les amibes libres: un danger méconnu

MICRO-ORGANISMES PATHOGÈNES DE L’EAU

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - MARS 2014 - N°460 // 41

article reçu le 15 juillet 2013, accepté le 28 octobre 2013.

© 2014 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.

RÉSUMÉ

Les amibes libres sont des protozoaires cosmopolites particulièrement retrouvés dans les environnements hydriques. Elles peuvent être respon-sables de pathologies graves mais exceptionnelles, comme la ménin-goencéphalite amibienne primitive due à Naegleria fowleri ou l’encéphalite granulomateuse amibienne due à Acanthamoeba sp. ou à Balamuthia mandrillaris. En revanche, les kératites causées par les amibes du genre Acanthamoeba sont plus fréquemment rapportées, le plus souvent liées à un défaut d’entretien de lentilles de contact.Les amibes libres ont de plus la particularité de pouvoir héberger d’autres micro-organismes (bactéries, champignons, virus…), leur accordant ainsi une certaine forme de protection et permettant un entraînement à leur survie ultérieure dans les macrophages. Les amibes retrouvées dans les réseaux d’eau peuvent ainsi endosser le rôle de réservoir de pathogènes potentiels et être indirectement en lien avec différentes infections.

Amibes libres – Acanthamoeba – Naegleria fowleri – Balamuthia mandrillaris – Sappinia – eau – réservoir.

Estelle Cateaua,b,*, Yann Héchardb, Marie-Hélène Rodiera,b

Les amibes libres : un danger méconnu

1. Introduction

Les amibes sont des protistes retrouvés de manière ubi-quitaire dans la nature. Il existe les amibes parasites, qui survivent dans l’environnement mais s’y développent généralement peu. Ces amibes, retrouvées dans les pays tempérés ou tropicaux, peuvent coloniser le tube digestif de l’homme et sont responsables de pathologies essen-tiellement digestives, comme Entamoeba histolytica, en cause dans l’amibiase humaine.Il existe également des amibes non parasites, accomplissant leur cycle dans l’environnement de façon autonome sans nécessiter la présence d’un hôte. Elles se nourrissent de bac-téries, d’algues, de champignons, d’autres protozoaires ou de particules organiques [1]. Ce sont les amibes libres, parti-

a Laboratoire de parasitologie et mycologie médicaleFaculté de médecine et de pharmacie6, rue de la Milétrie86034 Poitiers cedex b Écologie et biologie des interactionsUniversité de Poitiers – UMR CNRS 7267Équipe Microbiologie de l’eau1, rue Georges-Bonnet86022 Poitiers cedex

* [email protected]

culièrement représentées dans de nombreux compartiments naturels tels que les sols et les eaux. Elles sont égale-ment qualifiées d’amibes amphizoïques, puisqu’elles sont capables, dans certains cas, de se développer à l’intérieur d’un hôte (endozoïque) en plus de leurs conditions de vie libre (exozoïque).Les amibes libres sont des eucaryotes, les genres Acan-thamoeba, Balamuthia, Sappinia et Hartmannella étant classés dans le super groupe Amoebozoa, alors que le genre Naegleria appartient au super groupe Excavata [2].Parmi les amibes libres, quatre genres sont actuellement reconnus responsables directs de pathologies, avec par ordre de fréquence : Acanthamoeba, Naegleria, Balamuthia et Sappinia [3]. Parmi ces genres, certaines espèces sont également capables d’héberger des micro-organismes, s’impliquant ainsi dans leur développement et/ou leur dissémination [1]. D’autres genres amibiens, comme Hartmannella, fréquemment retrouvés dans les réseaux d’eau, en particulier hospitaliers, sans être directement impliqués dans les phénomènes pathologiques, sont égale-ment des hôtes pour bactéries ou levures pathogènes [4, 5].Les amibes libres sont classiquement retrouvées sous deux formes, une forme trophozoïte et une forme kystique. La forme trophozoïte ou végétative correspond à la période d’activité métabolique de l’amibe tandis que la forme kys-tique, biologiquement inactive, correspond à une phase de résistance de l’amibe aux conditions environnementales hostiles (déplétion en nutriments, stress osmotique, varia-tions de température, de pH…). Lors du phénomène de désenkystement, quand les conditions environnementales

