Kromatografi Lapis Tipis

A. Teori DasarLapisan tipis adsorben pada proses pemisahan berlaku sebagai fasa diam. Kromatografi

lapis tipis lebih bersifat reproduksibel ( bersifat boleh diulang) dari pada kromatografi kertas.Sebagai fasa diam dalam KLT berupa serbuk halus dengan ukuran 5 – 50 mikrometer.

Serbuk halus ini dapat berupa adsorben penukar ion. Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan gel, alumina, dan serbuk selulosa. Partikel  silica gel mengandung gugus hidrosil dipermukaannya yang akan membentuk ikatan hydrogen dengan molekul – molekul pokar.

Untuk membuat lapisan tipis pada KLT perlu dibuat bubur (slurry) ber air dari serbuk halus tadi. Zat pengikat dapat menggunakan gips, barium sulfat, polivenil alcohol atau kanji perlu ditambahkan, untuk membantu peletakan lapisan tipis pada penyangga. Bubuk halus ini kemudian ditebarkan pada papan penyangga (kaca, plastik atau aluminium), secara merata sehingga diperoleh ketebalan lapisan 0,1 – 0,3 mm. lapisan tipis adsorben diaktifkan dengan pengeringan didalam oven pada suhu 100 oC selama beberapa jam.PlatKLT/kertas→sebagai fase diam Pipakapiler→untukmenotolkansampelpadaplat Chamber→tempateluen Hasilekstraksoklet→sampelyangakandipisahkan Pelarut/eluen→fasegerak Lampu UV  → memflorensikan noda

B. DefinisiKromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik pemisahan yang sederhana dan banyak digunakan. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap untuk lapisan tipis dan kering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida. Untuk menotolkan larutan cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan pengulsi di dalam wadah yang tertutup. (Chamber)

C. PrinsipPemisahan campuran dengan cara kromatografi didasarkan pada perbedaan kecepatan merambat antara partikel-partikel zat yang bercampur pada medium tertentu. Dalam kehidupan sehari-hari

pemisahan secara kromatografi dapat kita temui pada rembesan air pada dinding yang menghasilkan garis-garis dengan jarak ternentu.

Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan.Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen.Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.

D. Mekanisme

Skema KerjaPlat KLT ditandai dengan garis menggunakan pensil  ↓Ditotolkan dengan menggunakan pipa kapiler       ↓      Dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen  ↓          Plat KLT tadi dikeluarkan dan dikeringkan  ↓         Noda tadi dilihat dibawah sinar ultraviolet dan uap iodium  ↓Noda yang terlihat ditandai menggunakan pensil ↓   Dihitung nilai Rf

Kromatografi Kertas

A. Teori DasarKromatografi kertas umumnya lebih bermanfaat untuk tujuan identifikasi, karena mudah

dan sederhana. Dalam kromatografi kertas perbandingan jarak rambat (di ukur sampai titik yang memberikan intensitas maksimum pada bercak) suatu senyawa tertentu terhadap jarak rambat fase gerak, di ukur dari titik penotolan, di nyatakan sebagai harga Rf suatu senyawa tersebut. Harga Rf berubah sesuai dengan kondisi percobaan karena itu identifikasi sebaikanya di lakukan dengan menggunakan baku pembanding yang sama dengan uji kromatogram yang sama. Jika zat uji yang di identifikasi dan baku pembanding itu sama, terdapat kesesuaian dalam warna dan harga Rf pada semua kromatogram dan kromatogram dari campuran menghasilkan harag Rf adalah 1,0.

Kromatografi kertas tergolong kromatografi cairn dengan kertas sebagai zat pendukung karena kertas atau serat-serat selulosa merupakan adsorben lemah yang hidrofil, adsorbs zat oleh kertas tidak terlalu kuat dan terdesak oleh air. Air atau bagian yang lebih polar dari cairan yang di pakai sebagai eluen akan berlaku sebagai fase stasioner jadi kromatografi kertas dapat di golongkan sebagai jenis kromatografi cairan-cairan dan mekanisme pemisahan yang dominan adalah partisi. Oleh gaya kapiler dari kertas, fase mobil dapat bergerak naik, mendatar maupun menurun.

Eluen (pelarut, cairan pengelusi) pada kromatografi kertas biasanya merupakan campuran 2 komponen atau lebih, yang berlaku sebagai fase mobil selanjutnya adalah bagian campuran yang kurang polar.

Teknik kromatografi kertas diperkenalkan oleh Consden, Gordon dan Martin (1994), yang menggunakan kertas saring sebagai penunjang fase diam. Kertas merupakan selulosa murni yang memiliki afinitas terhadap air atau pelarut polar lainnya. Bla air diadsorbsikan pada kertas, maka akan membentuk lapisan tipis yang dapat dianggap analog dengan kolom. Lembaran kertas berpran sebgai penyngga dan air bertindak sebagai fase diam yang terserap diantara struktur pori kertas.

