọi đó là những acid amin

chuẩn. [4]

1.1.3. Phân loại acid amỉn [4]

• Theo mức độ phụ thuộc vào gốc R có trong phân tử acid amìn có thể

chia các acid L- a amin thành 2 nhóm lớn: acid amin phân cực và acid amin

không phân cực.

Không phân cực Alanin, Isolcucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Tryptophan, Valin.

Phân cựcAcid aspartic, Acid glutamic, Arginin, Asparagin, Cystein, Glutamin, Glycin, Histidin, Lysin, Serin, Threonin, Tyrosin.

• Mặt khác, theo cấu tạo hóa học của nhóm R: Các acid L- a amin

được phân thành 7 nhóm :

o Nhóm acid amin mạch thẳng: Glycin, Alanin, Valin, Leucin,

Isoleucin.

o Nhóm acid amin chứa hydroxyl (OH): Serin, Threonin,

Tyrosin.

o Nhóm acid amin chứa lưu huỳnh: Cystein, Methionin.

o Nhóm acid amin acid (chứa carboxyl hay amid): Acid

aspartic, Asparagin, Acide Glutamic, Glutamin.

o Nhóm acid amin kiềm (chứa nhóm basic): Arginin, Lysin,

Histidin.

3

o Nhóm acid amin chứa nhân thơm: Histidin, Phenylalanin,

Tyrosin, Trytophan.

o Nhóm imin: Prolin.

1.1.4. Tính chất của acid amin

• Tính tan và điểm chảy của acid amiti [4]

Sự có mặt của nhiều nhóm ion hoá trên acid amin làm cho chúng dễ tan

hơn trong dung môi phân cực như: nước, ethanol, không tan trong các dung

môi không phân cực như: benzen, hexan hay ete.

Điểm chảy của chúng thường cao (trên 200°C) do lực ion của mạng kết

tinh.

• Các phản ứng hoá học đặc trưng của acid amin

Đó là các phán ứng đặc trưng cho các nhóm amin và carboxyl như phản

ứng acetyl hoá, phản ứng formyl hóa hay este hóa:

1.2. Cấu trúc hóa học của nguyên liệu Keratin [2][4]

Keratin là protein rắn chắc, không tan trong nước, chiếm tỷ lệ cao trong

tóc, sừng, móng và lông của hầu hốt các loài động vật kể cả con người.

o Phản ứng với Ninhydrin.

o Phản ứng với Fluorescamin.

o Phản ứng Biurê.

o Phản ứng Foln xác định acid amin chứa lưu huỳnh

(a)Ị ht \ Ịtt* tutr \'1 //»< ỉutit 1'tilb

(b)

Hình l : ịa): cấu trúc tóc; (h): cấu tạo sợi tóc;(c): Keratin

Thông thường Keratin có 2 cấu dạng chính đó là a-keratin và p-keratin,

a-keratin thường được tìm thấy ở người và động vật có vú còn p-keratin

thường có trong các loài chim và bò sát. Cấu trúc của ị3-keratin cứng rắn hơn

so với a-keratin.

Ngoài vai trò giúp ổn định cấu trúc tế bào Keratin còn có tác dụng bảo

vệ cơ thể tránh được các tác nhân có hại từ môi trường bên ngoài.

1.2.1. Cấu dạng xoắn a

Là cấu dạng điển hình cho cấu trúc của a-keratin. Khoảng cách một

chu kỳ xoắn là 0,54 nm (gồm 3,5 gốc acid amin). Các nhóm R của nguyên tử

carbon a đều chĩa ra ngoài trung tâm xoắn. Cấu dạng xoắn a (hình 2) có

những đặc điểm quan trọng sau đây :

• Cấu trúc bền vững nhờ có các liên kết Hydro tạo ra giữa H (thuộc nhóm

NH của mỗi liên kết peptid) với o (của nhóm c o thuộc gốc acid amin thứ

4 trong chuỗi). Như vậy mỗi liên kết peptid đều góp phần tạo sự bền vững

tối đa cho phân tử Keratin.

• Liên kết Hydro nói trên làm giảm tính chất ưa nước của vùng xoắn a.

• Là cấu dạng bền vững nhất của chuỗi polypeptid do có thể tạo xoắn a một

cách tự nhicn mà không cần nhiều năng lượng.

Hình 2: Cảu dạng xoắn a-keratin

1.2.2. Cấu dạng gấp nếp p

Là điển hình cho cấu trúc của P-keratin. Nó có hình dáng giống như

một tờ giấy gấp nếp và hầu như hoàn toàn duỗi thẳng hình zigzag (không bị

cuộn lại như cấu dạng xoắn a).

Trong cấu dạng p :

6

• Các chuỗi polypeptid cạnh nhau có thể song song (có cùng hướng từ N-

tận đến C-tận) hay đối song (hướng ngược nhau). Hai cấu trúc này giống nhau

mặc dù độ dài lặp lại trong cấu trúc song song ngắn hơn (0,65 nm so với 0,70

nm trong cấu trúc đối song).

• Khoảng cách giữa các acid amin cạnh nhau theo đường trục là 0,35 nm

(trong cấu dạng xoắn a là 0,15 nm).

• Các liên kết Hydro tạo bởi các nhóm -NH- và - CO- có thể nằm trong

cùng một chuỗi nhưng cách xa nhau hay giữa các chuỗi polypeptid khác nhau.

• Các gốc R của acid amin cạnh nhau nằm ở những vị trí gấp khúc

1.3. Lịch sử nghiên cứu, tính chất lý hoá và ứng dụng của L-cystin

1.3.1. Lịch sử nghiên cứu

Do L-cystin thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu trong

lĩnh vực dược lý học, tế bào học, sinh hóa học, phóng xạ học nên từ lâu nó đã

được tổng hợp và lưu hành trên thị trường. L-cystin có thể được điều chế bằng

nhiều phương pháp khác nhau. Người ta đã tổng hợp được L-cystin từ Serin

hay Acid acrylic, hoặc có thể sinh tổng hợp từ các enzym,... Tuy nhiên

phương pháp thủy phân L-cystin từ protein vẫn đơn giản và có ý nghĩa thực tế

hơn cả.Qua điều tra nghiên cứu người ta thấy L-cystin có tỷ lệ cao trong

Keratin của lông, tóc, sừng, móng: [9]

zigzag.

Tóc

Lông lợn

14%

14,4%

Sừng

Len

12,1%

10,3%

7

<J b eHình 4: Nguồn nguyên liệu L-cystin

a: Tóc; b: Sừng; c: Lông

Do đó nguyên liệu chủ yếu để chiết tách L-cystin là các Keratin.

Quá trình chiết L-cystin từ protein nhìn chung đều dựa trên sơ đồ

nguyên lý sau:

Thủy phân|/ (H®, OH ®enzym) . pH=5Keratin------------ -----------► Acidamin----------- ► L-cystinị

t° v

Để thủy phân Keratin người ta có thể dùng các tác nhân acid hoặc kiềm.

Nhưng thực tế tác nhân acid phù hợp hơn vì kiềm phá hủy L-cystin và nhiều

acid amin khác. Trong các acid, acid clohydric được dùng phổ biến hơn cả.

