l c cam la fosfoenolpiruvato carboxilasa (pepc): enzima...

85

LA FOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASA (PEPC): ENZIMA CLAVE DE LOS METABOLISMOS FOTOSINTÉTICOS C4 Y CAM

La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC):enzima clave de los metabolismosfotosintéticos C4 y CAM

CRISTINA ECHEVARRÍA*, JOSÉ ANTONIO MONREAL,ANA BELÉN FERIA, EDUARDO TERENCIO JIMÉNEZ,

ARANCHA LEÓN, ROSARIO ÁLVAREZ

y SOFÍA GARCÍA-MAURIÑO

Resumen

La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC 4.1.1.31) catalizala β-carboxilación del fosfoenolpiruvato (PEP) en presen-cia de HCO3

- y Mg2+, para producir oxaloacetato (OAA) y Pi(Chollet et al., 1996). La PEPC está ampliamente distribuidaen plantas, algas verdes y microorganismos pero ausente enlevaduras y animales (Chollet et al., 1996). En plantas vascu-lares su papel estelar está relacionado con la fotosíntesis C4 yCAM («Crassulacean acid metabolism»), sin embargo desem-peña otras funciones como la anaplerótica, en relación a lasíntesis de proteínas, homeostasis del pH citosólico, electro-neutralidad y osmolaridad. Está formada por una pequeñafamilia multigénica algunos de cuyos representantes estánregulados a nivel transcripcional por factores como luz,hormonas y metabolitos (Chollet et al., 1996; Vidal y Chollet,1997). La naturaleza alostérica de la enzima permite unaregulación fina en relación a diferentes ambientes metabóli-cos. La PEPC está regulada por fosforilación reversible,proceso ligado a una cascada de transducción de señales dealta complejidad. En la actualidad es uno de los mejoresmodelos de señalización descritos en plantas. Este capítulose centra en los eventos relacionados con este proceso enplantas C4 y CAM, los dos sistemas mejor estudiados en laactualidad (Chollet et al., 1996; Echevarría y Vidal, 2003; Izuiet al., 2004; Nimmo, 2000; Vidal y Chollet, 1997).

Summary

Phosphoenolpyruvate carboxylase (EC 4.1.1.31, PEPC) cata-lyzes the b-carboxylation of phosphoenolpyruvate (PEP) byHCO3

- in the presence of Mg2+ to yiel oxaloacetate and Pi(Chollet et al., 1996). PEPC is a widely distributed enzymein plants, green algae and micro-organisms but absent inyeast and animals (Chollet et al., 1996). In higher plants, itcatalyses a pivotal reaction related to such important pro-cesses as C4 and Crassulacean acid metabolism (CAM) photo-synthesis, the anaplerotic pathway linked to amino acidsynthesis, homeostasis of cytosolic pH, electroneutrality andosmolarity. PEPC belongs to a small multigenic family (Chol-let et al., 1996; Vidal y Chollet, 1997). At the transcriptionallevel, some PEPC genes respond to external and internalfactors (light, hormones and metabolites), while at the

* Departamento de Biología Vegetal y Ecología (Área de Fisiología Vegetal).Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Avda. de la Reina Mercedesnº 6. 41012, Sevilla, España.

protein level, the allosteric nature of the enzyme allows itsactivity to be fine-tuned in relation to a varying metabolicenvironment. PEPC undergoes a posttranslational control bya phosphorylation process linked to a highly complex signaltransduction cascade. Today, it is one of the best-describedmodels of plant signaling. This chapter will focus on what isknown about these processes in leaves of C4 and CAMplants, the two systems that have been studied in detail sofar (Chollet et al., 1996; Echevarría y Vidal, 2003; Izui et al.,2004; Nimmo, 2000; Vidal y Chollet, 1997).

Características generales

Las plantas de tipo C4 poseen características anató-

micas y bioquímicas que confieren lo que se conocecomo el síndrome C

4. Cabe destacar como hecho

característico la inducción de la maquinaria fotosintéti-ca en la vaina vascular, un tipo de tejido que en lasplantas C

3 no es fotosintético. La vaina vascular en

las plantas C4 desarrolla cloroplastos atípicos ricos en

fotosistema I y que contienen la maquinaria necesariapara la asimilación del CO

2, a saber, el ciclo de Calvin-

Benson o ciclo C3. En contrapartida las células del

mesófilo fotosintético pierden alguna de sus funcionesfotosintéticas y desarrollan cloroplastos ricos en fotosis-tema II pero deficientes en Rubisco. Estas células sedistribuyen formando una corona alrededor de la vainadando lugar a la anatomía Kranz, típica de este tipo deplantas. El ciclo C

4 se desarrolla como vía de comunica-

ción entre ambas células, y su fin último consiste enconcentrar el CO

2 en las inmediaciones de la Rubisco

para minimizar las pérdidas ocasionadas por la fotorres-piración (Hatch y Slack, 1970). A este hecho contribu-ye además la fuerte impermeabilización de la vaina a ladifusión del CO

2. Como consecuencia las concentra-

ciones de CO2 que se consiguen en la vaina están muy

por encima (2000 ppm) de las concentraciones de CO2

atmosféricas (360 ppm). Los metabolitos principales

86

CRISTINA ECHEVARRÍA ET AL.

que transportan carbono y poder reductor desde lascélulas del mesófilo a las de la vaina son el malato o elaspartato según la modalidad de planta C

4 (Hatch y

Slack, 1970). En este contexto fotosintético basado enla separación física de las enzimas y que implica unintenso tráfico intercelular de metabolitos, la fosfoe-nolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC 4.1.1.31) inicia laprimera reacción de la vía metabólica C

4 en las células

del mesófilo (la carboxilación del PEP) y es objeto deun alto grado de regulación. La figura 1 recoge estosconceptos mostrando la anatomía Kranz de una hojade sorgo (una planta C

4 del tipo NADP-ME) y un

esquema, marcado en rojo, de las reacciones quecomportan la vía C

4 en este subtipo fotosintético.

Otra variante fotosintética en la que interviene elciclo C

4 es la que se da en las plantas CAM. En las

plantas CAM se reproduce el mismo ciclo C4; sin

embargo, la separación de las dos carboxilacioneses temporal. El málico producido vía PEPC se acu-mula en la vacuola durante la noche. Durante eldía es descarboxilado. El CO

2 desprendido provoca el

cierre estomático, minimizando la pérdida de agua,y un aumento de la concentración de CO

2 en las

inmediaciones de la Rubisco eliminando la fotorres-piración. Finalmente, el CO

2 es asimilado en el

ciclo de Calvin-Benson. La eficiencia hídrica de lasplantas CAM es aún mayor que la de las C

4 (Smith y

Winter, 1996).

FIGURA 1: a) Corte transversal de unahoja de sorgo mostrando la anato-mía Kranz; CM, célula del mesófilo;CV, célula de la vaina; H, hacesvasculares; EP, epidermis, ES, esto-ma. b) Ciclo C4 en una planta deltipo NADP-enzima málico (NADP-ME). Línea gruesa gris, pared celulargruesa e impermeable que impide ladifusión de CO2 en las células de lavaina. PEPC, fosfoenolpiruvato car-boxilasa; MDH, malato deshidroge-nasa; PPDK, piruvato fosfato diqui-nasa. Los datos de concentración deCO2 son los estimados para cadatipo de célula.

87


Las plantas C4 y CAM constituyen una de las

adaptaciones más complejas y representativas de losvegetales a condiciones de estrés (Sheen, 1999). Ade-más, aquellas que son facultativas cambiando de meta-bolismo fotosintético C

3 a CAM o a C

4 en presencia de

un factor ambiental estresante (baja concentración deCO

2, altas temperaturas, salinidad, fotoperiodo o con-

diciones nutritivas adversas), representan unos de losmás singulares y mejor conocidos ejemplos de aclimata-ción (Hasegawa et al., 2000; Lüttge, 2004).

En este capítulo profundizaremos en los aspectosrelacionados con la regulación de la fosfoenolpiruvatocarboxilasa fotosintética (PEPC) y en concreto en suregulación postraduccional por fosforilación reversible.

