LAPORAN PRAKTIKUM ENZIMOLOGI

Uji Aktivitas Enzim Amilase dari Bakteri Termofilik D93 yang Diisolasi dari Pasir dan Air Sungai Gendol Merapi

Oleh:

Vella Liani

13308141051

Biologi E 2013

JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA

2015

1

A. Judul Penelitian

Uji Aktivitas Enzim Amilase dari Bakteri Termofilik D93 yang Diisolasi dari Pasir dan Air Sungai Gendol Merapi

B. Rumusan MasalahBerdasarkan latar beakang maka dirumuskan permasalah sebagai berikut:1. Berapa suhu optimum aktivitas enzim amilase dari bakteri Termofilik

D93?2. Berapa pH optimum aktivitas enzim amilase dari bakteri Termofilik D93?

C. TujuanTujuan yang ingin dicapai pada penelitian ini yaitu:1. Mengetahui suhu optimum aktivitas enzim amilase dari bakteri Termofilik

D93.2. Mengetahui pH optimum aktivitas enzim amilase dari bakteri Termofilik

D93.

D. Desain PraktikumPenelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan perlakuan variasi suhu (30 0C, 40 0C, 50 0C) dan pH (5,7,9).

E. Objek PraktikumObjek dari Penelitian ini adalah bakteri termofilik yang diisolasi dari pasir dan air sungai Gendol Merapi isolat D93.

F. Alat dan Bahan1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

a. Botol sampel steril, b. Termometer, c. pH meter, d. Vortex,e. Water bath, f. Bunsen, g. Pipet ukur, h. Jarum ose, i. Petridishj. Tabung reaksi

k. Autoklavl. Inkubatorm. Erlenmeyern. Hot plateo. Magnetic stirerp. Oven, q. Test tube,r. Spektrofotometers. Sentrifu

2. Bahan

2

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:a. Pati, b. Media NA,c. NB, d. Nutrient starch broth, e. Sitrat buffer fosfat, f. Glukosa monohidrat.

G. Cara Kerjaa. Isolasi enzim amilase kasar

1. Perbandingan media : kultur = 45 mL : 5 mL.2. Menumbuhkan isolat terpilih sebanyak 1 mL (10% dari medium) pada

medium starch broth dan pada medium NB, selama 18 jam pada suhu 55oC.

3. Mensentrifugasi kultur bakteri penghasil enzim amilase dengan kecepatan 5000 rpm selama 30 menit.

4. Mengambil supernatan yang dihasilkan.b. Pengukuran aktivitas enzim amilase kasar

1. Memasukkan satu milliliter supernatant ke dalam tabung reaksi.2. Menambahkan dengan 1 mL larutan pati 1% dalam 2 mL sitrat buffer

fosfat (pH 5, 7, dan 9).3. Menginkubasi dalam incubator selama 20 menit untuk setiap perlakuan

suhu (30oC, 40oC, 50oC).4. Satu unit aktivitas enzim amylase didefinisikan sebagai banyaknya pati

yang terhidrolisis menjadi glukosa selama masa inkubasi 20 menit.5. Setelah diinkubasi, kemudian menambahkan 0,5 mL campuran

pereaksi Nelson A dan Nelson B dan mengocok dengan vortex.6. Memanaskan selama 5 menit7. Mendinginkan selama 15 menit, menambahkan 0,5 mL pereaksi

arsenomolibdat, menambahkan aquades hingga 5 mL.8. Selanjutnya absorbansi menguji dengan menggunakan

spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.9. Mengeplotkan nilai absorbansinya dengan kurva standar glukosa yang

terbuat dari larutan baku 0,5 mL untuk konsentrasi 1,2,3,4, dan 5 mg/100 ml.