Vấn đề cần nghiên cứu trong quá trình thủy phân là các yếu tố ảnh

hướng đến hiệu suất L-cystin như: nồng độ acid, lượng acid sử dụng, thời gian

thủy phân và nhiệt độ thủy phân. Theo một số tài liệu, nhiều tác giả sử dụng

acid clohydric 37% với thể tích gấp 2 lần khối lượng tóc [7][ 11], một số lại sử

dụng acid ở nồng độ loãng hơn (20-30%) để thủy phân với lượng acid gấp từ

2- 4 lần tóc [15][16]. Theo Gortner và Hoffman [15] thì nên thủy phân tóc

trong acid clohydric 20% vì dung dịch này tương đối ổn định và ít nguy hiểm

hơn dung dịch acid đậm đặc.

Ngoài ra, các tài liệu còn cho rằng thời gian thủy phân không nên kéo

dài quá 8-10h [15] vì L-cystin dễ bị racemic hóa khi đun lâu trong acid. Tuy

8

nhiên thời gian thủy phân còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện nhiệt độ , nếu

đun trực tiếp trên bếp điện, bếp dầu hoặc cách cát thì chỉ cẩn 6-8h, trong khi

nếu đun cách thủy thì phải cần tới 120-144h để thủy phân hoàn toàn protein.

Sau khi thủy phân được một hỗn hợp các acid amin người ta kết tủa L-

cystin bằng cách đưa về điểm đẳng điện ở pH=5. Tác nhân trung hòa thường

dùng là: NaOH, KOH, Amoniac, Amoni acetat, Natri acetat. Ở đây những

nghiên cứu trước cho thấy nếu chỉ dùng NaOH đặc dễ gây môi trường quá

kiềm làm L-cystin bị phá hủy.

Hiệu suất chiết tách L-cystin thường đạt cao nhất (5%) khi sử dụng

nguyên liệu là tóc, tác nhân thủy phân là acid clohydric 37% với tỷ lệ acid :

tóc bằng 2:1 và thời gian thủy phân là 6h nếu đun sôi trực tiếp hoặc 12h nếu

đun sôi cách thủy.

Tuy nhiên một số hạn chế của các phương pháp này còn chưa được giải

* quyết như: sử dụng acid clohỵdric đặc làm dung môi thủy phân dễ gây độc,

khả năng ăn mòn thiết bị cao, ô nhiễm môi trường ...

Sau khi thủy phân, sản phẩm thu được là L-cystin thô chứa cả Humin

(chất mầu), Tyrosin và các tạp chất khác. Humin là những acid hydro và

polycarboxylic với 2-4 nhóm -COOH. Chúng có trọng lượng phân tử cao, hấp

Ihu ánh sáng, ở dạng vô định hình, có mầu và cấu trúc chưa chứng minh được.

Tạp chất Tyrosin có thể được loại bằng cách rửa nước nóng nhiều lần và tránh

để kết tủa L-cystin quá lâu [15].

Để tẩy mầu và loại bỏ tạp chất người ta thường sử dụng các chất hấp

phụ bề mặt kết hợp với nhiều lần hòa tan kết tủa. Đối với L-cystin thô người ta

hay dùng than hoạt, có the sử dụng than hoạt ở tỷ lệ 2-5% so với dung dịch và

xử lý như vậy từ 2-5 lần.

1.3.2. Câu tạo hoá học

9

L-cystin có cấu trúc ổn định, là sản phẩm oxy hóa của L-cystein. L-

cystin được biết đến như một disulfide amino acid bởi nó được cấu thành từ 2

phân tử Cystcin nối với nhau bằng cầu nối disulfide. L-cystin có thể tạo thành

L-cystein nhờ sự khử hóa. Nó được phát hiện vào nãm 1810 và được chấp

nhận là một thành phần của protein vào năm 1899.

c o o c o o

s u — CH

H -C -H 3N

Cystein Cystein

2h ^ 1 ^ 2h

c o o - + I

H3N— C -Hc h 2- s s — c h 2

Cystin

1.3.3. Tính chất lý hoá

l .3.3.1. Lý tính [ 18]

■0 0 C-CH-CH2-S-S-CH 2-CH-C00

n h 3+

c6h12o4n2s2M=240,30

N= 1 1 ,66% s=s=26,69%

1 + NÌỈ3+

Hình 5: Tinh thê L-cystin

10

L-cystin có dạng bột kết tinh màu trắng, thực tế không tan trong nước

và alcol. Có thể hoà tan được trong dung dịch kiềm loãng, khả năng tan trong

nước (g/1) ở nhiệt độ 25°c là 0,112, ở 50°c là 0,239, ở 75°c là 0,523, ở 100°c

là 1,142. L-cystin có góc quay cực từ -215° đến -225° (5%, HC1 IM), nhiệt độ

nóng cháy khoảng 260-26l°c.

1.3.3.2. Hoútính [3]

L-cystin có cấu trúc của một a-amino acid do vậy nó có thể tham gia

các phán ứng tương tự như các a-amino acid khác.

o Phản ứng Biurê:

Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, các liên kết peptid trong protein

kết hợp với ion Cu tạo phức hợp màu tím ở dưới dạng anion. Phản ứng này tạo

phức có màu bền vững và ổn định được dùng để định lượng protein.

R' Ọ

— C H c — N H — C H — c — N H — C H --------

oo

R"

R"

— C H c — N H — C H — c — N i l — C H --------

R' o

CuS04■ -------»Kiềm

R' Ọ

— C l l C = N — C H — c — N — C H --------

0‘o ,Cu

— C H c — N — C H — C — N = C H --------

R' o

2 Na

o Phản ứng với Ninhydrin

Nguyên tắc: Ninhydrin là chất oxy hoá mạnh, khi đun nóng có khả

năng khử nhóm amin và nhóm carboxyl của a-amino acid tạo Ninhydrin khử,

C 0 2, NH3 và aldehyd. Sau đó Ninhydrin và Ninhydrin khử lại phản ứng tiếp

11

với NH3 tự do tạo thành phức hợp màu tím có độ hấp thu cực đại ở Ằ, = 570

nm. Cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ của acid amin.

r- ~ COO H/ )H Ị

+ Hị N ------C ------

0,1II R

1 ^ Ỵ \ / 0H/ \ + nh3 + c = 0 + co2

v ^ c H

\c/

/c —N = c\

Ọ — n h 4

//c —N = c\

o Phản ứng với Fluorescamin:

Nguyên tắc: Tạo sản phẩm huỳnh quang với a-amin của acid amin, đây

là phản ứng rất nhạy cho phép phát hiện acid amin tới hàng ngàn nano gram.

H R

+ H ------N ------ c ----coo'

H H

F luo rescam in A cid am in

o Phản ứng Fohl xác định acid amin chứa lưu huỳnh

Nguyên tắc: L-cystein và L-cystin khi đun nóng trong môi trường kiềm

sẽ phản ứng với muối chì tạo sulfur chì PbS màu đen xám. Cơ chế phản ứng

như sau:

12

C H 2-------SH rI CH2---------OH

C H -N H 2 + 2NaOH -------- ► L - N H 2 + NajS + H20

“ OH COOH

Pb(CH3COO)2 + 2NaOH ---------* pb(OH)2 + 2CH3COONa

Pb(OH)2 + 2NaOH ---------► Pb(ONa)2 + 2 H20

Na2S + Pb(ONa)2 + H20 ———► Pbs I + 4 NaOH

1.3.4. Cách xác định L-cystin tạo thành: [6]

Sau khi thủy phân Keratin hoàn toàn thành L-cystin người ta có thể sử

dụng các phương pháp phân tích khác nhau để xác định L-cystin có trong dịch

thủy phân như: phương pháp Kendan, phương pháp Se ren sen, phương pháp sắc

ký giấy, phương pháp sắc ký trao đổi ion,...