SUMMARY

Free living amoebae: an unrecognized risk

Free living amoebae are ubiquitous protozoa found in water environments. They can be responsible for serious but exceptional diseases, such as primary amoebic meningoencephalitis caused by Naegleria fowleri and granulomatous amoebic encephalitis due to Acanthamoeba sp or Balamuthia mandrillaris. In contrast, Acanthamoeba keratitis are more frequently reported, often related to the use of contact lenses.Moreover, free living amoebae can be hosts for other microorganisms (bacteria, fungi, viruses...), represen-ting a way of protection and a training field for their survival in macrophages. Amoeba found in water systems can thus assume the role of a reservoir of potential pathogens and be indirectly related to various infections.

Free living amoebae – Acanthamoeba – Naegleria fowleri – Balamuthia mandrillaris – Sappinia – water – reservoir.

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redeviennent favorables, l’eau pénètre dans le kyste par osmose et réhydrate le cytoplasme permettant ainsi la reprise des différentes synthèses et métabolismes. Dans le cas d’Acanthamoeba, le trophozoïte sort alors du kyste par l’ostiole (figure 1) et reprend une vie libre. Seules les espèces du genre Naegleria peuvent exister sous une troi-sième forme, la forme flagellée, dans certaines conditions environnementales.

2. Naegleria fowleri

Parmi les 30 espèces de Naegleria, seule Naegleria fowleri a été rapportée comme pathogène pour l’homme. Il s’agit d’une amibe libre cosmopolite, existant sous forme flagellée et pouvant être retrouvée dans le sol et dans l’eau. Cette amibe serait plus sensible à certaines conditions environne-mentales telles que la sècheresse et les pH extrêmes et ne pourrait pas survivre dans l’eau de mer. N. fowleri est une amibe thermotolérante et pourrait survivre jusqu’à 45 °C. Cette thermotolérance expliquerait en partie son caractère pathogène par sa capacité à s’adapter à la température corporelle humaine. N. fowleri est souvent isolée d’eaux chaudes issues de lacs, d’étangs, de rivières, de sources, de piscines dont l’eau est insuffisamment traitée, ou d’eaux rejetées des circuits de refroidissement des centrales nucléaires. Elle a aussi pu être isolée de la muqueuse nasale d’individus asymptomatiques [3].N. fowleri peut se présenter sous trois formes morpholo-giques (figure 2) : la forme trophozoïte (10-25 μm) capable de déplacement par l’intermédiaire d’un ou plusieurs pseudopodes [3, 6]. Le trophozoïte se transforme en forme flagellée quand la concentration ionique du milieu change et en kyste quand les ressources en nutriments diminuent et/ou que les conditions de croissance deviennent défavorables ; la forme flagellée (10-16 μm) en forme de poire avec deux flagelles. Elle n’est qu’une forme transitoire ;

la forme kystique (8-20 μm), sphérique et à double paroi. Elle correspond à la forme de résistance et de protection de l’amibe.

