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LEGENDplex™ Data Analysis Software –User Guide

VigeneTech Inc. Confidential

LEGENDplex™ Data Analysis Software

Version 7.0

ユーザーガイド

Copyright © 2013-2014 VigeneTech. All rights reserved.


VigeneTech Inc. Confidential

目次

Introduction ............................................................................................................................ 1

Lesson 1 - The Workspace ..................................................................................................... 2

Lesson 2 – Quantitative Wizard .......................................................................................... 3

Lesson 3 – Qualitative Wizard .......................................................................................... 11

Lesson 4 – Selected Functions .......................................................................................... 16

Set Standard Curve Manually .......................................................................................... 16

Data Sorting....................................................................................................................... 16

Replicates .......................................................................................................................... 16

Define Sample Dilution ................................................................................................... 17

Edit Sample ID ................................................................................................................... 17

Flag and Unflag ................................................................................................................. 18

Edit Standard Curve ......................................................................................................... 18

Set Control Type ............................................................................................................... 20

Lesson 5 - Gating ................................................................................................................. 21

Gating Protocol ................................................................................................................. 22

Auto Gating ........................................................................................................................ 22

Manual Gating Tools ......................................................................................................... 23

Lesson 6 – View ..................................................................................................................... 24

3D Result View ................................................................................................................... 24

Bar Chart View ................................................................................................................... 25

Standard Curve View ......................................................................................................... 26

Clustering view or Heat Map .......................................................................................... 28

Lesson 7 – Report ................................................................................................................. 28

Detail Report ..................................................................................................................... 28

Summary Report ................................................................................................................... 29

Contacting VigeneTech ......................................................................................................... 29


1 VigeneTech Inc. Confidential

Introduction

LEGENDplex™ データ解析ソフトウェアはフローサイトメーターからのデータを

定量的に解析する為のソフトウェアです。簡便な操作で正確なデータを得られ、

自動的にレポートが出来るようにデザインされています。

LEGENDplex™ 特徴:

Easy-to-use ribbon style user interface

Simple wizard for repetitive tasks required to analyze flow data

Fully automated analysis including data reduction and

concentration calculation

Robust curve fitting and accurate detection limit determination

Completely integrated visualization between original data, curve

mapping and results

Standardized reports with graphic presentation

Support both quantitative and qualitative analysis

Normalization options for control analyte or control sample

Summary and detailed reports



Lesson 1 - The Workspace

LEGENDplex™ は Microsoft Office 製品と似ています。

リボン、タブ、グループ、タスクの階層に分かれています。

タブの表示/非表示の切替を行います。

Figure 1. LEGENDplex™ Ribbon

Ribbons

リボンの中にタブとグループがあります。

Tabs

タブは機能別に分類されており、さらにグループに分かれています。

例えば Analysisタブには Wizard、Preference、Edit、Analysis、Protocol、

Gatingがグループとして構成されています。



Groups

グループは特徴が似たものより構成されており、ツールのようなものになります。

例えば、Viewグループは 3D、Bar Cart、Standard Carve、Sample Detail より

構成されています。

Lesson 2 – Quantitative Wizard

1. はじめにをクリックします。



2. より Add Files を開きます。

3. 解析するファイルを選び、FCS Files リストよりドラッグします。

または、FCS Files リストのフォルダごとドラッグします。

LEGENDplexTMは FCS ファイルや LMDファイルを読み込む事が出来ます。



4. Next をクリックし、アッセイに応じて Settings パネルのパラメーターを調

節します。下記に例を示します。

今回は、Highest Conc. を 4000、Dilution Factor を 4、 Decimal Places

を 0 に設定しました。

AABBCC モードは数値ごとに連続した方法でサンプルを並べます（例：sample

1, sample 1; sample 2, sample 2; …..）。

ABCABC モードはグループごとに数値を昇順に並べます（例：sample 1, 2, 3,

4…; sample 1, 2, 3, 4…）。

Auto Gate は OFF にすることをおすすめします。



5. Next をクリックします。File Name や Data modified のカラムから昇順/降

順に並べ替えられます。

実験を行う際に、LEGENDplex™キット Plate Map もしくは Rac Mapの指示に従

い、スタンダードとサンプルのデータを 1つの Plate Map上に取得すれば、

Date modified をクリックしてファイルを任意順に整列し必要なファイルを

選択した後、をクリックし、デフォルト設定に従って、ス

タンダードカーブに当てはめる事が出来ます。

Note:スタンダードカーブ設定時のパラメーターが変更された際は、

をクリックする必要があります。

リスト内でスタンダードカーブ用の FCSファイルが連続しない場合は、Ctrl

キーを押しながらファイルを選択し、右クリックで Apply Curve Options を

選択します。

あるいは、C0, C1, C2…から 1つ 1つ適した濃度のファイルを読み込む事も

出来ます（C0はブランク、C1は一番低い濃度、C2は 2番目に低い濃度）。

サンプルを選択後右クリックでサンプルを編集することが出来ます。



6. Next をクリックします。 Bead のゲーティングウィンドウが自動的に開きま

す。Bead Size、Report Signal、Beads for Size 1、Beads for Size 2 を調

整し、ドットプロットのパラメーター軸を選択します。

必要であれば Bead Size と Bead ID、Analyte を展開します。Bead ID 情報

を入力する時は、常にアルファベットの昇順で入力します（例：A4, A5,

A6…, B2, B3, B4…）。

必要があれば、ドットプロットの X軸と Y軸のラベル (channels) を変更す

ることが出来ます。Channelsはフローサイトメーターによって変わります。

デフォルト設定は BD 社の FACSCaliburTM です。

をクリックします。LEGENDplex™の Bead範囲をオートゲーティ

ングします。

プロトコールに従い、フローサイトメーターの設定等を適切に行えば、オー

トゲーティングは問題なくフィットします。

何らかの原因によりオートゲーティングがうまくいかない場合は、次に示す

オプションを行ってください。

製品マニュアルにあります

ように、ここに Bead ID と

Analyte を入力します。



a. Gate Setting の数値を減らす（例：100 から 50へ）。

b. マニュアルゲーティングを使用する。

をクリックした後、Beadのポピュレーションをクリックし自動ゲ

ートを取り除きます。をクリックし手動でゲーティングを行います。

ゲートは自動に出てきます。

この操作は何度もやり直すことが出来ます。

マニュアルゲーティング後、をクリックすると、マニュア