Phương pháp Kendan :

Phương pháp Kendan dựa trên cơ sở dùng acid sulfuric đậm đặc để vô

cơ hóa nguyên liệu, các chất hữu cơ bị đốt cháy thành C 0 2 và H20 còn Nitơ

được chuyển thành (NH4)2S04.

Khi cho dung dịch NaOH tác dụng với (NH4)2S04 thì NH3 sẽ giải

phóng ra, cất kéo NH3 theo hơi nước và chuyển tới bình đựng dung dịch

H2S04 N/50 chuẩn độ. Chuẩn độ H2S04 dư bằng dung dịch NaOH N/50, từ đó

tính ra hàm lượng Nitơ toàn phần có trong dịch thủy phán.

Phương pháp này đánh giá được hàm lượng Nitơ toàn phần có trong chế

phẩm. Tuy nhiên phương pháp này khó phân biệt được lượng Nitơ trong L-

cystin và lượng Nitơ có nguồn gốc khác.

❖ Phương pháp N ỉtơform on (phương pháp Serensen)

Serensen đã dựa vào tính chất hóa học của các acid amin để định lượng

Nitơ của acid amin có trong dịch thủy phân, các acid amin đều có nhóm -

COOH và -NH2, cả 2 nhóm này đều yếu, quá trinh điện ly kém, khi gặp dung

dịch formon thì nhóm -NH2 chuyển thành nhóm metylenic -N=CH2, làm mất

tính kiềm của các acid amin, do vậy mà tính acid của nhóm -COOH mạnh hơn

và có thể định lượng được bằng một chất kiềm mạnh với chỉ thị màu là

phenolphtalein.

Phương trình phản ứng:

D pu — COOH ̂ — CH COOH— CH COOH + HC ^ -------- * I + h 20

N il, H N = c , l ;

R — CH — COOH R — CH — COONa+ NaOH -------- ► I + H2O

N = C H 2 N = C H 2

Phương pháp Serensen đã xác định hàm lượng Nitơ amin có trong dịch

thủy phân, nhưng có thể gây sai số vì điểm tương đương khó nhận thấy, mặt

khác nếu không dùng đủ lượng formon để khóa nhóm NH2 thì sẽ gây sai số

thiếu.

❖ Phương pháp Pepe-Steven

Pcpe-Steven đã dựa vào khả năng tạo phức của acid amin với đồng bền

vững trong môi trường kiềm có dung dịch đệm photphat. Hai tác giả đã đề

nghị xác định hàm lượng Nitơ amin theo phương pháp định lượng ion gián tiếp

(phương pháp thừa trừ) theo phương trình phản ứng :

^ y ° ^ c^ °R— C—COOH + Cu++ + H2N - C — R --------- ► I I

N H 2 C O O H r ^ H C ' N H 2 H 2 l s r H C ^ R

14

*

Cu++ + KI ------- ► Cui + h

I2 + Na2s 20 3 ------- ► Na2s 40 6 + Nal

Như vậy việc xác định hàm lượng Nitơ amin được chuyển sang xác định

hàm lượng I2 từ đó để tính ra hàm lượng Cu++ liên kết trong phức chất và suy

ra hàm lượng acid amin Irong dịch thủy phân.

♦> Phương pháp sắc ký giấy:

So sánh Rị của mẫu ihử với R, của mẫu chuẩn trong cùng một điều kiện,

từ đó suy ra acid amin có trong mẫu thử. Hệ dung môi sử dụng là n- butanol :

acid acetic : nước = 4:1:5. Hiện màu bằng thuốc thử Ninhydrin.

❖ Phương pháp tách các acid amin bằng sắc ký trao đổi ion

Dùng nhựa trao đổi ion để tách riêng các acid amin có trong dịch thủy

phân. Các nhựa thường được sử dụng trong sắc ký tách acid amin là: Dowex-

50, Dowex 2x8, Amberlite-IR-4B, Amberlite IRC-120, Amberlite IRC-50,

Wofatit Kps-200,...

Các acid amin thường được tách ricng biệt nhờ cột chứa cationit gắn

Na+, H+ và anionit gắn O H . ở môi trường có pH khác nhau, các acid amin

tách ra và hòa tan vào dung dịch rồi dịch chuyển theo dung dịch với tốc độ

dịch chuyển khác nhau. Người ta hứng dung dịch theo từng phần nhỏ, mỗi loại

acid amin được phân bố theo những phần nhất định. Kỹ thuật sắc ký trao đổi

ion có ý nghĩa rất lớn trong việc định tính, định lượng và tách từng acid amin

riêng biệt ra khỏi dung dịch thủy phân.

1.3.5. Tác dụng sinh học và ứng dụng

L-cystin chiếm một tỷ lệ lớn trong tóc khoảng 14% và 12,1% trong

sừng, ngoài ra nó còn chiếm một tỷ lệ ít hơn trong da (2 đến 4%). L-cystin

tham gia vào quá trình tổng hợp Keratin (chất sừng) của tóc và móng. Nó thúc

15

đẩy sự tăng sinh của tế bào mầm ở các vùng tạo chất sừng và có ảnh hưởng

đến sự tăng trưởng của chúng. Tác dụng này đã được chứng minh qua các thử

nghiệm có đánh dấu bằng phóng xạ ở các nhân của tế bào mầm.

L-cystin được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh về lông, tóc, móng

như : tóc móng dễ gẫy, chẻ; chống rụng tóc; hoạt hóa sự mọc tóc, chăm sóc và

giúp cho tóc móng tăng trưởng. Ngoài ra nó còn được sử dụng để điều trị các

chứng ngứa và các bệnh lý biểu bì da, tóc, móng; sạm da, chàm, ban da, nổi

mề đay; viêm nhiễm mụn nhọt, trứng cá trên da...

L-cystin thường xuất hiện dưới dạng các chế phẩm như: viên nang mềm

500m g X 12 vỉ X 5 viên, viên nén bao film hộp 20 v iên ,...

Một số chế phẩm có trên thị trường hiện nay như : Blooming, L-cystin

500,...có công dụng điều trị các bệnh về suy nhược cơ thể, các chứng liên

quan đến da, tóc, biểu bì. Liều lượng trung bình dành cho người lớn và trẻ em

trên 8 tuổi là 1 viên nang 500mg X 2 lần mỗi ngày, nên dùng liên tục 2-3

Iháng hoặc 10-20 ngày mỗi tháng.

2. PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ :

2.1. Phương pháp điều chê theo V ogel:

• Nội dung phương pháp [19]

Thuỷ phân

Keratin --------— ------► HOOC-CH-CH2-S—S-CH2-CH-COOH(Tóc, sừng) 0 N H 2 N H 2

L-cystin

Cân 500g tóc cho vào bình cầu ba cổ, thêm vào 1000 ml hỗn hợp acid

hydrochloric đặc và acid formic theo tỷ lệ 1:1. Đun cách dầu hồi lưu ở nhiệt

độ 120 C cho đến khi phản ứng Biurê trở nên âm tính (khoảng 20h). Tẩy màu

bằng khoảng 12g than hoạt, lọc nóng và cô đặc dịch lọc đến khi tạo thành sirô

có khối lượng không đổi. Hòa tan phần sirô trong 250ml nước cất, thêm từ từ

16

dung dịch Na acetat 50% cho đến khi dung dịch có pH khoảng từ 4-5. Để yên

hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, rửa tủa

nhiều lần bằng 50ml nước cất 60°c. Tinh chế sản phẩm bằng cách hòa tan

trong 750ml acid hydrochloric IM và tẩy màu bằng 5g than hoạt. Nếu dịch

lọc vẫn có màu vàng nhạt, tiếp tục tẩy màu bằng 5g than hoạt. Điều chỉnh dịch

lọc đến pH-4-5 bằng Na acetat 50%. Để yên hỗn hợp ở nhiệt độ phòng

khoảng 5-6h. Tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng 50ml nước cất 60°c.