La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC)

La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC4.1.1.31) cataliza la β-carboxilación irreversible delfosfoenolpiruvato (PEP) en presencia de HCO

3- y Mg2+,

para producir oxaloacetato (OAA) y Pi (Chollet et al.,1996). La PEPC fue caracterizada por primera vez enhojas de espinaca en 1953, considerándose durantemucho tiempo como una carboxilasa de plantas confunción secundaria con respecto a la Rubisco (Bandur-ski y Greiner, 1953). Sin embargo, el descubrimientode la fotosíntesis C

4 y la implicación de una isoenzima

específica de PEPC en esta ruta, aumentaron considera-blemente el interés por esta enzima. Además de suimplicación en este contexto fotosintético, la PEPCtiene una multiplicidad de funciones en la célula.Debido a la baja Km por el sustrato bicarbonato (en elrango de µmolar) esta enzima interviene, como funcióngeneral, en la economía del carbono de la célularecapturando el CO

2 respiratorio. Como funciones

específicas se le asignan una función anaplerótica, laregulación del pH celular, interviene en la fijación denitrógeno en leguminosas, en la absorción y transportede cationes, en el movimiento estomático y en lainteracción del tubo polínico y el estilo (Chollet et al.,1996; Echevarría y Vidal, 2003; Izui, 2004). Tambiénha sido implicada en la maduración y germinación dela semilla (Osuna et al., 1996, 1999; González et al.,1998, Izui, 2004) y en la maduración del fruto (Cholletet al., 1996; Echevarría y Vidal, 2003; Izui, 2004).

Para satisfacer esta multiplicidad de funciones laPEPC está formada por una familia multigénica quecodifica diferentes isoenzimas. En Sorghum vulgare, por

ejemplo, está representada por SvC3, PEPC constituti-va de Tipo-C

3; SvC4, PEPC fotosintética de Tipo C

4; y

SvC3RI, PEPC de raíz, inducible de Tipo C3 (Crétin et

al., 1991). Recientemente se ha descrito la existencia deuna PEPC de tipo bacteriano en Arabidopsis thaliana yarroz (Sánchez y Cejudo, 2003).

La PEPC es una enzima citosólica ampliamentedistribuida en plantas, algas verdes y microorganismospero ausente en levaduras y animales (Chollet et al.,1996). Se organiza como un homotetrámero con subu-nidades de aproximadamente 110 kDa (Chollet et al.,1996). La estructura tridimensional de la PEPC de E.coli y maíz muestra que las cuatro subunidades seorganizan en un dímero de dímeros y que todos losdeterminantes estructurales importantes son semejantesentre las dos enzimas (Matsumura et al., 2002), con lanotable diferencia de la adquisición de un dominio defosforilación en las PEPC eucariotas que está ausente enla PEPC bacteriana (Sánchez y Cejudo 2003; Vidal yChollet, 1997). Esta adquisición ha resultado ser degran importancia ya que las PEPC de plantas estánfuertemente reguladas por fosforilación reversible(Bakrim et al., 1993; Echevarría y Vidal, 2003). Tam-bién existen diferencias importantes entre la isoenzimafotosintética (tipo C

4) y las isoenzimas de tipo C

3. Uno

de los requerimientos básicos que están en la base de lasdiferencias cinéticas de estas isoenzimas es poseer unaSer situada en la posición 774 en la PEPC-C

4, que en la

PEPC-C3 es una Ala (Bläsing et al., 2000). Además, el

segmento 296-437 (301-442 en maíz) es también undeterminante crítico que caracteriza a las PEPC C

4

(Izui et al., 2004).

Regulación postraduccional de la PEPC

La coordinación entre el ciclo C4 y el ciclo de

Calvin-Benson (ciclo C3) exige una fuerte regulación de

la actividad de sus enzimas carboxiladoras. La PEPCestá regulada a nivel transcripcional por diferentesfactores entre los que destacan la luz, factores de estrés(salinidad, estrés hídrico, nutricional), hormonas (ABAy citoquininas) y fotoperiodo (revisado en Echevarría etal., 2004). Sin embargo, en este capítulo nos centrare-mos en la regulación postraduccional de la PEPCprofundizando en su mecanismo de regulación porfosforilación reversible y en algunos de los aspectosnovedosos que conciernen a la fosfoenolpiruvato car-boxilasa quinasa (PPCK), así como a los elementos de

88


la cadena de transducción de señales que opera para lasíntesis/activación de esta enzima.

La PEPC está sujeta a regulación alostérica. Enplantas dicotiledóneas, la PEPC se activa por glucosa 6-fosfato (G6P) y se inhibe por L-Malato o Aspartato(Asp). En plantas monocotiledóneas, además de éstos,la Glicina o la Alanina son activadores (Chollet et al.,1996; Izui et al., 2004). El L-malato interacciona con laenzima en diferentes puntos, produciendo una inhibi-ción competitiva, no competitiva o mixta dependiendodel pH, de la concentración y del estado de fosforila-ción de la PEPC (Chollet et al., 1996; Echevarría et al.,1994). La G6P incrementa la V

max de la PEPC produ-

ciendo una bajada de la Km para el PEP y disminuye el

efecto inhibidor del malato (Chollet et al., 1996).Tanto la actividad catalítica como el control metabólicoson altamente dependientes del pH, especialmentecuando se ensaya a valores subóptimos de 7,1 a 7,3(Echevarría et al., 1994); así, la afinidad de la enzimapor PEP y Mg2+ aumenta fuertemente entre pH 7 y 8.El pH óptimo de la actividad de la enzima ensayada invitro es de 8.

La PEPC C4 evolucionó a partir de isoenzimas

ancestrales C3 durante la evolución de las angiosper-

mas, adquiriendo propiedades cinéticas y de regulacióndistintas a las de las isoenzimas C

3. Así, para la

isoenzima fotosintética C4 de maíz encontramos valores

de Km para PEP, Mg2+, y HCO

3- a pH 7,3 de 30, 10 y 2

veces superiores a los de la forma C3, respectivamente

(Dong et al., 1998).La regulación de la actividad de la PEPC está

influenciada por el estado oligomérico de la enzima,siendo el tetrámero la conformación óptima, seguidadel dímero, y con un monómero inactivo. Los cambiosen el estado de oligomerización están propiciados porfactores como dilución de la enzima, concentración desales en el medio de ensayo, concentración de L-Malatoo baja temperatura (Chollet et al., 1996). Sin embargo,la contribución real de esta regulación a la actividad dela enzima in vivo no está clara en plantas C

4. Por el

contrario, en plantas CAM hay evidencias de que eltetrámero actuaría durante la fase nocturna asociado ala fase activa de fijación de CO

2 (Chollet et al., 1996).

La abundancia de cisteínas en la PEPC (7, enposiciones altamente conservadas) hace pensar que laactividad de la PEPC podría estar influenciada por elestado redox de la enzima (Chollet et al., 1996). Sinembargo, hasta la fecha no se ha descrito ningunacascada de óxido/reducción tipo ferredoxina/tiorredo-

xina implicada en la regulación de la PEPC (Chollet etal., 1996). En otro sentido, recientemente se ha descri-to que productos como DTT, mercaptoetanol, o gluta-tión reducido, cambian débilmente la sensibilidad de laPEPC C

4 al malato in situ (Pierre et al., 2004). Sin

embargo, ninguno de estos componentes tiene efecto invitro. El efecto observado no se debe a ningún procesomediado por tiorredoxina o dependiente de fosforila-ción; sin embargo, debido a que el glutatión es uncompuesto fisiológico que se encuentra en el citosolprincipalmente en estado reducido, los autores propo-nen una posible contribución de este compuesto tiólicoa la protección de la enzima frente al málico (Pierre etal., 2004).

Regulación de la PEPC por fosforilaciónreversible

La fosforilación reversible de la PEPC fotosintéticase puso de manifiesto en Bryophyllum y maíz, plantasCAM y C

4 respectivamente (Chollet et al., 1996).

