kromatografija(lc i cec).pdf

7/23/2019 Kromatografija(LC i CEC).pdf

http://slidepdf.com/reader/full/kromatografijalc-i-cecpdf 1/36

Kromatografija

(tekućinska kromatografija ielektrokromatografija)



Sadržaj

1. Uvod ……………………………………………………………..1

2. Kromatografija………………………………………………….2

2.1. Kromatogram……………………………………………....5

2.2. Teorija tavan (odsječaka)………………………..................8

2.3.

Kromatografski sustav…………………………..................9

2.4. Kromatografske veličine…………………………………..11

3. Tekućinska kromatografija…………………………….............15

3.1. Faktori koji utječu na tekućinsku kromatografiju………….21

3.2. LC-MS

4.

Kapilarna elektrokromatografija………………………………25

5. Zaključak

Literatura

Prilog 1.



1

1. Uvod

U analitičkoj praksi analit1 u uzorku treba detektirati ili odrediti u prisustvu drugih

tvari, ako one smetaju može ih se maskirati2 ili provesti postupak odjeljivanja.

Kromatografske metode odjeljivanja analitički su vrlo široko primijenjene. Analit koji treba

odijeliti podvrgnut je ponovljenim razdiobama između dvije faze, nepokretne (stacionarne)

faze koja može biti čvrsta tvar ili tekućina i pokretne (mobilne) faze koja može biti plin ili

tekućina. Kromatografska metoda podrazumijeva skup kromatografskih postupaka koji

omogućuju odjeljivanje, a potom selektivno i osjetljivo određivanje sastavnica u

multikomponentnim uzorcima (smjesama), uključujući i one gdje su sastavnice kemijski vrlo

slične i prisutne u vrlo niskim koncentracijama. Efikasna višestruka odjeljivanja (sličnih

spojeva) moguća su primjenom kromatografskih metoda koje su danas prisutne u 60%analiza. Kromatografija se temelji na pojavama adsorpcije, razdijeljena, ionske izmjene ili

isključenja koje omogućuju odjeljivanje sastojaka iz smjese. Uzorak otopljen u pokretnoj fazi

koja je tekućina, plin ili superkritični fluid kreće se preko nepokretne faze koja može biti u

koloni ili na plohi. Kromatografske metode koriste se za odjeljivanja u kvalitativnoj i

kvantitativnoj analizi, ali i u preparativne svrhe. Ispravnu kvalitativnu i kvantitativnu

kromatografsku analizu moguće je provesti samo uz odgovarajuće standarde. Pod unutarnjim

standardom podrazumijevamo spoj poznate koncentracije koji je dodan uzorku i koji je vrlo

često kemijski srodan analitu. Pod vanjskim standardom podrazumijeva se spoj, najčešće sam

analit, iz kojeg se priređuju standardne otopine poznate koncentracije koje se mjere odvojeno

od nepoznatog uzorka ali pod jednakim eksperimentalnim uvjetima te služe u svrhu

postavljanja kalibracijske funkcije [6].

1 Analit ( engl. analyte), sastojak koji se mjeri ili ispituje analitičkim postupkom 2 Maskiranje (engl. masking ), vezanje smetnja u matici uzorka u stabilne komplekse ili drugi oblik radi

sprečavanja sustavne pogreške

(definicija prema M. Kaštelan-Maca, Enciklopedijski rječnik analitičkog nazivlja, Fakultet kemijskog

inženjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014) )



2

2. Kromatografija

Instrumentalne metode obuhvaćaju veliki broj vrlo raznih metoda i postupaka. Kao što

su spektrometrijske metode koje se baziraju na interakciji uzorka i energije, a kao posljedicu

interakcije mjerimo elektromagnetsko zračenje ili zračenje raznih čestica (elektrona, protona i

iona), zatim elektroanalitičke metode kod kojih imamo ili signal pobude ili signal odziva (ili

oba) električna veličina, radiokemijske metode, termičke (toplinske) metode (termometrijske),

metode separacije koje obuhvaćaju kromatografiju i elektroforezu.

Kromatografija je postala jedna od najvažnijih metoda analitičke kemije. Kromatografskim

metodama moguće je razdvojiti dva ili više sličnih sastojaka smjese što je drugim postupcima

prilično teško postići. Prvi rad u kojem je opisan postupak odjeljivanja sastojaka smjese koja

prolazi kroz stupac adsorbensa3

, nazvan kromatografijom, objavio je M. Cvet4

1906. godine.Tek od 1931.godine kada su R. Kuhn i E. Lederer opisali odjeljivanje karotena,

kromatografski postupci se počinju šire primjenjivati. A.J.P.Martin i R.L.M.Synge5(1941.)

prvi su upotrijebili tekućinu kao nepokretnu fazu nanijetu u tankom sloju na podlozi velike

površine te uz tekućinu kao mobilnu fazu. Uveli su i objasnili pojam razdjelne kromatografije,

uveli teoriju tavana u kromatografiju i 1952. za teoriju razdjelne kromatografije dobili

Nobelovu nagradu. Primjenom plina kao pokretne faze i tekućine kao nepokretne faze otvorili

su A.J.P. Martin i A.T. James 1951. godine novo područ je, plinsku kromatografiju. E.Stahl6 je

1958. opisao mogućnost kromatografskog razdvajanja u kojem je adsorbens nanesen u

tankom sloju na staklenu ploču-tankoslojnu kromatografiju. Prva knjiga o kromatografiji

objavljena je 1936., prvi plinski kromatograf proizveden je 1952., a instrumentalna tekućinska

kromatografija počela se primjenjivati oko 1965. godine.

3 Adsorbens (engl.adsorbent ), praškasta, koloidna ili porozna čvrsta tvar na površini koje dolazi do adsorpcije;

služi kao nepokretna faza u adsorpcijskoj kromatografiji. (definicija prema M. Kaštelan-Maca, Enciklopedijski

rječnik analitičkog nazivlja, Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014) )

4 Mihail Semjonovič Cvet ( Asti, 1872.-Voronjež, 1919.), ruski botaničar koji je 1906.godine objavio svojeiskustvo odjeljivanja obojenih biljnih pigmenata adsorpcijom na kalcijevu karbonatu i tu tehniku nazvaokromatografijom prema grčkome chroma-boja i graphien-pisati5 Archer John Porter Martin ( London 1910.-Llangarron,2002.) i Richard Laurence Millington Synge

(Liverpool,1914.-Norwich, 1994.)bili su britansk i biokemičari, dobili su 1952. godine Nobelovu nagradu zarazvoj razdjelne kromatografije.6 Egon Stahl ( Eberbach, 1924.- Eberch, 1986.), njemački kemičar, utemeljitelj tankoslojne kromatografije.



3

Slika 1. Znanstvenici koji su se bavili proučavanjem kromatografije.

Zahvaljujući svojoj širokoj primjenjivosti i učinkovitosti, kromatografija je danas jedna od

najvažnijih analitičkih tehnika, čija se načela primjenjuju u znanstvenim istraživanjima i

rutinskim analizama uzoraka iz okoliša, biomedicinskim ispitivanjima, forenzičkoj analizi,

ispitivanju čistoće lijekova, praćenja reaktanata i produkata organske sinteze itd.

