kromatografi çeştleri

8/8/2019 kromatografi etleri

1/6

1

KROMATOGRAFMETODU

FOTOSENTETKPGMENTLERN NCE TABAKA

KROMATOGRAFS LEAYRITIRILMASI

KromatografiKromatografi; bir karmdaki bileikleri

birbirinden ayrmak ve maddeleri saflatrmakiin kullanlan bir tekniktir. zellikle fiziksel vekimyasal nitelikleri ok benzeyen maddelerinayrlma ilemlerinde, kromatografi ynteminin

kullanm ile baarl sonular elde edilmektedir.Kromatografi tekniinde yararlanlan temel

prensip, bir karmdaki eitli maddelerinhareketli bir faz yardm ile sabit bir faz

zerinden geirilmeleri ve bu gei srasndafarkl hzlarla hareket edebilmeleridir.

Hareketlifaz

Duraan faz

molekller

Kromatografi ilemi

A ve B maddelerinden oluan karm,sabit fazla birlikte kolonun balangblgesine uygulanr ve hareketli faz (svveya gaz) akmaya braklr. Bazkromatografi tiplerinde de madde

karm hareketli faza kartrlarakuygulanr. Numunede bulunan bileimlerfarkl yrme veya hareket hzlarna grehareketli faz ierisinde ilerlerler.

Yrme hz, Rf deeri ile ifade edilirve substansn yrme mesafesinin,zcnn yrme mesafesineoranndan hesaplanr.Rf deeri 0 ile 1arasnda bulunur ve doal olarak hzl yryen komponentler iin alnanmesafe byk olacandan Rf deeribyk daha yava yryenler iin dahakktr.


2/6

2

Kromatografi tekniinin temelinde ana unsur yer alr.

Sabit faz: Bu faz daima bir "kat" veya bir "kat destek

zerine emdirilmi bir sv tabakasndan" oluur. Hareketli faz: Bu faz daima bir "sv" veya "gazdan"

oluur.

Sabit faz, hareketli faz ve karmnda yer alan

maddeler arasndaki etkileimin tr: Kromatografide

"yzey tutunmas veya adsorpsiyon" ile "znrlk"

olgular temel etkileim trlerini olutururlar. ayet basit

faz bir "kat" ise, karmdaki maddelerle sabit faz

arasnda "yzey tutunmas (adsorpsiyon)" etkileimi

gerekleir.

Bu durumda farkl polaritelere (kutuplamalara)

sahip maddelerin, farkl derecelerde yzeytutunmas gstermeleri doaldr. Buna bal

olarak, hareketli faz yardm ile sabit faz

zerinden gei hzlarnn da farkl olmalar

beklenir. Bu tr etkileim gsteren kromatografik

yntemlerin tm "adsorpsiyon kromatografisi"

genel ad ile anlrlar.

ayet sabit faz bir "sv" ise, karmdaki

maddelerle sabit faz arasnda "znme"

etkileimi gerekleir. Bu durumda farkl

maddelerin, sabit ve hareketli fazlarda farkl

znrlklere sahip olmalar sz konusudur. Yani

farkl maddelerin iki faz arasndaki dalmlar n

plana gemektedir.

Buna bal olarak hareketli faz yardm ile sabit

faz zerinden gei hzlarnn da farkl olmalar

beklenir. Bu tr etkileim gsteren

kromatografik yntemlerin tm "dalmkromatografisi" genel ad ile anlrlar.

eitli kromatografik yntemler vardr. Bunlardan

bazlar; Kolon kromatografisi, nce tabaka

kromatografisi (ITK), Kat kromatografisi, Gaz

kromatografisi, yon deiimi kromatografisi, Jel

geirgenlik kromatografisi, Yksek basnl sv

kromatografisi, lgi kromatografisidir.