Cette amibe, comme Acanthamoeba, peut permettre la croissance de bactéries intracellulaires telles que Legionella pneumophila [3].N. fowleri est responsable de la méningoencéphalite ami-bienne primitive (MEAP) principalement chez l’enfant et le jeune adulte. N. fowleri n’est pas un pathogène opportuniste contrairement à Acanthamoeba et Balamuthia, la MEAP ne touche ainsi que des individus bien portants. Cette patho-logie aiguë, fulminante, se développe quelques jours après l’exposition à de l’eau douce et chaude et peut entraîner la mort en 1 ou 2 semaines après l’hospitalisation [6].N. fowleri a été décrite pour la première fois en 1965 par Fowler et Carter [7]. Depuis, plus de 300 cas auraient été rapportés, surtout aux États-Unis, en Australie et en Europe [8]. Aucun cas n’a été rapporté en France métropolitaine. Un seul cas, fatal, a été diagnostiqué en Guadeloupe en 2008 chez un enfant de 9 ans qui s’était baigné dans une source géothermique émanant du volcan La Soufrière [9].Les infections surviennent souvent pendant la saison chaude à l’occasion d’activités aquatiques. Les trophozoïtes de N. fowleri pénètrent à travers la muqueuse nasale et gagnent les bulbes olfactifs du système nerveux central. À ce stade, l’amibe se divise rapidement et la mort survient dans les 7 à 10 jours, causée par une nécrose hémorragique fulminante du cerveau. Les premiers signes surviennent généralement 1 à 2 jours après l’exposition et regroupent céphalées, nausées, vomis-sements, fièvre (38,5-41 °C) et rigidité de la nuque [3].Le diagnostic peut être obtenu par examen microscopique (contraste de phase de préférence) du liquide céphalo-rachidien (LCR), pour visualiser l’amibe mobile [3, 10]. Le test de flagellation permet de mettre en évidence les amibes du genre Naegleria se transformant en formes flagellées au contact de l’eau [10]. Une culture sur gélose non nutritive recouverte de bactéries inactivées peut être réalisée mais compte tenu du caractère fulminant de cette infection, le diagnostic devra être rapide. Ainsi, en dehors des techniques de microscopie, des techniques de biologie moléculaire par PCR en temps réel ont été développées pour mettre en évidence directement à partir du LCR, N. fowleri pour certaines [9] et Acanthamoeba, B. mandril-laris et N. fowleri simultanément par PCR mutliplex, pour d’autres [9, 11]. Il est à noter que ces techniques restent l’apanage des laboratoires de recherche et ne sont pas encore généralisées en diagnostic de routine.

Figure 1 – Kyste d’Acanthamoeba castellanii au microscope électronique à transmission.

La flèche indique l’ostiole.

Figure 2 – Représentation schématique

du cycle de Naegleria fowleri.



Des amibes du genre Acanthamoeba ont été isolées de nombreux environnements : eaux des réseaux d’eau y compris hospitaliers, eaux de boisson dont l’eau minérale embouteillée, eaux de piscine ou de spas, tours aéro-réfrigérantes de centrales nucléaires ou d’autres indus-tries, conduits de ventilation ou d’air conditionné… [16].Elles ont également été mises en évidence dans différents prélèvements de patients : écouvillonnage pharyngé, selles, peau… [15, 16] et plus récemment, une équipe brésilienne a déterminé la prévalence d’Acanthamoeba spp. dans des populations sauvages d’Aedes aegypti [17].Le genre Acanthamoeba est divisé en 17 génotypes. La majorité des souches responsables de pathologies humaines appartient au génotype T4, lui-même subdi-visé en sous-groupes, sans qu’on puisse affirmer pour l’instant que ce génotype soit le plus virulent, puisqu’il est aussi le génotype le plus fréquemment retrouvé dans l’environnement [18].Malgré de nombreuses possibilités de contact avec les amibes, peu d’infections à Acanthamoeba ont été rappor-tées chez les humains et chez les animaux. Néanmoins, certaines études ont montré que des individus sains ont développé des anticorps dirigés contre ces micro-orga-nismes [6, 15, 16]. En revanche, l’immunité protectrice de ces anticorps contre les infections à Acanthamoeba reste inconnue.Chez l’homme, trois types d’atteintes sont le plus souvent retrouvés.

3.1. Kératite amibienneC’est le type d’affection à Acanthamoeba le plus rap-porté. Elle survient chez l’immunocompétent et son principal facteur favorisant est le port de lentilles de contact. La kératite amibienne survient le plus souvent suite à une mauvaise utilisation ou un mauvais entretien des lentilles. En France, la prévalence est faible avec 1 cas pour 30 000 porteurs de lentilles de contact [19].

Peu de patients ont survécu à une infection à N. fowleri. Parmi eux, une enfant américaine a été traitée agressivement par amphotéricine B par voie intrathécale et intraveineuse associée à du miconazole par voie intrathécale et de la rifampicine par voie orale [12]. Suivant cette expérience clinique et des études réalisées in vivo et in vitro, l’ampho-téricine B semblerait être la molécule la plus efficace contre Naegleria [3]. D’autres études ont pu montrer l’activité d’antibiotiques de la famille des macrolides in vitro et in vivo chez la souris [13] ou encore de la chlorpromazine [14]. L’efficacité du traitement repose surtout sur sa mise en place précoce.La prévention de ces infections repose sur l’éviction des baignades en eaux douces ou le port de pince nasale ou de masque de plongée et sur la chloration des eaux de piscine.