Kromatografski sustav čine nepokretna i pokretna faza te ispitivana tvar koja se tijekom

kromatografskoga procesa nalazi u dinamičnoj ravnoteži između tih dviju faza. Zbog

narušavanja ravnotežnoga stanja ispitivana tvar putuje s pokretnom fazom, zadržavajući se svremena na vrijeme u nepokretnoj fazi. Da bi došlo do odjeljivanja sastojaka ispitivane

smjese, nepokretna faza mora selektivno i različito dugo zadržavati sastojke smjese. [2]

Kromatografske se tehnike s obzirom na prirodu ravnoteže između pokretne i nepokretne faze

mogu podijeliti na:

razdjelna kromatografija, kada se ravnoteža uspostavlja između pokretne faze

(tekućine ili fluida u superkritičnim uvjetima) i tekućine nepokretne faze vezane na

inertni čvrsti nosač

adsorpcijsku kromatografiju u kojoj se ravnoteža uspostavlja između tekućine ili plina

u pokretnoj fazi i površine čvrste nepokretne faze, pri čemu se ispitivane molekule

izravno vežu na površinu adsorbensa

ionsko-izmjenjivačku kromatografiju u kojoj dolazi do izmjene iona analiziranoga

spoja s ionima nepokretne faze

afinitetnu kromatografiju u kojoj do vezanja dolazi zbog specifičnih interakcija

molekula s kemijskim vezanim ligandom na površini nepokretne faze



4

kromatografiju isključenjem po veličini u kojoj je nepokretna faza materijal s porama

definiranih dimenzija i slabo izraženim adsorpcijskim svojstvima, a odjeljivanje

molekula zbiva se zbog razlike u molekulskoj masi i obujmu [1].

Podjela kromatografskih tehnika moguća je i na temelju sastava pokretne faze. Tako je u

plinskoj kromatografiji (GC) pokretna faza inertni plin, u tekućinskoj kromatografiji (LC) to

je tekućina male viskoznosti, a u fluidnoj kromatografiji u superkritičnim uvjetima (SFC)

pokretna je faza fluid iznad svoje kritične temperature i tlaka. Nepokretna faza može biti

tekuća ili čvrsta. Ako je gusto pakirana u kromatograf skom stupcu riječ je o kromatografiji u

stupcu, a ako je kao tanki homogeni film nanesena na inertnu podlogu ili je podloga

specijalno pripremljen papir, govorimo o plošnoj kromatografiji koju predstavljaju

tankoslojna kromatografija (TLC) i kromatografija na papiru (PC).

U tek ućinsku kromatografiju svrstavamo tankoslojnu kromatografiju (TLC), tekućinsku

kromatografiju visoke djelotvornosti (HPLC), kromatografiju ultravisoke djelotvornosti

(UHLPC), ionsku kromatografiju (IC) i kromatografiju isključenjem po veličini (SEC).

Čimbenici koji utječu na kromatografski proces su:

energetska barijera

veličina i geometrijski oblik zrna sorbensa koji tvori nepokretnu fazu

temperatura sustava

brzina pokretne faze

priroda veze

količina ispitivanog spoja [4].



5

2.1. Kromatogram

Kromatogram ( engl. chromatogram ) grafički prikaz odnosa koncentracije ili mase

analita prema obujmu eluata ili vremenu kromatografiranja tijekom kromatografskoga

procesa; u plošnoj kromatografiji pojam kromatogram se odnosi na papir ili tanki sloj na

kojem su vidljive razlučene kromatografske zone [10]. Proces u kojem se kromatografirana

tvar uravnotežuje između pokretne i nepokretne faze naziva se kromatografsko razvijanje. S

obzirom na kromatografski sustav razvijati se može ispiranjem (eluiranjem), zamjenom i

frontalnom analizom. U kr omatografiji u stupcu danas je uglavnom riječ o razvijanju

ispiranjem pri čemu se razlučeni sastojci detektiraju pri izlazu iz stupca. Kromatogram je

zapis analitičkog signala u ovisnosti o vremenu razvijanja ili obujmu eluata7,te informacija o

uspješnosti separacije sadržana je u kromatogramu, na temelju broja opaženihkoncentracijskih profila može se zaključiti o složenosti ispitivanog uzorka. Položaj mrlje ili

određene kromatografske krivulje pomaže u određivanju kvalitativnog sastava uzorka dok

površina kromatografskih krivulja, odnosno njezine visine, vrh , može se dobiti kvantitativna

procjena [2].

S obzirom na način razvijanja razlikujemo plošne i diferencijalne kromatograme (Slika 2.). U

plošnim kromatogramima sastojci uzorka prelaze različite udaljenosti u istome vremenu pa se

oni po završetku odjeljivanja detektiraju na nepokretnoj fazi. Kromatografijom na stupcu

dobivaju se diferencijalni kromatogrami. Svi sastojci prelaze isti put, ali se zbog specifičnih

interakcija s nepokretnom fazom, na izlazu iz stupca pojavljuju i detektiraju u različitim

vremenima. U analizi uzoraka iz okoliša kromatografija na stupcu zastupljenija je od plošne

kromatografije [1].

7 Eluat ( engl. eluate), otopina sastojaka nakon izlaska iz kromatografskog ili ekstrakcijskog stupca.

Eluens (engl. eluent ), sredstvo za eluiranje.

Eluiranje (eng. elution), ispiranje zadržanog sastojaka iz kromatografskog ili ekstrakcijskog stupca prikladnimotapalom.

Eluit (engl.eluite), eluirani analit.

(definicije prema M. Kaštelan-Maca, Enciklopedijski rječnik analitičkog nazivlja, Fakultet kemijskoginženjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014) )



6

Slika 2. Tipičan kromatogram

I.A- ispis dobiven diferencijalnim detektorom

IB.-ispis dobiven integralnim detektorom

( preuzeto iz http://issuu.com/hinus/docs/kroma_11str_obr )

Slika 3. Kalibracijski kromatogram anserina i kranozina koncentracije 6,25 mg/L, 12,5 mg/L

25 mg/L, 50mg/L i 100 mg/L dobiven uz pomoć fluorescentnog (RF -20A)detektora



7

Slika 4. Prikaz kalibracijske krivulje za anserin



8

2.2. Teorija tavana (odsječaka)

A. J. P. Martin i R. L. M. Synge (engleski znanstvenici), 1952. godine, dobili su Nobelovu

nagradu za doprinos razvitku suvremene kromatografije. U teorijskim razmatranjima

primijetili su model razvijen ranih 1920.-tih godina, kojim je objašnjeno odjeljivanje na

kolonama za frakcijsku destilaciju. Kolone za frakcijsku destilaciju, koje su se najprije

upotrebljavale u naftnoj industriji za odjeljivanje ugljikovodika, sastoje se od velikog broja

tavana na kojima se uspostavlja ravnoteža između pare i tekućine pri radu kolone u uvjetima

reflektiranja. Djelotvornost kolone, kao uređaja za odjeljivanje, izravno je povezana s brojem

tavana po jedinici duljine kolone.

