Kromatografi KertasPada kromatografi kertas sebagai penjerap digunakan sehelai kertas dengan susunan serabut dan tebal yang sesuai. Pemisahan kromatografi dapat berlangsung menggunakan fase cair tunggal dengan proses yang sama dengan kromatografi adsorpsi dalam kolom. Oleh karena kandungan air pada kertas, atau imbibisi selektif dari komponen hidrofilik fase cair oleh serat kertasnya, dapat dianggap sebagai fase diam, maka mekanisme partisi berperan penting dalam pemisahan.Sebagai alternatif dapat juga digunakan sistem dua fase. Kertas diimpregnasi dengan salah satu fase, yang kemudian menjadi fase diam (umumnya fase yang Iebih polar dalam hal kertas yang tidak dimodifikasi). Kromatogram dilakukan dengan merambatkan fase gerak, melalui kertas. Dapat dilakukan kromatografi menaik, pelarut merambat naik pada kertas ditarik oleh gaya kapiler, ataupun kromatografi menurun, pelarutnya mengalir oleh gaya gravitasi.Perbedaan harga H , bila kromatogram dikembangkan searah serat kertas (arah mesin), dibandingkan dengan yang dikembangkan dengan arah tegak lurus terhadap serat kertas. Oleh karena itu, dalam suatu seri kromatogram, arah perambatan pelarut harus dipertahankan tetap terhadap arah serat kertas. (Arah mesin umumnya ditandai oleh pabrik pada kemasan kertas kromatografi).

KROMATOGRAFI MENURUNPada kromatografi menurun, fase gerak diitarkan merambat turun pada kertas.Alat Alat utama untuk kromatografi menurun terdiri dari komponen-komponen berikut ini.Bejana kromatografi bertutup kedap uap dan mempunyai lubang untuk penambahan pelarut

atau untuk pengurangan tekanan dalam. Bejana sebaiknya dari kaca, baja tahan karat atau porselen, dan dirancang sedemikian, hingga dapat dilakukan pengamatan selama kromatografi berlangsung, tanpa membuka bejana. Tabung silinder kaca yang tinggi dapat digunakan. jika dibuat kedap uap dengan tutup yang sesuai.

Rak tahan korosi, yang lebih kurang 5 cm lebih rendah dari tinggi bejana bagian dalam. Rak digunakan sebagai penyangga bak pelarut dan batang kaca antisifon, yang menahan kertas kromatografi.

Satu atau lebih bak pelarut terbuat dari kaca, yang dapat menampung sejumlah pelarut lebih dari yang diperlukan untuk satu kali kromatografi. Panjang bak pelarut harus lebih lebar dari kertas kromatografi.

Batang kaca antisifon, yang disangga oleh rak, letaknya di luar sejajar dengan dan sedikit lebih tinggi dengan tepi bak pelarut.

Kertas kromatografi, berupa kertas saring khusus, dengan lebar tidak kurang dari 2,5 cm, tidak lebih lebar dari panjang bak pelarut dan dipotong lebih kurang sama dengan tinggi bejana. Dibuat garis tipis dengan pensil melintang pada kertas 'pada jarak tertentu dari salah satu ujung kertas, hingga jika kertas digantung pada batang kaca antisifon, dengan ujung atas di dalam bak pelarut dan ujung bawahnya tergantung bebas dalam bejana, garis tersebut terletak beberapa cm di bawah batang kaca antisifon. Usaha-kan agar kertas tidak terkontaminasi dan tidak kotor.

Prosedur Zat dilarutkan dalam pelarut yang sesuai. Sejumlah volume larutan zat yang umumnya mengandung I µg hingga 20 µg ditotolkan dengan pipet mikro pada titik-titik tertentu pada garis pensil, diameter bercak 6 mm hingga 10 mm dengan jarak antar bercak tidak kurang dari 3 cm. Jika jumlah larutan yang ditotolkan akan menghasilkan bercak dengan diameter melebihi 6 mm hingga 10 mm; totolkan larutan sedikit demi sedikit pada titik yang sama, tiap kali biarkan mengering dahulu sebelum ditotolkan lagi.

Kertas tersebut digantung dalam bejana dengan menggunakan batang kaca antisifon yang menahan ujung alas kertas dalam hak pelarut. Dasar bejana digenangi dengan sistem pelarut yang ditetapkan. Penjenuhan bejana dapat dipercepat dengan cara melapis dinding bagian dalam bejana dengan kertas saring yang dibasahi dengan sistem pelarut yang ditetapkan. Bagian kertas yang tergantung di bawah batang kaca antisifon harus tergantung bebas di dalam bejana tanpa menyentuh rak, dinding bejana atau cairan yang terdapat dalam bejana. Bejana ditutup rapat, agar terjadi penjenuhan bejana dan kertas dengan uap pelarut. Jika perlu, tekanan dalam yang berlebihan dikurangi. Untuk bejana berukuran besar, mungkin perlu dilakukan penjenuhan selama satu malam.