3. Le genre Acanthamoeba

Le terme Acanthamoeba signifie que le trophozoïte amibien présente à sa surface des structures fines ressemblant à des épines et nommées acanthapodes (figure 3). Parmi les amibes de ce genre, A. castellanii a été étudiée depuis longtemps sur le plan morphologique [15].Le cytoplasme du trophozoïte de l’amibe contient des vacuoles, contractile pour la régulation osmotique, diges-tives ou contenant du glycogène, et de nombreuses mito-chondries (figure 4). Dans les conditions hostiles, le tro-phozoïte (25-40 μm) se transforme en kyste (13-20 μm), possédant une double paroi riche en cellulose, et donnant à l’amibe une forme un peu étoilée (figure 1).

Figure 3 – Visualisation des acanthapodes

d’un trophozoïte d’Acanthamoeba castellanii au microscope électronique à balayage

en présence d’une bactérie.

Figure 4 – Trophozoïte d’Acanthamoeba castellanii au microscope électronique à transmission.

Les flèches indiquent des mitochondries.


des cellules épithéliales [22]. Plusieurs espèces respon-sables de kératites ont été rapportées : A. castellanii, A. polyphaga (les deux espèces les plus fréquemment retrou-vées dans cette pathologie), A. hatchetti, A. culbertsoni, A. rhysodes, A. lugdunensis [15].Les premiers symptômes de kératite amibienne asso-cient, à un stade précoce, une sensation de corps étran-ger, une photophobie, un œil rouge et larmoyant, une diminution de l’acuité visuelle et une douleur oculaire intense, de façon unilatérale le plus souvent. L’examen révèle un épithélium cornéen présentant des microé-rosions, des irrégularités et des opacifications blan-châtres dendritiformes pouvant égarer le diagnostic. On peut retrouver une kératonévrite radiaire quasi-pathognomonique mais inconstante avec une infiltration spécifique suivant la distribution des nerfs cornéens [6]. À un stade plus évolué, on observe une kératite stromale pisciforme, une ulcération caractéristique de la cornée en anneau à centre clair avec un infiltrat immunitaire annulaire (figure 5). Au stade ultime et après plusieurs mois d’évolution, s’installe un abcès cornéen avec néovascularisation. Le stroma cornéen s’amincit et s’opacifie. Le principal risque évolutif est la perforation de la cornée.La kératite amibienne est souvent diagnostiquée à tort comme une kératite virale ou fongique, ceci entraînant un retard dans le traitement. Or, un diagnostic précoce est primordial pour la mise en place rapide d’un traitement efficace.Le diagnostic peut être réalisé par un grattage de cornée (voire une biopsie cornéenne) qui va permettre la mise en évidence du pathogène. Dans certains cas, l’examen et la mise en culture de la ou des lentilles et du liquide de conservation seront contributifs.Le produit de grattage est étalé sur une lame, puis coloré. Les colorations de Gram ou Giemsa sont les plus couramment utilisées, mais de nombreuses autres ont été décrites : May-Grünwald-Giemsa (figures 6 et 7),

La maladie peut néanmoins aussi résulter d’un traumatisme cornéen avec exposition à des corps étrangers souillés (végétaux, terre, insectes…) [20]. Depuis les premières kératites amibiennes rapportées aux États-Unis en 1973, puis au Royaume-Uni en 1974, de nombreux cas sont régulièrement rapportés, en rapport avec l’augmentation de l’utilisation de lentilles de contact. Une épidémie de kératites amibiennes aux États-Unis entre 2004 et 2006 a été associée à l’utilisation d’une solution pour les len-tilles de contact, ce qui a conduit à un rappel du produit par le fabricant [21].L’amibe doit d’abord adhérer à l’épithélium cornéen. Les acanthapodes et une mannose-binding protein (MBP) se liant aux glycoprotéines et aux glycolipides des cellules épithéliales semblent être les principaux éléments amibiens impliqués à cette étape. Interviennent ensuite des protéases extracellulaires amibiennes, le phénomène de phagocytose et des mécanismes cytolytiques aboutissant à la mort

Figure 5 – Kératite amibienne à Acanthamoeba sp.

avec infiltrat concentrique de la cornée.