Martin i Synge promatrali su kromatografsku kolonu kao da je napravljena od dugačkog niza

tavana unutar kojega uvijek prevladavaju ravnotežni uvjeti. Model tavana (odsječaka)

pogodan je za tumačenje Gaussova oblika kromatografskog vrha. On uzima u obzir i veličine

koje utječu na različitost brzina gibanja analiziranih sastojaka. U svakom tavanu doći će do

uravnoteženja u razdiobi kromatografiranih komponenata između pokretne i nepokretne faze.

Međutim, taj model ne objašnjava širenje zone eluiranog sastojka zbog osnovne pretpostavke

da tijekom eluacije ravnotežni uvjeti prevladavaju duž cijele kolone. U dinamičkom stanju

koje vlada u kromatografskoj koloni, faze se jedna prema drugoj pomiču tako da ne ostavljaju

dovoljno vremena za uspostavljanje ravnoteže. Budući da je model tavana (odsječaka) vrlo

manjkav prikaz kromatografske kolone, treba izbjegavati svako stvarno i imaginarno davanje

važnosti izrazima „tavan“ i „visina tavana“ i te izraze treba promatrati kao oznake za

djelotvornost kolone zadržane samo zbog povijesnog razloga. Ti pojmovi nemaju fizikalnu

važnost. Na nesreću, oba su pojma udomaćena u kromatografskoj literaturi pa je teško

očekivati njihovu zamjenu primjerenijim pojmovima [3].

Broj teorijskih tavana (odsječaka) predstavlja broj pseudoravnoteža ili faznih prijelaza

postignut na određenoj koloni, a zadan je izrazom N= 16(tR /W b)2, pri čemu je W b širina vrha

u osnovici (Slika 5.). Djelotvornost kromatografske kolone povećava se povećanjem broja

teorijskih tavana (odsječaka) [5].



9

Slika 5. Način računanja broja teorijskih tavana (odsječaka) N ( preuzeto iz M.

Cindrić, A. Marković, A. Horvatić, Spregnute tehnike tekućinski kromatograf spektrometar

masa: osnove metodologije i primjene, Medicina, 45 (3) (2009) 220)

2.3. Kromatografski sustav

Separacija se ostvaruje selektivnom distribucijom komponenta između pokretne i

nepokretne faze. No postoje brojni faktori koji se odnose na fizikalno-kemijska svojstva

pokretne i nepokretne faze te analita, a kontroliraju razne interakcije između analita i ove

dvije faze. Brojnost mogućih interakcija između analita i nepokretne faze (adsorbensa) ovisi o

veličini čestica nepokretne faze tj. što je veća površina nepokretne faze veći je broj

interakcija. Nepokretna faza s velikom površinom može osigurati bolju separaciju [12].

Kromatografska odjeljivanja se temelje na različitoj razdiobi sastojaka između pokretne i

nepokretne faze [9].

Analit pokretna↔ Analit nepokretna

Raspodjela uzorka između dviju faza određena je konstantom ravnoteže, a naziva se još i

koeficijentom raspodjele (distribucije), K. Ravnoteža je dinamički proces, a molekule

komponenata prelaze iz jedne u drugu fazu tako da se u prosjeku njihove koncentracije

ravnaju prema zakonu raspodjele (Jednadžba 1.):

K =

(1)



10

gdje su cS i cM koncentracije analita u nepokretnoj i pokretnoj fazi

Konstanta ravnoteže ovisna je o kemijskim svojstvima sustava [13]. Kao što je spomenuto,

k romatografski sustav čini uzorak koji analiziramo te pokretna i nepokretna faza. Budući da

su molekule analita zadržane interakcijama s površinom nepokretne faze, separacija se temelji

uglavnom na razlici afiniteta adsorpcije molekula analita prema površini nepokretne faze [12].

Zato treba pridodati posebnu pozornost izboru nepokretnih i pokretnih faza jer o njihovom

izboru ovisi učinkovitost kromatografskog odjeljivanja. Nepokretna faza je čvrsta tvar ili

kapljevina na inertnom nosaču.

S obzirom na kemijsku strukturu i polarnost, sorbensi8 se dijele:

-

na polarne anorganske (hidrofilne) sorbense, kojima su predstavnici silikagel,aluminijev oksid i magnezijev silikat

- na nepolarne anorgnaske sorbense kao što su aktivni ugljen i grafit

- na polarne vezane faze, npr. aminopropil, cijanopropil, diol

- na nepolarne vezane faze, poput alkana C8 i C18 ugljikovodika

- na polarne organske sorbense kojih su predstavnici celuloza, hitin, poliamid [2].

S obzirom na sposobnost tvorbe vodikove veze, otapala su podijeljena na pet skupina:

1. tekućine kojima su molekule međusobno povezane višestrukim vodikovim vezama

(voda, glicerol, aminoalkoholi, etilenglikol i sl.),

2. tekućine kojima su molekule povezane vodikovom vezom i koje mogu tvoriti

vodikovu vezu s molekulama ispitivanog spoja ( alkoholi, fenoli, amini),

3. tekućine kojima molekule sadrže atome kisika, koji mogu imati udjela u vodikovoj

vezi, ali ne sadrže atome vodika (ketoni, eteri, esteri, aldehidi), 4. tekućine kojima molekule sadrže atom vodika, koji može tvoriti vodikovu vezu, ali ne

sadrži odgovarajuće atome koji bi mogli imati udjela u vezi ( kloroform, diklormetan)

5. ostale tekućine kojima molekule mogu tvoriti vodikovu vezu [2].

8 Sorbensi (engl. sorbent ), tvari koje vežu druge tvari fizikalnim i kemijskim silama, a mogu biti polarni i

nepolarni. (definicija prema M. Kaštelan-Maca, Enciklopedijski rječnik analitičkog nazivlja,

Fakultet kemijskoginženjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014) )



11

2.4. Kromatografske veličine

Za svaki analit na svakoj koloni očitavani su karakteristične veličine kromatografske

krivulje.

Tablica 1. Prikaz kromatografskih veličina (tablica preuzeta iz D. A. Skoog, D. M. West, F. J.

Holler, Osnove analitičke kemije, Školska knjiga, Zagreb (1999) 669)

NazivOznaka za eksperimentalnu

veličinu [mjerna jedinica]

Vrijeme kretanja

nezadržanog spoja t M [s]

(t-engl.time)

Vrijeme zadržavanja,

sastojka A i B (t R ) A, ( t R ) B [s]

Prilagođeno/ispravljeno vrijeme

zadržavanja

(

, ) A [s]

{(t R, )A= (tR )A -tM}

Širina vrhova, sastojka A i B W A i W B [s] (W-engl.width)

Duljina punila kolone L [cm] (L-engl-leght)

Brzina protoka F [mL/min] (F-engl. flow)

Volumen pokretne i nepokretne

fazeV M i V S [ml]

(S-engl. stacionary, M-engl.mobile)

Koncentracija sastojaka u

pokretnoj i nepokretnoj fazi

c M i cS

(S-engl. stacionary, M-engl.mobile)

Vrijeme kretanja nezadržanog spoja (t M ), ili mrtvo vrijeme, je vrijeme koje je potrebno da

sastojak koji se ne zadržava u koloni prođe kroz kolonu, to su uzorci čije su molekule veće od

najvećih pora čestica gela.

