kisela fosfataza 2014

1

Kisela fosfataza

Predavanja iz Kliničke enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska

biohemija Školska 2014/2015. godina

Biohemijski markeri remodelovanja kostiju

Enzimski markeri stvaranja kostiju ALP Enzimski markeri razgradnje – resorpcije kostiju ACP

• Izoenzimi i izoforme markeri remodelovanja kostiju – BALP Bone alkaline phosphatase Koštana alkalna fosfataza – TRACP tartarat rezistentna kisela fosfataza

2

3

Kisela fosfataza

• Uloga i karakteristike enzima • Distribucija enzima u organizmu • Izoenzimi i izoforme • Klinički značaj • Tartarat rezistentna kisela fosfataza • Analitika ACP i TR-ACP • Preanalitičke varijacije • Referentne vrednosti

4

Kisela fosfataza

• Skraćenica: ACP acid phosphatase ili KF

• Enzimski broj: EC 3.1.3.2, ortofosforna- monoestar fosfohidrolaza (kiseli optimalni pH)

• Klasa hidrolaza

• Grupa enzima koja hidrolizuje ortofosfatne monoestre

• Ortofosfatni monoestar + H2O → alkohol + H3PO4

• Obuhvata sve fosfataze sa optimalnim pH ispod 7

• Deluje na prirodne i sintetičke supstrate

• Izoenzimi ili izoforme kiselih fosfataza razlikuju se po rasprostranjenosti u tkivima, hromozomskom poreklu, molekulskoj masi, homologiji aminokiselina, dužini sekvence amino kiselina, rezistenciji na tartarat i fluorid.

5

Kisela fosfataza Ćelijska lokalizacija • Lizozomalna ACP

– ACP je prisutna u lizozomima, a to su organele prisutne u svim ćelijama izuzev eritrocita.

• Ekstralizozomalna ACP je prisutna u mnogim ćelijama Distribucija u tkivima • Najveća koncentracija ACP je u prostati, kostima (osteoklastima),

slezini Distribucija kisele fosfataze u krvi • Eritrociti, trombociti i leukociti

6

Kisela fosfataza

• Na osnovu svojstava inhibicije L-(+)-tartaratom podeljene su na

• Tartarat osetljive kisele fosfataze

– lizozomalna i prostatična ACP su jako inhibirane tartaratnim jonom

• Tartarat rezistentne kisele fosfataze

– eritrocitna i koštana ACP

• Serumska kisela fosfataza

– Najveći deo aktivnosti ACP u normalnom (nehemolizovanom)

serumu je tartarat rezistentna forma TR-ACP i potiče iz osteoklasta

7

Izoenzimi i izoforme kisele fosfataze

Pet tipova kisele fosfataze (4 izoenzima)

Elektroforetska pokretljivost na PAAG 1. Lizozomalna LAP tip 3

– Mast ćelije

2. Prostatična kisela fosfataza PACP tip 2b – Prostata, mozak, slezina, jetra, trombociti

3. Eritrocitna EACP tip 1 – Eritrociti

4. A. Makrofagna MACP tip 5a – Makrofage jetre, slezine i pluća

B. Osteoklastna OsACP tip 5b – Osteoklasti kostiju

8

Kisela fosfataza

• 4 gena za kiselu fosfatazu.

• Gen za eritrocitnu - hromozom 2

• Gen za TR-ACP osteoklasta i makrofaga - hromozom 19

• eksprimira se u osteoklastima i makrofagama drugih tkiva

– makrofage alveola i Kupferove ćelije (tip 5 ACP)

– Izoenzim 5 se sastoji iz dve strukturno slične izoforme koje se razlikuju

u sadržaju ugljenih hidrata.

• Tip 5a makrofage i dendritske ćelije

• Tip 5b više specifičan za osteoklaste

• Geni za lizozomalni izoenzim - hromozom 11

• Gen za prostatičnu ACP – hromozom 13

• Lizozomalni i prostatični gen pokazuju homologiju

9

Svojstva kisele fosfataze

• Stabilnost kisele fosfataze – nestabilna

– Na temperaturi preko 370C

– Nestabilna u alkalnoj sredini, pH >7,0

– Neke forme u serumu su labilne i više od 30 % ACP aktivnosti se gubi

tokom 3 sata na sobnoj temperaturi

– Acidifikacija seruma na pH ispod 6,5 pomaže u stabilizaciji enzimske

aktivnosti.

• Uticaj jona, aktivatora i inhibitora – Na aktivnost ne utiču joni Mg 2+ i Zn 2+. – Aktivnost ACP stimulišu hidroksilna jedinjenja - akceptori fosfata – Izoenzimi ACP se međusobno razlikuju i po osetljivosti prema

inhibitorima kao što su etanol, formaldehid, L-(+)-tartarat, gvožđe, bakar i fluorid.