Khối lượng L-cystin thu được: 25g. Hiệu suất phản ứng: 5%.

Chú ỷ: Sản phẩm thô có thể chứa Tyrosin. Một phần của nó được loại bởi than

hoạt và rửa bằng nước nóng. Nhưng khi kết tinh lại có thể sản phẩm vẫn chứa

Tyrosin nếu thời gian kết tinh để quá 5-6h.

2.2.Phưưng pháp điều chế theo Gortner và Hoffman :

• Nội dung phương pháp [15]

Gortner và Hoffman tiến hành thí nghiệm với dung dịch acid HC1 20%,

lượng acid sử dụng gấp 2-4 lẩn khối lượng tóc. Sau khi tiến hành thủy phân

được hỗn hợp các acid amin, tiến hành kết tinh L-cystin bằng cách đưa về

điểm đẳng điện ở pH=5. Để trong 3 ngày, tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, tiến hành

tinh chế bàng dung dịch HC1 IM và chất hấp phụ bề mặt. Kết quả thu được

sản phẩm L-cystin thô. Ở đây 2 tác giả không sử dụng acid HC1 đặc vì theo

các ông dung dịch acid 20% là tương đối ổn định và ít gây nguy hiểm hơn so

với acid đậm đặc. Hiệu suất L-cystin thu được từ 4-5%.

2.3. Các phương pháp điều chê khác :

Các tác giả này đã khảo sát phản ứng thủy phân tóc bằng acid HC1 đặc

theo những cách khác nhau cụ thể như sau:

Trong bình cầu dung tích 1 lít cho 200g tóc khô sạch và một thể tích

acid clohydric nồng độ 30% hoặc 37% theo tỷ lệ acid/tóc bằng 2:1. Hỗn hợp

đun sôi với sinh hàn hổi lưu trực tiếp trên bếp điện trong thời gian 10 giờ. Sau

khi để nguội đến nhiệt độ phòng, dung dịch thủy phân được trung hòa từ từ

với dung dịch NaOH 30% đến pH = 5, thử phản ứng Biurê để xác định mức độ

thủy phân. Tủa đcn xuất hiện, để qua đêm, lọc và hòa tan trở lại trong acid

clohydric 5%. Lọc để loại hợp chất không tan, rửa tủa bằng 50ml HC1 5%

(chia 3 lẩn). Khử màu toàn bộ dung dịch lọc bằng cách đun nóng với 20g than

hoạt và lắc trong 1 giờ. Lọc và rửa than bằng một ít HC1 5%. Trung hòa dịch

lọc màu vàng nhạt bằng dung dịch NaOH 30% đến pH=5. Để kết tủa trong 3-

4h, lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước nóng để loại Tyrosin. Sản phẩm thu được là

L-cystin, có thể tinh chế bằng một lần hòa tan và kết tủa nữa. Tủa được thử

phản ứng Millon để xác định tạp chất Tyrosin. Hiệu suất phản ứng là : 5%.

2.3.2. Theo tác giả Bành Đức Lâm:

• Nội dung phương pháp [8]

Cho 1 kg tóc vào bình thủy phân 4 lít (có thể chia vào 5 bình nhỏ 1 lít).

Thêm 2 lít HC1 37%. Đậy kín. Ngâm trong thời gian 1 tuần. Tóc mòn ra thành

dịch. Tiến hành thủy phân cách thủy dưới sinh hàn hồi lưu. Sau từng thời gian

2h, 4h, ...14h, 16h lấy một lượng nhỏ dịch đang thủy phân, để nguội. Thử

phản ứng Biurc đến khi âm tính thì ngừng thủy phân, để nguội dịch thủy phân.

Trung hòa bằng dung dịch Na acctat 50% đến pH=5. Để kết tủa trong 4h. Lọc

lấy tủa bằng phễu hút chân không. Hòa tan tủa trong 200ml HC1 5%. Khử

màu dung dịch bằng than hoạt (tỷ lệ than hoạt bằng 2% thể tích dịch lọc) :

đun nóng dịch lọc đến 60°c cho than hoạt vào khuấy đều trong 30’. Để yên

3h. Lọc loại than hoạt và rửa than bàng 50ml HC1 5%. Trung hòa dịch lọc

bằng dung dịch Na acetat 50% đến pH=5. Để kết tủa 4h. Lọc lấy tủa. Rửa tủa

18

nhiều lần bằng nước nóng, sản phẩm thu được là L-Cystin thô. Có thể tinh chế

bằng cách hòa tan và kết tủa lần nữa. Sấy ở nhiệt độ 60-70°C đến khô.

Hiệu suất sản phẩm thu được là: 5%

19

PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u :

1.1.Nguyên liệu:

Nguyên liệu chính được sử dụng để chiết xuất L-cystin là tóc. Tóc được

thu mua tại các hiệu cắt tóc. Trước khi sử dụng nguyên liệu cần phải loại bỏ

các tạp chất cơ học. Đặc biệt khi rửa nguyên liệu cần chú ý loại bỏ các chất

dầu mỡ và dầu tự nhiên. Nên rửa sạch nguyên liệu bằng nước nhiều lần sau đó

ngâm nguyên liệu trong nước xà phòng, vò kỹ. Rửa lại cho hết xà phòng. Đổ

khô.

Ngoài ra một nguyên liệu khác chứa hàm lượng L-cystin tương đối cao

cũng được sử dụng là sừng trâu, bò. Nguyên liệu này được thu mua từ các lò

mổ và những nơi chế biến đồ thủ công mỹ nghệ. Dạng nguyên liệu là những

phế phám không còn được sử dụng để gia công chế biến. Trước khi sử dụng

tiến hành loại bỏ phần tủy, rửa sạch, để khô.

1.2.Hóa chất và thuốc thử :

Bảng 1: Bảng hóa chất và thuốc thử được sử dụng trong klióa luận

Tên hoá chất và thuốc thử Nguồn gốc

Acid clohydric đậm đặc Trung Quốc

Acid Formic Trung Quốc

Natri acetat Trung Quốc

NaOH Trung Quốc

Nước cất Xí nghiệp Dược phẩm TW II

Than hoạt Việt nam

Chí thị mầu vạn năng Merck (Đức)

20

1.3.Thiết bị và máy móc:

• Bình cầu 3 cổ 1 lít

• Sinh hàn hồi lun

• Nhiệt kế thủy ngân-Trung Quốc

• Máy khuấy từ IKA-Đức

• Tủ hốt Labconco-Mỹ

• Máy cất quay Buchi B-480-Thụy Sỹ

• Dụng cụ thủy tinh sạch, sấy khô

• Cân phân tích METTLER TOLEDO AB204S-Thụy Sỹ

• Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S-ĐỨC

• Phân cực kế A-KRUSS PlOOO-Đức

• Máy đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp

• Tủ sấy Memmert-Đức

1.4.Phương pháp nghiên cứu và cách xác định hàm lượng L-cystin tạo

thành.

1.4.1. Phương pháp nghiên cứu:

Như đã trình bày ở phần tổng quan, phương pháp nghiên cứu mà chúng

tồi lựa chọn để điều chế L-cystin là thủy phân tóc, sừng trong môi trường acid.