Sejumlah fase gerak dengan volume lebih dari yang diperlukan untuk kromatografi dijenuhkan dengan fase diam dengan cara pengocokan. Setelah jenuh, fase gerak dimasukkan ke

dalam bak pelarut melalui lubang. Lubang ditutup dan fase gerak dibiarkan merambat turun pada kertas sejauh yang dikehendaki. Pada waktu membuka tutup bejana dan mengangkat kertas, usahakan agar pelarut tidakmerambat lagi. Batas rambat pelarut segera ditandai dan kertas dikeringkan.

Kromatogram diamati dan diukur langsung atau setelah disemprot dengan pereaksi yang sesuai untuk menampakkan letak bercak obat yang telah terpisah. Bagian kertas yang telah ditentukan mengandung obat yang telah terpisah dapat digunting dan dieluasi dengan pelarut yang sesuai, dan dibuat larutan mencapai volume tertentu untuk analisis secara kuantitatif dengan teknik kimia atau instrumen yang sesuai. Prosedur yang sama dapat dilakukan dengan berbagai kadar baku pembanding yang ditotolkan pada kertas yang sama dengan rentang kadar yang sesuai untuk membuat kurva kalibrasi yang absah.

KROMATOGRAFI MENAIKPada kromatografi menaik, ujung bawah kertas dicelupkan ke dalam fase gerak, sehingga

memungkinkan fase gerak merambat naik pada kertas oleh gaya kapiler.Alat Alat yang digunakan pada dasarnya sama dengan peralatan yang diuraikan pada

Kromatografi menurun.Prosedur Larutan uji ditotolkan pada kertas dengan cara seperti yang tertera pada

Kromatografi menurun, di atas batas kertas yang tercelup dalam fase gerak. Dasar bejana digenangi dengan sistem pelarut untuk eluasi. Jika digunakan sistem dua fase, maka kedua fase tersebut ditambahkan. Sebaiknya dinding bagian dalam bejana dilapisi dengan kertas saring dan lapisan kertas ini dijenuhkan dengan sistem pelarut. Bak pelarut kosong ditempatkan pada dasar bejana dan kertas digantung dan sedemikian hingga bagian ujung kertas yang telah ditotolkan tergantung bebas di dalam bak pelarut kosong.

Bejana ditutup rapat dan dijenuhkan menurut cara yang tertera pada Kromatografi menurun. Kemudian fase gerak dengan jumlah berlebih dari yang diperlukan untuk membasahi seluruh kertas dituangkan ke dalam bak pelarut melalui lubang. Bejana kemudian ditutup lagi. Jika batas perambatan pelarut telah mencapai ketinggian yang dikehendaki, bejana dibuka, kertas dikeluarkan dan dikeringkan.

Analisis kuantitatif bercak dapat dilakukan menurut cara yang tertera pada Kromatografi menurun.

1. KROMATOGRAFI KERTAS.

Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang sating tidak bercampur. Kromatografi kertas berbeda dengan ekstraksi yang menggunakan corong pemisah yang sudah diterangkan terdahulu adalah bahwa fase bawah berupa air atau pelarut yang mengandung air terikat secara stasioner pada selulosa kertas. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fase mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.

Jika kromatografi kertas terutama merupakan kromatografi partisi, maka tidak dapat diabaikan bahwa proses adsorpsi juga terjadinya tergantung dari jenis pelarut yang digunakan dan sifat kertas kromatografi.

Kertas kromatografi terdiri dari selulosa murni dengan serabut panjang,, yang dalam keadaan menggelembung bersama-sama dengan air atau pelarut yang mengandung air merupakan fase stasioner atau melalui impregnasi dengan' senyawa lipofil dapat bertindak sebagai bahwa pengemban Dilihat dari sifat selulosa maka kemurnian, kehomogenan, kemampuan menyerap dan mekanik ketangguhan' merupakan faktor yang menentukan.

Kapasitas dan lamanya kromatografi tergantung dari ketebalan dan kemampuan menyerap atau kemampuan menggelembung kertas. Antara kecepatan migrasi dan ketajaman pemisahan terdapat hubungan. Kertas yang melewatkan dengan cepat; umumnya memisahkan lebih baik. Dalam perdagangan terdapat berbagai kertas kromatografi dengan sifat yang sudah tertentu. Yang berbeda adalah kecepatan migrasi, kemampuan memisahkan dan mekanik ketangguhan.

Umumnya arah migrasi ditunjukkan dengan punah pada tepi dasar. Jika tidak deniikian, biasanya dilakukan pada arah panjang lembar kertas. Besarnya lembar kertas tergantung dari bejana pengembangan dan juga dari beberapa noda senyawa yang akan ditotolkan. Sifat dapat memisahkan kertas dapat diubah dengan impregnasi. Impregnasi dapat dilakukan dengan mencelup atau mengembangkan dengan suatu larutan tertentu atau dengan penyemprotan.