10. Aktivitas enzim amylase dihitung berdasarkan data kadar glukosa relatif sebagai mg glukosa yang dihasilkan oleh 1 mL filtrate kasar amylase. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai banyaknya µmol glukosa yang dihasilkan dari hidrolisa pati oleh 1 mL ekstrak kasar enzim amylase selama masa inkubasi. Untuk melihat besarnya satu unit aktivitas enzim tersebut digunakan rumus:

3

AE = MG x 1000BMg x MI

Dimana:AE = aktivitas enzim (unit/mL filtrate enzim)MG = milligram glukosaBMg = berat molekul glukosaMI = masa inkubasi

c. Pembuatan kurva baku larutan glukosa1. Mengisi sepuluh tabung reaksi masing masing dengan larutan baku

glukosa 0,5 ml untuk konsentrasi 1,2,3,4, dan 5 mg/100 ml.2. Menambahkan pada semua tabung dengan 0,5 ml campuran pereaksi

Nelson A dan Nelson.3. Mengocok dan memanaskan selama 5 menit dan mendinginkan pada

air mengalir selama 15 menit.4. menambahkan kedalam masing masing tabung 0,5 ml pereaksi

arsenomolidat dan dikocok.5. Setelah itu mengencerkan hingga 5 ml dengan akuades dalam labu

ukur.6. Selanjutnya mengukur serapan masing masing konsentrasi larutan

baku pada panjang gelombang 540 nm blangko yang digunakan diperlakukan seperti sampel tetapi penambahan 0,5 ml larutan baku glukosa diganti dengan 0,5 ml akuades.

7. Melakukan uji aktivitas enzim pada pH dan suhu di atas.

4

H. Hasil dan Analisis Data

A. Hasil dan Perhitungan

Tabel .1 Nilai Absorbansi Enzim Amilase Pada Media NB Pati

Suhu (oC) PH

Nilai Absorbansi30 40 50

5 0,515 0,628 0,5747 0,447 0,310 0,2139 0,257 0,248 0,291

Tabel 2. Nilai Absorbansi Enzim Amilase Pada Media NB

Suhu (oC) PH

Nilai Absorbansi30 40 50

5 0,488 0,355 0,3227 0,137 0,338 0,1889 0,222 0,158 0,299

1. Mencari Konsentrasi Glukosa Pada Perlakuan

Grafik 1. Grafik Kurva Standar Larutan Glukosa Konsentrasi 1; 2; 3; 4; dan 5 mg/100 mL

Berdasarkan kurva standar glukosa di atas, untuk mengetahui besarnya konsentrasi glukosa yaitu dengan memasukkan pada persamaan berikut:

Persamaan

5

1 2 3 4 50

0.010.020.030.040.050.06

f(x) = 0.0084 x + 0.00699999999999999

Kurva Standar Glukosa

Series1Linear (Series1)

Konsentrasi

Nila

i Abs

orba

nsi (

OD)

x = y−0,0070,0084

Keteranganx = konsentrasi glukosa hasil hidrolisis patiy = nilai absorbansi enzim perlakuan

Tabel 3. Konsentrasi Glukosa Pada Media NB Pati (M)

Suhu (oC) PH

Konsentrasi (M)30 40 50

5 60,476 73,929 67,57 52,381 36,071 24,5249 29,762 28,691 33,809

Tabel 4. Konsentrasi Glukosa Pada Media NB (M)

Suhu (oC) PH

Konsentrasi (M)30 40 50

5 57,262 41,429 37,57 15,476 39,405 21,5489 25,595 17,976 34,762

2. Mencari Massa Glukosa (mg) Pada Perlakuan

Rumus : M = grMr X

1000P

Maka,

Keterangangr : Massa glukosa (g)M : Konsentrasi glukosa (M)Mr : Berat molekul glukosa = 180P : Volume pelarut (ml) = 5 ml

Tabel 5. Massa Glukosa Pada Media NB Pati (mg)

Suhu (oC) PH

Massa (mg) 30 40 50

5 54428,57 66535,71 60750,007 47142,86 32464,29 22071,439 26785,71 25821,43 30428,57

6

gr = M x Mr x P

1000

Tabel 6. Massa Glukosa Pada Media NB (mg)

Suhu (oC) PH

Massa (mg)30 40 50

5 51535,71 37285,71 33570,007 13928,57 35464,29 19392,869 23035,71 16178,57 31285,71

3. Mencari Aktivitas Enzim

Rumus :