10

Lizozomalna kisela fosfataza • Deficijencija LACP • Autozomalno recesivno oboljenje • Poremećaji u metabolizmu Prostatična kisela fosfataza • Serumski marker kancera prostate • U semenoj tečnosti • Marker u forenzici za seksualne delikte • Ranije se prostatična ili tartarat osetljiva kisela fosfataza koristila za praćenje

karcinoma prostate ali sada je u potpunosti zamenjena sa prostata- specifičnim antigenom (PSA).

• Novija ispitivanja prognostičkog značaja PACP

• Vrednosti su višestruko povećane kod karcinoma prostate

Eritrocitna kisela fosfataza • EACP pokazuje genetski polimorfizam • Utvrđivanje očinstva • Poremećaj hemolitički favizam

Izoenzimi kisele fosfataze

11

Genetski polimorfizam eritrocitne kisele fosfataze Genski lokus ACP1 ima četiri alela A, B, C i R

12

Osteoklastna kisela fosfataza Tartarat rezistentna kisela fosfataza

• Osteoklasti produkuju i izlučuju

tartarat rezistentnu kiselu fosfatazu

u toku resorpcije kostiju

• Svojstva tartarat rezistentne kisele fosfataze – Glikoprotein 35 KDa, – Aktivan centar binuklearno gvožđe – Aktivnost ACP u serumu je merena brojnim metodama, ali one ne mogu

da razdvoje dve izoforme TRACP 5b iz osteoklasta i TRACP 5a iz inflamatornih makrofaga i dendritskih ćelija.

13

Osteoklastna kisela fosfataza Tartarat rezistentna kisela fosfataza

Svojstva izoformi TRACP

– Izoforme se razlikuju u sadržaju ugljenih hidrata

– ACP 5a sadrži sijalinsku kiselinu i manozu, a ACP5b samo manozu.

– Forma 5b je dimer dok je 5a monomer

Sintetiše se u inaktivnoj formi

Aktivacija dejstvom cistein proteinaze

– u serumu se javljaju dve forme – aktivna i neaktivna forma

– 10 % TR-ACP cirkuliše u enzimski aktivnoj formi

– 90 % u vidu neaktivnih fragmenata

14

Remodelovanje kostiju i oslobađanje TR-ACP

15

Klinički značaj tartarat rezistentne kisele fosfataze

• Dejstvo TR-ACP – Deluje na prirodne i sintetičke fosfatne supstrate – Fosfoproteine matriksa kostiju osteopontin i koštani sijaloprotein

• TR-ACP je potencijalno važan marker u stanjima značajne osteolitičke aktivnosti.

• TR-ACP je važna za dijagnozu, praćenje i tretman patologije resorpcije kostiju

• Aktivnost osteoklasta povećava sintezu i sekreciju ACP

• Broj osteoklasta se povećava u bolestima kostiju

• Broj osteoklasta se snižava kod antiresorptivne terapije

• Primena lekova – bifosfonata i

– selektivnih modulatora estrogenskih receptora SERM

16


Blaga ili umerena povećanja serumske TR-ACP

1. Pagetova bolest

2. Hiperparatioridizam sa manifestacijama na kostima

3. Malignim invazijama na kostima pri kanceru dojke kod žena

4. Osteoklastoma tumor giant ćelija - osteoklastna neoplazma

5. Osteopetrosis – mermerna bolest kostiju gde osteoklasti ne mogu da resorbuju kost

17

Među bolestima kostiju umeren porast se dobija kod Pagetove bolesti (osteitis deformans) Rezultat dejstva osteoklastnih ćelija Povećana aktivnost u prvoj fazi, ali specifičnije je povećanje ALP Rentgenski snimak Osteolitička mesta na delu osteoklastne resorpcije kostiju Sklerotična mesta na delu aktivnosti osteoblasta

Kisela fosfataza u Pagetovoj bolesti

18


• Visoka koncentracija TR-ACP u serumu pacijenata je proporcionalna broju osteoklasta

• TR-ACP pokazuje male dinamične promene u poređenju sa drugim markerima disocijacije kostiju kao što su markeri metabolizma kolagena tipa I

– Enzim se oslobađa u mikrookolinu osteoklasta, a ne direktno u cirkulaciju

19


• Prednost određivanja TR-ACP u odnosu na druge markere resorpcije kostiju

• Za razliku od ostalih markera resorpcije kostiju (C-telopeptid I kolagen) TR-ACP nije pod uticajem renalne disfunkcije.

• Diurnalna varijacija je minorna jer je poluživot TR-ACP 5b duži nego drugih

markera resorpcije

20

Primena tartarat rezistentne kisele fosfataze za praćenje efekta terapije kod osteoporoze

Efekat terapije bifosfonatima (alendronat) sniženje 40 % u poređenju sa ostalim parametrima urinarni telopeptidi 49 do 69% i CTX 75 %.