Pengubahan sifat dapat memisahkan dapat juga diperoleh dengan penyiapan kertas kromatografi misalnya melalui asetilasi selulosa. Untuk pemisahan tertentu digunakan kertas terasetilasi terfosforitasi atau terformilasi. Untuk kromatografi fase balik, kertas dalam perdagangan diimpregnasi dengan zat lipofil seperti parafin cair; parafin, vaselin atau undekan. Sebelum suatu senyawa dikarakterisasi atau dipisahkan secara kromatograf kertas, pertama-tama harus ditotolkan. Untuk itu senyawa dilarutkan dalam pelarut sesuai dan ditotolkan dengan pipet ukur berskala (pipet gula darah, pipet kapiler yang dapat terisi sendiri, pipet konstriksi dan semprotan mikro) sebagai bentuk titik atau bentuk garis. Hasil yang terbaik akan diperoleh dengan alat penotol automatik. Konsentrasi larutan yang hendak ditotolkan haruslah antara 1 sampai 5%. Untuk penotolan berbentuk titik dibutuhkan volume 1 sampai 10 μl.

Ketajaman pemisahan tergantung dari noda awal. Makin kecil noda ini dapat diperoleh, makin besar ketajaman pemisahan. Makin mudah menguap pelarut yang ,digunakan untuk penotolan, makin kecil diameter noda. Untuk menguapkan pelarut larutan uji yang ditotolkan jika perlu digunakan kipas. Sebelum senyawa yang hendak dipisahkan ditotolkan, untuk garis awal ditandai dengan garis menggunakan pensil dan pada garis ini ditandai masing-masing titik awal.

Untuk kromatografi menurun garis awal dibuat dengan jarak 15 cm dari tepi kertas. Untuk kromatografi menaik jarak ini diukur 4 sampai 5 cm. Jarak noda awal masing-masing satu antara lain sebaiknya 1 sampai 3 cm.

Proses kromatografi disebut pengembangan. Pada kromatografi kertas dibedakan 3 jenis pengembangan:- Kromatografi menaik,- Kromatografi menurun,- Kromatografi horizontal.

Untuk kromatografi menaik lembar kromatografi digantung ke dalam "tahang" yang berisi fase mobil atau lembar kertas dibentuk silinder dengan bantuan penjepit sintetik dan dipasang pada tahang yang sudah disediakan.

Untuk kromatografi menurun lembar kertas digantung dengan ujung atas kedalam palung yang berisi fase mobil.Untuk kromatografi horizontal atau untuk pengembangan kromatografi melingkar dibutuhkan

cawan petri yang sama besarnya dengan tepi ditangkupkan satu sama lain sebagai bejana pengembang. Pelarut pengembang dialirkan dari bawah dengan bantuan kapiler kertas atau sumbu kapas pada titik pusat kromatogram atau dari atas dengan melubangi, diteteskan dengan bantuan pipet yang sesuai.

Untuk pelaksanaan pengembangan dibutuhkan bejana pemisahan. Bejana ini merupakan bejana kering yang tertutup rapat dan mempunyai besar dan bentuk berbeda. Sebelum memulai proses pengembangan pada dasar bejana pengembangan ditambahkan sedikit pelarut pengembang dan sedikit air dan harus dijaga agar kertas kromatografi tidak langsung dibasahi. Setelah bejana pengembangan ditutup dengan hati-hati, kertas kromatografi dibiarkan dalam keadaan ini 2 sampai 3 jam sampai terjadi kesetimbangan atau klimatisasi. Dengan demikian akan tercapai suatu keadaan jenuh yang tergantung pada sistem dan derajat penggelembungan. Selanjutnya untuk memulai pengembangan, dalam cawan yang ada dasar yang di dalamnya; terdapat kertas kromatografi atau dimana terdapat silinder kromatografi, diisikan pelarut pengembang sejumlah tertentu hingga kertas tercelup kira-kira 5 cm. Pada kromatografi menurun dengan cara yang sesuai palung kromatografi diisi dengan pelarut pengembang. Jika pada kromatografi menaik tepi muka pelarut telah berjarak 3 sampai 5 cm dan tepi kertas sebelah atas dan pada kromatografi menurun dengan ukuran sama dari tepi bawah kertas, maka kertas dikeluarkan dari bejana pengembangan kemudian tepi muka pelarut diberi tanda garis dengan pensil. Kemudian kertas kromatografi dikeringkan dalam rak pengering atau dengan bantuan kipas. Jika pada pengembangan pertama tidak tercapai pemisahan yang memuaskan, maka dapat dilakukan kromatografi dua dimensi. Untuk itu setelah dikeringkan, kertas dikembangkan sekali lagi dengan arah 90° dari arah pertama. Pada senyawa yang bermigrasi tidak baik, kromatogram dapat diselesaikan dengan bantuan kromatografi menurun. Kromatogram lewat diperoleh jika pelarut dibiarkan bermigrasi beberapa hari, yaitu kromatografi tidak dihentikan jika tepi muka pelarut pengembang sampai pada akhir lembar kertas. Dengan demikian harga Rf tidak dapat lagi ditentukan. Untuk identifikasi, senyawa pembanding dengan sifat diketahui harus juga ditotolkan dan dikembangkan bersama.