Estudios posteriores pusieron de manifiesto que lafosforilación de la PEPC depende de luz en plantas C

4

(Echevarría et al., 1990) y de un oscilador circadianoaún sin identificar en plantas CAM (Nimmo, 2000).En cualquiera de estos casos la fosforilación de la PEPCestá asociada a la etapa activa de fijación de CO

2. Es un

mecanismo sinérgico que altera la regulación metabóli-ca de sus efectores negativos, L-Malato, y positivo,G6P, y la respuesta al pH (Echevarría et al., 1994). LaPEPC fosforilada es menos sensible a málico, respondemejor a G6P y es más eficaz a pH subóptimo perofisiológico de 7 y 7,3 (Echevarría y Vidal, 2003).

La fosforilación de la PEPC se produce en unúnico residuo de serina (Ser), localizado en el extremoN-terminal de la proteína. La Ser fosforilable reside enel motivo E/DR/KxxS*IDAQL/MR, común a todas lasenzimas de plantas secuenciadas hasta la fecha, peroausente en las PEPC de cianobacterias y en la PEPC detipo bacteriano de plantas (Chollet et al., 1996; Sán-chez et al., 2003). Este hecho sugiere que la regulaciónde la enzima por fosforilación ocurre en los múltiples ydiversos contextos fisiológicos donde la PEPC estáinvolucrada.

Los estudios de mutagénesis dirigida sobre unaPEPC C

4 recombinante de sorgo, pusieron de manifies-

to que el efecto de la fosforilación puede ser simuladopor la introducción de una carga negativa, sustituyendo

89


el residuo de serina por aspartato (S8D) en el extremoN-terminal de la proteína. La incorporación de unacarga negativa en dicho dominio se traduce en unaumento de la velocidad catalítica y una disminuciónde la sensibilidad al L-Malato (Chollet et al., 1996). Lamodificación de las propiedades funcionales de laPEPC también se consigue por la unión a la PEPC deanticuerpos específicos dirigidos contra el péptido sin-tético de 20 aminoácidos del extremo N-terminal, quecontiene la secuencia del sitio de fosforilación de laenzima C

4 de hojas de sorgo, denominados APS-IgG

(Pacquit et al., 1995). Estos anticuerpos imprimen unadistorsión en la molécula que simula la fosforilación(Pacquit et al., 1995). Otros tratamientos como lasustitución de un residuo básico situado tres aminoáci-dos antes de la Ser por Asn, o la eliminación delpéptido N-terminal de la PEPC-C

4 de maíz con entero-

quinasa mimetizan parcialmente el efecto de la fosfori-lación (Izui et al., 2004).

La fosfoenolpiruvato carboxilasa quinasa(PPCK)

La fosforilación de la PEPC la realiza una proteínaquinasa llamada PEPC-quinasa (PPCK). La PPCK esaltamente específica, pertenece a la familia de lasquinasas Ca2+/calmodulina dependientes (CDPK) aun-que no posee ninguna extensión N-terminal ni C-terminal que contenga motivos de regulación comositios de unión a Ca2+ o secuencia autoinhibidora;también carece de motivos de fosforilación. Su activi-dad es independiente de Ca2+, y es la proteina kinasamás pequeña conocida hasta la fecha con un pesomolecular de 32 kDa (Hartwell et al., 1999). Es laprimera quinasa descrita cuya regulación se producepor cambios rápidos en su velocidad de síntesis, conuna velocidad de recambio de 2 h (Hartwell et al.,1999; Jiao et al., 1991). Las PEPC-quinasa de Flaveriay de M. crystallinum contienen una secuencia específica(GAA, ATAGAT y elementos GTA) en la región 3’ nocodificante, determinantes para los ARNm de vidacorta, por lo que se les supone una tasa de recambiorápida para el ARNm (Tsuchida et al., 2001).

Las primeras PEPC-quinasas se clonaron a partirde Kalanchoe fedltschenkoi y Arabidopsis en 1999 (Hart-well et al., 1999). En la actualidad se sabe que la PEPC-quinasa está codificada por una pequeña familia degenes (Hartwell et al., 1999; Nimmo, 2003; Shenton et

al., 2006). El genoma de Arabidopsis posee dos genes dePEPC-quinasa, PPCK1 y PPCK2, siendo PPCK1 elque se expresa de forma más abundante en las hojas dela roseta (Fontaine et al., 2002; Nimmo, 2003). Entomate, la expresión de PPCK2 aumenta considerable-mente durante la maduración del fruto (Marsh et al.,2003). También se han encontrado representantes deestas dos isoenzimas en berenjena y tabaco (Marsh etal., 2003) y en F. trinervia (Nimmo et al., 2003;Echevarría y Vidal, 2003; Izui et al., 2004). En soja sehan identificado cuatro representantes de PPCK (Sulli-van et al., 2004). Dos de las isoformas (GmPPCK2 yGmPPCK3) se expresan preferentemente en el nódulodependiendo del aporte de fotosintatos desde la raíz(Sullivan et al., 2005; Xu et al., 2003, 2007).

Los productos de la traducción de los ADNc de losgenes PPCK constan de 274-307 residuos de aminoáci-dos, y poseen una masa molecular de 31-33 kDa. Alalinear secuencias de PEPC-quinasa, se observa que lossubdominios IV, V y VIA son muy variables mientrasque los X y XI están muy conservados y son caracterís-ticos de esta enzima (Izui et al., 2004).

En especies C4 se han identificado varios represen-

tantes de PEPC-quinasa. En F. trinervia se ha identifi-cado un gen PPCK que se expresa fuertemente en hojasen respuesta a la luz (Tsuchida et al., 2001), mientrasque su expresión en otros tejidos es muy escasa, por loque se cree que este gen codifica la PPCK C

4 que

fosforila a la PEPC fotosintética (Shenton et al., 2006).En maíz se han identificado cuatro genes que codificanpara PPCK, denominados ZmPPCK1-4 (Shenton etal., 2006). ZmPPCK1 se expresa preferentemente enrespuesta a luz en las células del mesófilo de hojas,mientras que ZmPPCK2 se expresa en luz y oscuridaden células de la vaina y no parece estar sometido aregulación circadiana. Los otros dos genes de PPCK demaíz se expresan en menor nivel y en otros tejidos de laplanta (Shenton et al., 2006). En sorgo, se han descritoSbPPCK1 y SbPPCK2, equivalentes a ZmPPCK1 yZmPPCK2. Las proteínas PPCK1 y PPCK2 de sorgoposeen un 92 % y un 90% de identidad de aminoáci-dos con las quinasas 1 y 2 de maíz respectivamente.Además, la expresión de SbPPCK1 aumenta de formadrástica en respuesta a luz, mientras que la respuesta deSbPPCK2 a los cambios luz/oscuridad es menor. Estosresultados muestran que los genes ZmPPCK1 ySbPPCK1 codificarían para la PPCK1, que estaríaconsiderada como la PPCK fotosintética que opera enel ciclo C

4 (Shenton et al., 2006). Las proteínas PPCK2

90


y 3 de maíz y la 2 de sorgo son muy parecidas entre sí,y se diferencian del resto de miembros de la familiaPEPC-quinasa en que contienen una inserción ácida delongitud variable entre el dominio VIb y VII deldominio catalítico quinasa (Shenton et al., 2006).

Cadena de transducción de señalesque conduce a la síntesis/activaciónde la PEPC-quinasa

La PEPC-quinasa está regulada principalmente anivel transcripcional (Hartwell et al., 1999). En plantasC

4, la PEPC-quinasa se activa durante el día en respues-

ta a una alta intensidad luminosa, a través de unacadena de transducción de señales de la que se conocennumerosos componentes (Coursol et al., 2000; Echeva-rría y Vidal, 2003; Giglioli-Guivarc’h et al., 1996;). Enplantas CAM, la síntesis de la PEPC-quinasa dependede un oscilador circadiano que actúa en conjuncióncon el malato (Nimmo, 2000). En el caso de las plantasCAM, el L-Malato se libera de la vacuola al citosoldurante el día, disminuyendo la expresión del genPPCK, la actividad PEPC-quinasa y el estado de fosfo-rilación de la PEPC, proceso que se revierte en oscuri-dad (Bakrim et al., 2001) siguiendo un ritmo circadia-no (Nimmo, 2000 y 2003).

