BALTYMŲ BIOSINTEZĖ(TRANSKRIPCIJA + TRANSLIACIJA)

DNR RNR Polipeptidas Fenotipas

Baltymai yra vienas svarbiausių substratų, sąlygojančių organizmų morfologines, funkcines bei biochemines savybes. Laikui bėgant, baltymų struktūra ir funkcija sutrinka, pvz., fermentai praranda savo aktyvumą. Neveiklūs baltymai degraduojami ir pakeičiami naujais. Kiekviena ląstelė gamina ne visus, o tik jai būdingus baltymus; šį sugebėjimą ji paveldi iš motininės ląstelės ir perduoda dukterinėms ląstelėms. Yra žinoma, kad didelę genetinės

informacijos dalį sudaro programos, glūdinčios DNR ir nusakančios, kokia seka turi būti sujungiamos aminorūgštys, formuojant skirtingus polipeptidus. Ši informacija yra nuskaitoma iš DNRnaudojant specifinius tarpininkus - RNRmolekulės ir toks genetinės informacijos pernešimo būdas vadinamas genų ekspresija. DNR kiekis, tenkantis vienam branduoliui, yra pastovus, tada kai RNRkiekis ląstelėse gali varijuoti, priklausomai nuo ląstelės metabolizmo intensyvumo.

Dvigrandė DNR sudaryta iš nukleotidų(fosforo rūgšties liekana, angliavandenis dezoksiribozė ir azotinė bazė). Sutinkamos keturių rūšių bazės: purino – adeninas (A) ir guaninas (G), pirimidino – citozinas (C) ir timinas (T).

DNR saugoma informacija transkribuojama į RNR molekulė, sudaryta iš vienos nukleotidų (vietoje dezoksiribozės - ribozė) grandies, kur vietoje timino (5-metiluracilo) naudojamas uracilas (RNR aptinkami ir neįprasti nukleotidai, inozinas ar pseudouracilas).RNR molekulė išsilanksto taip, kad

komplementarios bazės atsiduria viena prieš kita ir susiformuoja specifinės antrinė bei tretinė RNR struktūros.Įvairūs RNR tipai (iRNR, tRNR, rRNR,

mažosios, pvz. snRNR) skiriasi dydžiu, struktūra ir funkcijomis. Visų RNR(išskyrus virusines) sintezės matrica (genas) yra DNR. Transkribuojant susidaro RNR pirminis transkriptas –pre-RNR. Vėliau jis pakinta ir ši transformacija vadinama procesingu.

DNR yra keturios nukleotidų rūšys, todėl genetinio kodo alfabetas gali būti sudarytas tik iš 4 "raidžių“ – A (adenino), T (timino), C (citozino) ir G (guanino).Kadangi baltymuose aptinkama 20 įvairių

aminorūgščių, kiekviena jų negali būti koduojama po viena "raide", nes tada 16 aminorūgščių liktu be „įrašo“. Genetinės kalbos "žodžiai" negali būti sudaryti ir iš 2 raidžių, nes galimi variantai [C4

2 = 16] irgi neaprėpia visų aminorūgščių kiekį. Todėl mažiausią galimą "žodžio" ilgį, nusakantį tą ar kitą aminorūgštį genetinėje "kalboje“, gali sudaryti tik 3 "raidės" – nukleotidų tripletas[C4

3 = 64].Tokiu būdu, genetinis kodas yra tripletų

seka DNR molekulėje, nulemianti baltymo aminorūgščių seką. Atitinkami iRNRnukleotidų tripletai vadinami kodonais. Kadangi "pranešimas", kuris betarpiškai nuskaitomas ribosomose, yra atnešamas RNR, o ne DNR, galutinė baltymų struktūra yra nusakoma RNR kodonųseka.