Pemilihan pelarut pengembang diarahkan pada fase stasioner dan diorientasikan pada deretan eluotrop. Pelarut pengembang yang sesuai harus mempunyai sifat fisiko-kimia meliput sifat akseptor - donor, gaya dipol, gaya dispersi, gaya koordinasi serta mempunyai kemampuan rnengikat ion cuplikan yang hendak dipisahkan. Orientasi cepat mengenai efek pemisahan suatu pelarut yang dipilih dapat diberikan oleh apa yang dinamakan teknik mikrosirkular. Untuk itu campuran senyawa yang hendak dipisahkan ditotolkan pada kertas dalam bentuk titik. Jika fase mobil diteteskan secara sentral dari suatu pipet maka dapat diperkirakan apakah pelarut yang dipilih itu sesuai atau tidak. pelarut pengembang optimal telah terpilih jika menunjukkan banyak cincin koaksial yang terpisah baik. Jika senyawa bermigrasi dalam daerah tepi muka, maka pelarut pengembang adalah polar. Jika senyawa tinggal dekat titik awal, maka polaritas pelarut pengembang adalah rendah.

Deteksi. Pada senyawa yang mempunyai warna sendiri, maka penyelesaian kromatogram pasti dapat dilakukan secara visual. senyawa yang tidak berwarna harus dibuat tampak dengan prosedur identifikasi sesuai (deteksi). Prosedur identifikasi fisika yang sering digunakan adalah eksitasi fluoresensi. Dengan demikian senyawa dengan kromofor sesuai dapat ditunjukkan dengan fluoresensi karakteristik dengan menyinarinya dengan cahaya UV gelombang pendek 254 nm) atau gelombang panjang (365 nm). Jika dihadapkan pada senyawa yang menyerap cahaya pada panjang gelombang 254 nm, maka berkurangnya fluoresensi atau pemadaman fluorosensi indikator fluoresensi yang ditambahkan pada fase stasi-oner dapat digunakan untuk deteksi. Tergantung dari indikator flourosensi akan terjadi noda gelap dengan latar belakang berfluoresensi. Yang paling sering digunakan adalah prosedur identifikasi kimia. Untuk itu kromatogram diletakkan dalam atmosfer gas yang sesuai (uap amonia, iod, osmiumtetraoksida) atau disemprot dengan larutan pereaksi sesuai. Penyelesaian kualitatif kromatogram dilakukan secara visual langsung dengan pengukuran dan perhitungan harga Rf atau dibandingkan dengan senyawa yang diketahui.

Untuk penyelesaian kuantitatif dapat dibedakan dua prosedur yaitu tidak langsung dan langsung. Jika senyawa yang hendak ditentukan untuk pengukuran kuantitatif diekstraksi dari fase stasioner, maka dinamakan metode penentuan tidak langsung. Untuk penentuan jumlah dapat dipilih metode di bawah ini:

– Mikrotitrimetri,– Pengukuran dalam daerah sinar tampak dan UV,- Pengukuran refraksi,— Penentuan polarografi,— Pengukuran fluorimetri.

Penentuan kuantitatif langsung mungkin dilakukan melalui pembandingan luas secara visual masing-masing noda dengan menggunakan planimetri, dengan densitometri, dengan spektrofoto-metri, dengan pengukuran.fluoresensi atau penentuan radioaktivitas pada penggunaan senyawa yang dicacah.

Kromatografi kertas, yang pada pelaksanaannya rumit dan lebih lama dibandingkan kromatografi lapis tipis, sekarang terutama digunakan untuk pemisahan golongan senyawa sangat hidrofil, dan kromatografi lapis tipis tidak dapat digunakan. Golongan zat itu adalah:—Gula,—Alkohol bervalensi banyak;—Asam alfa amino,— Fenol dan asam fenilkarboksilat,—Asam organik alifatik,- Glikosida,– Zat anorganik (kation).

1.3.2 Kromatografi kertasSatu keuntungan utama KKt ialah kemudahan dan kesederhanaannya pada pelaksanaan

pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai medium pemisahan dan juga sebagai penyangga. Keuntungan lain ialah keterulangan bilangan RF yang besar pada kertas sehingga pengukuran RF merupakan parameter yang berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan baru. Memang, untuk senyawa antosianin yang tidak mempunyai ciri fisika lain yang jelas, RF adalah sarana terpenting dalam memaparkan dan membedakan pigmen yang satu dengan pigmen yang lain (Harborne, 1967).