La cinética de aparición de la actividad PPCK en lahoja de maíz (planta C

4) es relativamente lenta, con un

máximo de actividad después de 90 min de ilumina-ción (Echevarría et al., 1990). La inhibición de esteproceso por CHX sugiere la implicación de una neosín-tesis de la enzima como elemento de la cadena detransducción que conduce a la fosforilación de la PEPCin vivo (Hartwell et al., 1999; Jiao et al., 1991) o insitu, en los protoplastos de células del mesófilo deDigitaria (Giglioli-Guivarc’h et al., 1996).

La fotoactivación de la PEPC-quinasa C4 está

mediada por la fotosíntesis, ya que se inhibe en presen-cia de inhibidores del flujo fotosintético de electrones(DCMU), de desacoplantes y también de inhibidoresdel ciclo de Calvin (Chollet et al., 1996; Echevarría yVidal, 2003 Vidal y Chollet, 1997). Resultados obteni-dos en protoplastos de células del mesófilo ponen demanifiesto que la basificación del pH y la presencia deCa2+ son elementos indispensables para la fotoinduc-ción de la actividad PEPC-quinasa, así como para lafosforilación in situ de la PEPC. En este sentido, se hasugerido que el ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA) es el

metabolito mensajero que produce la regulación positi-va de la quinasa en plantas C

4 (Giglioli-Guivarc’h et al.,

1996). En las hojas C4 iluminadas, este metabolito es

producido en el ciclo de Calvin en los cloroplastos delas células de la vaina y difunde a las células vecinas delmesófilo, donde se transporta al cloroplasto en suforma parcialmente protonada. Existen evidencias queapoyan que este proceso de bombeo de protones, y laconsecuente alcalinización del citosol es, de hecho, loque dispara la transducción de señales para la síntesis dela quinasa en las células del mesófilo C

4 (Giglioli-

Guivarc’h et al., 1996). La secuencia de acontecimien-tos de esta cadena de transducción de señales en hojasC

4 implicaría los siguientes elementos: i) la luz, a una

intensidad luminosa superior a 200 μE m-2 s-1; ii) el 3-PGA, producido en el ciclo de Calvin y que estransportado al mesófilo actuando como mensajerointercelular; iii) la basificación del pH citosólico; iv) laparticipación de una fosfolipasa C dependiente deinositol (PI-PLC) (Coursol et al., 2000) y producciónde inositol trifosfato (IP

3); v) apertura de canales de

Ca2+ del tonoplasto (sensibles a TMB8) y activación deuna quinasa Ca2+-dependiente (inhibida por W7), concaracterísticas de proteína quinasa C (PKC) (Coursol etal., 2000; Echevarría y Vidal, 2003; Giglioli-Guivarc’het al., 1996; Osuna et al., 2004); vi) síntesis de laPEPC-quinasa; vii) fosforilación de la PEPC, hecho asu vez modulado por una regulación metabólica (L-malato y G6P) y por el pH (Echevarría et al., 1994).Además, resultados recientes de nuestro grupo hanmostrado que en la cadena de transducción de señaleshay otra fosfatasa implicada (datos no publicados). Estafosfatasa sería de tipo 2B o 2C, ya que no es sensible alácido okadáico ni a la microcistina-LR (inhibidoresespecíficos de PP2A).

Según estudios realizados en protoplastos y hojasde M. crystallinum, existe una cascada de transducciónsimilar a la de plantas C

4 en plantas CAM (Bakrim et

al., 2001; Taybi et al., 1999). En ellas, el incremento depH desencadenante de la señalización, que permitiría laexpresión del gen PPCK, sería el resultado del transpor-te de ácido málico a la vacuola durante la noche.Cuando el malato se libera de la vacuola al citosoldurante el día, la expresión y actividad de la quinasa y elestado de fosforilación de la PEPC disminuyen (Cour-sol et al., 2000; Giglioli-Guivarc’h et al., 1996; Vidal yChollet, 1997). En las plantas CAM, el malato produ-cido por la PEPC citosólica durante la noche setransporta activamente a la vacuola. Este transporte se

91


realiza por ATP-asas de H+ del tonoplasto que estable-cen un gradiente electroquímico de H+ a través de lamembrana cuando los protones son bombeados a lavacuola (Cushman y Bohnert, 1999). Puede ser queeste proceso produzca la alcalinización del citosol enlas células del mesófilo de hojas CAM. Apoyandoesto, se ha visto que el pH citosólico del mesófilo en laplanta CAM Kalanchoe daigremontiana aumentaaproximadamente en 0,3 unidades durante la ultimafase día/principio de oscuridad.

Los metabolitos, además de regular la síntesis enplantas CAM (Nimmo, 2003), también tienen efectosen algunas plantas C

3 y C

4. Por ejemplo, plantas de

tabaco a las que se les suministra malato por corrientetranspiratoria, reducen los niveles de actividad y detranscritos de la nitrato reductasa, que a su vez estáncoordinados con los de PEPC y PEPC-quinasa (Nim-mo, 2003). En nódulos, el gen de PPCK se expresa enfunción de los fotosintatos translocados por la hoja,siendo la PEPC fosforilada durante el ciclo de luz,coincidiendo con el mayor aporte de fotosintatos (Ni-mmo, 2003; Xu et al., 2003).

Numerosos estudios realizados en hojas de plantasC

3 y en órganos no fotosintéticos indican que en estas

plantas y órganos C3, la activación de la PPCK también

ocurre por síntesis proteica a través de una cadena deseñalización que comparte numerosos elementos con ladescrita en las plantas C

4 y CAM, con la notable

excepción de la activación de la PPCK de semillas detrigo y cebada durante la germinación (Osuna et al.,1999). Así, en protoplastos de células del mesófilo deArabidopsis se ha comprobado que la expresión dePPCK1 (la PPCK específica de la roseta) se activa porluz e implica el ciclo de los fosfoinosítidos, flujos decalcio desde la vacuola al citosol, y la regulaciónpositiva de la PEPC-quinasa mediante el aumento en latasa de renovación (Gousset-Dupont et al., 2005).Además, esta cascada es dependiente de fotosíntesis. Sinembargo, en plantas y órganos C

3 se han descrito

algunas variantes. Por ejemplo, en hojas cortadas detabaco, el aumento de actividad PEPC-quinasa sebloquea por inhibidores de la fotosíntesis y por CHX,pero también por inhibidores de la glutamina sintetasa(Li et al., 1996). Esta inhibición se revierte parcial yespecíficamente al aplicar glutamina exógena a lashojas, lo que induce a los autores a concluir que laPPCK se activa por luz en plantas C

3 mediante una

ruta similar, pero no idéntica, a la que ocurre en maíz.En protoplastos del mesófilo de cebada, se ha observa-

do que la fosforilación de la PEPC dependiente de luzse modula por síntesis proteica y por calcio, sin embar-go, esto ocurre sin una fluctuación asociada de losniveles de PEPC-quinasa, que se detecta siempre (Smi-th et al., 1996). Otra variante importante es la definidapor nuestro grupo. En trabajos realizados con semillasde trigo y cebada hemos puesto de manifiesto lafosforilación de la PEPC durante la germinación. Sinembargo la activación de la PPCK, inactiva en lasemilla seca, no se produce por síntesis proteica (Osunaet al., 1996 y 1999) sino por un aumento en la relaciónG6P/malato que se produce en las primeras horas de lagerminación (Feria et al., 2005).

Recientemente, los trabajos de Sullivan et al.(2004) describen un gen de PPCK de soja (PPCK4),una planta C

3, que se regula de forma circadiana en ho-

jas pero no en raíces. Comprueban que el gen del relojcircadiano LHY/CCA1 se expresa tanto en hojas comoen raíces siguiendo el ciclo normal, lo que indica que elreloj funciona en ambos órganos, pero sólo está conec-tado a la expresión del gen PPCK4 en las hojas. En estetrabajo se describe por primera vez la expresión de ungen PPCK bajo un control circadiano en una planta queno es CAM y, además, ese control es dependiente delórgano de la planta (Sullivan et al., 2004 y 2005).

