1

KromatografiteoriNITO‐kurs i kromatografi og massespektrometri

Trondheim 23.05.2018

Åse Marit Leere Øiestad

1

Disposisjon

• Innledning ‐ historikk

• Kromatografiske parametere

• Analytters egenskaper

• Kromatografi – definisjoner

– Typer kromatografi 

– prinsipper vs. teknikker

• Eksempler på kromatografiproblemer og løsninger

2

2

Kromatografi

• Kromatografi = ”fargeskriving” (Tsvet 1903)

– chroma ‐ farge

– grafi – skrive

– Separerte klorofyll og karotenoider

• Samlenavn på separasjonsmetoder

3

Hva brukes kromatografi til?

• Separere forbindelser

– De fleste prøver er komplekse blandinger, må skille analytten(e) fra forurensninger/matriks/andre stoffer

• Prøveopparbeidelse  ‐ preparativ HPLC

• Kvalitativ identifikasjon

– Sammenlikne retensjonstiden, tR (dvs. tiden stoffet vandrer) med standarder

– UV, IR, MS identifikasjon

• Kvantitativ bestemmelse

– Ved hjelp av kalibreringskurver

4

3

Prinsipp for Kromatografi(separasjon av stoffer)

Eksempel: Væskekromatografi (LC)Mobil fase: Væske (ofte blanding av flere)

Stasjonær fase: Kolonne pakket med små partikler <2µm

A B

Buffer          Organisk løsningsmiddel (metanol)

Kolonne  (5‐10 cm) 

Ecstasy Amfetamin   Morfin

Opprenset prøve injiseres med sprøyte i systemet

og føres med væskestrømmen gjennom kolonna

Separerer stoffer fra hverandreved at de vandrer med forskjellighastighet i et system med en mobil‐ og en stasjonær fase:‐ forskjell i vandringshastighet må være stor nok‐ veien stoffene vandrer må være lang nok

5

Kromatografisk separasjon

1. Stoffene beveger seg med forskjellig hastighet2. Stoffene spres i lengderetningen når de vandrer

6

4

Retensjon

K = 

Cs

Cm

Fordelingskoeffisientenbestemmer hvor mye avstoffet som vil oppholde segi stasjonær fase (BESTEMMERRETENSJONEN)

7

Båndspredning

• Får alltid båndspredning fordi molekyler av samme type har forskjellig (gjennomsnitts) hastighet

• Skyldes fysiske prosesser

8

5

Van Deemter

• Høyere optimal flowhastighet for små partikler enn store.

• Høyere flow gir smalere og høyere topper.

Figur fra Waters

9

5 μm partikel 1.7 μm partikler

60 μm menneskehår

10

6

KromatogramResultatet av en kromatografisk separasjon

1. Retensjonstiden tR karakteriserer retensjonen ‐interaksjonen med stasjonær fase (brukes til identifikasjon)

2. Bredden av toppene tW (ved grunnlinjen) karakterisererbåndspredningen

3. t0 er tiden et ikke retardert stoff bruker gjennom kolonnen

11

Kromatografiske parametre

• Retensjonsfaktor

– retensjonstid

– retensjonsvolum

• Teoretiske plater

– høydeekvivalenten til en teoretisk plate

• Oppløsningsevne

12

7

tot R

k =

tR ‐ t0

t0

tiden stoffet oppholder seg i stasjonær fasetiden stoffet oppholder seg i mobil fase

k: retensjonsfaktor for et stoffmed retensjonstid tR

k uttrykker :

(Vo) (VR)

Retensjonsfaktor

13

Effekt av selektivitet, effektivitet og retensjon

Rs= 1/4 ( 

‐1)  

N(

k

1  +  k

)

14

8

Analytten(e)

• Kjemiske egenskaper– Sure og basiske grupper – pKa‐verdier

– Lipofilisitet, hydrofilisitet ‐ løselighet i vann og organiske løsningsmidler

– Flyktighet, størrelse, stabilitet

– Funksjonelle grupper

– Egenskaper av betydning for deteksjon

• UV‐absobans

• Fluorescens

• Oksiderbarhet

• Bestemte grunnstoffer  (nitrogen, fosfor, halogener)

• Konsentrasjon

15

Kjemiske egenskaper: pKa

• Repetisjon av gamle kunnskaper: pH = ‐log[H3O+]

• Syrekonstanten Ka er definert ved 

i likevekten

• pH = pKa – log[syre]/[base]

– Dvs. når konsentrasjonen av syre = konsentrasjonen av base vil pH = Pka

• I praksis betyr dette at 50% av molekylene i løsningen er ladet og 50% er nøytrale

– Ved en pH 2 pH‐enheter fra pKa vil ca. 99% av molekylene være på den ene formen