Phương pháp này được khái quát hóa dưới dạng sơ đồ như sau:

*

21

Hình 6: Sơ dồ điều chếL-cystin.

22

1.4.2. Phương pháp định lượng L-cystỉn theo Dược điển A nh BP 1998: [ 13]

Cách tiến hành: Trong bình nón có nút mài, hoà tan chính xác khoảng

0,100 g L-cystin vào hỗn hợp 2 ml NaOH loãng và 10 ml nước. Thêm 10ml

dung dịch KBr 200g/t, 50ml dung dịch KBr03 0,0167M và 15ml dung địch

acid HC1 loãng. Đậy kín bình nón và làm lạnh trong nước đá, để trong chỗ tối

khoảng 10 phút. Thêm l,5g KI vào bình. Sau 1 phút, đem chuẩn độ bằng dung

dịch Na2S20 3 0,1M cho đến khi dung dịch có màu vàng nhạt, thêm lml chỉ thị

hồ tinh bột, tiếp tục định lượng đến khi màu chuyển từ xanh thẫm đến không

màu thì ngừng chuẩn độ. Ghi V ml N a ^ c ^ 0,1M đã dùng: Vthử.

Song song tiến hành mẫu trắng: Vtrắng.

Iml dung dịch KBr03 0,0167M tương đương với 2,403 mg

c 6h 12n 2o 4S2-

Công thức tính kết quả định lượng:

(Vtrắng - Vthử) X 2,403% L- cystin = ------------------------------------

mTrong đó m (g) là khối lượng L-cystin cân ban đầu.

Hàm lượng L-cystin phải đạt từ 98,5- 101,0% C6H 12N20 4S2 tính theo

chế phẩm đã được làm khan.

2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT :

Trong phần này chúng tôi tiến hành khảo sát một vài yếu tố ảnh hưởng

tới quy trình điều chế L-cystin nhằm hoàn thiện quy trình và tạo ra lượng sản

phẩm L-cystin có độ tinh khiết phù hợp cho các giai đoạn tổng hợp sau.

2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ acid tới hiệu suất của phản ứng

thủy phân:

2.1.1. Đối với nguyên liệu tóc

23

Phản ứng thủy phân được thực hiện bằng việc hổi lưu nguyên liệu tóc

trong acid HC1 với các nồng độ khác nhau theo tỷ lệ aciđ/tóc = 2:1. Tỷ lệ này

chúng tôi sử dụng theo tài liệu [11][ 19] và cho là hợp lý vì lượng tóc sau khi

cắt nhỏ phải được làm ngập trong ỉ lượng acid tối thiểu. Ở giai đoạn đầu tiên

việc thực hiện khuấy ỉà rất khó. Chỉ sau khi hồi lưu khoảng 3h, khi tóc đã mủn

ra thì vừa hồi lưu vừa khuấy để phản ứng thủy phân được tốt hơn.

Khí HC1 thoát ra từ phản ứng cần được rửa qua 1 bình rửa đựng dung

dịch NaOH loãng.

Tiến hành khảo sát với các nồng độ acid khác nhau chúng tôi thu được

kết quả như sau:

Bảng 2: Bảng khảo sát nồng độ acid thay đổi với nguyên liệu tóc

Thínghiệm

Lương tóc'(g)

Thời gian(h)

Nồng độ acỉdHC1 (%) Hiệu suất (%)

1 100 20 10 1,762 100 20 15 2,673 100 20 20 3,44 100 20 37 4,05

Kết quả của quá trình khảo sát trên được thể hiện rõ hơn trong biểu đồ sau:

Hình 7: Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid đến hiệu suất phản

ứng đổi với nguyên liệu tốc

Nhận xét: Qua 4 thí nghiệm, hiệu suất L-cystin thu được thay đổi khá

nhiều khi nồng độ acid biến đổi từ 10% đến 37%.

Đe theo dõi ảnh hưởng của nồng độ acid đến hiệu suất của sản phẩm

thu được chúng tôi cố định thời gian thủy phân là 20h. Khi đó phản ứng Biurê

của loại acid có nồng độ thấp nhất (10%) là âm tính thì phản ứng thủy phân

cũng chưa xảy ra hoàn toàn. Chúng tôi chọn thời gian này để khảo sát các

thông số khác và thấy rằng, trong thực tế sản xuất nên dùng loại acid HC1

20% v ì :

• Việc sử dụng acid đặc có nhiều điểm bất lợi: gây ô nhiễm môi

trường, khả năng ăn mòn thiết bị cao và dễ xảy ra tai nạn lao

động.

• Các acid có nồng độ thấp hơn, mặc dù phản ứng Biurê (xác định

sự thủy phân protein) đã âm tính nhưng thực tế phản ứng thủy

A phân tóc vẫn chưa xảy ra hoàn toàn nên hiệu suất các phản ứng

thấp.

2.1.2. Đối vói nguyên liệu sừng :

Tiến hành khảo sát tương tự như với nguyên liệu tóc với tỷ lệ sừng/acid

= 1/2 chúng tôi thu được kết quả sau:

Bủììg 3 : Bảng khảo sát nồng độ acid thay đổi với nguyên liệu sừng

Thínghiệm Lượng sừng (g) Thời gian

(h)Nồng độ acid

HC1 (%)Hỉẽu suất

(% )1 50 20 15 4,212 50 20 20 5,033 50 20 25 5,144 50 20 37 6,24

Kết quả được trình bày theo biểu đồ sau:

25

Hình 8: Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid đến hiệu suất phản

ứng đối với nguyên liệu sừng

Nhận xét: Hiệu suất cao nhất đạt được là khi sử dụng HC1 đặc (6,24%)

cho thấy việc sử dụng acid đặc làm tăng khả năng thủy phân sừng, các nồng

độ acid khác cũng cho hiệu suất tương đối cao. Tuy nhiên, cần phải tiếp tục

tiến hành thêm thí nghiệm để tìm nồng độ acid phù hợp cho quá trình thủy

phân nguyên liệu này. Trước khi thực hiện phản ứng thủy phân cần phải cưa

ngắn và chẻ nhỏ sừng nguyên liệu để phản ứng dễ dàng hơn. Điều này rất

thuận lợi nếu sử dụng các phế liệu phoi sừng từ các xưởng thủ cồng mỹ nghệ.

2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian thuỷ phản tới hiệu suất phản

ứng thủy phân:

2.2.1. Đôi vói nguyên liệu tóc

Sau khi chọn được nồng độ acid dùng thủy phân thích hợp là 20%

chúng tôi tiến hành khảo sát với yếu tố thời gian thay đổi để tìm thời gian thủy

phân hợp lý. Điều này đặc biệt có ý nghĩa đổi với các cơ sở không có điều

kiện thử phản ứng Biurê.