Keterangan:AE : Aktivitas enzim (unit/mL filtrat enzim) MG : massa glukosaBMg : berat molekul glukosa = 180MI : masa inkubasi = 20 menit

Tabel 7. Aktivitas Enzim Amilase Pada Media NB Pati (unit/mL filtrat enzim)

Suhu (oC) PH

Aktivitas Enzim (unit/mL filtrat enzim)30 40 50

5 15119,05 18482,14 16875,007 13095,24 9017,86 6130,869 7440,48 7172,62 8452,38

Tabel 8. Aktivitas Enzim Amilase Pada Media NB (unit/mL filtrat enzim)

Suhu (oC) PH

Aktivitas Enzim (unit/mL filtrat enzim)30 40 50

5 14315,48 10357,14 9375,007 3869,05 9851,19 5386,919 6398,81 4494,05 8690,48

I. PembahasanPraktikum yang kami lakukan berjudul uji aktivitas enzim amilase dari

bakteri termofilik D93 yang diisolasi dari pasir dan air Sungai Gendol Merapi. Praktikum ini kami lakukan untuk mengetahui suhu dan pH optimum aktivitas enzim amilase dari bakteri Termofilik D93. Praktikum ini kami lakukan

7

AE = MG x 1000BMg x MI

selama ±1 bulan yaitu pada Oktober 2015 di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA UNY.

Bakteri yang kami gunakan pada praktikum kali ini yaitu bakteri termofilik D93. Termofilik secara umum diartikan sebagai organisme yang hidup pada suhu di atas 450C. Organisme ini telah memberikan pengetahuan baru selama beberapa tahun terakhir. Minat para ilmuwan terhadap organisme termofil semakin tinggi terutama adanya penemuan bakteri-bakteri yang dapat hidup pada suhu didih air atau bahkan lebih tinggi.

Bakteri termofilik yang kami gunakan adalah bakteri penghasil enzim amylase. Enzim amylase dapat menghidrolisis amilum menjadi glukosa. Kebanyakan enzim membutuhkan medium cair untuk mendukung aktivitas katalisasi air penting untuk menyusun struktur enzim. Media tumbuh yang kami gunakan pada praktikum yaitu nutrient broth (NB) dan amilum. Amilum yang kami gunakan pada praktikum ini yaitu pati, karena pada pati tersusun oleh polisakarida yang dapat dipecah oleh enzim amylase menjadi monosakarida berupa glukosa. Menurut Fox (1991) amilase dapat diartikan sebagai segolongan enzim yang merombak pati, glikogen dan polisakarida yang lain. Amilase memotong rantai polisakarida yang panjang, menghasilkan campuran glukosa dan maltosa. Amilosa merupakan polisakarida yang terdiri dari 100-1000 molekul glukosa yang saling berikatan membentuk rantai lurus.

Enzim adalah senyawa organik yang dihasilkan oleh sel-sel hidup. Bekerja dengan urut-urutan yang teratur, enzim mengkatalis ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrien, reaksi yang menyimpan dan mengubah energi kimiawi, dan yang membuat makromolekul sel dari prekursor sederhana. Spesifitas enzim amat tinggi terhadap substratnya, enzim mempercepat reaksi kimiawi spesifik tanpa pembentukan produk samping, dan molekul ini berfungsi di dalam larutan encer pada keadaan suhu dan pH normal. (Albert Lehninger,1982:235).

Untuk menguji teori aktivitas enzim maka kami melakukan perlakuan bakteri termofilik penghasil enzim amylase dengan variasi pH 5, 7, 9. Untuk membuat variasi pH kami menggunakan larutan sitrat buffer fosfat. Larutan buffer adalah larutan yang tahan terhadap perubahan pH dengan penambahan asam atau basa. Larutan seperti itu digunakan dalam berbagai percobaan biokimia dimana dibutuhkan pH yang terkontrol dan tepat (Fardiaz, 1992). Larutan buffer bermanfaat untuk melarutkan kotoran yang masih terikut di dalam endapan enzim tersebut sekaligus bisa mencegah enzim dari denaturasi dan kehilangan fungsi biologisnya (Fox, 1991). Buffer dapat mempertahankan kondisi enzim presipitat agar tidak terjadi perubahan pH dan mencegah agar enzim tidak mengalami inaktivasi (Winarno, 1995).