Kromatografi pada kertas biasanya melibatkan kromatografi pembagian atau penjerapan. Pada kromatografi pembagian, senyawa terbagi dalam pelarut alkohol yang sebagian besar tidak bercampur dengan air (misalnya n-butanol) dan dalam air. Campuran pelarut klasik yaitu n-butanol—asam asetat—air (4 : 1 : 5, lapisan atas) (disingkat BAA), memang dirancang sebagai sarana untuk meningkatkan kadar air lapisan n-butanol dan dengan demikian memperbaiki manfaat campuran pelarut tersebut. Memang, BAA masih tetap dipakai secara luas sebagai pengembang umum untuk banyak golongan kandungan tumbuhan. Sebaliknya, gaya jerap merupakan salah satu ciri utama KKt dalam pengembang air. Air murni ialah pengembang kromatografi yang sungguh-sungguh serba guna dan dapat digunakan untuk memisahkan purina dan pirimidina biasa, dan secara umum dapat dipakai juga untuk senyawa fenol dan glikosida tumbuhan.

Pemilihan radas untuk KKt, sampai batas tertentu, bergantung pada luas ruang laboratorium yang tersedia. Misalnya, KKt datar dan lingkar memerlukan tempat yang sedikit lebih luas daripada bejana KLT baku. Daya pisah kromatografi kertas betul-betul baik dan digunakan, misalnya, untuk memisahkan karotenoid. Di kebanyakan laboratorium, KKt dilakukan dengan cara menurun dalam sebuah bejana yang dapat menampung kertas Whatman berukuran 46 X 57 cm. KKt menurun adalah yang paling berguna karena pengembang dapat dengan lebih mudah dibiarkan lewat ujung bila diperlukan. Cara ini juga sedikit lebih mudah untuk pemisahan dua arah.

Untuk mencapai pemisahan dengan teknik kromatografi tertentu, dalam perdagangan tersedia berbagai jenis kertas saring yang sudah dimodifikasi. Misalnya, sifat polar selulosa dapat dikurangi dengan memadukan asam silikat atau alumina ke dalam kertas sehingga lebih cocok untuk memisahkan lipid. Kertas dapat dimodifikasi juga di laboratorium, misalnya dengan merendamnya dalam parafin atau minyak silikon agar dapat digunakan untuk kromatografi fase-balik, juga untuk lipid. Untuk pemisahan skala besar dapat dibeli lembaran kertas saring kromatografi yang tebal (Whatman no. 3 atau 3MM), dan kertas semacam ini dapat menampung beberapa mg senyawa per lembar. Pada KKt, senyawa biasanya dideteksi sebagai bercak ber-warna atau bercak berfluoresensi - UV setelah dircaksikan dengan pereaksi kromogenik yang digunakan sebagai pereaksi semprot atau pereaksi celup. Untuk lembaran besar, pencelupan biasanya lebih mudah tetapi susunan pereaksi semprot harus diubah agar mudah kering, dan dengan demikian mencegah difusi waktu pencelupan. Selanjutnya kertas dapat dipanaskan untuk menimbulkan warna.

Bilangan RF adalah jarak yang ditempuh senyawa pada kromatografi, nisbi terhadap garis depan. Bilangan RF diperoleh dengan mengukur jarak antara titik awal dan pusat bercak yang dihasilkan senyawa, dan jarak ini kemudian dibagi dengan jarak antara titik awal dan garis depan (yaitu jarak yang ditempuh cairan pengembang). Bilangan ini selalu berupa pecahan dan terletak antara 0,01 dan 0,99. Akan lebih mudah bila bilangan tersebut dikalikan 100, dan bilangan RF

dalam buku ini dinyatakan sebagai RF (X100). Kadang-kadang RF (X100) dinyatakan sebagai hRF.

Bila kita membandingkan bilangan RF dari suatu deret senyawa yang strukturnya berkaitan, ada manfaatnya bila kita memperhatikan tetapan kromatografi lain, yaitu bilangan RM . Kaitan antara RM dan RF dinyatakan dalam persamaan:

RM =log( -1) RF

Menghubungkan gerakan kromatografi dengan struktur kimia ada faedahnya karena bilangan Δ RM dalam deret homolog biasanya tetap. Jadi, pada senyawa flavonoid, Δ RM tetap untuk sejumlah substitusi hidroksil dan glikosil yang ada dalam molekul (Bate-Smith dan Westall, 1956). Prosedur ini dapat digunakan untuk menghitung bilangan RF dari senyawa anggota yang

belum diketahui dalam suatu deret senyawa untuk mempermudah pencarian senyawa tertentu dalam ekstrak tumbuhan. Prosedur yang demikian digunakan, misalnya, dalam pencirian (karakterisasi) eter metil kemferol yang baru. Ternyata bilangan RF yang dihitung dan RF yang sebenarnya sangat bersesuaian (tabel 1.1) (Harborne, 1969).