Thí nghiệm được tiến hành tương tự như trên với kết quả thu được như sau:

26

Bảng 4 : Bảng khảo sát thời gian thay đổi với nguyên liệu tóc

Thí nghiệm Lượng tóc(g)

Lượng acid HC1 20% (ml)

Thời gian (h) Hiệu suất (%)

1 100 200 16 2,172 100 200 17 2,963 100 200 18 3,144 100 200 19 3,255 100 200 20 3,406 100 200 21 3,747 100 200 22 3,948 100 200 23 4,099 100 200 23h30 4,1210 100 200 24 4,05

Ta có thể xem xct kết quả trcn theo biểu đồ:

Hình 9: Biểu đồ khảo sát sự phụ thuộc hiệu suất phản ứng vào thời gian thủyphân đối với nguyên liệu tóc

Nhận x é t: Từ bảng 4 ta thấy yếu tố thời gian có ảnh hưởng tới hiệu suất

L-cystin thu được. Thời gian tăng dần từ 16h đến 23h30 thì hiệu suất L-cystin

thu được cũng tăng dần từ 2,17% đến 4,12%, tuy nhiên nếu thời gian thủy

phân lớn hơn 23h30 thì hiệu suất phản ứng không tăng. Như vậy, chúng tôi có

thể kết luận rằng với nồng độ acid HC1 20% thì thời gian thủy phân thích hợp

là từ 23h đến 23h30\

2.2.2. Đôi vói nguyên liệu sừng:

27

Như đã trình bày trong phần 2.1.2, hiệu suất khi thủy phân sừng đạt

được cao nhất là sử dụng HC1 đặc ở thời gian 20h (6,24%). Tuy nhiên điều

kiện phòng thí nghiệm không cho phép thực hiện phản ứng này quá nhiều vì

hơi acid làm ô nhiễm môi trường quá nặng. Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ

acid hợp lý trong trường hợp thủy phân tóc là 20% để khảo sát thí nghiệm này.

Kết quả thu được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 5 : Khảo sát thời gian thay đổi với nguyên liệu sừng

Thí nghiệm Lương sừng‘ (g)

Lượng acid H ci 20% sử

dụng (ml) Thời gian (h) Hiẻu suất(% )

1 50 100 17 4,122 50 100 18 4,573 50 100 19 4,824 50 100 20 5,035 50 100 21 5,046 50 100 22 5,04

Biểu đồ kết quả như sau :

Hình 10: Biểu đồ khảo sát sự phụ thuộc hiệu suất phản ứng vào thời gian

thủy pliân đối với nguyên liệu sừng

28

Nhận x é t : Từ kết quả trên ta thấy hiệu suất thủy phân nguyên liệu sừng

cũng chịu ảnh hưởng của thời gian tương tự như nguyên liệu tóc. Hiệu suất sản

phẩm thu được tỷ lệ thuận với thời gian thủy phân và hiệu suất đạt được khi

thủy phân trong 20h là 5,03%. So sánh với hiệu suất thu được từ tóc (3,4%) ta

thấy trong cùng khoảng thời gian thủy phân 20h thì sừng cho hiệu suất cao

hơn. Điều này cho thấy sừng cũng là một nguyên liệu cần được quan tâm

nghiên cứu khi tiến hành điều chế L-cystin.

2.3. Khảo sát và tỏi ưu hóa giai đoạn tách và tinh chế L-cystin

2.3.1. Nghiên cứu giai đoạn cất loại nước acid sau khi thủy phàn

Theo các phương pháp đã biết, sau khi kết thúc giai đoạn thủy phân cần

tẩy màu và lọc. Sau đó cất loại nước acid của khối phản ứng đến dạng sirô

trước khi tinh chế.

Việc cất loại nước acid của khối phản ứng sau khi thủy phân trong sản

xuất ở qui mô công nghiệp rất khó thực hiện v ì :

• Khả năng gây ô nhiễm môi trường cao.

• Tính ăn mòn thiết bị của HC1.

• Tốn năng lượng, thời gian.

Do đó chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của quá trình cất loại

nước acid tới hiệu suất của phản ứng nhằm mục đích loại bỏ công đoạn này

trong sản xuất.

Sau khi phản ứng thủy phân kết thúc, tiến hành tẩy màu và lọc. Dịch lọc

được xử lý theo 2 hướng khác nhau:

• Cất loại nước acid đến dạng sirô và tinh chế.

• Tách và tinh chế ngay không cần cất loại nước acid.

Kết quả của các thí nghiệm này được trình bày trong bảng sau:

29

Bảng 6 : Khảo sát ảnh hưởng của quá trình cất loại nước acid

Thínghiệm

Lượngtóc (g)

Nồng độ acid HCI

(% )

Thời gian (h)

Quá trình cất loại nước

acid

Hiêu suất(%)

Hiệu suất tb

(%)

1 100 20 20 Có 3,40 3,362 100 20 20 Có 3,323 100 20 20 Không 3,25 3,1254 100 20 20 Không 3,00

Nếu tính trung bình hiệu suất L-cystin thu được từ số lần thí nghiệm có

cất loại nước acid (3,36%) và số lần thí nghiệm không cất loại nước acid

(3,125%) thì hiệu suất ở các thí nghiệm có cất loại nước acid cao hơn không

nhiều (0,235%), về mặt lý thuyết điều này không có nhiều ý nghĩa khoa học

tuy nhiên nó lại rất có lợi về mặt thực tiễn sản xuất bởi khi cất quay sẽ có một

lượng lớn năng lượng bị tiêu tốn và như vậy tất yếu sẽ làm tăng giá thành sản

phẩm. Từ những nhận định trên chúng tôi suy ra rằng để tiết kiệm trong khâu

sản xuất và giảm giá thành thì trong qui trình điều chế L-cystin có thể không

cần sử dụng cách loại nước acid bằng cất quay mà giữ nguyên dịch lọc để tiến

hành các giai đoạn tiếp theo.

2.3.2. Trung hòa dịch lạc

Sau khi tẩy màu, khối phản ứng cần được đưa về pH thích hợp (pH đẳng

điện) để kết tủa acid amin. Nhiều tài liệu [8][19J chỉ dùng Na acctat, một số

tài liệu khác [11] lại dùng NaOH. Khi chỉ sử dụng Na acetat nguyên liệu này

có nhiều ưu điểm như:

• Dễ điều chỉnh pH.

• Không phá hủy chế phẩm.

• Tạo thành lượng quá bão hòa đẩy L-cystin ra khỏi dung dịch làm

tăng hiệu suất của chế phẩm.

30

Tuy nhiên giá thành của nó tương đối cao. Để khắc phục nhược điểm

này chúng tôi sử dụng dung dịch NaOH 20%. Việc dùng NaOH 20% cũng tồn

tại một vài nhược điểm: khó điều chỉnh pH, dễ gây môi trường quá kiềm làm

chế phẩm bị phân hủy. Do đó chúng tôi đã sử dụng cả 2 dạng nguyên liệu để

tiến hành trung hòa, dùng dung dịch NaOH 20% trung hòa cho tới gần điểm

pH qui định rồi sử dụng Na acetat để điều chỉnh cho đến khi đạt pH thích hợp.

Mặt khác, nếu chỉ dùng riêng Na acctat để trung hòa thì phải dùng khoảng

250ml Na acctat 50% mới đạt đến pH=5, còn khi sử dụng đồng thời cả 2

nguycn liệu thì lượng NaOH 20% cần dùng là 90ml và lượng Na acetat 50%

sử dụng giảm xuống còn 20ml. Giá thành của quá trình sẽ giảm xuống nếu

sản xuất ở qui mô công nghiệp vì nguycn liệu NaOH rẻ hơn và ít tốn hơn Na

acetat.

2.4.Kết quả phân tích phổ và biện giải các phổ:

2.4.1. Biện giải phổ hồng ngoại:

Phân tích phổ hồng ngoại (ỈR) được ghi trcn máy Perkin Elmer với kỹ

thuật làm vicn nén KBr đo trong vùng 4000-500 cm '1 tại Viện Hóa học các

hợp chất thiên nhiên - Trung tâm Khoa học tự nhiên và công nghệ Quốc gia.