i) kodonas koduoja tik 1 a.rūgštį; iš 64, prasmingų yra 61. UAA, UAG, ir UGA vadinami terminaliniais ir nusako transkripcijos/transliacijos pabaigą (skyrybos ženklai). AUG dar vadinamas startiniu (pradeda transliacija);ii) išsigimęs: viena a.rūgštį gali koduoti keli kodonai-sinonimai. Tik 2 a.rūgštys: metioninas (AUG) ir triptofanas (UGG) sinonimų neturi. A.rūgštys, turinčios daugiau sinonimų, baltymuose pasitaiko dažniau. Sinonimams, kurių skaičius < 4, dažniausiai skiriasi 3 baze (pvz., val: GUU, GUC); jei sinonimų daugiau – skiriasi ir 1 baze (pvz., leu: UUA, UUG, CUG). Iš to seka, kad labiausia informatyvus yra vidurinysis tripleto narys, mažiausią – trečiasis. Ši savybė daro kodą stabilesniu ir mažina genų mutacijų įtaką: pakitus 3 ar 1 nukleotidui, kodonas gali likti sinonimu; iii) kryptingas (transliuojama tik 5131 kryptimi); iv) nepersidengęs. Pvz., grandyje …ACGAGC… kodonai gali būti tik ACG ir AGC, o ne ACG ir GAG. Tai mažina mutacijų įtaką (kitaip 1 nukleotido mutacija keistų 2 gretimus kodonus); v) universalus - visiems organizmams vienodi kodonai sąlygoja vienodas a.rūgštis (yra išimčių, pvz. žmogaus ir mielių mitochondrijų DNR terminalinis kodonas UGAkoduoja triptofaną).

Genetinio kodo savybės:

Kodo universalumas rodo, kad evoliucijoje jis atsirado vieną kartą. Manoma, kad pradžioje jis buvo dupletinis (kodavo tik 15 aminorūgščių). Padidėjus jų kiekiui iki 20, kode atsirado trečias narys (du dupletai buvo atskirti nukleotidu, kuris įsiterpė į tripletą).

Baltymų sintezė susideda iš dviejų pagrindinių etapų – transkripcijos ir transliacijos bei vyksta pagal vieningą schemą visiems organizmams.

Transkripcija – pirminės (preliminarinės pre-iRNR) sintezė, vykstanti nuo pradinės matricos (DNR), esančios branduolyje. Transkribuojant kokį nors geną, fermentas RNR polimerazė II turi atpažinti jo pradžią ir šioje vietoje susijungti su DNR. Nukleotidų seka, prie kurios tvirtinasi RNR

polimerazė vadinama promotorium (lot. stūmiku). Surasti promotorių ir pradėti transkripciją, RNR polimerazei padeda įvairūs citozoliniai bei branduoliniai baltymai (transkripcijos faktoriai). Promotoriaus paskirtis – iRNR sintezės inicijacija. Jis taip pat lemia, kuri iš 2 DNR grandžių bus transkribuojama (tam tikra DNR atkarpa gali koduoti du genus). Ši grandis vadinama prasmine(sense), kita – antiprasminė (antisense) – gali būti netranskribuojama. Nuo vieno geno gali būtitranskribuojama daug iRNR.Nors bendras transkripcijos mechanizmas

prokariotams ir eukariotams yra vienodas, promotoriaus atpažinimas ir iRNR sintezės incijacija turi savų ypatumų.

TRANSKRIPCIJA

Bakterijose promotorių atpažįsta RNR polimerazės subvienetas, vadinamas -faktorium. RNR polimerazei susijungus su promotorium, jisprieš save išvynioja dvigubą DNRspiralę. Sujungus apie 10 RNR nukleotidų, -faktoriusatsipalaiduoja ir RNR polimerazėjuda tolyn (3151 kryptimi), tęsdama transkripciją, o atsiskyrusios DNR grandys vėl susijungia. Transkripcijos greitis apie 50

nukleotidų/s. Fermentas slenka iki matricos galo, kuris baigiasi terminatoriumi – nukleotidų seka, kuria baigiasi iRNR sintezė. Atsilaisvinus RNR polimerazei, ji vėl susijungia su -faktorium, kitos iRNR transkripcijai. Kadangi prokariotų DNR yra betarpiškai citoplazmoje, po transkripcijos iRNR savo laisvuoju 51 galuprisitvirtina prie ribosomos ir iš karto galima transliacija.

Eukariotuose transkripcijos procesas yra žymiai sudėtingesnis. RNR polimerazė II pati negali prisijungti prie DNR ir pradėti transkripcijos kol įvairūs reguliaciniai baltymai, transkripcijos faktoriai, nesusirenka prie chromosomos. Jie tiksliai pritvirtina RNR polimerazę II prie promotoriaus, atskiria transkribuojamą DNR grandį, ir atpalaiduoja RNR polimerazę II nuo promotoriaus, prasidėjus transkripcijai.