Source CD Rom ANOFEL 4e version : Association française des enseignants et praticiens hospitaliers titulaires de parasitologie et mycologie médicale – Photo du service de microbiologie, Hôtel Dieu, M. Cornet.

Figure 6 – Trophozoïtes d’Acanthamoeba castellanii colorés au May-Grünwald-Giemsa (objectif 50).

Figure 7 – Kystes d’Acanthamoeba castellanii colorés au May-Grünwald-

Giemsa (objectif 50).



PAS, acridine orange, calcofluor (figure 8)… [6, 23]. Les kystes, grâce à leur double paroi, sont plus faciles à visualiser que les trophozoïtes qui peuvent être confon-dus avec des cellules inflammatoires [6]. Ces structures sont aisément retrouvées en microscopie électronique à transmission [24]. Les kystes peuvent également être marqués par le calcofluor, qui va se lier au collagène de leur paroi. Dans ce cas, la lecture s’effectue au micros-cope à fluorescence.Le prélèvement est mis en culture sur une gélose peu nutri-tive à 1,5 % d’agar et recouverte en nappe avec Escherichia coli, Enterobacter cloacae ou Klebsiella pneumoniae le plus souvent inactivés. Les boîtes sont ensuite incubées à 27-30 °C et examinées quotidiennement au microscope inversé (figure 9). La PCR est un examen permettant un diagnostic rapide réservé cependant à certains laboratoires spécialisés. Le prélèvement doit être effectué après un rin-çage abondant de la cornée pour éliminer au maximum les inhibiteurs de PCR qui pourraient fausser le diagnostic [6]. Boggild et al. ont récemment démontré que la PCR mon-trait une meilleure sensibilité que le frottis ou la culture, avec cependant une spécificité moindre [23].L’utilisation de la microscopie confocale in vivo, examen non invasif, a l’avantage d’apporter une réponse immé-diate en visualisant des images évocatrices de kystes amibiens et des co-infections potentielles. Néanmoins, dans certains cas, cet examen resterait négatif malgré des signes cliniques évocateurs et une PCR positive [25]. La technique de spectroscopie à résonance magnétique nucléaire a récemment été présentée comme une tech-nique potentielle de diagnostic in vitro [26].Les principales molécules actives sur les trophozoïtes et les kystes amibiens sont des biguanides comme le polyhexa-méthylènebiguanide, toxique pour les cellules cornéennes, ou la chlorhexidine. Cette dernière molécule est souvent utilisée en association avec des diamines aromatiques comme l’isethionate de propamidine, la dibromopropami-dine ou l’hexamidine, cependant moins efficaces sur les formes kystiques [27]. En cas de surinfection bactérienne, des collyres contenant des antibiotiques sont également prescrits. Certains praticiens ont utilisé des applications topiques combinant propamidine et miconazole associées ou non avec des azolés (itraconazole, voriconazole) par voie orale [22]. Le traitement doit être prolongé plusieurs semaines, voire plusieurs mois. L’utilisation des cortico-stéroïdes pour diminuer une inflammation persistante est controversée.De nouvelles thérapeutiques sont à l’étude [28], ainsi que la recherche de nouvelles cibles situées dans la paroi ou dans la membrane plasmatique de l‘amibe [29].En cas d’échec thérapeutique, une kératoplastie peut être pratiquée. Dans tous les cas, la récupération d’une l’acuité visuelle convenable est liée à la mise en route précoce d’un traitement adapté.