Qua nghiên cứu phân tích phổ đồ, chúng tôi nhận biết được các dải hấp

thụ đặc trưng của các nhóm chức và các liên kết của chất điều chế được. Hình

ảnh phổ đồ được in trong phần phụ lục. Sau đây là kết quả thu được :

• Dải hấp thụ nằm trong khoảng 3011,05-2964,17 cm 1 đặc trưng

cho nhóm chức -NH amin.

• Dải hấp thụ nằm trong khoảng 1624,41-1585,42 cm'1 đặc trưng

cho nhóm chức -CO acid.

2.4.2. Biện giải phổ khỏi

Phân tích phổ khối (MS) được ghi trên máy LC-MSD-Trap-SL bằng

phương pháp va chạm electron với năng lượng bắn phá 70eV tại phòng phân

31

lích cấu trúc, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Trung tâm Khoa học tự

nhiên và công nghệ Quốc gia. Kết quả ghi phổ khối được thể hiện ở bảng 8.

Hình ảnh phổ đồ được in trong phần phục lục.

Tiến hành phân tích kết quả ghi phổ trên phổ đồ có thể nhận thấy chất

được ghi phổ có các pic phân mảnh phù hợp với sơ đồ phân mảnh.

Bảng 8: Kết quả phổ khối của chất điều chế được

Nguồn gốcKhôi phổ

Khối lượng M ảnh

H O O C -C H -C H 2- S - S - C H 2-C H -C O O H7NH, NH; 240 M+

0IIHOOC-CH-CH2-S-S-CH2-CH-C—

NHj NH/

+

224 - c 6h 12n 2s a

1 lOOC-CI i - c h 2- s - s - c h 2- c h —

n h 2 nh2

+

195 - q h 1]n 2s2o 2

hooc-ch-ch2-s-s-ci i2— n h 2

+

165 - c 4h 8n s 2o 2

1IOOC—CH-CHi—s—s-1nh2

+

152 - c 3h 6n s 2o 2

hooc- ch-ch2- s—n h 2

+

119 - c 3h 6n s o 2

IIOOC-CH—íNHj

+

74 -

32

❖ Từ các kết quả thu được cho phép chúng tôi kết luận rằng sản phẩm

thu được là L-cystin.

2.5. Kiểm nghiệm một số tiêu chuẩn của L-cystin điều chê được theo tiêu

chuẩn của Dược điển Anh BP 1998.

2.5.1. Năng suất quay cực [ơr0[J:

Dược điển Anh BP 1998 qui định [a20D] từ -218° đến -224° tính theo

chế phẩm đã làm khan.

Hòa tan 0,5g sản phẩm trong 25,0 ml acid HC1 IM. Đo năng suất quay

cực trên phân cực kế A-KRUSS P1000.

Kết quả: [a20D] = - 220,3°.

Kết luận: Đạt tiêu chuẩn.

2.5.2. Định lượng

Dược điển Anh BP 1998 qui định hàm lượng L-cystin phải đạt từ 98,5-

101,0% C6H |2N20 4S2tính theo chế phẩm đã được làm khan.

Tiến hành theo phương pháp ở mục 1.4.2. Kết quả như sau:

v trắng = 35,45 ml

Vlhử = 31,20 ml

Khối lượng cân m = 0,1032 g

% L-cystin trong chế phẩm = 99,97 %.

Kết luận: Đạt ticu chuẩn.

3. BÀN LUẬN

Điều chế L-cystin bằng phản ứng thủy phân Keratin là vấn đề đã được

nhiều tác giả thực hiện và không còn mới. Tuy nhiên để giải quyết các vấn đề

kỹ thuật trong sản xuất phù hợp với từng cơ sở là công việc rất quan trọng.

Với nhiệm vụ tạo nguồn nguyên liệu cho tổng hợp Acetylcystein, chúng tôi đã

lựa chọn đề tài này. Qua quá trình thực nghiệm của bản thân, chúng tôi có

những nhận xét sau:

• Ncn thủy phân tóc trong acid HC1 20% vì dung dịch này tương đối ổn

định và ít nguy hiểm với thời gian thủy phân từ 23h-23h30.

• Có thể xử lý được acid giải phóng trong quá trình thủy phân để tránh ô

nhiễm môi trường.

Ngoài nguyên liệu tóc, các dạng nguyên liệu khác dùng để điều chế L-

cystin còn chưa được nghiên cứu nhiều, khi tham khảo các đề tài trước chúng

tôi nhận thấy mới chỉ có một đề tài của tác giả Bành Đức Lâm [8] là đề cập

đến việc nghiên cứu điều chế L-cystin từ lông gà với hiệu suất 3,6%. Đây

cũng là 1 hướng cần nghiên cứu để tận dụng nguồn nguyên liệu.

Trong đề tài này chúng tôi khảo sát thêm một nguyên liệu nữa để điều

chế L-cystin đó là sừng trâu, bò nhằm tận dụng nguồn nguyên liệu khá phổ

biến trong các hợp tác xã thủ công mỹ nghệ, lò mổ gia súc. Hiệu suất của sản

phẩm thu được từ 5-6%.

Trong quá trình tách và tinh chế L-cystin, giai đoạn cất loại nước acid

sau khi thủy phân bằng phương pháp cất quay rất khó thực hiện trong sản xuất

mà hiệu suất cũng không cao hơn nhiều khi tách L-cystin bằng phương pháp

đưa pH về điểm đẳng điện trực tiếp bằng kiềm. Vì vậy chúng tôi đề nghị bỏ

qua giai đoạn này trong sản xuất.

Cũng trong qui trình điều chế L-cystin, giai đoạn trung hòa dịch lọc

đến pH thích hợp chúng tôi đã sử dụng thêm nguyên liệu NaOH 20% cùng với

Na acetat 50% nhằm tận dụng các ưu điểm của chúng và tiết kiệm chi phí sản

xuất.

34

PHẦN 3 : KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤTTừ những thí nghiệm được thực hiện trong khóa luận chúng tôi đã thu

được một số kết quả và có những đề nghị như sau:

• Đã điều chế được L-cystin từ tóc, sừng đạt tiêu chuẩn là nguyên liệu

cho tổng hợp Acetylcystein.

• Môi trường được sử dụng để thủy phân Keratin từ các nguồn nguyên

liệu khác nhau là acid HC1 20%.

• Thời gian thích hợp cho phản ứng thủy phân L-cystin bằng HC1 20% là

từ 20h đến 23h.

• Đã nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế L-cystin nhằm tiết

kiệm năng ỉưựng và nguyên phụ liệu.

• Từ kết quả nghiên cứu đã có này chúng tôi đề nghị một qui trình điều

chế L-cystin như sau:

o Đôi vói nguyên liệu tóc:

Cân 500g tóc cho vào bình cầu ba cổ, thêm vào 1000 ml acid

hydrochloric 20%. Đun cách dầu hồi lưu ở nhiệt độ 120 c cho đến khi phản

ứng Biurê trở nên âm tính (thời gian thủy phân khoảng 23h-23h30). Tẩy màu

bằng 12g than hoạt, lọc nóng. Để nguội. Thêm từ từ dung dịch NaOH 20%

đến gần khoảng pH 4-5, tiếp tục điều chỉnh đến pH-5 bằng Na acetat 50%.