Eukariotų promotoriuje yra pasikartojanti TATA seka, kuri per 25 nukleotidus nutolusi nuo transkripcijos starto vietos. Prie jos prisitvirtina pirmas transkripcijos faktorius – TFIID. Jam prisijungus kinta tiek baltymo, tiek DNRkonformacija ir prie iniciacijos komplekso gali prisijungti keletas kitu transkripcinių faktorių.

Kai kurios promotoriaus sekos, pvz. TATA, yra vienodos daugelio genų promotoriuose ir atpažįstamos visų organizmo ląstelių transkripcijos faktoriais. Kitos promotorių sekos gali būti specifinės nedaugeliui genų ir atpažįstamos tik kai kurių audinių ląstelių transkripcijos faktoriais. Šie faktoriai atlieka svarbų vaidmenį genų reguliaciniuose procesuose bei ląstelių diferencijacijoje ir specializacijoje.

Susijungus su promotorium, RNR polimerazė atskiria DNR grandis (~14 nukleotidų), kad DNR nukleotidų bazės galėtų komplementariai prijungti laisvų ribonukleozidų trifosfatų bazės, kurios vėliau jungiasi tarpusavyje. Pirmasis (51) RNR nukleotidas prijungiamas prie 31

DNR atkarpos galo. Inicijacija laikoma baigta, kai sujungiami pirmieji 2 RNR nukleotidai. Sujungus keletą nukleotidų, RNR polimerazė atsiskiria nuo promotoriaus ir transkripcijos faktorių, pradedant RNR elongacija.RNR polimerazė juda per vieną bazę 3151 kryptimi, atidarydama DNR grandis ir

prijungdama RNR nukleotidus 5131 kryptimi. Fermento apimama apie 14 bazių porų sritis vadinama “transkripcijos burbulu“, kur būna susiporavę apie 8 DNR-RNR nukleotidų. Vidutinio dydžio genas (1500 n.) transkribuojamas per 50 s (~20 nukleotidų/s). Transkribuojama RNR grandis iš karto atpalaiduojama nuo DNR, todėl kita RNR polimerazė

gali pradėti nauja transkripciją, dar nepasibaigus pirmąjai. Pasiekus terminatorių, pre-iRNRtranskriptas atsipalaiduoja nuo RNR polimerazės ir pastaroji atsiskiria nuo DNR. RNR polimerazė gali padaryti klaidą kas ~104 nukleotidų. Kadangi iRNR nėra informacijos

saugotojas, šios klaidos didelės reikšmės neturi.

iRNR PROCESINGAS

Eukariotų pre-iRNR, susintetinta branduolyje, yra kitokia, palyginus su nukleotidų seka, atitinkančia galutinį produktą – polipeptidą. Pirminės RNR modifikacijos, apimančios du etapus, vadinamos procesingu (brendimu).

Eukariotų pre-iRNR sudaro ekzonai (E) ir intronai(I), transkribuojami nuo DNR, bet splaisingo(sujungimo) metu I pašalinami ir “susiuvami“ tik E.

Prie pre-iRNR prisijungia sudėtingas kompleksas (splaisosoma), sudarytas iš mažosios RNR (snRNR, 100-215 nukleotidų ) ir baltymų. Pvz., žinduoliams yra 6 snRNR rūšys, kurios visada yra sujungtos su atitinkamais baltymais ir sudaro mažąsias branduolines ribonukleoproteino daleles (snRNP –“snurpus“).

E-I riboje vienodos trumpos sekos (su mažom variacijom) aptinkamos visuose genuose. Vieno snRNP(U1) tam tikra RNR bazių seka komplementari šiai 51 E-I ribos sekai. Kitas snRNP (U2) komplementariai prisijungia netoli 31 I-E ribos. Dar kiti snRNPprisijungia prie sekų pačiuose intronuose. Splaisosoma (naudojant ATP energija) sukarpo pre-iRNR, pašalina I ir sujungia E, pagamindama iRNR, kuri pro branduolio poras eksportuojama į baltymo sintezės vietą.