Vrijeme zadržavanja (t R ) je vrijeme od unošenja uzorka u kolonu do pojave sastojka u

detektoru smještenome na izlazu kromatografske kolone.

Prilagođeno vrijeme zadržavanja ( , ) je ukupno vrijeme zadržavanja umanjeno za vrijeme

zadržavanja nezadržanog sastojka.



12

Slika 6. Tipični kromatogram smjese koja sadrži dva sastojka. Mali pik s lijeve strane predstavlja sastojak koji se ne zadržava u koloni pa u detektoru dospijeva gotovo neposredno

nakon početka eluacije. Dakle, vrijeme zadržavanja t M je približno jednakom vremenu potrebnome da molek ule mobilne faze prođu kroz kolonu. (preuzeto iz D. A. Skoog, D. M.

West, F. J. Holler, Osnove analitičke kemije, Š kolska knjiga, Zagreb (1999) 649)

Tablica 2. Prikaz izračunavanja kromatografskih veličina (tablica preuzeta iz D. A. Skoog,

D. M. West, F. J. Holler, Osnove analitičke kemije, Školska knjiga, Zagreb (1999) 669)

NazivIzračunavanje

izvedenih veličina

Veza s ostalim

veličinama Linearna brzina mobilne faze u= ⁄ /

Volumen pokretne faze V M = t M F /

Faktor kapaciteta ,= (t R-t M )/t M ,=

Koeficijent raspodjele K = ,

K =

Koeficijent selektivnosti α=()−()−

α=,

, =

Razlučivanje RS =2[()−()]

+ RS =

√

4( −1

)( ,

1+, )

Broj tavana (odsječaka) N=16 ( )2 N =16

2( −1

)2(

,

1+, )

Visina tavana (odsječaka) H = ⁄ /

Vrijeme zadržavanja ( ) B=16

( −1

)2(

, )3

(, )

/



13

Faktor kapaciteta (k , ) parametar s kojim se opisuje brzina gibanja analita u koloni. Kada je k ,

manji od 1,eluacija je tako brza da je teško očitati njegovo vrijeme zadržavanja. Kada je k ,

veći od 20 do 30 tada je eluacija preduga, najoptimalniji k , za analite u smjesi iznosi 1 i 5.

Mijenjanjem k , u tekućinskoj kromatografiji poboljšava se odjeljivanje, a to se postiže

mijenjanjem sastava nepokretne i pokretne faze.

Razlučivanje9 kromatografskih krivulja (Rs) (Slika 7.) je kvantitativna mjera kojom se

izražava sposobnost odjeljivanja dvaju analita na koloni. Razlučivanje za određenu

stacionarnu fazu može se poboljšati produživanjem kolone, čime se povećava broj teorijskih

tavana (odsječaka). Nepogodnost pri povećanju broja tavana (odsječaka) jest produženju

vremena koje je potrebno za postizanje boljeg razlučivanja. Izraženo je pomoću prosjeka

širina njihovih osnovica (tR2>tR1).

Djelotvornost kromatografske kolone ili širenje površine zone pokazuje učinkovitost

kromatografske separacije može se kvantitativno izraziti :

Broj tavana (odsječaka) (N) (Slika 5.) je broj koji označava djelotvornost kolone, a

izračunava se pomoću gore navedene jednadžbe.

Visina tavana (odsječaka) (H) je duljina kolone podijeljena s brojem tavana.

Kolona je djelotvorna kada je H mali, a N veliki.

Linearna brzina pokretne faze ( ) se izračunava dijeljenjem duljine kolone (L) s vremenom

zadržavanja spoja koji kroz kolonu prolazi bez zadržavanja (tM).

Koeficijent selektivnosti ( α ) neke kromatografske kolone izračunat za dva različita analita

pokazuje kako će dobro ta kromatografska kolona odijeliti te sastojke, uvijek α >1.

9 Razlučivanje (engl. resolution), najmanja promjena mjerene veličine koja pokazuje zamjetnu promjenu u

odgovarajućem pokazivanju. (definicija prema M. Kaštelan-Maca, Enciklopedijski rječnik analitičkog nazivlja,

Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014) )



14

Slika 7. Primjeri različito razlučenih pikova i osnovnih

veličina koje se koriste u izračunu N, R s (na slici R) , α i k te širina vrhova (W A i W B ). Na slici

je vidljivo razlučivanje od 1,5 omogućuje potpuno odjeljivanje sastojaka A i B, a razlučivanjeod 0,75 to ne omogućuje. Uz razlučivanje od 1,0 zona A sadrži otprilike 4% B, a zona B

sadrži približno 4% A. Uz razlučivanje od 1,5 preklapanje iznosi otprilike 0,3%. (preuzeto iz

D. A. Skoog , D. M. West, F. J. Holler, Osnove analitičke kemije, Š kolska knjiga, Zagreb

(1999) 663)



15

3. Tekućinska kromatografija

U tekućinskoj kromatografiji pokretna faza je kapljevina, a nepokretnu fazu mogu

činiti različiti sorbensi. Izbor pogodnog otapala, odnosno smjese otapala, provodi se s

obzirom na sposobnost otapala da stvaraju vodikove veze (odjeljivanje hidrofilnih, odnosno

hidrofobnih spojeva). Otapala moraju biti kromatografski čista, šta znači da ne smiju

sadržavati nečistoće koje mogu smetati kromatografskom određivanju.

Vrlo su velike mogućnosti uporabe tekućinske kromatografije za odjeljivanje polarnih i

nepolarnih spojeva. U posljednja dva desetljeća ta se tehnika naglo razvila zbog mogućnosti

utjecanja na učinkovitost separacije modificiranjem nepokretne i pokretne faze [2].

Izbor nepokretne faze je uvjetovan vrstom veze koja nastaje između ispitivanog spoja i

kr omatografske podloge, prirodom ravnoteže kromatografskog procesa, prirodom ravnoteže

kromatografskog procesa te ponajprije prirodom ispitivanog spoja.

Silikagel je u tekućinskoj kromatografiji stacionarna faza koja se najčešće upotrebljava za

separaciju prirodnih produkata i može biti komercijalno dostupna u više oblika. Površina

silikagela je blago kisela, pa stoga postoji težnja k preferiranoj adsorpciji jako bazičnih

supstancija u odnosu prema adsorpciji na neutralni ili bazični adsorbens [12] (Slika 8.).

Slika 8. Strukturna građa silikagela ( opća formula je SiO2·H 2O), adsorpcijska svojstva

silikagela ovise o broju, položaju i međusobnom odnosu hidroksilih skupina na površini

silikagela. (preuzeto iz M. Kaštelan- Macan, Kemijska analiza u sustavu kvalitete, Školska

knjiga, Zagreb (2003) 232)



16

Kako bi se s obzirom na izbor nepokretne faze omogućio optimalan kromatografski sustav za

odjeljivanje željene smjese, treba izabrati pogodan sustav otapala koji čine pokretnu fazu.