Finalmente, en arroz, se ha descrito recientementeun nuevo mecanismo en el control de la expresión deuno de los genes de PPCK, en concreto OsPPCK2. Estemecanismo se ha llamado iniciación alternativa de latranscripción, y consiste en la expresión de dos trans-critos distintos a partir del mismo gen (Fukayama et al.,2006), uno más corto y otro más largo (OsPPCK2-S yOsPPCK2-L respectivamente). La expresión diferencialde este gen en respuesta a la nutrición por fosfato ynitrógeno sugiere que la iniciación alternativa es unmecanismo de regulación de la PPCK2 con significa-ción fisiológica (Fukayama et al., 2006).

Otros mecanismos de regulación de la PPCK

Aunque la síntesis/degradación de la PEPC-quina-sa representa el mecanismo principal de regulación,existen otros factores que pueden regular la actividad dela enzima. En este sentido, la PEPC-quinasa estáregulada por el pH, siendo su óptimo in vitro de 8(Chollet et al., 1996; Echevarría et al., 1994). Además,la fosforilación de la PEPC en ensayos reconstituidoscon PEPC-quinasa está regulada por metabolitos

92


(Echevarría et al., 1994). La fosforilación es inhibi-da por L-Malato (Echevarría et al., 1994). Esta inhi-bición por L-Malato es revertida en presencia de G6P(Echevarría et al., 1994; Chollet et al., 1996; Echevarríay Vidal, 2003). La base de este mecanismo sería uncambio de conformación de la PEPC en presencia deestos metabolitos y no una acción directa de ellos sobrela actividad PEPC-quinasa (Chollet et al., 1996; Eche-varría et al., 1994; Echevarría y Vidal, 2003). Estaregulación por metabolitos de la fosforilación de laPEPC también ocurre durante el desarrollo, madura-ción y germinación de semillas de cebada y de sorgo(Feria et al., 2005; Osuna et al., 1999).

Recientemente se ha aislado un inhibidor de laPEPC-quinasa de hojas de plantas C

4 (en maíz) y CAM

(en K. fedtschenkoi). Su naturaleza es proteica (100kDa), y se une por interacción directa inhibiendo elnivel basal de PEPC-quinasa existente en condicionesbajo las cuales no se requiere un flujo rápido decarbono a través de la PEPC (Nimmo et al., 2001). Porel momento no parece estar directamente implicado,como elemento esencial, en la regulación luz/oscuri-dad de la actividad PEPC-quinasa C

4 o de la regulación

circadiana de la PEPC-quinasa de plantas CAM.Por otra parte, los trabajos de Saze et al. (2001)

muestran que la PPCK de maíz se inactiva in vitro encondiciones semi-oxidativas, y se reactiva eficientemen-te por una reducción mediada por tiorredoxina. Ade-más, observan el mismo fenómeno con la PPCK de F.trinervia (Saze et al., 2001). Sin embargo, no hanobtenido evidencias de que el mecanismo sea operativoin vivo o que esté implicado en la regulación circadianade la PPCK, ni en plantas C

4 ni en CAM.

Otro mecanismo implicado en la regulación de laPPCK podría provenir de la interacción con su sustra-to, la PEPC. En este sentido, se ha constatado quecuando se utiliza como sustrato de la fosforilación unpéptido sintético de 20 aminoácidos que contiene eldominio de fosforilación de la PEPC, la eficiencia de lafosforilación por la PPCK es muy baja. Estos resultadossugirieron la existencia de un sitio secundario deinteracción con la PPCK. Este segundo sitio de interac-ción es, al menos in vitro, el extremo C-terminal de laPEPC (Álvarez et al., 2003). Resultados recientes obte-nidos por nuestro grupo mostraron que un péptidosintético que contiene los últimos 19 aminoácidos delextremo C-terminal de la PEPC, inhibe in vitro lafosforilación de la PEPC por la PPCK, aportandola primera evidencia de que la alta especificidad de la

PEPC-quinasa por la PEPC, podría provenir de lainteracción con el dominio C-terminal hidrofóbico desu sustrato (Álvarez et al., 2003).

Regulación de la PPCK en condicionesde estrés

Las plantas C4 y CAM son conocidas por tener una

eficiencia hídrica superior a la de las plantas C3 (Smith y

Winter, 1996). Además, son plantas muy competitivasen ambientes salinos (Echevarría et al., 1988; Hase-gawa, 2000). La contribución de la PEPC a esta res-puesta al estrés salino se demostró en algunas especiesC

4 como el sorgo (Amzallag et al., 1990), y también en

especies C3 (Popova et al., 1995), con un aumento de la

actividad PEPC. También se ha mostrado un aumentode la actividad PEPC en nódulos tratados con diferen-tes concentraciones de sal (Soussi et al., 1998). En laplanta halófita Mesembryanthemum crystallinum la sali-nidad induce la transcripción y la actividad de la PEPCy del metabolismo CAM. Sin embargo, curiosamente,el promotor de la PEPC de Mesembryanthemum crysta-llinum expresado en plantas transgénicas de tabaco noes inducible por sal (Cushman et al., 1993).

En la actualidad se sabe que el estrés salinoconlleva un incremento de PEPC y paralelamente unaumento de actividad nocturna de la PPCK Ca2+-independiente, en plantas CAM (Chollet et al., 1996).Estudios realizados en la planta Clusia, con patronesfotosintéticos entre C

3 y CAM constitutivo, han podi-

do demostrar que la expresión de la PEPC es el factorprimario determinado por la capacidad genotípica delCAM y que la abundancia de transcritos de PPCKregulados durante el día y la noche (alto durante lanoche) es más bien la consecuencia del funcionamientodel CAM y de la fluctuación diurna de metabolitos(Taybi et al., 2004). Si bien se sabe que la expresión dela PEPC en la inducción del CAM por salinidad u otrosfactores de estrés es también producida por ABA (Taybiet al., 2002), no existen datos sobre la participación deesta hormona en la expresión de la PPCK.

La inducción de la PEPC y de la PPCK en elmetabolismo CAM está bien documentada (Taybi etal., 2002; Nimmo, 2003); sin embargo, existen pocostrabajos sobre la contribución del mecanismo de fosfo-rilación de la PEPC a la adaptación o tolerancia a lasalinidad, y en general a otros estreses, en plantas C

4.

Este concepto es tanto más importante cuanto que es

93


conocido que en la planta C4 la fosforilación de la

PEPC responde del 85% de la eficacia fotosintética(Bakrim et al., 1993; Nimmo, 2000).

Los primeros resultados publicados sobre el efectode la salinidad en la PPCK y en la fosforilación de laPEPC en una planta C

4 fueron obtenidos por nuestro

grupo y derivan del hallazgo de un espectacular aumen-to de la actividad de la PPCK en extractos crudos deplantas de sorgo aclimatadas a concentraciones crecien-tes de NaCl (172 y 258 mM NaCl). Este aumento dePPCK repercute en un incremento de la fosforilaciónin vivo de la PEPC, sin embargo los niveles de PEPCno se ven alterados (Echevarría et al., 2001). El efectosobre la PPCK es independiente del estrés osmótico; sedebe a la toxicidad iónica siendo también promovidopor Li+ (García-Mauriño et al., 2003), y no es promovi-do por la aplicación de ABA exógeno bien a cultivoshidropónicos o por pulverización foliar (Echevarría etal., 2001). Por último, el tratamiento con NaCl au-menta la actividad PPCK de hojas de sorgo en oscuri-dad en un proceso que depende de síntesis proteica.Este es el primer contexto metabólico en el que seinduce la síntesis de la PPCK en oscuridad, en una hojade planta C

4. La consecuencia de este hecho es un

considerable aumento de la concentración de malato enoscuridad además de un incremento de malato en luzrespecto de las plantas controles. La ausencia de fijaciónnocturna de CO

2 parece indicar que la planta C

4 en

condiciones de estrés severo, al igual que algunas C3,

podría manifestar un CAM-latente con un aumento delos niveles de malato tanto nocturnos como diurnos(García-Mauriño et al., 2003). Además del estrés salinose han descrito resultados sobre un aumento de laPPCK en aire libre de CO

2, en plantas CAM (Nimmo,

2000) y en estrés oxidativo (Izui et al., 2004).En conjunto estos resultados indican que la parti-

cipación de la PEPC en situaciones de desecación,salinidad, o CO

2 limitante, se puede establecer por una

regulación del nivel de fosforilación de la enzimadestacando el papel de la PPCK como enzima implica-da en mecanismos de tolerancia al estrés.