8

Selain dipengaruhi pH, kerja enzim juga dipengaruhi oleh suhu sehingga kami membuat variasi suhu 30, 40, 500C utnuk menguji aktivitas enzim. Pada suhu di atas dan di bawah optimalnya, aktivitas enzim berkurang. Di atas suhu 50°C enzim secara bertahap menjadi inaktif karena protein terdenaturasi. Pada suhu 100°C semua enzim rusak. Pada suhu yang sangat rendah, enzim tidak benar-benar rusak tetapi aktivitasnya sangat banyak berkurang (Gaman & Sherrington, 1994). Namun enzim yang kami gunakan pada percobaan ini berasal dari bakteri termofilik yang sudah lama inaktif sehingga suhunya tidak terlalu tinggi yaitu sekitar 30-500C. untuk mengaktifkan enzim tersebut, kami melakukan penanaman bakteri pada media agar miring dengan metode goresan zig-zag. Setelah medium tumbuh dan jumlahnya cukup kemudian kami biakan di medium cair untuk diberi perlakuan suhu dan pH yang telah ditentukan.

Penentuan nilai absorbansi dilakukan dengan menguji larutan pada alat spektrofotometri. Nilai absorbansi yaitu kemampuan suatu zat dalam menyerap sinar spektro pada panjang gelombang tertentu. Pada praktikum ini digunakan panjang gelombang 540nm. Berdasarkan hasil praktikum, pada media yang menggunakan media NB+Pati diperoleh nilai absorbansi terbesar yaitu 0,628. Nilai absorbansi tersebut diperoleh pada bakteri termofilik yang diberi perlakuan suhu 400C dan pH 5. Pada media control atau hanya menggunakan NB saja diperoleh nilai absorbansi sebesar 0,488. Nilai absorbansi tersebut diperoleh pada bakteri termofilik yang diberi perlakuan suhu 300C dan pH 5. Berdasakan hasil tersebut maka bakteri termofilik dapat bekerja optimum pada suhu 400C dan pH 5 pada media NB+Pati serta suhu 300C dan pH 5 pada media NB saja.

Hal tersebut terlihat bahwa enzim dipengaruhi oleh panas atau suhu, yang ditunjukkan dengan nilai absorbansinya. Semakin tinggi suhunya, nilai absorbansinya semakin turun, karena enzim mengalami inaktivasi pada suhu tinggi. Sedangkan pada pengaruh pH didapatkan bahwa setiap bahan memiliki nilai pH optimum untuk melakukan aktivitas enzimnya, yang dapat dilihat dari nilai absorbansinya. Menurut Gaman & Sherrington (1994) semakin besar atau basa pH yang digunakan maka semakin rendah nilai OD-nya dikarenakan enzim mengalami denaturasi. Suhu yang tinggi akan menaikkan aktivitas enzim tapi suhu yang terlalu tinggi pun dapat mendenaturasi enzim. Ketika temperatur meningkat, pH optimal enzim adalah sekitar pH 7 (netral) dan jika medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis enzim mengalami inaktivasi. Akan tetapi beberapa enzim hanya beroperasi dalam keadaan asam atau alkalis, sedangkan aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu.

Konsentrasi glukosa pada perlakuan dapat diketahui dengan membuat grafik kurva standar glukosa dengan persamaan:

9x =

y−0,0070,0084

y = 0,0084x + 0,007, maka

Keterangan:x = konsentrasi glukosa hasil hidrolisis patiy = nilai absorbansi enzim perlakuan

Berdasarkan hasil analisis dengan persamaan tersebut, diperoleh konsentrasi glukosa tertinggi pada media NB+Pati yaitu sebesar 73,929. Konsentrasi glukosa tersebut diperoleh pada bakteri dengan perlakuan suhu 400C dan pH 5 karena enzim yang dihasilkan bakteri termofilik bekerja optimum dalam mengubah pati menjadi glukosa pada suhu dan pH tersebut. Sedangkan pada media control (NB saja) diperoleh konsentrasi glukosa tertinggi sebesar 57,262 pada perlakuan bakteri termofilik dengan suhu 300C dan pH 5. Hal itu karena enzim amylase dari bakteri termofilik pada media NB mampu bekerja optimum dalam mengubah nutrient cair missal berupa litmus milk menjadi glukosa.