Intermolekulske interakcije Van der Waalsovim silama, veze diplo-inducirani dipol, dipol-

dipol te vodikova veza najčešće su u tekućinskoj kromatografiji normalnih faza (NPLC, engl.

N ormal P hase L iquid C hromatography) i obrnutih faza (RPLC, engl. R eversed P hase L iquid

C hromatography).

Kromatografija normalnih faza: nepokretna faza (najčešće silikagel, a katkad Al2O3) je

polarna, a pokretna nepolarna (sustav organskih otapala u kojemu se prema potrebi dodaje

voda ili elektrolit radi podešavanja polarnosti). Odjeljivanje smjese u tome slučaju ovisi o

interakciji polarnog analita s polarnom nepokretnom fazom. No treba naglasiti da se

homologni ili izomerni spojeva ne mogu odjeliti (npr. nepolarni ugljikovodici bez polarnih

skupina, u tom slučaju vrlo slabo r eagiraju s nepokretnom fazom). Interakcije polarnih

skupina u analitu (npr. hidroksi, keto, amino, amido, ester, eter ili merkapto) i polarna strana

površine dominiraju mehanizmom retencije. Polarne i kisele silanolne skupine podliježu

dipolnim i vodikovim vezama i kiselo-baznim interakcijama [12].

Kromatografija obrnutih faza: nepokretna faza je nepolarna, a pokretna faza polarna.

Mehanizam odjeljivanja smjese se temelji na hidrofobnosti analita. Materijali od kojeg je

većinom izrađena nepokretna faza je alkilno modificirani silikagel te polistiren-divinilbenzen

(PS-DVB) polimeri (alkilni ligandi vezani na aromatske prstenove). Pokretačke sile za

ostvarivanje retencije jesu: disprezivne interakcije između nepolarnih liganada s površine i

nepolarnih komponenata u analitu, te "hidrofobni efekt", tj, nastojanje da se minimizira

narušavanje strukture vode [12]. Stoga je velika primjena RPLC-a u razdvajanju homolognih

izomernih spojeva slične polarnosti, ali i onih vrlo polarnih i ioniziranih spojeva.

Silikagel je temeljna nepokretna faza, no zbog smanjivanja njegove polarne moći treba ga

modificirati, pa se na površinu silikagela vežu alkilne i arilne skupine, amino, cijano, nitro ili

diolne skupine te kiralni dodatci [6]. Treba još naglasiti da je silikgel, nepokretne faze,

nestabilan izvan 2,5-8 pH.

Pokretna faza je smjesa i polarnog organskog otapala (metanola, acetonitrlila,

tetrahidrofurana), izbor otapala ovisi o njegovoj moći eluiranja analita ( povezana s

viskoznosti, dielektričnoj konstanti, proton-akceptor te proton donorima) [6].



17

Tekućinska kromatografija se može provoditi u zatvorenom ili otvorenom sustavu, tj. stupcu

ili na kromatografskoj ploči [1].

Osnovni konstrukcijski dijelovi tekućinskog kromatografa visoke djelotvornosti su spremnici

za otapala pokretne faze, crpka, injektor, po mogućnosti predkolona, kolona i detektor(Slika 9.). Crpka ubacuje pokretnu fazu u stupac pod visokim tlakom stalnom brzinom

(0,1-10mL/min), a uzorak se automatski dodavanjem unosi u sustav za injektiranje, tzv. petlju

(obujam 5-500 µL) u kojoj se održava tlak. Otapalo prolazi kroz injektor te nosi uzorak u

kolonu (može biti ručno ili automatsko unošenje, „autosampler “), mora se paziti da se ne

ošteti kolona) koja je obično cijev od nehrđajućega čelika, duljine 50-250 mm, unutarnjeg

promjera 2-4,6 mm, punjena česticama veličine 1,7-5 µm, a najčešće 4 ili 5 µm. Za

produljenje kolone dobro je rabiti predkolone tzv. „ guard “ kolona kojoj je glavna ulogaodržavanje analitičke kolone u što duljem i boljem radu (uklanjajući smetnje).

Kolone najčešće nose oznake po vrsti nepokretne faze (C18, C8, C4, NH2, Ph-NH2, CN,

grafitna, SiO2 , gel-propusna itd.). Pri razvoju tekućinsk e kromatografije najprije su se

upotrebljavala anorganska punila, a razvojem metode organska punila. Punila kolone moraju

udovoljavati određenim zahtjevima: moraju imati otpornost prema visokim tlakovima koji se

stvaraju u koloni, otpornosti prema organskim otapalima i kemikalijama koje su

upotrijebljene u kromatografiji te prikladnosti za usitnjavan je do vrlo malih čestica (za HPLC

do 3 µm)

Pokretna faza u tekućinskoj kromatografiji je tekućina: voda, organska otapala i puferi. Sva

otapala koja se rabe u tekućinskoj kromatografiji moraju udovoljavati strogim zahtjevima:

moraju biti savršeno čista

ne smiju biti štetna

moraju biti kompatibilna s detektorom i relativno ne reaktivna

moraju moći otopiti uzorak.

Prema temeljnim svojstvima detektori mogu biti osjetljivi na koncentraciju (odgovor je

detektora proporcionalan koncentraciji komponente uzorka) i masu (odgovor je detektora

proporcionalan masi komponente uzorka).

Važni detek tori su spektometar masa, spektrofotometrijski detektori u UV-VIS području

elektromagnetskog zračenja, detektori na osnovi molekulske fluor escencije, indeksa loma(Slika 10.), oni koji se temelje na raspršenju elektromagnetskog zračenja na isparenom uzorku



18

(Slika 11.), te elektrokemijski detektori (konduktometrijski na slici 12. i amperometrijski na

slici 13.). Detektori mogu pratiti važne značajke pokretne faze ili otopljene tvari. U prvome

slučaju mjeri se indeks loma il provodnosti, pa se otopljeni analit dokazuje neizravan iz

promjene tih veličina. U drugome se slučaju prate karakteristike otopljene tvari (apsorpcija u

UV/VIS ili IR području, fluorescencija ili struja na elektrodi) [1].

Vrlo dobri detektori su spektometri s diodnim nizom koji omogućuju snimanje spektra

eluiranih sastojka u UV/VIS području. Apsorbancija se prikazuje u ovisnosti o vremenu

zadržavanja i o valnoj duljini (Slika 14.) [1].