][

]][[ 3

Syre

OHBaseKa

)(3)()(2)( aqaqlaq OHBaseOHSyre

16

9

Eksempel: Ladningen av morfin ved forskjellige pH‐verdier 

Morfin: pKa1= 8.0 pKa2 =9.9

pH ~ 6

99% av molekylene er ladet på aminet

100% er uladet på oksygenene

H+

OH O

NCH3

OH

Ladet

pH = 8

50% av molekylene er ladet på aminet

50% er uladet på aminet

~99% er uladet på oksygenene

OH O

N

CH3

OH

H+

OH O

N

CH3

OH

Ladet

‐O O

N

CH3

OH

Ladet

OH O

N

CH3

OH

pH = 10

99% av molekylene er uladet på aminet

~50% er ladet på det ene oksygenet

~50% er uladet på oksygenene

Figur av Thomas Berg, RMF, OUS

17

Kjemiske egenskaper: løselighet

• ”Like løser like”

– Lipofilisitet = fettløselighet

– Hydrofilisitet = vannløselighet

– Polare funksjonelle grupper ‐ lokalisert eller spredt ut over molekylet?

– Størrelsen på upolar del av molekylet

18

10

Matriks

• Vanlige komponenter som må vurderes– Proteiner– Fett– Salter– Endogene forbindelser– Andre stoffer/metabolitter

• Hvordan foreligger analytten– Grad av proteinbinding– Konjugert 

• Er det forbindelser som kan interferere eller ødelegge for analysen?

19

Prinsipper NB! Prinsipp er ikke det samme som teknikk (metode)

• Prinsipper (type stasjonærfase i kolonnen)– Adsorpsjon

– Fordeling/faste kjemisk bundne stasjonærfaser

– Ionebytte

– Eksklusjon (gel)

• Stasjonærfasen i kolonnen holder stoffene tilbake ‐retensjon

– Stoffene tvinges i gjennom kolonnen med en væske eller gass som presses gjennom med konstant hastighet (gassen/væsken kalles mobilfasen)

20

11

Teknikker 

• Gasskromatografi (GC)– Mobilfasen er en gass

• Væskekromatografi (UHPLC/HPLC el LC)– Mobilfasen er en væske

– Kolonne• preparativ eller analytisk

– Tynnsjikt (TLC)

• Superkritisk fluid kromatografi– Mobilfasen er et superkritisk fluid (vanligvis superkritisk CO2)

21

• Likevekten mellom stasjonærfase og mobilfase (og dermed vandringslengden) er avhengig av– Sammensetningen av den stasjonære fase

– Sammensetningen av den mobile fase (LC og SFC) –raskere ved sterkere mobilfase

– Temperaturen (GC og SFC) – retensjonen kan styres ved temperaturendring

– Trykk (LC og SFC) – endring i flowhastighet endrer også trykket over kolonnen

Kromatografi

22

12

Fordelingskromatografi (GC) 

• Den stasjonære fase er impregnert som en tynn film på en bæresubstans eller på veggen av en kapillærkolonne, vanligvis silikoner evt silikonoljer eller ‐gummier

• Disse har god termisk stabilitet, og variasjon av kjede‐grupper gir ulik grad av polaritet.

• Upolar stasjonærfase 

– separasjon etter kokepunkt (flyktighet)

• Polar stasjonærfase 

– separasjon etter polaritet (interaksjon) og kokepunkt (dvs. kan separere forbindelser med samme kokepunkt, men forskjellige funksjonelle grupper) 

23

Fordelingskromatografi (HPLC)

• HPLC (faste kjemisk bundne stasjonærfaser)

– den stasjonære fase er vanligvis kjemisk bundet til overflaten av en bæresubstans (silika eller polymer)

24

13

Separasjonsprinsipper i LC

• Omvendt fase kromatografi

– stasjonærfasen er hydrofob

• Normal fase kromatografi

– stasjonærfasen er hydrofil

• Hydrofob interaksjonskromatografi (HILIC)

– vannrikt lag på stasjonærfasen

• Ionebytterkromatografi

– stasjonærfasen har ladet overflate

• Gelkromatografi

– stasjonærfase med gitt porestørrelse

25

Separasjonsprinsipper i LC

• Omvendt fase

– Stasjonærfasen er upolar og mobilfasen er polare væskerslik som metanol, acetonitril eller vann.

– Vanlige stasjonærfaser: C18, C8

– Mer upolare forbindelser har større retensjon i systemet. 

– Aller mest brukte system innen LC per i dag!

• Normalfase

– Stasjonærfasen er sterkt polar og mobilfasen erhovedsakelig upolar (slik som heksan).