Regulación de la degradaciónde la PEPC-quinasa

El protagonismo en los estudios de la PPCK haestado centrado en la regulación de la síntesis de laenzima y de la cadena de transducción de señales que

conduce a la síntesis/activación tanto en plantas C4

como CAM. Este hecho está justificado porque lasíntesis de la PPCK es el elemento principal de laregulación circadiana de la actividad PPCK en estasplantas. En este sentido se le ha prestado muy pocaatención a la regulación de la degradación y a losmecanismos implicados. Los resultados obtenidos porel grupo de Izui (Agetsuma et al., 2005), utilizando unaPEPC-quinasa recombinante de F. trinervia expresadatransitoriamente en protoplastos de células de mesófilode maíz, sugieren que la PEPC-quinasa puede serdegradada vía ubiquitina-proteasoma. Sin embargo, losexperimentos realizados con anticuerpos anti ubiquiti-na en los que utiliza extractos crudos o PPCK purifica-da de hojas de maíz no le han permitido mostrar que laPPCK de la planta esté ubiquitinada, sugiriendo quepueda ser debido a una falta de afinidad del anticuerpoo a la poca abundancia de esta proteína. Resultadosrecientes obtenidos por nuestro grupo muestran que enhojas de sorgo la degradación de la PPCK está reguladapor ABA en un proceso que podría estar mediado porel proteosoma. Tanto el ABA como el inhibidorMG132, infiltrados a hojas o a discos de hojas inhibenla degradación de la PPCK. Estas son la primerasevidencias mostradas en plantas de que la degradaciónde la PPCK podría regularse por un mecanismo en elque estaría implicado el ABA y el proteosoma (Monrealet al., 2007a). La regulación de la degradación de laPPCK podría tomar relevancia en contextos específicoscomo plantas sometidas a estrés. En este sentido, hemosobtenido evidencias de que en plantas tratados con Li+

el aumento espectacular de PPCK que se mantiene apartir de 30 min de iluminación es independiente de latranscripción de la PPCK vía PLC, y se debe, en parte,a la inhibición de la degradación (Monreal et al.,2007b).

Otras vías alternativas de señalizaciónpara la síntesis/activación de la PPCK

Los trabajos realizados por nuestro grupo sobre lacadena de señalización que conduce a la síntesis/activación de la PPCK en condiciones de estrés salino oLi+ han aportado una nueva visión de esta señalizacióny han abierto nuevas alternativas de gran importancia.El hecho clave ha sido trabajar con discos de hojas encontraposición a los estudios clásicos de señalizaciónrealizados en protoplastos de hojas. En este sistema, la

94


fosforilación de la PEPC no se inhibe en presencia deTMB8 o verapamil (inhibidores de los canales de Ca2+

de los compartimentos endógenos como la vacuola)sino que necesita la presencia de EGTA en el medio deincubación de los discos de hojas. Este experimento hapuesto en evidencia por primera vez que la ruta deseñalización de la PPCK puede utilizar tanto el Ca2+

endógeno como el exógeno. Además, en discos de hojasy en hojas infiltradas, el inhibidor de la ruta de la PI-PLC, el U73123, no inhibe por completo la activaciónde la PPCK como ocurre en protoplastos (Coursol etal., 2000), indicando que la activación de la PPCKpuede ocurrir por vías alternativas a la descrita hasta lafecha en la que la señalización se produce por la vía dela PI-PLC. Estos resultados sugieren además que loscanales de Ca2+ del plasmalema, poco activos en losprotoplastos, son funcionales en el sistema íntegro delas hojas con una importante repercusión en los recur-sos de utilización de Ca2+ y en la versatilidad de larespuesta de activación de la PPCK. También hemospuesto en evidencia que el n-butanol (inhibidor de laruta de la fosfolipasa D) inhibe la síntesis de la PPCK

sugiriendo que la ruta de la fosfolipasa D (PLD) podríarepresentar una ruta alternativa o adicional de señaliza-ción. Otro mensajero de esta ruta como el ácidofosfatídico (PA) también parece intervenir; sin embargoserán necesarios más experimentos para consolidar estasalternativas. Una hipótesis que pudiera integrar estasposibilidades podría ser que la enzima de la cadena detransducción que es regulada por Ca2+ (inhibida porW7) estuviera también regulada por PA, lo que podríallevarnos a una quinasa del tipo proteína quinasa C(PKC). En plantas no existen PKC como tal pero síCDPK que responden a estos criterios de regulación,las PKC-like (Hrabak et al., 2003). Una enzima de estascaracterísticas ha sido recientemente caracterizada enhojas de sorgo (Osuna et al., 2004). Estudios realizadosen colaboración con el Dr. Vidal muestran que estaenzima está presente en las hojas de plantas C

4 y que es

activada por Ca2+ y por PA. La figura 2 ilustra unesquema hipotético de la organización de los diferenteselementos nuevos que podría intervenir en la señaliza-ción de la síntesis de la PPCK en las células del mesófiloincidiendo en los puntos de regulación del Ca2+.

FIGURA 2: Posible papel del Ca2+ enla señalización que controla la sín-tesis de la PPCK en las células delmesófilo. Posible implicación de laPLD y de una PKC-like. CDPK, quina-sa Ca2+ dependiente calmodulinaindependiente; DAG, diacilglice-rol; PLC, fosfolipasa C, PLD, fosfo-lipasa D; Ins (1,4,5)P3, inositol 1,4,5trisfosfato; PA, ácido fosfatídico;Ptdlns(4,5)P2 , fosfatidylinositol -4,5- bifosfato; PtdCho, fosfatidilco-lina ; PEPC-OH y PEPC-OP, PEPC ensu forma desfosforilada y fosforila-da respectivamente. PEPCk, fosfo-enolpiruvato carboxilasa quinasa.(Esquema adaptado de Vidal etal., 2007. Calcium and the controlof C4 photosynthesis. Med. Sci.23, 18-20).

95


Referencias bibliográficas

AGETSUMA, M.; FURUMOTO, T.; YANAGISAWA, S. e IZUI, K.,2005. «The ubiquitin-proteasome pathway is involved inrapid degradation of phosphoenolpyruvate carboxylase kinasefor C

4 photosynthesis». Plant Cell Physiol. 46, 389-398.

ÁLVAREZ, R.; GARCÍA-MAURIÑO, S.; FERIA, A.B.; VIDAL, J. yECHEVARRÍA, C., 2003. «A conserved 19 amino acid syntheticpeptide from the carboxy-terminus of phosphoenolpyruvatecarboxylase inhibits the in vitro phosphorylation of theenzyme by the Ca2+-independent phosphoenolpyruvate car-boxylase kinase». Plant Physiol. 132, 1097-1106.

AMZALLAG, G.N.; LERNER, H.R. y POLJAKOFF-MAYBER, A.,1990. «Exogenous ABA as a modulator of the response ofsorghum to high salinity». Journal Exp. Botany 41 (233),1529-1534.

BAKRIM, N.; PRIOUL, J.L.; DELEENS, E.; ROCHER, J.P.; ARRIO-DUPONT, M.; PIERRE, J.N.; VIDAL, J. y GADAL, P., 1993.«Regulatory phosphorylation of C

4 PEPC, a cardinal event

influencing the photosynthesis rate in Sorghum and maize».Plant Physiol. 101, 891-897.

BAKRIM, N.; BRULFERT, J.; VIDAL, J. y CHOLLET, R., 2001.«Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase is controlled by asimilar signaling cascade in CAM and C

4 plants». Biochem.

Biophys. Res. Commun. 286, 1158-1162.BANDURSKI, R.S. y GREINER, C.M., 1953. «The enzymatic

synthesis of oxalacetate from phosphorylenolpyruvate andcarbon dioxide». J. Biol. Chem. 204, 781-786.