Slika 9. Shematski prikaz HPLC kromatografa (preuzeto iz M. Kaštelan- Macan, M. Petrović(urednice), Analitika okoliša, HINUS i Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologija (2013)

211)



19

Slika 10. Refraktometar (preuzeto iz M. Kaštelan- Macan, M. Petrović (urednice), Analitikaokoliša, HINUS i Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologija (2013) 211)

Slika 11. ELS (engl. e vaporative l ight s cattering) detektor(preuzeto iz M. Kaštelan-Macan,

M. Petrović (urednice), Analitika okoliša, HINUS i Fakultet kemijskog inženjerstva itehnologija (2013) 212)



20

Slika 12. Konduktometrijski detektor (preuzeto iz M. Kaštelan- Macan, M. Petrović(urednice), Analitika okoliša, HINUS i Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologija (2013)

212)

Slika 13. Amperometrijski detektor (preuzeto iz M. Kaštelan- Macan, M. Petrović (urednice), Analitika okoliša, HINUS i Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologija (2013) 213)



21

3.1. Faktori koji utječu na tekućinsku kromatografiju

Kao kod svake kromatografske metode tako i kod tekućinske kromatografije, najveći dio

vremena čak oko 60 % odlazi na pripremanje uzorka (homogenizacija, centrifugiranje,

precipitacija, hidroliza, filtracija itd.). Zatim moramo predvidjeti faktore koji će utjecati na

kromatografski proces. U tekućinskoj kromatografiji na kromatografski proces utječu:

energetska barijera (Slika 14.),da bi molekule prešle iz jedne faze u drugu potrebna im

je određena količine energije, energija koja ima je potrebna da preskoče energetsku

barijeru između faza. Vjerojatnost da pojedina molekula iz promatranog skupa u

promatranom vremenskom intervalu nadmaši energetsku barijeru ΔE može se

prikazati jednadžbom 2:

p= (2)

prijelaz pojedine molekule iz nepokretne faze u pokretnu fazu događa se onda kada se

ona oslobodi veze u nepokretnoj fazi te obratno. Molekula će lakše prelaziti

energetsku barijeru ako se nalazi u pokretnoj fazi jer je ta veza puno slabija nego veza

molekule i nepokretne faze.

Slika 14. Shematski prikaz energetskog stanja molekula u nepokretnoj fazi i pokretnoj fazi:

E m-osnovno energetsko stanje u pokretnoj fazi, E s-osnovno energetsko stanje u nepokretnoj

fazi (preuzeto iz M. Kaštelan- Macan, M. Petrović (urednice), Analitika okoliša, HINUS i

Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologija (2013) 227)



22

Uspješnost odjeljivanja smjese, u kojoj se nalaze spojevi A i B, tijekom kromatografskog

procesa ovisi o što većem omjeru razlika njihovih energetskih stanja kao što je prikazan jednadžbom 3.:

∆−∆

∆−∆ (3)

te što većem broju teorijskih odsječaka N, prema jednadžbi 4.:

N =()2·( R F -

2 ) (4)

L- prijeđeni put otapala

σ- standardno odstupanje

R F- omjer puta koji je tijekom kromatografskog procesa prešla ispitivana tvar i puta otapala

temperatura utječe na odjeljivanju u tekućinskoj kromatografiji, s povišenjem

temperature sustava povećava se difuzija, a povećanjem difuzije dolazi do povećanja

disperzije ispitivanih molekula [9].

Slika 15. Slika prikazuje kromatogram smjese od tri različita sastojaka gdje se vidi utjecaj

t emperature na ravnotežni pomak i retencijsko vrijeme (preuzeto iz K. A. Rubinson, J. F.

Rubinson, Contemporary Instrumental Analysis, Prentice Hall (2000) 650)

http://www.amazon.com/Kenneth-A.-Rubinson/e/B001H6UZZG/ref=dp_byline_cont_book_1


http://www.amazon.com/s/ref=dp_byline_sr_book_2?ie=UTF8&field-author=Judith+F.+Rubinson&search-alias=books&text=Judith+F.+Rubinson&sort=relevancerank







23

veličina i oblik čestica nepokretne faze utječe na tekućinsku kromatografiju te najbolju

iliti optimalnu veličinu zrna nepokretne faze treba se naći eksperimentalnim putem.

Manja zrnca imaju veću aktivnu površinu te proces uravnoteženja približava idealnom.Dok veća zrnca imaju manju aktivnu površinu, ali omogućavaju brži protok pokretne

faze.

priroda veze analita s nepokretnom fazom također je bitan faktor u tekućinskoj

kromatografiji, ako je veza prečvrsta kromatografske mrlje su razvučene, no ako je

preslaba nema kromatografskog fenomena i analit putuje pokretnom fazom.

k oličinu analita moram una prijed odrediti jer utječe na disperziju10 skupa molekula u

analitu, idealno bi bilo beskonačno razrjeđenje što nije, realno, moguće.

kapilarnost je pojava podizanja ili spuštanja razine tekućina uz rub uskih cijevi

(kapilara) uzrokovana silama adhezije11 i kohezije12. U uskim cijevima, gdje je

površina tekućine velika prema volumenu tekućine, vrijednosti površinskih sila i

gravitacije postaju usporedive i razina tekućine u cijevi može se podizati (kapilarna

elevacija) ili spuštati (kapilarna depresija). Tekućina koja „moči“ stjenke kapilare

(adhezija veća od kohezije, npr. voda u staklenoj posudi) podizat će se, a tekućina koja

„ne moči“ stjenke kapilare (kohezija veća od adhezije, npr. živa u staklenoj posudi)

spuštat će se [23].

10 Disperzija (raspršenost) (engl. dispersion)

11 Adhezija (lat. adhaesio), pojava međusobnog privlačenja površina dvaju tijela načinjenih od različitih tvari, ili

tijela i tekućine, zbog djelovanja elektromagnetskih sila među molekulama. Privlačne sile kratka su dosega, avrijednost im ovisi o vrsti tvari u dodiru. Prianjanje je izraženije ako je jedna od tvari tekućina. 12

Kohezija (lat. cohaerere: prianjati, biti povezan), privlačna međuatomska ili međumolekularna sila kojadjeluje između susjednih čestica tvari. Najjača je u tvarima koje su u čvrstom stanju, slabija u tekućinama, a

najslabija u realnim plinovima

http://www.enciklopedija.hr/natuknica.aspx?ID=470








24

3.2. LC-MS

Brojni autori su pisali o tandemu tekućinske kromatografije i spektrometrije masa

(LC-MS) kao najveći napredak u analitičkoj kemiji u posljednjem desetljeću i kao brzo i

selektivno određivanje mnoštva spojeva u biološkim uzorcima. LC/MS postao je nezamjenjiv

alat u brojnim poljima istraživanja. Pruža rješenja visoke pouzdanosti, produktivnosti i

osjetljivosti, koja su tražena u područjima farmaceutske, prehrambene i kemijske industrije i

analize okoliša. Tekućinska kromatografi ja i spektrometrija masa do prije dvadesetak godina

bile su dvije potpuno odvojene tehnike. Sedamdesetih i osamdesetih godina, međutim, došlo

je do povezivanja LC-a i MS-a na područjima mehanizama desorpcije, otparavanja i

ionizacije analita u tekućoj fazi, ionizacije pri atmosferskom tlaku i povezivanja ionizatora i

analizatora, što je predstavljalo ogroman iskorak k rutinskoj upotrebi tzv. vezanog sustava

LC-MS [5].