Di antara pustaka yang sangat banyak, yang membahas KKt, ada satu pengantar yang berguna yang ditulis untuk pemula, yaitu buku karangan Peereboom (1971). Buku mengenai KKt yang bernilai, terutama sebagai sumber data RF, ialah buku karangan Lederer dan Lederer (1957), Linskens (1959), serta Sherma dan Zweig (1971).

13.5 Teknik Kromatografi KertasProses pengeluaran asam mineral dari kertas disebut desalting. Larutan ditempatkan pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2-3 cm dari salah satu ujung kertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, ia diletakkan di dalam ruang yang sudah dijenuhkan dengan air atau dengan pelarut yang sesuai. Penjenuhan dapat dilakukan 24 jam sebelum analisis. Terdapat tiga teknik pelaksanaan analisis. Descending adalah salah satu teknik di mana cairan dibiarkan bergerak menuruni kertas akibat gravitasi. Pada teknik ascending; pelarut bergerak ke atas dengan gaya kapiler. Nilai R f harus sama baik pada descending maupun ascending. Sedangkan yang ketiga dikenal sebagai cara radial atau kromatografi kertas sirkuler. Kondisi-kondisi berikut harus diperhatikan untuk memperoleh nilai R f yang reprodusibel. Temperatur harus dikendalikan dalam variasi tidak boleh lebih dari 0,5°C. Kertas harus didiamkan dahulu paling tidak 24 jam dengan atmosfer pelarutnya, agar mencapai kesetimbangan sebelum pengaliran pelarutnya pada kertas. Dilakukan beberapa pengerjaan yang paralel, Rf nya tidak boleh berbeda lebih dari ± 0,02.

Suatu atomiser umumnya digunakan sebagai reagent penyemprot bila batas permukaan pelarut dan zat terlarut dalam kertas ingin dibuat dapat dilihat. Atomiser yang harus lebih disukai. Gas-gas juga dapat digunakan sebagai penanda bercak. Untuk karbohidrat notasi RG digunakan untuk menggantikan R f. Setelah penandaan bercak atau batas permukaan, selanjutnya dapat dilakukan analisis kolori metri atau spektroskopi reflektansi bila sampel berupa logam. Materi yang terdapat di dalam kertas dapat ditentukan secara langsung dengan pelarutan. Kromatografi kertas selain untuk pemisahan dan analisis kuantitatif, juga sangat bermanfaat untuk identifikasi. Hal ini dapat dilakukan misalkan dengan membuat grafik antara RM α terhadap jumlah kation dalam suatu deret homolog, maka memungkinkan untuk mengidentifiksi suatu anggota deret homolog.

Kromatografi KertasDalam tahun 1944, lagi-lagi dari laboratorium Martin, dilaporkan pemisahan suatu campuran

asam amino dengan menggunakan kromatografi kertas. Dalam teknik ini sedikit larutan contoh diteteskan pada satu ujung pita kertas saring dan noda itu dibiarkan mengering (meniupnya dengan pengering rambut cukup nyaman). Ujung kertas saring itu kemudian dicelupkan ke dalam pelarut yang sesuai yang berada dalam bejana dan seluruh sistem berada dalam bilik tertutup. Dalam kromatografi kertas naik, yang tampak dalam Gambar 18.13, kertas itu digantung pada bagian atas bilik sehingga tercelup ke dalam pelarut pada dasar bilik, dan pelarut itu akan merayap naik sepanjang kertas karena kapilaritas. Dalam bentuk turun, kertas dikaitkan dalam cawan (trough) pelarut pada bagian atas bilik dan dibiarkan menggelantung ke bawah; pelarut akan bermigrasi ke bawah berkat kapilaritas dan dibantu gaya berat. Setelah garis depan pelarut bergerak menjalani hampir sepanjang pita kertas itu, pita itu diambil, dikeringkan dan diperiksa. Dalam kasus yang sukses, zat-zat terlarut dari dalam campuran asli akan ikut bermigrasi sepanjang kertas pada laju yang berbeda, sehingga ter-bentuk sederet noda yang terpisah. Jika senyawaan-senyawaan itu berwarna, tentu saja noda-noda itu akan tampak. Jika tidak mereka harus ditemukan dengan sesuatu cara lain. Beberapa senyawa berpendar, dalam hal ini dapat terlihat noda-noda yang membara bila kertas itu ditaruh di bawah lampu ultraviolet. Untuk asam-asam amino, kertas itu biasanya disemprot dengan larutan ninhidrin, suatu reagensia yang bereaksi dengan gugus amino untuk menghasilkan senyawa ungu. Untuk analisis kualitatif, noda-noda itu bisa digunting bersama kertas saringnya, zat-zat terlarut dilarutkan dan dalam kertas dengan pelarut yang tepat, dan larutan-larutannya diperiksa dengan teknik yang sesuai, seringkali adalah spektrofotometri

Untuk maksud identifikasi, noda-noda sering dicirikan oleh nilai - Rfnya. Nilai-R f ialah perbandingan angka jarak berpindah zat terlatur itu dan jarak berpindahnya garis depan pelarut pada waktu yang sama. Nilai-nilai Rf yang identik untuk senyawa yang diketahui dan yang tidak diketahui, dengan menggunakan sistem-sistem pelarut yang berlainan, akan merupakan bukti yang cukup kuat bahwa keduanya identik, terutama jika mereka dijalankan bersama-sama sepanjang satu pita kertas.