3.2. Encéphalite granulomateuse amibienne (EGA)La deuxième atteinte humaine à Acanthamoeba concerne le système nerveux central, avec l’encéphalite granuloma-teuse amibienne (EGA). Bien que la période d’incubation de la maladie ne soit pas connue, plusieurs semaines

à plusieurs mois semblent nécessaires à l’établissement des signes cliniques. Il n’y a pas de signes spécifiques de l’agent pathogène et le début est lent et insidieux, avec un tableau chronique, associant des signes d’irritation méningée et des signes variés d’atteinte encéphalique avec ataxie cérébelleuse, troubles visuels, hémiparésie, convulsions voire coma [3, 15].L’EGA survient le plus souvent chez des sujets immunodé-primés [15, 30]. Plus de 240 cas ont été à ce jour rapportés dans la littérature [11]. La pénétration dans l’organisme se fait par voie nasale ou pulmonaire, voire à la faveur d’une lésion cutanée, les amibes gagnant secondairement l’encéphale par voie hématogène [15]. L’imagerie cérébrale

Figure 8 – Kystes d’Acanthamoeba polyphaga

marqués au calcofluor (objectif 20).

Figure 9 – Culture sur gélose non nutritive d’une lentille

de contact : kystes d’Acanthamoeba sp. et filaments

mycéliens au microscope à lecture inversée (x10).


(de 15 à 60 μm) avec une structure irrégulière « bran-chée » et une forme kystique plus petite et plus arrondie (13 à 30 μm) possédant une triple paroi [33].La distribution environnementale de B. mandrillaris, sa niche écologique et ses préférences nutritives sont pour l’instant mal connues. Cette amibe n’a été isolée de l’environnement qu’à deux reprises et seulement dans des prélèvements de sol [33, 34]. Ce manque d’informa-tions peut être relié au fait que B. mandrillaris se multiplie lentement et sur des milieux particuliers. Cependant, sa proximité taxonomique avec Acanthamoeba a conduit plusieurs auteurs à penser que B. mandrillaris pourrait être retrouvée dans l’eau [6]. Ce protozoaire semblerait se nourrir préférentiellement d’autres protozoaires plutôt que de bactéries. Il peut également se développer sur des cellules de mammifères en culture [10].B. mandrillaris est responsable d’une encéphalite que les Anglons-Saxons ont tout d’abord nommée BAE pour Balamuthia Amoebic Encephalitis. Il est admis aujourd’hui que ce protozoaire est responsable d’EGA, comme cer-taines espèces d’Acanthamoeba [3, 33]. Le contact avec un sol contaminé serait un facteur de risque important. Cette atteinte évoluant sur plusieurs mois (entre 3 mois et 2 ans) est le plus souvent fatale au patient [35]. Cette pathologie peut être retrouvée aussi bien chez l’immu-nodéprimé que chez l’immunocompétent sans terrain sous-jacent évident. Elle a été plus souvent rapportée dans des zones géographiques chaudes, chez des sujets d’origine hispanique, sans qu’il ait pu être déterminé si ces individus étaient plus exposés à l’amibe ou s’il s’agissait d’une prédisposition génétique [33].Plus de 150 cas mondiaux de BAE ont été rapportés [35], la plupart provenant du continent américain, quelques cas européens ont également été décrits, mais cette pathologie, de diagnostic difficile, reste probablement sous-estimée. Il a été montré que des individus sains possèdent des anticorps dirigés contre B. mandrillaris, suggérant un contact avec ce pathogène potentiel [36]. La prévalence augmente avec l’âge, étant probablement le reflet de contacts répétés avec l’amibe au cours de la vie.Plusieurs portes d’entrée dans l’organisme ont été sug-gérées : la porte d’entrée cutanée avec infection locale associée serait la plus probable mais une voie d’entrée nasale puis respiratoire est également possible. La période de dissémination hématogène qui suit peut intéresser différents organes (rein, pancréas, thyroïde) en dehors du cerveau où B. mandrillaris pénétrerait soit par les plexus choroïdes, soit plus probablement en franchissant la barrière hémato-encéphalique [6, 37].La symptomatologie au début de l’infection associe des céphalées, des nausées, des vomissements, une photophobie, une douleur et/ou une raideur de nuque accompagnée d’un fébricule et d’une sensation de fatigue générale. Elle évolue ensuite vers des atteintes neurolo-giques diverses (hémiparésie, paralysies, ataxie, confu-sion, difficultés dans l’élocution et le déplacement…). La mort survient après une longue évolution et les cas de guérison sont rares, même après l’instauration d’un traitement [3, 33, 35, 37].Le diagnostic est difficile et tardif. En effet, il n’existe pas de signes pathognomoniques d’une atteinte