Jei splaisingo metu intronai nepašalinami, gaunasi iRNR, sąlygojanti „neteisingą“ baltymą, kas gali sukelti ligas. Pvz., -talasemija tai genetinė žmogaus liga, kuri pasireiškia mažu -globino kiekiu hemoglobine (būdinga stipri anemija). Priežastis -mutacija I-E ribos sekoje, dėl kurios snRNP negali prisijungti prie pre-iRNR.

Vienas iš pagrindinių genetinės reguliacijos būdų (baltymų įvairovės priežasčių) eukariotuose yra alternatyvus splaisingas. Alternatyvus splaisingas sudaro galimybę įjungti arba nejungti į formuojamą iRNR dalį egzonų, tokiu būdu sukuriant baltymų variantus, besiskiriančius aminorūgščių sekomis ir funkcinėmis savybėmis.

Žmogaus genome apie 94% genų transkriptų patiria alternatyvų splaisingą. Vienų genų transkriptai turi keletą splaisingo variantų, kitų genų –tūkstančius variantų. Viena dalis pre-iRNR egzonų yra pastovūs, t.y. visada įjungiami į galutinę iRNR, kita -reguliuojami egzonai - gali būti įjungiami arba nejungiami (egzonų kasetės).

Savaiminis splaisingas vyksta bakterijose, archejose, žemesniujueukariotu branduolyje ir organelėse, aukštesniuju eukariotu organelėse. Intronų seka iškerpama nesiformuojant splaisosomai ir katalizuojant paciomsiRNR molekulėms.

Seka AAUAAA

iRNR PROCESINGAS

Prie inicialinio (51) RNR galo prijungiama vadinamoji “Cap“ dalis. Tai chemiškai modifikuotas guanozino trifosfatas (7-metilguanozinas, prisijungęs 51-galu prie pirmo nukleotido 51-galo). Ji palengvina iRNR prijungimą prie ribosomos ir apsaugo nuo degradacijos.

Daugumai eukariotų pre-iRNR pabaigoje (bet ne gale) yra seka AAUAAA. Šią seką atpažįsta specialus fermentas ir už jos nukerpa likusią pre-iRNR dalį. Kitas fermentas prie likusio terminalinio galo (31) prijungia poli-A grupę (monotoniška 100-300 adenino liekanų seka). Ji svarbi brandžios iRNR transportavimui iš branduolio, o taip pat tolimesnėms modifikacijoms. Poli-A ilgis įvairus ir keičiasi senstant iRNR molekulėms.

Transliacija – informacijos pervertimas iš 4-raidės nukleotidų kalbos į 20-raidę aminorūgščių kalbą. Ji užtikrina realią genotipo fenotipinę išraišką. Prokariotuose transliacija prasideda iš karto po transkripcijos, eukariotuose su transkriptu atliekamas sudėtingas procesingas ir tik po to jis gali pereiti iš branduolio į citoplazmą. Transliacija vyksta ribosomoje - komplekse, sudarytame iš >50 baltymų ir keleto rRNR

molekulių. Susilanksčiusi rRNR sudaro ribosomos šerdį, baltymai išsidėstę paviršiuje ir užpildo rRNR tarpus. Ribosomoje skiriami didysis ir mažasis subvienetai, kurie susijungia į funkcionuojančią ribosomą, kai į ją patenka iRNR „Cap“ galas. Prie mažojo tvirtinasi iRNR(kiekvienu momentu ribosomoje yra 2 iRNR kodonai), o didžiajame yra 3 aktyvūs centrai: A-centras (aminoacilinis), P-centras (peptidil transferazės, katalitinis) ir E-centras (išėjimo).A-centre vandenilinėmis jungtimis susijungia tRNR antikodonas su iRNR kodonu; P-centre susidaro peptidinės jungtys tarp aminorūgščių.