25

4. Kapilarna elektrokromatografija

Kapilarna elektrokromatografija, CEC (engl. c apillary e lectroc romatography) je

hibrid kapilarne elektroforeze i HPLC-a koji omogućava razdvajanje i nabijenih i nenabijenih

vrsta [19]. Možemo reći da se ova metoda temelji na dva načela: elektromigracija

(elektroosmozu i elektroforezu) , te načelo kromatografije (razdioba analita između dvije

faze) [17]. Metoda se razvila 1980.-tih godina no veću pozornost dobiva tek posljednjih

godina. Odjeljivanje analita, koji se nalaze u kapilarnoj koloni, temelji se na njihovom

odjeljivanju između nepokretne faze i eluenta. Ono što je specifično za ovu tehniku je da tu

separaciju pokreće elektroosmotski tok, EOF (engl. e lectroo smotics f low), koji doprinosi

boljoj rezoluciji i boljoj separaciji nego kod HPLC-a [20]. Metoda je vrlo učinkovita u

odjeljivanju nenabijenih čestica (kao kod HPLC-a) na mikro-količinama uzorka bez potrebeza pumpama koje rade pod visokim tlakom (kao kod kapilarne elektroforeze). Veliki

nedostatak ove metode je što visoki napon može prouzročiti pregrijavanje („ self heating “)

gdje u većini slučajeva dolazi do stvaranja mjehura koji dovodi do isušivanja kolone i prekida

struje. Ovaj nedostatak CEC-a svodimo na minimum tako da smanjujemo promjer kapilare,

jer je ta toplina upravo proporcionalna kvadratu promjera kapilare [14]. Kapilare su načinjene

od tzv.“ frit “ stakla i pune se najčešće s materijalima kao u HPLC-u i µHPLC-u (C18 i C8

ugljikovodici /3µm i 5µm) [17].

Koristeći ovu metode trebamo pripaziti da:

- uzorke uvijek moramo profiltrirati radi otklanjanja neotopljenih dijelova koji bi mogli

spriječiti prohodnost kapilare

- uzorci bi trebali biti otopljeni u mobilnoj fazi

- pomno odabrati pH pufera

- kada je god moguće koristiti prirodne pufere, jer će prouzročiti nižu struju, a time

analit može biti veće koncentracije (jer tada smanjuje opasnost od pregrijavanja)

- zbog krhkosti kapilara trebaju uvijek biti pravilno skladištene



26

Slika 16. Prikaz tri različita načina kapilara, koje su punjene sa silikagelom (preuzeto iz M. Mayer, E. Rapp, C. Marck, G. J. M. Bruin, Fritless capillary electrochromatography,

Electrophoresis 20 (1999) 44)

Sli ka 17. Primjer elektrokromatograma (kapilara:25.2/33.7 cm,75mm ID; nepokretna faza:3

mm Grom-Sil ODS-0 AB; pokretne faza: acetonitril/13 µ M trifluoroctena kiselina u omjeru

60:4 ,pH =3.5; napon=15 kV; injektiranje= 5 kV, 6 s;tlak=8 bar; uzorak:2.4 µ M, koji se

otapa u pokretnoj fazi. (preuzeto iz M. Mayer, E. Rapp, C. Marck, G. J. M. Bruin, Fritless

capillary electrochromatography, Electrophoresis 20 (1999) 45)



27

EOF je uzrokovan Kulonovom silom induciranom električnim poljem koje djeluje na nabijene

čestice dok se gibaju u otopini. Kemijska ravnoteža između čvrste površine i otopine

elektrolita uglavnom dovodi do stvaranja naboja iznad površine, tj. sloj pokretnih iona koji se

naziva dvostruki sloj ili Debye-ev sloj. Kada se pusti električno polje tada dolazi do kretanja

nabijenih čestica iz dvostrukog sloja zbog rezultirajuće Kulonove sile, tj. dolazi do kretanja

otopine u kapilari koje je uzrokovano električnim poljem. Protok koji se javl ja se naziva EOF.

Uzrokovan je primjenom separacijskog potencijala te „gura“ nabijene čestice [16] (Slika 18.).

Slika 18. Prikaz elektroosmotskog toka i čestica koje se gibaju u separacijskom kanalu pod

utjecajem elektroosmotskog toka, od anode prema katodi (preuzeto iz C. S. Henry, Microchips

capillary electophoresis, Humana Press, New Yersey, 2006.)



28

Slika 19. Prikaz puta nabijenih čestica u kapilarnoj elektrokromatografiji ( K. D. Bartle, P.

Myers, Theory of capillary electrochromatography, Journal of Chromatography A, 916

(2001) 6)

Dva čimbenika kontroliraju EOF, to je jakost električnog polja i dvostruki sloj. Od ta dva

čimbenika pri mjerenju je najlakše kontrolirati jakost električnog polja, dok je dvostruki sloj

puno teže kontrolirati, ali on je općenito reduciran ako se ionska jakost povećava, a pH

smanjuje. Što je dvostruki sloj veći, protok je slabiji. Brzina EOF-a (izražena kao EOF

mobilnost) ovisi o brojnim parametrima poput pH pufera, ionske jakosti pufera, temperature,

intenziteta električnog polja i prisutnosti nekih aditiva. Zaustavljanje ili promjena smjera

EOF-a postiže se modifikacijama stjenki kapilare, trajnim ili privremenim modifikacijama

[22].

Tokom analize, nabijene molekule putuju brzinom koju određu je brzina elektroosmotskog

toka. Brzina kretanja pozitivno nabijenih iona se povećava, a negativnih smanjuje. Ukupna

mobilnost (µ) supstanci u kapilari predstavlja sumu elektroforetske (µEOF, zavisi od odnosa

m/z) i elektroosmotske mobilnosti (µEOS). Elektroosmotska mobilnost predstavljena je

izrazom:



29

(5)

gdje su σ - gustoća naboja na površini kapilare, κ - debljina dvostrukog električnog sloja, η -

viskoznost otopina, ε - dielektrična konstanta pufera i Ψ - električni potencijal na površinikapilare. Brzina kretanja otopine pod utjecajem elektroosmoze na razmaku x od zida kapilare

zavisi od elektroosmotske mobilnosti i jačine primijenjenog električnog polja (E):

EOF v x E (6)

te je brzina samog analita određena umnoškom njegove mobilnosti sa EOF-om i jakosti

električnog polja, kao što se vidi iz izraza:

e EOF v analita E (4)

gdje je v - brzina analita, μe - elektroforetska mobilnost analita, μEOF - elektroosmotski tok te

E - jakost električnog polja.



30

Zaključak

U razvoju kromatografskih metoda, jedan od prioritetnih ciljeva je definirati uvjete za

postizanje najboljeg odjeljivanja svi sastojaka smjese, a u tu svrhu potrebno je pronaći

najprikladnije eksperimentalne uvjete tj. validirati metodu. Kromatografija je postala jedna od

najvažnijih metoda analitičke kemije. Kromatografskim metodama moguće je razdvojiti dva

ili više sličnih sastojaka smjese što je drugim postupcima prilično teško postići. Da bismo

postigli što bolje kromatgrafsko odjeljivanje smjese moramo obratiti pozornost na odabir

nepokretne i pokretne faze. Različiti separacijski mehanizmi ostvaruju se odabirom različitog

materijala za nepokretnu i pokretnu fazu. Tekućinska kromatografija osnovna je

višenamjenska separacijska tehnika koja se primjenjuje u modernim biološkim znanostima isrodnim područjima molekularne biologije, ima veliku uspješnost odjeljivanja molekula

širokog spektra kao što su polimeri, male molekule, peptidi, proteini itd. U posljednje vrijeme

veliku pozornost dobiva i elektrokromatografija, kao hibrid dvaju vrlo učinkovitih metoda,

zbog svoje uspješnosti u razdvajanju i polarnih i nepolarnih spojeva. Ta se tehnika naglo

razvila zbog mogućnosti utjecanja na učinkovitost separacije modificiranjem nepokretne i

pokretne faze.