21

Klinički značaj TR-ACP

• Stanje koje nije vezano za kosti a odlikuje se povišenjem TR-ACP je Gaucher-ova bolest slezine, lizozomalna bolest deponovanja

• Izvor TR-ACP su abnormalne makrofage u slezini i drugim tkivima, u kojima ima prekomerne ekspresije normalnih sastojaka makrofaga

• Osteoklastna TR-ACP ima značaj i kod leukemije retikuloendoteliosis i koristi se kao važan histološki marker – Izoenzim ne prelazi u cirkulaciju

22

Makrofagna kisela fosfataza Tartarat rezistentna kisela fosfataza tip 5a

• Gaucher-ova bolest • Poremećaj metabolizma glukocerebrozida • Recesivno oboljenje • Deponovanje lipida u mozgu i kostima • Mentalna retardacija • Gaucher-ove ćelije –

– makrofagne abnormalne ćelije – identifikacija ćelija citohemijsko bojenje

• Demineralizacija kostiju

Ćelije kostne srži: Gaucherove ćelije sa deponovanim Glukocerebrozidima u lizozomima duguljastog izgleda

24

• Određivanje aktivnosti ukupne kisele fosfataze u serumu • Određivanje prostatične kisele fosfataze • Određivanje neprostatične kisele fosfataze • Određivanje tartarat rezistetne kisele fosfataze

• Određivanje prostatične kisele fosfataze • Dodatak tartarata inhibira osetljivu prostatičnu kiselu fosfatazu, a

preostala aktivnost se meri i označava kao neprostatična kisela fosfataza.

• Iz razlike ukupne i neprostatične kisele fosfataze dobija se vrednost prostatične kisele fosfataze

Metode određivanja aktivnosti kisele fosfataze

25

Supstrati:

• 4-nitrofenilfosfat, 1-naftil-fosfat i timolftalein-fosfat • Pojedini izoenzimi ACP pokazuju različitu specifičnost prema supstratima

• 1-naftil-fosfat i timolftalein-fosfat brže se hidrolizuju sa prostatičnim izoenzimom nego sa ostalim ne-prostatičnim ACP

• Diskontinuirana metoda – Supstrat: 4-nitrofenilfosfat

4-Nitrofenilfosfat + H2O ↔ fosfat + 4-nitrofenol

– Reakcija se odvija u kiseloj sredini i prekida se dodatkom alkalije

– Meri se apsorbancija 4-nitrofenola na 405 nm

• Kontinuirana metoda – 1-naftil fosfat i FAST RED TR

Metode određivanja aktivnosti kisele fosfataze

26

Metode određivanja tartarat rezistentne kisele fosfataze

Kontinuirane metode

• Kontinuirane metode Hillman-ova metoda

• Supstrat: 1-naftil-fosfat

• Proizvod reakcije: 1-naftol gradi obojeni produkt koji je stabiliziran sa

diazonijum solima 2-amino-5-hlorotoluen-1,5-naftalen disulfonat (Fast

Red TR)

• Alkoholi poput 1,5 pentandiola ubrzavaju reakciju i povećavaju

senzitivnost jer deluju kao akceptori fosfata u transferu

• Dodatak natrijum tartarata inhibira osetljive izoenzima (prostatičnu i

lizozomalnu ACP)

27


Imunohemijske metode • TR-ACP tip 5b se određuje imunoesejom

• Prve metode koriste monoklonalno antitelo koje vezuje ACP za čvrstu fazu

• Posle vezivanja aktivnost TR-ACP se određuje pri optimalnom pH 6,1

• Druge metode koriste dva monoklonalna antitela koja su dobijena sa visoko

prečišćenim koštanim TR-ACP 5b

– Jedno antitelo vezuje intaktnu izoenzimsku molekulu TR-ACP, a drugo antitelo

eliminiše interferencije inaktivnih fragmenata tipa 5b u serumu.

– Posle imunoreakcije vezana aktivnost TR-ACP tip 5b se meri sa specifičnim

supstratom na koji selektivno deluje na TR-ACP 5b i taj supstrat je 2-hlor-4-nitrofenil

fosfat.

• Ova dva eseja imaju sličnu specifičnost za TR-ACP 5b i klinički značaj u

praćenju antiresorptivne terapije.

• FAICEA – fragment absorbed immunocapture enzymatic assay.

28


Priprema uzoraka • Serum se mora odvojiti odmah od eritrocita i stabilisati dodatkom 50 μL

sirćetne kiseline (5 mol/L) po mL seruma do pH 5,4 pri kome je enzim stabilan

• Pod ovim uslovima, TR-ACP ostaje stabilna na ts nekoliko sati do nedelju dana, ako se čuva na 40C ili 4 meseci na -200C

• Hemolizirani uzorci seruma su kontaminirani sa značajnom količinom TR-ACP izoenzima i taj se uzorak mora odbaciti

Referentni interval • Serum zdravih osoba • TR-ACP na 370C 1,5 do 4,5 U/L • Deca imaju više vrednosti 3,4 do 9,0 U/L • Kod dece dečaci između 13 i 17 godina imaju više vrednosti od devojčica u

istoj starosnoj grupi

kisela fosfataza 2014

Health & Medicine