BLÄSING, O.E.; WESTHOFF, P. y SVENSSON, P., 2000. «Evolutionof phosphoenolpyruvate carboxylase in Flaveria, a conservedserine residue in the carboxy-terminal part of the enzyme is amajor determinant for C

4-specific characteristics». J. Biol.

Chem. 275, 27917-27923.CHOLLET, R.; VIDAL, J. y O’LLEARY, M., 1996. «Phosphoenol-

pyruvate carboxylase: a ubiquitous highly regulated enzymein plants». Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 47, 273-298.

CRÉTIN, C.; SANTI, S.; KERYER, E.; LEPINIEC, L.; TAGU, D.;VIDAL, J. y GADAL, P., 1991. «The phosphoenolpyruvatecarboxylase gene family in Sorghum: promoter structure,aminoacid sequences and expression of genes». Gene., 99, 87-94.

CUSHMAN, J.C.; MEINERS, M.S. y BOHNERT, H.J., 1993.«Expression of a phosphoenolpyruvate carboxylase promoterfrom Mesembryanthemum crystallinum is not salt-inducible inmature transgenic tobacco». Plant. Mol. Biol. 21, 561-566.

CUSHMAN, J.C. y BOHNERT, H.J., 1999. «Crassulacean acidmetabolism: molecular genetics». Ann. Rev. Plant Physiol.Plant Mol. Bio.l, 50, 305-332.

COURSOL, S.; GIGLIOLI-GUIVARC’h, N.; VIDAL, J. y PIERRE,J.N., 2000. «An increase in phosphoinositide-specific phos-pholipase C activity precedes induction of C

4 phosphoenol-

pyruvate carboxylase in illuminated and NH4Cl-treated

protoplasts from Digitaria sanguinalis». Plant J., 23, 497-506.DONG, L.Y.; MASUDA, T.; KAWAMURA, T.; HATA, S. y IZUI, K.,

1998. «Cloning, expression, and characterization of a root-form phosphoenolpyruvate carboxylase from Zea mays: com-parison with the C

4-form enzyme». Plant Cell Physiol., 39,

865-873.ECHEVARRÍA, C.; VAQUERO, I. y GIL, F., 1988. «Aportación al

conocimiento del metabolismo fotosintético utilizado porcormofitas del Parque Natural de las Marismas del Odiel».Lagascalia, 15 (extra), 509-526.

ECHEVARRÍA, C.; VIDAL, J.; JIAO, J. y CHOLLET, R., 1990.«Reversible light activation of the phosphoenolpyruvate car-boxylase protein-serine kinase in maize leaves». FEBS Lett.,275, 25-28.

ECHEVARRÍA, C.; PACQUIT, V.; BAKRIM, N.; OSUNA, L.; DELGA-DO, B.; ARRIO-DUPONT, M. y VIDAL, J., 1994. «The effect ofpH on the covalent and metabolic control of C

4 phosphoe-

nolpryruvate carboxylase from Sorghum leaf». Arch. Biochem.Biophys., 315(2), 425-430.

ECHEVARRÍA, C.; GARCÍA-MAURIÑO, S.; ÁLVAREZ, R.; SOLER, A.y VIDAL, J., 2001. «Salt stress increases the Ca2+-independentphosphoenolpyruvate carboxylase kinase activity in Sorghumplants». Planta. 214, 283-287.

ECHEVARRÍA, C. y VIDAL, J., 2003. «The unique phosphoenolpy-ruvate carboxylase kinase». Plant Physiol. Biochem. 41, 541-547.

ECHEVARRÍA, C.; FERIA, A.B.; MONREAL, J.A.; JIMÉNEZ, E.T.;ÁLVAREZ, R. y GARCÍA-MAURIÑO, S., 2004. «Regulacióntranscripcional y posttraduccional de la fosfoenolpiru-vato carboxilasa (PEPC) y la fosfoenolpiruvato carbo-xilasa quinasa (PEPCK) por factores abióticos, estrés y hor-monas». En Metabolismo y modo de acción de fitohormonas.Ediciones Universidad de Salamanca, 211-229. Salamanca(España).

FERIA, A.B.; ÁLVAREZ, R.; COCHEREAU, L.; VIDAL, J.; GARCÍA-MAURIÑO, S. y ECHEVARRÍA, C., 2008. «Regulation of phos-phoenolpyruvate carboxylase phosphorylation by metabolitesand ABA during the development and germination of Barleyseed». Plant Physiology, 148, 761-774.

FONTAINE, V.; HARTWEL, G.; JENKINS, H.G. y NIMMO, H.G.,2002. «Arabidopsis thaliana contains two phosphoenolpyru-vate carboxylase kinase genes with different expression pat-tern». Plant Cell Environ., 25, 115-122.

FUKAYAMA, H.; TAMAY, T.; TANIGUCHI, Y.; SULLIVAN, S.; MI-YAO, M. y NIMMO, H.G., 2006. «Characterization andfunctional analysis of phosphoenolpyruvate carboxylase kina-se genes in rice». Plant J., 47, 258-268.

GARCÍA-MAURIÑO, S.; MONREAL, J.A.; ÁLVAREZ, R.; VIDAL, J. yECHEVARRÍA, C., 2003. «Characterization of a salt stress-enhanced phosphoenolpyruvate carboxylase kinase activity inleaves of Sorghum vulgare: independence of osmotic stress,involvement of ion toxycity and significance of dark phos-phorylation», Planta. 216, 648-655.

GONZÁLEZ, M.C.; OSUNA, L.; ECHEVARRÍA, C.; VIDAL, J. yCEJUDO, F.J., 1997. «Expression and localization of phos-phoenolpyruvate carboxylase in developing and germinatingwheat grains». Plant Physiol., 116, 1249-1258.

GOUSSET-DUPONT, A.; LEBOUTEILLER, B.; MONREAL, J.A.;ECHEVARRÍA, C.; PIERRE, J.N.; HODGES, M. y VIDAL, J.,2005. «Metabolite and post-translational control of phos-phoenolpyruvate carboxylase from leaves and mesophyll cellprotoplasts of Arabidopsis thaliana». Plant Sci., 169, 096-1101.

GIGLIOLI-GUIVARC’H, N.; PIERRE, J.N.; BROWN, S.; CHOLLET,R.; VIDAL, J. y GADAL, P., 1996. «The light-dependenttransduction pathway controlling the regulatory phos-phorylation of C

4 phosphoenolpyruvate carboxylase in pro-

toplasts from Digitaria sanguinalis». The Plant Cell., 8, 573-586.

HARTWELL, J.; GILL, A.; NIMMO, G.A.; WILKINS, M.B.; JEN-KINS, G.I. y NIMMO, H.G., 1999. «Phosphoenolpyruvatecarboxylase kinase is a novel protein kinase regulated at thelevel of expression». Plant J., 20, 333-342.

96


HASEGAWA, P.M.; BRESSAN, R.A.; ZHU, J.K. y BOHNERT, H.,2000. «Plant cellular and Molecular Responses to HighSalinity». Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 51, 463-99.

HATCH, M.D., y SLACK, C.R., 1970. «Photosinthetic CO2

fixation pathway». Ann. Rev. Plant Physiol., 21, 141-162.HRABAK, E.M.; CHAN, C.W.; GRIBSKOV, M.; HARPER, J.F.;

CHOI, J.H.; HALFORD, N.; KUDLA, J.; LUAN, S.; NIMMO,H.G.; SUSSMAN, M.R.; THOMAS, M.; WALKER-SIMMONS, K.;ZHU, J.K. y HARMON, A.C., 2003. «The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases». Plant Physiol., 132,666-680.

IZUI, K.; MATSUMURA, H.; FURUMOTO, T. y KAI, Y., 2004.«Phosphoenolpyruvate carboxylase: A new Era of StructuralBiology». Annu. Rev. Plant Physiol., 55, 69-84.

JIAO, J.A.; ECHEVARRÍA, C.; VIDAL, J. y CHOLLET, R., 1991.«Protein turnover as a component in the light/dark regulationof phosphoenolpyruvate carboxylase protein-serine kinase ac-tivity in C

4 plants». Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 2712-2715.

LI, B.; ZHANG, X.Q. y CHOLLET, R., 1996. «Phosphoenolpyru-vate carboxylase kinase in tobacco leaves is activated by lightin a similar but not identical way as in maize». Plant Physiol.,111, 497-505.