Ribosomos katalitinė vieta panaši į fermentų aktyvųjį centrą, todėl manoma, kad evoliucijos eigoje ribosomos atsirado iš protoribosomų, arba ribozimų (RNR molekulių, veikiančių kaip katalizatoriai peptidinių jungčių sudarymui).

tRNR 51 gale visada yra guaninas, o 31 gale – grupė CCA-OH, prie kurios prijungiama aminorūgštis. Likusioje molekulės dalyje nukleotidai gali turėti "neįprastas„ bazes (pvz., inoziną ar pseudouracilą). tRNR specifikuoja nukleotidų tripletas antikodono kilpoje, vadinamas antikodonu. tRNR funkcijos:

i) atpažįsta ir prijungia aminorūgštį. tRNR su a.rūgštimi sujungia fermentai aminoacil-tRNR-sintetazės (kurių kaip ir aminorūgščių yra 20). Sintetazė turi 3 aktyvias vietas, kurios atpažįsta 3 molekules (aminorūgštį, ATP, tRNR) ir turi klaidų taisymo savybę. Esant neatitikimui, ryšio sintetazė katalizuoja klaidingos aminorūgšties pašalinimą (viena klaida ~50000 kodonų);

ii) transportuoja (ATP energija) aktyvuotą aminorūgštį į ribosomas;

iii) antikodonu pagalba nuskaito iRNR informaciją (atpažįsta nešamos aminorūgšties vietą).

Sąveikaujant tRNR antikodonui ir iRNR kodonui, tik 2 pirmieji nukleotidai sudaro standartines nukleotidų poras, o 3 nukleotidas tRNR antikodone gali sudaryti poras su daugiau kaip vienu iRNR kodono nukleotidu (sinonimai).

Dėl nevienareikšmio atitikimo (voblingas), eukariotuose 20 aminorūgščių 61 kodonas gali būti atpažįstamas 48 tRNR rūšimis. Prokariotuose tRNR ekonomija dar didesnė – 31 tRNR rūšis. Mielių mitochondrijoms užtenka 25, o žmogaus – 22 tRNR. Nėra antikodonų, komplementinių terminaliniams kodonams.

Wobbling

4 5 6

1 2 3

Transliacijos iniciacijos fazė pradedama kodonu AUG ir specifine inicijatorinė tRNR (I-tRNR), kuri visada neša aminorūgštį metioniną (bakterijose – formilmetioniną). Metioninas vėliau dažniausiai pašalinamas specialia proteaze. I-tRNR skiriasi nuo tRNR, normaliai nešančios metioniną.

Eukariotams I-tRNR pirmiausiai (kartu su baltymais - transliacijos inicijacijos faktoriais, TIF) jungiama prie mažojo ribosomos subvieneto. Šis kompleksas susijungia su iRNR 5`galu (atpažįstama Cap sritis) ir juda 5` 3`kryptimi, ieškant start-kodoną AUG. Jį suradus, keletas TIF atsiskiria nuo mažojo subvieneto ir gali prisijungti didysis (I-tRNRsusijungia su P-centru). Į A-centrą atėjus kitai tRNR su aminorūgštimi, prasidėda sintezė. Prokariotų iRNR neturi Cap, bet yra (6 nukleotidų) ribosomą-surišančios sritys,

lokalizuotos keletu nukleotidų prieš AUG kodonus. Todėl ribosomos gali jungtis su start-kodonais iRNR viduje, nes prokariotų iRNR dažnai yra policistroninės (koduoja keletą polipeptidų nuo tos pačios iRNR, tuo tarpu kai eukariotams tik 1 baltymas).

Prasidėjus baltymo sintezei, kiekviena nauja aminorūgštis trijų reakcijų ciklu prijungiama prie ilgėjančios grandinės. Pavyzdžiui, sintezė, kai jau yra sujungta keletas aminorūgščių, ir ribosomos P-centre yra tRNR, sujungta su polipeptidu, vyksta sekančiai:

1 – atnešusios naują aminorūgštį tRNR antikodonas komplementariai susijungia su iRNR kodonu A-centre;

2 – polipeptido grandinės karboksilinis galas atjungiamas nuo P-centre esančios tRNR ir peptidiniu ryšiu prijungiamas prie amino grupės A-centre esančios tRNR atneštos aminorūgšties. Reakciją katalizuoja peptidil transferazė, kuri yra ribosomos dalis. Didysis ribosomos subvienetas pasislenka mažojo subvieneto atžvilgiu. Šis poslinkis didžiajam subvienete abi tRNRpastumia iš P-centro į E-centrą ir, atitinkamai, iš A-centro į P-centrą;

3 – mažasis ribosomos subvienetas pasislenka per tris iRNR nukleotidus į pradinę padėtį didžiojo subvieneto atžvilgiu, E-centre atsiradusi tRNRpasišalina, o į atsilaisvinusį A-centrą gali prisijungti nauja tRNR.Tokiu besikartojančiu trijų žingsnių ciklu

aminorūgštys prijungiamos prie polipeptidinės grandinės, jai ilgėjant nuo amino galo link karboksilinio, kol pasiekiamas stop-kodonas.