retrouve des images diffuses, plus ou moins marquées, non spécifiques. Ces lésions multifocales accompagnées d’œdème sont communément observées dans cette patho-logie [6]. Les amibes lysent les tissus cérébraux, produisant des foyers de nécrose hémorragique, touchant plus par-ticulièrement les hémisphères cérébraux, le cervelet et le tronc cérébral [31]. Une dissémination à d’autres organes (dont poumon et peau) est possible avec une évolution souvent fatale.L’examen du LCR retrouve une pléïocytose avec prédo-minance lymphocytaire, une protéinorachie augmentée et une glycorachie basse. Les amibes peuvent être mises en évidence dans le LCR ou son culot (faible centrifugation pour éviter de lyser les amibes), directement ou après coloration. La cytocentrifugation peut donner de meilleurs résultats [15]. Des cultures en milieu non nutritif additionné de bactéries peuvent contribuer à la mise en évidence du pathogène. L’analyse anatomopathologique des biopsies cérébrales montre de nombreuses cellules multinucléées, des infiltrats inflammatoires et des formes amibiennes entourant les vaisseaux sanguins. Les amibes peuvent être différenciées des cellules inflammatoires par la pré-sence d’un volumineux caryosome entouré d’une sorte de halo [15]. La mise en évidence des pathogènes peut être facilitée par l’utilisation d’anticorps spécifiques. Les techniques de microscopie électronique sont également utilisables [6]. La sérologie, peu utilisée car très spécia-lisée, retrouve des titres d’anticorps spécifiques élevés, bien que les patients immunodéprimés puissent présenter une sérologie négative [16]. Le diagnostic est aujourd’hui facilité par l’utilisation de la PCR. Le pronostic est mauvais, avec une mortalité proche des 95 %, malgré l’utilisation de différentes molécules comme des azolés ou des polyènes [10, 16, 32]. La miltéfosine pourrait néanmoins donner des résultats plus satisfaisants [32].

3.3. Atteinte cutanéeCette atteinte est plus fréquente chez les patients atteints de sida. On retrouve des nodules durs et érythéma-teux et/ou des ulcères cutanés plus ou moins indurés. Les lésions cutanées peuvent représenter la primo infec-tion de l’atteinte amibienne ou sont le résultat d’une dissémination hématogène secondaire à d’autres foyers. La mortalité est d’environ 70 % sans atteinte du système nerveux central et de 100 % en cas d’atteinte cérébrale associée [15]. Le diagnostic est réalisé par biopsie cutanée avec mise en évidence directe des formes amibiennes par coloration ou par examen anatomopathologique, mise en culture des prélèvements et PCR. Le traitement fait appel aux mêmes molécules que celles utilisées pour le traitement de l’EGA.

4. Balamuthia mandrillaris

Cette amibe doit son nom au fait qu’elle fut isolée pour la première fois en 1986 du cerveau d’un mandrill mort d’une encéphalite nécrosante. Il n’existe pour l’instant qu’une seule espèce connue dans le genre Balamuthia, très proche du point de vue taxonomique du genre Acantha-moeba. Deux formes sont décrites, une forme trophozoïte