31

Literatura

[1] M. Kaštelan-Macan, M. Petrović (urednice), Analitika okoliša, HINUS i Fakultet

kemijskog inženjerstva i tehnologija (2013) 207-215

[2] M. Kaštelan- Macan, Kemijska analiza u sustavu kvalitete, Školska knjiga, Zagreb (2003)

222-235

[3] D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, Osnove analitičke kemije, Školska knjiga, Zagreb

(1999) 645-672

[4] I.Keselj, Ekstrakcija farmaceutika iz sedimenta ultrazvukom, završni rad, Zagreb (2012)

29

[5] M. Cindrić, A. Marković, A. Horvatić, Spregnute tehnike tekućinski kromatograf

spektrometar masa: osnove metodologije i primjene, Medicina, 45 (3) (2009) 218-232

[6] S. Luterotti, Uvod u kemijsku analizu, sedmo izdanje, Farmaceutsko-biokemijski fakultet

sveučilišta u Zagrebu (2014)

[7] M. A. Mansoor, Liquid Chromatography, Encyclopedia of life sciences, Macmillan

Publishers Ltd, Nature Publishing Group (2002) 1-3

[9] K. A. Rubinson, J. F. Rubinson, Contemporary Instrumental Analysis, Prentice Hall

(2000) 629-671[10] M. Kaštelan-Maca, Enciklopedijski rječnik analitičkog nazivlja, Fakultet

kemijskog inženjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014)

[11] http://issuu.com/hinus/docs/kroma_11str_obr ( 19.2.2015.)

[12] B. Borovička, Izolacija i strukturna karakterizacija novih pol iketida, derivata antrona

dobivenih biosintezom, doktorska disertacija, Zagreb (2012) 38

[13] Satinder, A., Chromatography and Separation Science, Academic Press, Elsevier

Science, Maryland Heights (4) (2003)

[14] K. D. Bartle, P. Myers, Theory of capillary electrochromatography, Journal of

Chromatography A, 916 (2001) 3 – 23

[15] M. Mayer, E. Rapp, C. Marck, G. J. M. Bruin, Fritless capillary electrochromatography,

Electrophoresis 20 (1999) 43-49







32

[16]

J.F.Ricelli, N. L.Carvalho, C.Lago, JbrazChemSoc,14 (2003) 265-268

[17] I. Mikšik, P. Sedlkov, Capillary electrochromatography of proteins and peptides, J. Sep.

Sci. 30 (2007) 1686 – 1703

[18] N.Smith, Capillary electrocromatography, Beckman Coulter (1999)

[19] D. Klinčić, S. Herceg Romanić, Pah and PCB metabolite determination in biological

material, Arh Hig Rada Toksikol 62 (2011) 77-89

[20] M. Guček, B. Pihlar, Separation of sugar anomers by capillary electrocromatography,

Acta Chim. Slov., 47 (2000) 165−177

[21] C. S. Henry, Microchips capillary electophoresis, Humana Press, New Yersey, 2006

[22] M. Vlčková, Microchip electrophoresis bioanalytical applications, Doktorska dizertacija,

Fakultet prirodoslovno-matematičkih znanost, Basel, 2008.

[23] http://www.enciklopedija.hr/Natuknica.aspx?ID=30305 (1.3.2015.)



33

Prilog 1.

GC ( engl. G as C hromatography), plinska kromatografija, kromatografska tehnika u kojoj je

pokretna faza plin nosilac, a nepokretna faza čvrsti adsorbens ili selektivna tekućina nanesena

u tankom sloju na internu čvrstu podlogu, temperatura i protok pokretne faze programiraju seovisno o ispitivanoj smjesi.

LC (engl. L iquid C hromatography),tekućinska kromatgorafija, kromatografska tehnika u

kojoj je pokretna faza tekućina, a ovisno o nepokretnoj fazi dijeli se na adsorpcijsku i

razdjelnu kromatografiju.

HPLC (engl. H igh P erformance L iquid C hromatography), tekućinska kromatografija visoke

djelotvornosti, kromatografska tehnika u kojoj se visoka djelotvornost postiže vrlo sitnimčesticama nepokretne faze i relativno visokim tlakom.

UHPLC (engl. U ltra H igh P erformance L iquid C hromatography), tekućinska kromatografija

ultravisoke djelotvornosti, kromatografska tehnika u kojoj su stupci ispunjeni česticama

promjera <2µm, što omogućuje veću brzinu odjeljivanja, bolju osjetljivost i razlučivost nego

HPLC-om.

TCL (engl. T hin Layer C hromatography), tankoslojna krmatografija, plošna kromatografija,

u kojoj je nepokretna faza u tankom sloju nanosi na čvrsti inertan nsač, a razvijač putuje

nošen kapilarnošću.

IC (engl. Ion-C hromatography, ion-exchange chromatography), ionska kromatografija,

kromatografska tehnika u kojoj je nepokretna faza ionski izmjenjivač, a ionska se izmjena

odvija u stupcima visoke djelotvornosti; rabi se za odjeljivanje srodnih iona relativno male

razlike u selektivnosti, što uvjetuje različitu brzinu njihova kretanja u stupcu izmjenjivača.

SFC (engl. S upecritical F luid C hromatography), kromatografija natkritičnim fluidom,

kromatgorafsko odjeljivanje u kojem je pokretna faza fluid iznad ili blizu njegove kritične

temperature i tlaka; odjeljivanje se odvija u kapilarnim ili punjenim stupcima, a nepokretne su

faze obično kemijski vezane na nosač.

SEC (engl. E xclusion C hromatography), kromatografija isključivanjem, kromatografska

tehnika koja se temelji na razlici u molekulskoj masi, veličini molekula te njihovu obliku ili

naboju.



NPLC (engl. N ormal P hase L iquid C hromatography), tekućinska kromatografija normalne

faze, polarna stacionarna faza je u međusobnom djelovanju s mobilnom fazom male

polarnosti. Interakcije polarnih skupina u analitu (npr. hidroksi, keto, amino, amido, ester, eter

ili merkapto) i polarna strana površine dominiraju mehanizmom retencije. Polarne i kisele

silanolne skupine podliježu dipolnim i vodikovim vezama i kiselo-baznim interakcijama.

RPLC (engl. R eversed P hase L iquid C hromatography), tekućinska kromatografija obrnutih

faza, nepolarna stacionarna faza je u međusobnom djelovanju s polarnom, obično smjesom

vodeno-organskom mobilnom fazom. RPLC se najčešće primjenjuje za analite koji se mogu

otopiti u vodeno-organskim eluensima. Materijali od kojeg je većinom izrađena stacionarna

faza je alkilno modificirani silikagel te polistiren-divinilbenzen (PS-DVB) polimeri (alkilni

ligandi vezani na aromatske prstenove) .

kromatografija(lc i cec).pdf

Documents