ルゲートが取り除かれてしまいオートゲートになってしまいますので、ご

注意ください。

c. 異なるサンプルでゲーティングを行ってください。

この方法が最も一般的です。

をクリックすると現在のゲート設定が保存されます。

7. をクリックしてゲーティングを終了します。



をクリックで完了です。

スタンダードカーブと統計計算は Curve と Options より編集することが出

来ます。

異なる検体でのスタンダード濃度のばらつきは Curve と Options より修正出

来ます。カーブのフィッティング方法は Options より変更することが出来ま

す。

Step 5 でスタンダードカーブを定義し忘れた場合は、Curve と Options はア

クティブにならない場合があります。その場合は、Previous をクリックし前

のページに戻ってスタンダードカーブの定義付けを行ってください。

8. をクリックします。Process ウィンドウが開きます。



結果が下記図のように表示されます。

9. Ribbon メニューにある View をクリックします。結果の表示方法を変えたい

場合は、Viewタイプより変更します。3Dや 2Dでの表示が可能です。

右クリックで図を保存したり、コピーすることが可能です。

10.Ribbon メニューから Reportをクリックし、レポートタイプを選択します。

エクセルやワード、PDF ファイルにエクスポートし印刷することが出来ます。



Lesson 3 – Qualitative Wizard

1. 新しい quick wizard を始める為にをクリックします。

2. をクリックし、 Add FCS Files を開きます。



3. FCS ファイルまたは LMDファイルを選択し、FCS Files にドラッグします。

またはフォルダごとドラッグします。

LEGENDplexTM はこのファイルフォルダの中の FCSファイルを読み込みます。

FCS ファイルを読み込むとワークスペースが図のように表示されます。



4. Next をクリックします。Setting の中にある Data Analysis の Type を

Qualitative に設定変更します。

5. 左下のをクリックし、ゲーティングを行います。

6. Next をクリックし次のステップに進みます。

7. 必要であれば、下記の編集を行います。

Sample ID

Options



8. をクリックします。 Process ウィンドウが開きます。



9. 結果が下記図のように表示されます。



Lesson 4 – Selected Functions

Set Standard Curve Manually

スタンダードカーブ用の FCSファイルがファイルリストの中にまとまっていない

場合は、それぞれのファイルに個別にファイルリストの上の C0、C1、C2 をドラ

ッグし指定することが出来ます。

また、FCS ファイルリスト内の Type 列のドロップダウンリストから、C を選択

し、手動で Concentration 列に濃度を入力することもできます。

は検体サンプル、からはスタンダードサンプルです。アイコ

ンの上にマウスを移動すると、定量設定に従って理論的な標準濃度を示します。

Data Sorting

FCSファイルリストでは、File Name、および Date Modified をクリックする事

で昇順/降順でファイルをソートする事が出来ます。ソート機能の一般的な使用

目的は、データが正しく計算できるよう、ファイルの順序を配置することにあり

ます。

Replicates

2つの方法があります。

1. Name 列をダブルクリックし、FCS Fileの名称や設定値を変更する。



2. FCS File を右クリックし copy してから、同じサンプルとして定義したり、

FCS File 上で右クリックし pasteする。

Define Sample Dilution

FCS File を選択し、右クリックで Edit Names ダイアログボックスを開きます。

Dilution Factorに希釈値を入力するか、またはそれぞれのサンプルの FCS

Files の Dilution Fold から希釈値を直接入力します。

Edit Sample ID

複数のファイルを選択し、右クリックで Edit Names ダイアログボックスを開き、

Prefixで名称を編集します。

Prefix --- サンプルの名称を決めます(初期設定は Sampleです)。

Start Number --- 開始番号を規定します。

Replicate Mode --- AABBCC モードは数値ごとに連続した方法でサンプルを並

べます。ABCABCモードはグループごとに数値を昇順に並べます。



Replicate number ---選択されたサンプルの複製数を入力します。

Dilution Factor ---サンプルが希釈されている場合に希釈倍率を入力します。

Flag and Unflag

Flag data

個別、または複数のデータを選択し右クリックして Flagを選びます。

Analysis タブのをクリックします。

Unflag Data

個別、または複数のデータを選択し右クリックして Unflagを選びます。

Analysis タブのをクリックします。

Edit Standard Curve

解析の前に編集することが出来ます。

Step1: Edit Standard Curve を開きます。

・Wizard Step 7 (Quantitative Analysis) の後、Edit Standard Curve のダ

イアログをクリックしてください。



Step2:

・左のパネル（スタンダード）で濃度を確認します。

IDの前にあるチェックボックスをオンにします。チェックボックスが青色であ

る場合、上記の複製であることを意味しています。

Step3:

・スタンダード曲線の最高濃度、希釈率および校正されたサンプルの濃度につい

て小数点以下の桁数の値を入力します。

・バックグラウンドウェルが含まれていることを示すために、Background(STD0)