Cairan fase bergerak yang biasanya berupa campuran dari pelarut organic dan air, akan mengalir menbawa noda cuplikan yang di depositkan pada kertas dengan kecepatan yang berbeda. Pemisahan terjadi berdasarkan partisi masing-masing komponen diantara fase diam dan fase bergeraknya.

Kromatografi kertas digunakan baik untuk analisi kulitatif maupuk kuntitatuf. Senyawa-senyawa yang dipisahkan kebnyakan bersifat sangat polar, misalnya asam-amino, gula-gula, dan pigmen-pigmen alam.

Terdapat tiga metode pengembangan pada kromatografi kertas, yaitu:a.        Metode Penaikan (Ascending)

Kertas digantung sedemikian rupa sehingga bagian bawah kerta ercelup pada pelarut yang terletak didasar bejana. Noda harus diusahakan tidak sampai tercelup karena dapat larut dalam pelarut. Pelarut akan naik melalui serat-serat kertas oleh gaya kapiler menggerakkan komponen dengan jarak yang berbeda-beda.

b.        Metode Penurunan (Descending)Kertas digantung dalam bejana dengan ujung dimana aliran mulai bergerak dicelupkan dalam palung kaca yang berisi pelarut. Pelarut bergerak turun membawa komponen melalui gaya kapiler dan gaya gravitasi. 

c.        Metode mendatar (Radial)Matode ini sangat berbada dari sebelumnya. Biasanya kertas dibentuk bulat yang tengahnya diberi sumbu dari benang atau gulungan kertas. Noda ditempatkan pada pusat kertas kemudian pelarut akan naik melalui sumbu sehingga membasahi kertas untuk kemudian mengembang melingkar membawa komponen yang dipisahkan.

B. DefinisiKromatografi kertas merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam

adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan.

C. PrinsipPrinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua

cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.

D. Mekanismea. Cara melakukannya, ciplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan,

diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang bulat.

b. Bila noda telah kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena berarti senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas).Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut.

c. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering.

d. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau noda yang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa-senyawa.

e. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf.

Kromatografi Kolom

A. Teori DasarSilika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3) adalah 2 adsorben yang paling umum digunakan

untuk kromatografi kolom. Ukuran partikel dari adsorben sangat berpengaruh pada bagaiman eluen bergerak melewati kolom. Partikel yang lebih kecil (mesh lebih besar) digunakan untuk kromatografi kolom tekanan sedangkan adsorben dengan ukuran partikel yang lebih besar digunakan untuk komatografi kolom gravitasi. Alumina lebih sering digunakan dalam kromtografi kolom dibanding kromtografi lapis tipis. Daya adsorbsi alumina dapat diatur dengan mengatur jumlah air yang dikandung. Caranya ialah dengan mengeringkan alumina pada suhu 360 0C selma 5 jam, kemudian membiarkan alumina kering  tersebut menyerap air sampai jumlah tertentu. Aktivitasnya tergantung dari kadar airnya dan dinyatakan dalam skala Brockman.

Pelarut mempunyai peranan yang penting dalam mengelusi sampel yang dapat menentukan keberhasilan pemisahan secaa kromatografi kolom. Pelarut yang mampu menjalankan elusi terlalu cepat tidak akan mampu mengadakan pemisahan yang sempurna. Sebaliknya elusi yang terlalu lambat akan menyebabkan waktu retensi yang terlalu lama.

Sistem pelarut dengan kepolaran yang bertingkat sering juga digunakan adalah pelarut mengelusi kolom. Dalam hal ini pelarut yang pertama kali digunakan adalah pelarut non polar untuk mengelusi komponen yang kurang polar. Pelarut yang lebih polar ditambahkan untuk mengelusi komponen yang lebih polar juga.

Alat-Alat yang digunakan        

  Wadah eluen (fase gerak).

·           Kolom, biasanya terbuat dari gelas yang berfungsi sebagai penunjang fase diam. Pada bagian dasar dari kolom mempuny bentuk sedemikian rupa agar fase diam dapat tetap dalam keadaan statis. Terdapat glass woll atau kapas, atau bahan dari pasir kuarsa yang dikemas dengan kolom.

·          Wadah penampung, untuk menampung Eluat dari kolom dalam bentuk fraksi-fraksi. Pada dasarnya penampung dapat dilakukan secara manual, namun jik total volume dari eluat besar dengan setiap fraksi yang diinginkan dalam volume kecil, maka diperlukan suatu alat penampung tertentu. Untuk hal ini biasanya digunakan suatu alat penampun otomatis yng dikenal sebagai kolektor.

B. DefinisiKromatografi Fase NormalKromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.Kromatografi Fase Terbalik

Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.