Để yên hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, rửa

tủa nhiều lẩn bằng 50ml nước cất 60°c. Tinh chế sản phẩm bằng cách hòa tan

trong 750ml acid hydrochloric IM và tẩy màu bằng 5g than hoạt. Nếu dịch

lọc vẫn có màu vàng nhạt, tiếp tục tẩy màu bằng 5g than hoạt. Điều chỉnh pH

dịch lọc bàng NaOH 20% và Na acetat 50%. Để yên hỗn hợp ở nhiệt độ phòng

khoảng 5-6h. Lọc lấy tinh thể, rửa bằng 50ml nước cất 60°c. Sấy khô. Hiệu

suất L-cystin thu được khoảng 4-5%.

35

o Đối với nguyên liệu sừng:

Phản ứng thủy phân và xử lý khối phản ứng sau thủy phân tương tự như

đối với nguyên liệu tóc.

36

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Trần Thị Ân, Sinh hóa học, N.X.B Y học và Thể dục thể thao, trang 33,

39.

2. Trần Mạnh Bình, Ngô Mai Anh, Nguyễn Quang Đạt, Giang Thị Sơn,

Phạm Minh Thủy (1999), Hóa học hữu cơ Dược, Trường Đại học Dược

Hà nội, trang 159-170.

3. Đào Kim Chi, Nguyễn Xuân Thắng (2000), Thực tập hóa sinh, Trường

Đại học Dược Hà nội, trang 6-12.

4. Đào Kim Chi, Nguyễn Xuân Thắng, Nguyễn Duy Thiệp (2001), Hóa

Sinh I, Trường Đại học Dược Hà nội, trang 40-63.

5. Dược điển Việt Nam ///, trang 11, 147.

6. Lê Quang Đán (1988), Góp phần nghiên cứu phương pháp xác định

điều kiện thủy phân và kết tinh acid amin, Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ

đại học.

7. Kỷ yếu các công trình viện Dược liệu (1961-1971), N.X.B Y học và Thể

dục thê thao, trang 14.

8. Bành Đức Lâm (1985), Góp phần nghiên cứu chiết tách Cystin từ tóc

và lông gà, Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ đại học.

9. Mai Long (1970), Hóa lý, N.X.B Y học và Thể dục thể thao, trang 395.

10. Nguyễn Quang Lộc (1971), Kỹ thuật ép dầu và chế biến dấu mỡ thực

phẩm, N.X.B Khoa học và Kỹ thuật, trang 172.

11. Lê Thị Vinh và cộng sự (1984), Tap chí Dược học s ổ 2, trang 15.

37

TIẾNG ANH

12. Boyd and Morrison (2001), Organic chemistry, p 1132-1163.

13. British Pharmacopoeia (1998), p 423.

14. Cytil Long (1961), Biochemists Handbook, p 701.

15. Gortner R.A. and Hoffman W.F. (1941), Organic Syntheses, Colective

Vol I. p 194.

16. Houbcn-Weyl (1958), Metoden der org chemie, p 429.

17. Jocclyn p.c. (1972), Biochemistry o f the S-H group, London, p 243.

18. The Merck Index (2001 j, p 2815.

19. Vogel’s text book o f practical organic chemistry (1985), Fourth

Edition, Longman, London and New York, p 560.

38

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: Phổ hổng ngoại của tóc

PHỤ LỤC 2: Phổ hổng ngoại của sừng

PHỤ LỤC 3: Phổ khối của tóc

PHỤ LỤC 4: Phổ khối của sừng

2.2

0

\8

\6

1. 4

1.2

i . o

0.8

0.6

0.4

0.2

0 0

w>

/ ' .ỵ 2915 00

V'

?740 49

2584 84

VẠV

3447 <12 \ 2085 45

AV /

4000 3500 3000 2500 2000

Wavenumbers (cm-1)

1500 1000 500

Date: Sat May 14 03:40:27 2005

Scans 32

Resolution: 4.000

HT. KBr IKK >c—Cl [—Clh—s — s —c 11 .—Cl I — COOJII,,, ‘ 'Nil: NII2

l.-CVSTIN

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Wavenumbers (cm-1)

Date: Sat May 14 03:29:38 2005 HS. KBr IIOO C— t ’ H — ( 'M r— s — S— n i l — C l I— COOII

L j .Scans 32 N112 N II2

Resolution: 4 000 I (’YSTIN

Display Report - Selected Window Selected

A n a ly s is NameQ17.d

Mẹ t h o d : Copy of QUANG.M

S a m p le Na HT

A n a ly s is Inf

Inters X 1 0 ' i

I

I n s t m m e LC-MSD-Trap-SL

O perator: Adm inistratorP r in t Dat 05/24/03:16:

A cq . Date 8S/23/ỞỘ21:24:05

► M S , 1 8 m i r i | # 2 14 ■

240 8I

2i

1 -

1 1 8 . 9

135 91 5 1 8

154

S'! .0

7 4 0

60 80 100 120 uo 160

' 9 4 7

2 0 3 5

2 DO

223 e

22 D

I .2 4 0 mJz

H O O C— C H -C i l :— s — s — C1Í;— CM— coon

N in N H :

L - C V S T I N Agilem Ĩ6L iiiôlogie

MSD Trap Report v2 Paoe 1 of 1

Display Report - Selected Window Selected

A n a lys is NameQ17.d

M eth od: Copy o f QUANG.M

S a m p le Na HT

A n a lys is Inf

Inters I X 1 0 6 :

In s t ru m e LC-MSD-Trap-SL

O perator: Adm inistratorPrint D at 05/24/03:16:

Acq. D ate 0l/23/ớf21 :24:05

^M S2(240 St. 2 6 min (#359 )

■ SO

74 1

BŨ ' ũ :

' 2 1 3

' 4 0 150

2 2 3 82 0 5 s

200 220 2ÍŨ rrvz

H()( )C— C M — c ỉ h— s — s — c 1 h— c I i — ()(111I

NH: NH; Agilent Technologic

L-CYST1N

MSD Trap Report v2 Page 1 of 1

Display Report - Selected Window Selected

A n a lys is NameQ18.d

M ethod: Copy of QUANG.M

S a m p le Na HS

Ana lys is In f

In s t ru m e LC-MSD-Trap-SL

O p e ra to r : Adm inistrator

Intens ■X'O r

6 -■

P r in t D a t 05/24/03:17:

Acq. D ate ẽÌ/23/ữệ21:37:00

* VS 07:r>tn s-.cv

240 6

74.1

151.8

121 s136 6

177 s'5-5.6

6 0 80 100 120 1 4 0 'SC ' 6 : 200 220 2 4 0

H O O C — c I i — c H— s — s — c 1I;— c H — COOHINH; NH;

L-CYSTINAgilent Technologies

MSD Trap Report v2 Page 1 of 1

Display Report - Selected Window Selected

An a lys is Nam eQIS.d

M eth od: Copy of QUANG.M

S am p le Na HS

A n a ly s i s Inf

In st ru m e LC-MSD-Trap-SL O perator: Adm inistrator

Print Dat 05/24/03:17:

Acq. D ate 0f/23/S$ 21:37:00

n i e n s . .

x 1 0 7

20 iM S 2 ( 2 4 0 ’. 8 t 1 1 m i n ' ( # i 5 4 i

1 5 1 6I

10

6 0

1 2 1 9

74 1 88 0 136 6

SO 100 120 140 160

177 Ễ

is:

•94 s

2 0 5 8 2 2 3 8

200 22C 2 4 0 m / z

!! ooc —c H —c II;—S— s—CH;—CH—CO 011 N Ih N i l :

I O S Ĩ 1 N Agtienl Technologies

MSD Trap Report v2 Page 1 of 1