Kemudian dicari massa glukosa pada masing-masing media menggunakan rumus:

Rumus : M = grMr X

1000P

Maka,

Keterangangr : Massa glukosa (g)M : Konsentrasi glukosa (M)Mr : Berat molekul glukosa = 180P : Volume pelarut (ml) = 5 ml

Berdasarkan perhitungan rumus diperoleh massa glukosa tertinggi pada media NB+Pati sebesar 66535,71 mg yaitu pada perlakuan bakteri termofilik di suhu 400C dan pH 5. Sedangkan pada media NB saja diperoleh massa glukosa tertinggi sebesar 51535,71 mg pada perlakuan bakteri termofilik di suhu 300C dan pH 5. Hal itu berarti pada suhu dan ph tersebut enzim amylase pada bakteri termofilik bekerja secara optimum dalam mengubah nutrisi pada media sehingga dihasilkan produk berupa glukosa dalam jumlah banyak.

Setelah diketahui massa glukosa yang dihasilkan, maka kita dapat mengetahui aktivitas enzim menggunakan rumus:

10

gr = M x Mr x P

1000

AE = MG x 1000BMg x MI

Keterangan:AE : Aktivitas enzim (unit/mL filtrat enzim) MG : massa glukosaBMg : berat molekul glukosa = 180MI : masa inkubasi = 20 menit

Berdasarkan perhitungan menggunakan rumus diperoleh aktivitas enzim (unit/mL filtrat enzim) tertinggi untuk media NB+Pati yaitu sebesar 18482,14 pada perlakuan suhu 400C dan pH 5. Sedangkan pada media NB saja diperoleh aktivitas enzim tertinggi sebesar 14315,48 pada perlakuan suhu 300C dan pH 5. Dari hasil tersebut terlihat bahwa aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh konsentrasi substrat. Pada media NB+Pati aktivitas enzim lebih besar karena penambahan substrat berupa Pati mampu meningkatkan aktivitas enzim. Namun, jika enzim sudah mencapai titik jenuh atau semua sisi aktif enzim sudah berikatan dengan substrat maka jika dilakukan penambahan substrat tidak akan meningkatkan aktivitas anzim. Hal ini karena enzim sudah mencapai kecepatan maksimum (Vmax).

J. KesimpulanBerdasarkan pembahasan maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut:1. Enzim pada umumnya memiliki pH optimum 5 sehingga kerja enzim

optimum, karena suasana yang terlalu asam atau alkalis menyebabkan denaturasi protein dan hilangnya secara total aktivitas enzim. Larutan Buffer digunakan untuk menjaga aktivitas enzim agar tidak rusak dan mengalami aktivasi saat penambahan pH.

2. Suhu optimum enzim yaitu 40oC, pada suhu lebih dari 50oC enzim menjadi inaktif karena protein terdenaturasi. Nilai absorbansi pada percobaan ini dapat menunjukkan nilai aktivitas enzim yang dipengaruhi oleh pH dan suhu tertentu.

K. SaranUntuk penelitian selanjutnya sebaiknya bakteri yang digunakan bakteri yang masih baru sehingga suhunya belum berubah karena adaptasi dengan lingkungan. Selain itu sebaiknya dilakukan pengulangan untuk masing-masing perlakuan supaya data hasil penelitian lebih valid.

L. Daftar Pustaka

Albert L. Lehninger. 1982. Dasar – dasar Biokimia. Jakarta : Erlangga.

Fardiaz, S. (1992). Mikrobiologi Pangan 1. Gramedia Pustaka. Jakarta.

Fox, P.F. (1991). Food Enzymology Vol 2. Elsevier Applied Science. London.11

Gaman, P.M & K.B. Sherrington. (1994). Ilmu Pangan, Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi dan Mikrobiologi. Universitas Gadjah Mada press. Yogyakarta.

12