Elongacijos fazė

Transliacijos pabaigą nusako vienas iš terminalinių kodonų (UAA, UAG, UGA). Jie neatpažįstami tRNR, bet signalizuoja ribosomai baigti transliaciją. Prie stop-kodono, atėjusio į A-centrą, prisijungia baltymas – atpalaidavimo faktorius. Jis pakeičia ribosomos peptidil transferazės aktyvumą ir prie P-centre esančios tRNR prijungiama ne aminorūgštis, bet vandens molekulė. Ši reakcija atlaisvina karboksilinį polipeptidinės grandinės galą nuo tRNR molekulės ir baltymas atsipalaiduoja į citoplazmą. Paskutinioji tRNR patenka į E-centrą ir išeina iš ribosomos. Ribosomos subvienetai atsiskiria ir gali susirinkti ant kitos iRNR tam, kad pradėti naujo baltymo sintezę.Dauguma baltymų įgauna 3D formą spontaniškai, kitiems tam

padeda šaperonai. Šie baltymai susitinka savo šaperonus kai tik pradeda išeiti iš ribosomos.

iRNR vienu metu gali būti transliuojama keliolika ribosomų (poliribosoma), nutolusių viena nuo kitos per 80 nukleotidų. Pvz., 1500Ǻ ilgio hemoglobino iRNR vienu metu gali būti transliuojama 5 ribosomomis.

Terminacijos fazė

Transliacijos reguliavimasiRNR gyvavimo laikas labai skirtingas - dauguma bakterijų iRNR suskaidomos į nukleotidus po 3 min.,

eukariotų iRNR išsilaiko ilgiau (30 min., arba, pvz., koduojančios -globiną, nesuyra iki 10 val.). Gyvavimo laikas dalinai priklauso nuo nukleotidų sekų pačioje iRNR (atkarpoje tarp 31-galo ir poli-A pradžios). Skirtingas iRNR gyvavimo laikas padeda ląstelei nustatyti jos sintezuojamų baltymų kiekį: dažniau aptinkami baltymai, transliuojami nuo ilgalaikių iRNR, tuo tarpu baltymai, kurių reikia nedaug (arba jų kiekį sąlygoja įvairūs išorės ar vidaus signalai), transliuojami nuo trumpalaikių iRNR.

Nustatyta, kad kai kurie antibiotikai slopina baltymų sintezę bakterijose (jungiasi prie bakterijosribosominių baltymų). Pvz., chloromicetinas slopina peptidinių ryšių sintezę, eritromicinas – iRNRjudėjimą ribosomoje, neomicinas – tRNR ir iRNR sąveiką, tetraciklinas – tRNR prisijungimą ribosomoje(penicilinas slopina bakterijos sienelės gamybą).

Baltymų sintezė kiekviename etape valdoma specialiais fermentais. Pvz., laboratorijoje sintetinant iš51 aminorūgšties sudarytą insuliną, prireikė 5000 operacijų, ir šį darbą 10 žmonių dirbo trejus metus. Tuo tarpu gyvoje ląstelėje dauguma baltymų susintetinama per kelias minutes.

Baltymo biosintezė yra endoergoninis procesas: iRNRsintezė, aminorūgščių aktyvacija, peptidinių jungčiųsintezė, kodono-antikodono jungtis, tRNR atjungimas irpan. Reikalinga energija gaunama iš ATP.

Kokybinė ir kiekybinė baltymų sudėtis skirtingose organizmo ląstelėse, ir vienoje ląstelėje įvairiu laiku, yra nevienoda. DNR turi visą genetinę programą, būtiną įvairių baltymų sintezei. Konkrečiu momentu ląstelėje sintezuojami tik tie baltymai, kurie jai reikalingi.

Reiškia, yra sistemos, reguliuojančios sintezės procesus ir sąlygojančios konkretaus baltymo sintezę konkrečiu laiku. Reguliavimas gali būti atliekamas tiek transkripcijos, tiek transliacijos metu, tiek potransliaciniais mechanizmais.