26

14

I omvendt fase kromatografi retarderes stoffene ved hydrofob interaksjon

SiOSi

OSi

O SiH3C

H3CCH3

O

O Si

Si

H3COHCH3C

COOH

Hydrofob interaksjon – van der Waalske krefter

Interaksjon mellom hydrokarbonkjedene på C18 og den hydrofobe delen av naproxen

27

Separasjonsprinsipper i LC

• HILIC

– Stasjonærfasen er polar og mobilfasen er upolar(“normalfasesystem”)

– Mobilfasen inneholder vann

– Alternativ til omvendt fase kromatografi for polare forbindelser

– Fordeling mellom mobilfasen og vannlag utenpå stasjonærfasen Begynner å få stor utbredelse.

28

15

Isokratisk eluering vs. gradient eluering

• Isokratisk eluering (mobilfasen endres ikke) gir best separasjon– kan utføres med en enkel pumpe

• Gradienteluering (mobilfasen endres i løpet av analysen) brukes når stoffene har stor forskjell i hydrofobisitet– må utføres med en gradient pumpe eller flere pumper

• Hovedsakelig bruk av gradienteluering fordi man sparer tid, og i tillegg får man smalere topper på slutten av kromatogrammet.

29

Retensjonsrekkefølge RP C18

• Minst hydrofob kommer først ut

• Lenger hydrofob kjedelengde gir lengre retensjonstid 

• Forgrenet før rettkjedet

• Umettet før mettet

• Ionisert form før

ikke‐ionisert

30

16

Retensjonen påvirkes av:

• Mobilfasens sammensetning– Økende innhold av organisk modifikator (ACN, MeOH) gir mindre retensjon

• pH– Syrer blir minst retardert ved høy pH 

– Baser blir minst retardert ved lav pH 

• Tilsetning av salter– Salter kan minske løseligheten i mobil fase

– Ionepardannere øker stoffets lipofile karakter

– Tilsetningsstoffer som adsorberes til kolonnen (eks. aminer) gir mindre retensjon samt bedre symmetri og mindre båndspredning ved analyse av baser

31

Retensjonen påvirkes av:

• Stasjonær fase

– Omvendt fase materialer med lange hydrokarbonkjeder som C18 gir større retensjon enn materialer med kortere hydrokarbonkjeder

– Materialer med polare overflategrupper gir mindre retensjon

– Forskjellige typer C18 materialer kan gi forskjellig retensjon

• Temperatur

– Økende temperatur gir mindre retensjon

– Ofte ca. 35 grader HPLC, 60 grader UHPLC

32

17

Kromatografiproblemer og «hacks» 1

• Metode for analyse av legemidler med LC‐MS.

• Ved utvikling av metoden hadde stoffene som kom først i gradienten veldig brede topper.

• Injiserte en løsning med høy prosentandel organisk.

• Løsningen på problemet var å fortynne prøvene mer med vann før injisering på kolonnen.

• Løsemiddelstyrken ble for stor ift. starten på gradienten og de tidligst eluerende stoffene ble spredt utover på kolonnen.

33

Kromatografiproblemer og «hacks» 2

• LC‐MS‐metode for analyse av benzodiazepiner.

• Stoffet som kom først i gradienten hadde stor variasjon i retensjonstid mellom høye og lave konsentrasjoner, hvilket det vanligvis ikke har. De andre stoffene var fine.

• Har opplevd dette før og løsningen var da som nå å bytte kolonnen.

• Stasjonærfasen klarte ikke lenger å «holde på» høye konsentrasjoner og stoffet eluerte for tidlig, trolig pga. slitasje på stasjonærfasen.

34

18

Kromatografiproblemer og «hacks» 3

• Fikk plutselig veldig stygge og brede topper for de tidligst eluerende stoffene i en LC‐MS‐metode.

• Injeksjonsvolumet hadde blitt endret til et lavere volum.

• Metoden bruker en injeksjonsteknikk (partial loop withneedle overfill)

– Loopen fylles med prøve, slik at ikke noe vaskeløsning blir med i injeksjonen

– Når inj. volum + overfillvolum < loop volum ble vaskeløsning med sterkere løsemiddelstyrke også injisert

• Tilpasset overfillvolumet slik at det ikke ble mindre totalt enn loopen rommer og toppene ble fine igjen.

35

Kromatografiproblemer og «hacks» 4Ulik reløsning ‐ ulik respons

1) 10% ACN og 90% 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,22) 30% ACN og 70% 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,23) 25% ACN og 75% 5 mM ammoniumacatatbuffer pH 5.

Figur fra Ingeborg Amundsen, Sykehuset i Østfold

36

19

Kromatografiproblemer og «hacks» 5

John W. Dolan, LCGC Europe, 2008Volume 21, Issue 11

37

Kromatografiproblemer og «hacks» 5 forts.

Viktig å passe på at man ikke får dødvolumer i systemet og at det er god kvalitet på alle løsninger, evt. filtrere løsninger før bruk.

38

20

Takk til• Thomas Berg og Elisabeth Øiestad, RMF, OUS

• Ingeborg Amundsen, Sykehuset i Østfold

• Léon Reubsaet, Farmasøytisk institutt, UiO

Spørsmål?

39