C. PrinsipPrinsip kerja kromatografikolomperbedaan dayaserap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalamsedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zatmenyerap.Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebihlambat dari senyawa non polarterserap lebih lemah dan turun lebih cepat.Zat yang diserap dari larutan secara sempurnaoleh bahan penyerap berupa pita sempit padakolom. Pelarut lebih lanjut/ dengan tanpa tekanan udara masing-masing zat akanbergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom

D. Mekanisme

PROSEDUR KERJAA. A.       Persiapan Kolom

1. Menimbang sebanyak 10 gram silika.2. Melarutkan sebagian silika dengan n-heksan hingga terbentuk lumpur.3. Memasukkannya ke dalam buret yang ujungnya sudah tersumbat dengan kertas.4. Mengetuk-ngetuk dinding kolom agar silika tertata rapid an tidak ada udara yang

masuk. 

B.       Pemisahan Pigmen dalam Sampel DaunA. Melarutkan ekstrak sampel daun mangga dengan n-heksana : aseton (7:3).B. Memasukkan ekstrak tersebut ke dalam kolom.C. Setelah itu elusi dengan menambahkan larutan n-heksana.D. Menampung hasil elusi di dalam vial.E. Kemudian mengujinya dengan KLT.F. Mengamati jenis pigmen apa saja yang terdapat dalam tiap fraksi.

Kromatografi Cair Vakum

A. Teori DasarKromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu dengan

memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa vakum. Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium oksida (Ghisalberti, 2008).

Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV. Proses penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu:

a.       Cara BasahPreparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa

diam dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata. Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan (Sarker et al., 2006).b.      Cara kering

Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan (Sarker et al., 2006).

Preparasi sampel saat akan dielusi dengan KCV juga memiliki berbagai metode seperti preparasi fasa diam. Metode tersebut yaitu cara basah dan cara kering (Canell, 1998). Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang sama. Sedangkan cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali dengan fase diam yang sama (Canell, 1998; Sarker  et al., 2006).

B. DefinisiKromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu dengan

memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa vakum. Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium oksida (Ghisalberti, 2008).

C. PrinsipPrinsip kerja dari Kromatografi Vakum Cair (KVC) adalah adsorpsi atau serapan,

sedangkan pemisahannya didasarkan pada senyawa-senyawa yang akan dipisahkan terdistribusi di antara fasa diam dan fasa gerak dalam perbandingan yang berbeda-beda 

D. MekanismeProsedur kerja KVC menggunakan alat bantu yang berupa pompa vakum untuk

mempercepat laju alir fasa gerak selama proses pemindahan zat terlarut. Kolom kromatografi dikemas kering (biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 µm) dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Pompa vakum dihentikan dan pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan kembali. Kolom dihisap sampai kering dan telah siap dipakai. Cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimulai dengan pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan. Kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi. Oleh karena itu, kromatografi vakum cair menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak (Hostettmann K., Hostettmann M., dan Marston A., 1986: 33-34).

Kromatografi Preparasi

A. Teori Dasar

KLT Preparatif dapat digunkaan untuk memisahkan bahan dalam jumlah gram, namun sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram (Kristanti, 2008). Seperti halnya KLT secara umum, KLT Preparatif juga melibatkan fase diam dan fase gerak. Dimana fase diamnya adalah sebuah plat dengan ukuran ketebalan bervariasi. Untuk jumlah sampel 10-100 mg, dapat dipisahkan dengan mengunakan KLT Preparatif dengan adsorben silika gel atau aluminium oksida, dengan ukuran 20x20 cm dan tebal 1 mm, jika tebalnya di dua kalikan, maka banyaknya sampel yang dapat dipisahkan bertambah 50%, seperti halnya KLT biasa, adsorben yang paling umum digunakan pada KLT Preparatif adalah silika gel (Kristanti, 2008).

Sebelum ditotolkan pada plat KLT Preparatif, sampel dilarutkan terlebih dahulu dalam sedikit pelarut. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah menguap, misalnya n-heksana, diklorometana atu etil asetat. Karena jika pelarut yang digunakan tidak mudah menguap, maka akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi sampel juga sebaiknya hanya 5-10%. Sampel yang ditotolkan harus berbentuk pita yang sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan juga bergantung pada lebarnya pita (Kristanti, 2008).

Setelah plat KLT Preparatif dielusi, pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari plat. Selanjutnya senyawa harus diekstraksi dari adsorben dengan pelarut yang sesuai (5 ml pelarut untuk 1 gram adsorben). Diupayakan untuk menggunakan pelarut yang paling nonpolar yang mungkin. Harus diperhatikan bahwa makin lama senyawa kontak dengan adsorben, maka makin besar kemungkinan senyawa tersebut mengalami peruraian. Selanjutnya ekstrak yang diperoleh disaring menggunakan corong berkaca masir atau menggunakan membran.

Kelebihan dari penggunaan KLT Preparatif adalah biaya yang digunakan murah dan memakai peralatan paling dasar. Sementara kekurangannya antara lain : adanya kemungkinan senyawa yang diambil dari plat adalah senyawa beracun, waktu yang diperlukan dalam proses pemisahan cukup panjang ,adanya pencemar setelah proses ekstraksi senyawa dari adsorben dan biasanya rendemen yang diperoleh berkurang dari 40%-50% dari bahan awal (Kristanti, 2008).

B. Definisi