Bunlardan en ok kullanlanlar sralayacak olursak;

Kolon kromatografisi

nce tabaka kromatografisi (ITK)

Kt kromatografisi

Gaz kromatografisi


3/6

3

depo(tampon)

sabit faz(katporlu matriks)

mobil faz(tampon)

elent

Proteinkarm

1.KOLON KROMATOGRAFS

Kolon kromatografisi:biyomolekllerinsaflatrlmasnda sklkla kullanlrKolon, biyomoleklleri seici adsorblayan

bir maddeyle (kat porlu matriks)doldurulur SABT FAZ

biyomolekl karm kolona tatbik edilirTampon zelti (MOBL FAZ) ile

ykanan kolon tarafndan,adsorbe edilmeyenler nceadsorbe edilenler daha ge

kolondan karlar

Balca kat dolgu maddeleri (hareketsiz faz)unlardr: Silika jel: Genellikle ntr ve asidik yapdakibileikler iin uygundur. Alumina: Genellikle ntr ve bazik yapdakibileikler iin uygundur. Sellloz: Genellikle biyokimyasal maddeler iinuygundur.

Hareketli faz grevini stlenecek zcler;Sikloheksan, Kloroform (kansorojen), Metanol,Petrol eter, Metilen klorr, Etanol,Benzen(kansorojen), Etil asetat, Aseton, Toluen,Dietil eter, Karbon tetraklorr(kansorojen), n-Butanol zopropanol olabilir.

Kolon Kromatografi TipleriKolondaki dolgu maddesi ve seilen elsyon

metoduna gre gruplandrlr:

Jel filtrasyonu byklk

yon exchangeyk

Affinite (balanma)

Jel Filtrasyon Kromatografi

Biyomolekllerin, molekl byklne gre ayrlrlarKolon,jel boncuklar [polisakkarid veya poliakrilamidpolimer]ile doldurulur kat matriksBiyomolekl karmn ieren tampon, kolondangeirilir

Kk molekller,jel boncuklararasndaki boluklara girer,kolondan ge karlar

Byk molekller, jel boncuklararasndaki boluklara taklmaz,kolondan nce karlar

jel boncuklarcam kolon

ak

Proteinlerin elsyonu: en byk en kk

Jel Filtrasyon Kromatografi


4/6

4

Jel Filtrasyon Kromatografijel boncuk

en bykprotein

Biyomelekllerin, matriksteki porlarataklma yzdesi, bykl ileters orantldr

Avantaj: Byk miktardabiyomolekl karmsaflatrlabilir

Dezavantaj: Yava ayrm

Porlara taklan molekllerdaha yava srklenirler

yon exchange (dei-tokuKromatografi

Proteinleri, zerlerinde tadklar net yke gre

ayrr. Biyomolekl karmndaki iyonlar, sabitfazdaki ayn ykl iyonlarla[ (+)(+) veya (-)(-) ile] yer deitirerek, kolona balanrlarBalanmayan proteinler, kolondan en ncekarlar

Daha sonra, iyonik gc/pHs farkl birtampon kolondan geirilir bal molekllerin ykdeitirilerek elsyonu salanr

yon-Exchange KromatografiAffinite Kromatografisi

Bir eit iyon deiim kromatografisidir. Sabitfazn st yzeyine B maddesine kar afinitesi olanfakat dier btn maddelere kar ilgisiz olan A

maddesi ile adsorbe edilirse (kovalent balanmasnsalamak suretiyle) B maddesi A ya skcabalanmas salanarak belirgin bir ayrma

gerekletirilebilir.

Sonra baka bir element yardm ile B maddesisabit fazdan zlebilir. Bu metotla komplekskarmlardan belirli bir maddeyi kk miktarlar

halinde ayrmak mmkn olur.

Affinite Kromatografisi

Enzim, hormon,vb spesifik proteinlerin saflatrlmasndakullanlr.Kolonun dolgu maddesine,(dekstran, poliakrilamid, selloz vb)

spesifik protein ile kompleksyapabilen bir ligand balanr:

Ligand balboncuk

spesifikprotein

dierproteinler

Tampon ak

Serbestproteinler

ligand-proteinkompleksi

Affinite Kromatografisi

glukoz-proteinkompleksi

boncuk serbesprotei

boncuk

laveglukoz(G)

Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,kat desteebalanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonuterkederlerBal protein, daha sonra, pH deiiklii / tuz zeltileriveya ligand ilavesiyle kolondan ele edilirrnek:


5/6

5

3.KtKromatografisiBu yntemde kaln bir

szge kad destek; ve

gzeneklerine yerleensu ise, sabit "sv faz"oluturur. Hareketli fazbir yrtc tank iine yerletirilmi uygun birsvdr. Bu durumda,kt kromatografisininbir "sv-sv dalmkromatografisi" olduunubelirtmeliyiz.