Kadang-kadang terjadi bahwa semua komponen suatu contoh talc dapat dipisahkan dengan menggunakan satu sistem pelarut apapun; beberapa komponen berpisah dengan lebih baik dalam satu sistem, beberapa dalam sistem yang lain. Maka dapatlah digunakan kromatografi kertas dua dimensi. Contoh itu ditotalkan di dekat satu sudut lembar kertas saring bujur sangkar. Setelah migrasi zat-zat terlarut paralel dengan satu sisi kertas dengan menggunakan satu sistem pelarut, kertas itu diputar 90 dan suatu sistem pelarut kedua mengangkut zat-zat terlarut ke dalam bagian kertas yang belum dipakai Pola noda-noda yang disemprot dengan ninhidrin yang dihasilkan dari penerapan teknik ini pada asam-asam amino dalam hidrolisat protein seringkali disebut "sidik jari'' protein itu. (Lihat Gambar 18.14.)

Pada awalnya kromatografi dianggap semata-mata sebagai suatu bentuk partisi cairan-cairan. Serat selulosa yang hidrofilik dan kertas itu dapat mengikat air; setelah disingkap ke udara yang lembap, kertas saring yang tampak kering itu sebenarnya dapat mengandung air dengan persentase tinggi, katakan 20% (bobot/bobot) atau lebih. Jadi kertas itu dipandang sebagai analog dengan sebatang kolom yang berisi fase stasioner berair. Zat-zat terlarut itu kemudian dipartisikan antara air ini dan pelarut organik yang bergerak dan tak dapat campur dengan air. Tetapi, segera disadari bahwa model ini terlalu sederhana. Pemisahan diperoleh padahal fase geraknya dapat campur dengan air atau dalam beberapa kasus malahan fase geraknya adalah larutan air itu sendiri. Jadi meskipun partisi cairan-cairan mungkin memang memainkan peranan dalam beberapa kasus, seringkali mekanisme kromatografi kertas lebih rumit daripada itu. Antaraksi antara zat terlarut dan penopang selulosa agaknya terlibat, misalnya, adsorpsi dan pengikatan hidrogen. Gugus karboksil dan yang dapat terionkan lainnya dimasukkan ke dalam kerangka selulosa selama operasi pembuatan bubur kayu dan pengelantangan dalam pembikinan kertas, dan karena itu kertas itu dapat juga bertindak sebagai penukar ion.

B. KROMATOGRAFI KERTAS

Pada kromatografi kertas sebagai penyerap digunakan sehelai kertas dengan susunan serabut dan tebal yang cocok. Pemisahan dapat dilakukan menggunakan pelarut tunggal dengan proses yang analog dengan kromatografi penyerapan atau menggunakan dua pelarut yang tidak dapat bercampur dengan proses yang analog dengan kromatografi pembagian. Pada kromatografi pembagian, fase bergerak merambat perlahan-lahan melalui fase tidak bergerak yang membungkus serabut kertas atau yang membentuk kompleks dengan serabut kertas. Perbandingan jarak perambatan suatu suatu zat terhadap jarak perambatan fase bergerak dihitung dari titik penetesan larutan zat, dinyatakan sebagai Rf zat tersebut. Perbandingan jarak perambatan suatu zat dengan jarak perambatan zat pembanding kimia dinyatakan sebagai Rf.

Penggunaan zat pembanding kimia pada percobaan identifikasi. Harga Rf mutlak sukar ditetapkan, karena harga R f yang diperoleh tergantung dari kondisi percobaan. Harga R f tersebut sangat berguna untuk identifikasi pendahuluan zat kimia. Identifikasi pemastian dilakukan dengan menggunakan zat pembanding kimia.

Dalam hal ini dibuat 3 kromatogram pada sehelai kertas; per tama dari zat yang diperiksa, kedua dari zat pembanding kimia dan ketiga dari campuran zat yang diperiksa dengan zat pembanding kimia dengan jumlah yang lebih kurang sama. Untuk masing-masing kromatogram digunakan sejumlah zat yang bobotnya lebih kurang sama. Jika zat yang diperiksa sama dengan zat pembanding kimia, maka ketiga kromatogram memberikan warna dan mempunyai harga Rf yang sama, dan kromatogram campuran memberikan bercak tunggal (Rf = 1,0).

Letak bercak.