チェックボックスをオンにします。バックグラウンドファイルが含まれていない

標準曲線ファイルを示す場合は、それをオフにします。

・Direction にチェックを入れると上昇曲線形状、入れないと下降曲線形状で示

されます。



・全ての検体が同一の濃度より始まっている場合は、Apply to All Analytes を

チェックします（デフォルトではクリックされた状態です）。をクリ

ックして作業を続けてください。

・全ての検体が同一の濃度より始まっていない場合は、Apply to All Analytes

をチェックせずに同じ濃度の検体だけを個別にチェックを入れ、

Highest Concentration 内に濃度を入力し、をクリックします。

異なる Highest Concentration を持っている他のターゲットに対して同じ操作を

繰り返します。すべての検体が定義されたら、OK ボタンをクリックしてくださ

い。

Set Control Type

Qualitative wizard 5 を参照し、から Bead Gating ウィンドウを開きます。

ドロップダウンリストから Control Type を選択してください。

Analyte、Negative Control、Positive Control が選べます。



Lesson 5 - Gating

ゲーティングは、bead 集団を分離するプロセスです。beadサイズからサブポピ

ュレーションを分離することが出来ます。このソフトウェアでは、自動ツールと

高度なマニュアルゲーティングを提供しています。

まず、Bead Gating ウィンドウを開きます。任意のサンプルを選択し、左下また

は Wizard step 6 の Analysis タブにある同じアイコンをクリックしてください。

Gating Toolbar はゲーティング処理をするためのツールです。

Gate Setting はパラメーターを定義する部分です。

Size Panel と Band Panel はゲーティング結果を表示します。



Qualitative wizardでは、下記図のように Gate Settings の部分だけが異なり

ます。

Gating Protocol

ゲーティングプロトコールは、ゲートの設定とゲーティング結果を含む

gating.xmlファイルです。保存しておいたゲーティングプロトコールファイル

はをクリックすることで読み込む事が出来ます。

をクリックすることで、最新のゲーティング設定を保存したり、ゲー

ティング結果をゲーティングプロトコールに適用させたりすることが出来ます。

Auto Gating

#of Bead Size、#Bead of Size1,Size2 の値を調整し、実験に合わせて Size

Panelと Band Panelの X軸と Y軸のパラメータを変更出来ます。



サイズを定義する為に、Size Panel（画面上部）の x軸に FSC-H、 y軸に SSC-H

を選択します。beadのサブポピュレーションを定義する為に、Band Panel（画

面下部）の x軸に FL2、y軸に FL3または FL4を選択します。FL3か FL4 のどち

らを選択するかは、データを取得したフローサイトメーターのソフトによります。

データを適切に表示する為に、適切なパラメータを選択してください。

をクリックすると自動でゲートを設定します。

Manual Gating Tools

ゲーティングプロセスに作用する深刻なバックグラウンドノイズや、実験にマッ

チしないゲーティング結果が出た場合は、手動でゲートを作成出来ます。

手動でゲートを作成します。

ゲートを削除します。



Lesson 6 – View

3D Result View

3D表示は Concentration や Median データを強調して表示します。

Ribbonタブの View からをクリックします。3D ウィンドウが下記図のよう

に表示されます。

3D表示では、マウスで図を回転させたりズームをしたりすることが出来ます。

3D 画像は他のアプリケーションで使用出来るように、保存やコピーが出来ます。

画像上で右クリックし、Save や Copy を選択してください。



Bar Chart View

bar chartは Concentration と Median データを強調し表示します。

Ribbonタブの Viewからをクリックします。Bar Chartウィンドウが下記

図のように表示されます。

Bar Chart画像は他のアプリケーションで使用出来るように、保存やコピーが出

来ます。画像上で右クリックし、Save や Copy を選択してください。

マウスが各バーの上に移動すると、ツールチップが特定の値を表示します。

データが多すぎると、うまく表示が出来ない場合があります。



Standard Curve View

View タブをクリック後 Concentration をアクティブにし、をクリックしま

す。それぞれの検体についてのスタンダードカーブが一つ一つ表示されます。

曲線係数、最小濃度、最大濃度を含むカーブフィッティングパラメーターはスタ

ンダードカーブの上にそれぞれ表示されます。



Sample Detail View

データを強調したい場合は、View からをクリックし、下記図のように 1

つ表示にすることが出来ます。

検体(例：d)とサンプル (例：F026)を画面の上から選択して表示させます。

サンプルはスタンダードカーブ状にマッピングされます。

全てのサンプル濃度はスタンダードカーブ状にマッピングされます。



Clustering view or Heat Map

一つ以上のデータを強調したい場合は、View からをクリックします。

クラスタリングが表示されます。

Lesson 7 – Report

LEGENDplex™では 2タイプのレポートを用意しています。

Detailed Reportと Summary Report があります。

ツールバー上のからレポートの種類を選択します。

レポートは Excel、PDF、Wordへエクスポートすることが出来ます。

Detail Report

Detailed Report はサンプル濃度、スタンダードカーブの詳細、ファイル情報、

スタンダード図、署名が含まれます。



Summary Report

Summary Reportはサンプル濃度、サンプル MFI(蛍光強度)、ファイルフォーマッ

ト、スタンダードカーブ図、署名が含まれます。

Contacting VigeneTech

LEGENDplexTM データ解析ソフトウェアのテクニカルサポートや商品情報は、

VigeneTechカスタマーサポートとテクニカルサポートまでお願いいたします。

Web site www.vigenetech.com

E-mail [email protected]

Telephone 1-978-371-5959

http://www.vigenetech.com/

mailto:[email protected]

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