LÜTTGE, U., 2004. «Ecophysiology of Crassulacean Acid Meta-bolism (CAM)». Annals of Botany 93, 629-652.

MARSH, J.T.; SULLIVAN, S.; HARTWELL, J. y NIMMO, H.G.,2003. «Structure and expression of phosphoenolpyruvatecarboxylase kinase genes in solanaceae. A novel gene exhibitsalternative splicing». Plant Physiol., 133, 2021-2028.

MATSUMURA, H.; XIE, Y.; SHIRAKATA, S.; INOUE, T.; YOSHINA-GA, T.; UENO, Y.; IZUI, K. y KAY, Y., 2002. «Crystal structuresof C

4 form maize and quaternary complex of E. coli phos-

phoenolpyruvate carboxylase». Structure, 10, 1721-1730.MONREAL, J.A.; FERIA, A.B.; VIDAL, J.; ECHEVARRÍA, C. y

GARCÍA-MAURIÑO, S., 2007a. «ABA modulates the degrada-tion of PEPC-kinase in sorghum leaves». FEBB setter, (enprensa).

MONREAL, J.A.; LÓPEZ-BAENA, F.J.; VIDAL, J.; ECHEVARRÍA, C.y GARCÍA-MAURIÑO, S., 2007b. «Effect of Li on phosphoe-nolpyruvate carboxylase kinase and the phosphorylation ofphosphoenolpyruvate carboxylase in leaf disks and leaves ofSorghum vulgare». Planta, DOI 101007/s00425-006-0391-0.

NIMMO, H.G., 2000. «The regulation of PEPC in CAMplants». Trends in Plants Sci., 5, 75-80.

– 2003. «Control of phosphorylation of phosphoenolpyruvatecarboxylase in higher plants». Arch. Biochem. Biophys.,414,189-196.

OSUNA, L.; GONZÁLEZ, M.C.; CEJUDO, J.; VIDAL, J.; ECHEVA-RRÍA, C., 1996. «In vivo and in vitro phosphorylation of thephosphoenolpyruvate carboxylase from wheat seeds duringgermination». Plant Physiol. 111, 551-558.

OSUNA, L.; PIERRE, J.N.; GONZÁLEZ, M.C.; ÁLVAREZ, R.;CEJUDO, F.J. y ECHEVARRÍA, C., 1999. «Evidence for a slow-turnover form of the, calcio-independent phosphoenolpyru-vate carboxylase kinase in the aleurone.endosperme of germi-nating barley seeds». Plant Physiol., 119, 511-520.

OSUNA, L.; COURSOL, S.; PIERRE, J.N. y VIDAL, J., 2004. «ACa2+-dependent protein kinase with characteristics of proteinkinase C in leaves and mesophyll cell protoplasts fromDigitaria sanguinalis: possible involvement in the C

4-phos-

phoenolpyruvate carboxylase phosphorylation cascade». Bio-chem. Biophys. Res. Commun., 314, 428-433.

PACQUIT, V.; SANTI, S.; CRETIN, C.; BUI, V.L.; VIDAL, J. y

GADAL, P., 1993. «Production and properties of recombinantC

3-type phosphoenolpyruvate carboxylase from Sorghum vul-

gare: in vitro phosphorylation by leaf and root PyrPC proteinserine kinases». Biochem. Biophys. Res. Commun., 197, 1415-1423.

PIERRE, J.N.; PRIETO, J.L.; GADAL, P. y VIDAL, J., 2004. «In situc(4) phosphoenolpyruvate carboxylase activity and kineticproperties in isolated digitaria sanguinalis mesophyll cells».Photosynthesis Res, 79(3), 349-55.

POPOVA, L.P.; STOINOVA, Z.G. y MASLENKOVA, L.T., 1995.«Involvement of abscisic acid in photosynthetic process inHordeum vulgare L. during salinity stress». J. Plant GrowthRegul., 14(4), 211-218.

SÁNCHEZ, R. y CEJUDO, F.J., 2003. «Identification and analysisof a gene encoding a bacterial-type phosphoenolpyruvetecarboxylase from Arabidopsis and rice». Plant Physiol., 132,949-957.

SAZE, H.; UENO, T.; HISABORI, H.; HAYASHI, H. y IZUI, K.,2001. «Thioredoxin-mediated reductive action of a proteinkinase for the regulatory phosphorylation of C

4-form phos-

phoenolpyruvate carboxylase from maize». Plant Cell Physiol.,42, 1295-1302.

SHEEN, J., 1999. «C4 gene expression». Ann. Rev. Plant Physiol.

Plant Mol. Bio., 50, 187-217.SHENTON, M.; FONTAINE, V.; HARTWELL, J.; MARSH, J.T.;

JENKINS, G.I. y NIMMO, H.G., 2006. «Distinct patterns ofcontrol and expression amongst members of PEP caboxylasekinase gene family in C

4 plants». The Plant Journal, 48, 45-

53.SMITH, L.H.; LILLO, C.; NIMMO, H.G. y WILKINS, M.B., 1996.

«Light regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase in bar-ley mesophyll protoplasts is modulated by protein synthesisand calcium, and not necessarily correlated with phosphoe-nolpyruvate carboxylase kinase activity». Planta 200, 174-180.

SMITH, J.A.C. y WINTER, K., 1996. «Taxonomic distribution ofcrassulacean acid metabolism». En WINTER, K.; SMITH,J.A.C. Crassulacean Acid Metabolism: Biochemistry, Ecophysio-logy and Evolution. Editado por Springer-Verlag, Berlin, 114,427-436.

SOUSSI, M.; OCAÑA, A. y LLUCH, C., 1998. «Effects of salt stresson growth, photosynthesis and nitrogen fixation in chick pea(Cicer arietinum L.)». J. Exp. Botany., 49(325), 1329-1337.

SULLIVAN, S.; JENKINS, G.I. y NIMMO, H.G. 2004. «Roots,cycles and leaves. Expression of the phosphoenolpyruvatecarboxylase kinase gene family in soybean». Plant Physiol.,135, 2078-2087.

SULLIVAN, S.; SHENTON, M. y NIMMO, H.G. 2005. «Organspecificity in the circadian control of plant gene expression».Biochem. Soc. Trans. 33, 943-944.

TAYBI, T. y CUSHMAN, J.C., 1999. «Signaling events leading tocrassulacean acid metabolism induction in the common iceplant». Plant Physiol., 121, 545-556.

– 2002. «Abscisic acid signalling and protein synthesis require-ments for phosphoenolpyruvate carboxylase transcript induc-tion in the common ice plant». J. Plant Physiol., 159, 1235-1243.

TAYBI, T.; NIMMO, H.G. y BORLAND, A.M., 2004. «Expressionof phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruva-te carboxylase kinase genes. Implications for genotypic capa-city and phenotypic plasticity in the expression of crassula-cean acid metabolism». Plant Physiol., 135, 587-598.

TSUCHIDA, Y.; FURUMOTO, T.; IZUMIDA, A.; HATA, S. y IZUI, K.,

97


2001. «Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase involved inC

4 photosynthesis in Flaveria trinervia: cDNA cloning and

characterization». FEBS Lett., 507, 318-322.VIDAL, J. y CHOLLET, R., 1997. «Regulatory phosphorylation of

C4 PEP carboxylase». Trend Plant Sci. 2, 230-237.

XU, W.; ZHOU, Y. y CHOLLET, R., 2003. «Identification andexpression of a soybean nodule-enhanced PEP-carboxylase

kinase gene (NE-PpcK) that shows striking up-/down-regula-tion in vivo». Plant J. 34, 441-452.

XU, W.; SATO, S.J.; CLEMENTE, T.E. y CHOLLET, R. 2007. «ThePEP-carboxylase kinase gene family in Glicine max (Gm-PpcK1-4): an in-depth molecular analisis with nodulated,non-transgenic and transgenic plants». Plant J., DOI:10.1111/j.1365-313X.2006.03006.x.

l c cam la fosfoenolpiruvato carboxilasa (pepc): enzima...

Documents