Letak bercak yang diperoleh dari zat yang dikromatografi dapat ditetapkan dengan cara berikut:

1.Pengamatan langsung. jika zat tampak dengan cahaya biasa atau dengan sinar ultraviolet.

2.Pengamatan dengan cahaya biasa atau dengan sinar ultraviolet setelah kertas disemprot dengan pereaksi yang dapat memberikan warna pada bercak.

3.Menggunakan pencacah Geiger-Muller atau otoradiografik, jika ada zat radioaktif.4.Menempatkan pita atau potongan kertas pada medium perbiakan yang telah ditanami,

untuk melihat hasil stimulasi atau hambatan dari pertumbuhan bakteri.

Kromatografi kertas menurun. Pemisahan zat dengan cara kromatografi kertas menurun dilakukan dengan membiarkan fase bergerak merambat turun pada kertas kromatografi.

Alat.

Bejana kromatografi. Bejana bertutup kedap uap yang mempunyai lubang untuk penambahan pelarut atau untuk pengurangan tekanan dalam. Bejana sebaiknya terbuat dari kaca, baja tahan karat a tau. porselen dan bentuknya sedemikian rupa sehingga pengamatan selama kromatografi dapat dilakukan tanpa membuka tutup bejana. Silinder kaca yang tinggi dapat digunakan jika dapat ditutup hingga kedap uap dengan tutup yang cocok dengan pertolongan lemak penutup.

Rak tahan korosi. Tinggi rak 5 cm kurang dari tinggi bejana bagian dalam. Rak digunakan sebagai penyangga bak pelarut dan batang kaca antisifon.

Bak pelarut. Satu atau lebih bak pelarut terbuat dari kaca, dapat diisi dengan sejumlah volume pelarut lebih besar dari pada yang diperlukan. Panjang bak pelarut harus lebih besar dari lebar kertas kromatografi.

Batang kaca antisifon. Disangga oleh rak. letaknya diluar sejajar dengan tepi bak pelarut dan sedikit lebih tinggi. Batang tersebut digunakan sebagai penahan kertas kromatografi.

Kertas kromatografi. Digunakan kertas saring tertentu yang panjangnya lebih kurang sama dengan tinggi bejana. Lebar kertas tidak kurang dari 2,5 cm tetapi tidak lebih lebar dari panjang bak pelarut. Buat garis tipis dengan pensil melintang pada kertas pada salah satu ujung kertas sedemikian rupa. hingga jika kertas digantungkan pada batang kaca antisifon dengan salah satu ujungnya dalam bak pelarut dan ujung lain tergantung bebas, garis ter-sebut terletak beberapa cm di bawah batang kaca antisifon. Usahakan agar kertas tidak terkena kotoran.

Cara kerja

Cara I. Zat yang diperiksa dilarutkan dalam pelarut yang cocok. Sejumlah volume larutan zat yang diperiksa umumnya mengandung 1 mcg sampai 20 mg, teteskan pada titik-titik tertentu pada garis pensil, garis tengah fetesan 6 mm sampai 10 min dengan jarak masing-masing tidak kurang dan 3 cm. Jika jumlah larutan yang diteteskan akan menghasilkan tetesan dengan garis tengah lebih besar dan 10 mm, teteskan larutan sedikit demi sedikit pada titik yang sama, tiap kali dibiarkan mengering dahulu sebelum ditetesi lagi. Kertas digantungkan di dalam bejana dengan menggunakan batang kaca antisifon dan batang kaca tebal lain yang dapat menahan ujung atas kertas di dalam bak pelarut. Dasar bejana digenangi dengan fase tidak bergerak yang tertera pada masing-masing monografi. Bagian kertas yang tergantung dibawah batang kaca antisifon harus tergantung bebas di dalam bejana tanpa menyinggung rak, dinding bejana atau cairan yang terdapat dalam bejana. Bejana ditutup sehingga bejana dan kertas jenuh dengan uap pelarut. Jika perlu tekanan dalam yang berlebihan dikurangi. Penjenuhan bejana yang berukuran besar jika perlu dilakukan selama 1 malam. Sejumlah fase bergerak dengan volume yang cukup untuk kromatografi, jenuhkan dengan fase tidak bergerak dengan cara pengocokan. Setelah penjenuhan bejana, fase bergerak dimasukkan kedalam bak pelarut melalui lubang. Lubang ditutup dan fase bergerak dibiarkan merambat turun pada kertas sejauh yang dikehendaki Pada waktu membuka tutup bejana dan mengangkat kertas, usahakan agar pelarut tidak merambat lagi. Batas perambatan pelarut segera ditandai dan kertas dikeringkan. Kromatogram diamati dan diukur langsung atau setelah disemprot dengan pereaksi yang cocok.

Cara II. Lakukan menurut cara yang tertera pada Cara I tetapi bejana dijenuhkan dengan fase bergerak dan kertas telah diimpregnasikan dengan fase tidak bergerak.