3. Gaz Kromatografisi

Bu teknik laboratuarda basit aletlerle

yrtlemez. Yntemin uygulanmasnda okgelimi otomatik cihazlar gereklidir.

Bu yntemde sabit faz, cihaz iineyerletirilen ve iinde kat destek maddesi

zerinde emdirilmi sv bulunan birkolondur. Tayc faz ise, He veya N2 gibi

bir gazdr.Buna gre gaz kromatografinin bir

"gaz-sv dalm kromatografisi" olduunubelirtebiliriz.

4. NCE TABAKA KROMATOGRAFS (TK)nce tabaka kromatografisi, bir "kat -sv

adsorpsiyon kromatografisidir." Bu yntemde sabitfaz, eitli boyutlardaki "cam plakalar stne, ince

bir tabaka halinde svanm kat adsorbanmaddedir. "Adsorban madde olarak kolon

kromatografisinde kullanlan tm katlar (alumina,

siliko jel, sellloz vb.) kullanlabilir. Bu yntemdehareketli fazn sabit faz zerinden ilerleyii,aadan yukar doru olur. zc klcallk etkisi

ile ierisine daldrlan ince tabaka plakas zerindeyrr.

Bu ilem srasnda, plakann alt kesimlerine bir

damlalkla nceden damlatlm olan karm da

farkl hzlarla yukarya srkler. Ayrm bu

ekilde salanm olur. Yrme hz maddenin,

kat fazn ve zcnn polaritesine baldr.


6/6

6

DENEYSEL YNTEM

FOTOSENTETK PGMENTLERN NCE TABAKAKROMATOGRAFS LE AYRITIRILMASI

MATERYAL1- Yeil bitki yapra2- Havan3- Aseton4- Santrifj aleti5- Kromatografi tank6- Klcal pipet7- Aseton, toluen, metanol8- Silika jel tabaka

SOLVENT HAZIRLANII: Toluen (200 ml)/Metanol (1 ml), V/V

METOT- 10g yapra havan ierisinde iyice ezin. Havana 5ml

aseton ekleyip 5 dakika daha ezmeye devam edin.- Yapra szn ve kalntlar 5 ml aseton ile ykayn.- Szlen zeltileri birlestirdikten sonra elde edilen

karsma 10 ml aseton ekleyin.- Elde edilen zeltiyi 5 dk 300-400 gde santrifj

edin.- Santrifj edilen zeltiyi uygun tplere aln ve su

banyosundan bekletin. Bu sayede asetonun fazlasuurulmu olur. Konsantre pigment ekstrakt halinegelmesi salanr. Bu ekstrakt hem klorofil hem deksantofil ve karotin pigmentlerini ierir.

Kurun kalemle silika jel zerine bir izgiekin ve bu izgi zerine klcal pipetyardmyla dzgnce klorofil ekstraktnyayp iinde solvent bulunan kromatografitankna yerletirin. Belli bir sre sonrasolventin ve pigment ekstrakt iindeki 4

farkl pigmentin silika jel tabaka zerindefarkl hzlarda yrd gzlemlenir. Cetvelyardmyla tabaka zerinde oluan farkltabakalarn yrme uzunluklarn lerek herbir madde iin rf deerlerini hesaplayn.

Pigment ekstraktnn iindeki farkl pigmentlerinsolventten ste doru srasyla:

Klorofil b Zeytin yeiliKlorofil a Mavi yeilKsantofil SarKaroten Turuncu

eklinde sraland gzlenir. Bylelikleyapraklarn yeil grnlerini salayan veyapraklardan yeil bir ekstrakt olarak eldeedilen zeltide 4 farkl pigment maddesi farklabsorbe olu derecelerine gre ayrlm olurlar.

Sorular

1. Kat ve nce Tabaka kromatografisindespotlar ilk uyguladnz noktalariaretlerken tkenmez kalemkullanlmamasnn sebebi nedir?

2. nce Tabaka kromatografisi ile analizedilen bir karmdaki iki maddenin Rfdeerleri 0.8 ve 0.5 ise, zc 12 cmilerlediinde iki madde arasndaki mesafeka cm olacaktr?

kromatografi çeştleri

Documents