à B. mandrillaris qui puisse la distinguer d’autres étiolo-gies d’atteintes cérébrales infectieuses ou non (tumeur, toxoplasmose, cysticercose…). Les examens réalisés sur le liquide céphalo-rachidien montrent une augmentation des leucocytes, une glycorachie normale ou abaissée et une hyperprotéinorachie, les formes amibiennes n’étant le plus souvent pas visibles [33]. L’imagerie (IRM et scanner) retrouve des lésions disséminées dans l’encé-phale [38]. Le parasite peut être mis en évidence dans les lésions par des techniques histologiques (coloration à l’hématoxyline-éosine), avec des trophozoïtes et des kystes localisés dans les espaces périvasculaires du cerveau ou d’autres tissus, comme la peau, intéressés par l’infection [35]. Les biopsies de l’encéphale retrouvent des granulomes et des cellules géantes multinucléées. Le diagnostic morphologique reste néanmoins du domaine du spécialiste. Les techniques de biologie moléculaire, disponibles uniquement dans quelques laboratoires spécialisés, permettent de confirmer la présence du protozoaire.Devant les difficultés diagnostiques, le traitement est toujours institué avec retard, et l’issue pratiquement toujours fatale (98 % des cas). De rares cas de guérison ont été publiés avec des traitements associant différentes molécules dont les diamines, qui seraient le traitement recommandé [33, 38], avec maintien pendant plusieurs années pour éviter la récurrence due à la présence de kystes moins sensibles au traitement.La GBP (galactose binding protein) ou d’autres adhésines exprimées à la surface de l’amibe pourraient représenter des cibles pour de futures thérapeutiques [39].

5. Sappinia diploidea

Le genre Sappinia, décrit en 1896, regroupe actuellement deux espèces : S. pedata et S. diploidea que le séquen-çage du gène de l’actine a permis de classer dans les Thecamoebidae. La répartition des deux espèces est cosmopolite, elles ont pu être isolées de l’environnement sur des arbres, dans l’eau ou sur des sols souillés par des déjections de bovins [6].Le seul cas humain d’encéphalite due à Sappinia a été décrit au Texas en 1998 [40] chez un patient souffrant de céphalées, de vomissements, de crises d’épilepsie, et d’anomalies visuelles. L’imagerie retrouvait alors une masse située dans le lobe temporal gauche dont la biop-sie permettait de mettre en évidence des trophozoïtes au sein d’une lésion inflammatoire et nécrotique. Ces trophozoïtes (de 50 à 60 μm de long et de 20 à 30 μm de large) possédaient deux noyaux accolés, caractéris-tiques du genre. Le diagnostic retenu a donc été celui d’une encéphalite amibienne due à Sappinia diploidea. L’exérèse de la lésion ainsi qu’un traitement comprenant azithromycine, pentamidine, itraconazole et flucytosine, ont permis d’obtenir la guérison du patient. Des examens de biologie moléculaire menés ultérieurement ont permis d’identifier S. pedata comme étant le micro-organisme responsable de l’atteinte, les deux espèces étant en effet difficiles à distinguer au plan morphologique [41]. Un seul cas ayant été décrit, la période d’incubation et la porte d’entrée de l’amibe restent inconnus.

6. Paravalkampfia francinae

Un cas de méningoencéphalite a été rapporté en 2009 chez un jeune homme américain ayant pratiqué des acti-vités nautiques, en mer 2 mois et en piscine 2 semaines avant l’apparition des signes cliniques. Le patient se plaignait de céphalées, de vomissements et de toux et l’examen clinique permettait d’objectiver une raideur de nuque. Le premier diagnostic évoqué a été celui d’une méningoencéphalite à N. fowleri. La mise en culture du LCR sur fibroblastes au Center for disease control and prevention a permis la mise en évidence de nombreuses formes amibiennes ne produisant pas de flagelles. La microscopie électronique a précisé la morphologie amibienne : les trophozoïtes de 15 à 25 μm ne possèdent qu’un seul noyau et les kystes, arrondis, mesurent de 15 à 25 μm de diamètre. Les techniques moléculaires ont permis de caractériser une nouvelle espèce : Paravalkampfia francinae, appartenant au super groupe Excavata. Le patient a guéri spontanément deux jours après sa mise sous traitement antibiotique systématique. Les rapporteurs de ce cas clinique ont ainsi suggéré que les rares cas de méningoencépha-lites amibiennes d’évolution favorable aient pu être en réalité dus à P. francinae [42].

7. Amibes et micro-organismes

pathogènes

Les amibes libres sont décrites comme des réservoirs potentiels de bactéries pathogènes dans l’environne-ment, en lien avec des biofilms complexes composés de nombreux microorganismes, ce qui représente un risque potentiel pour la santé [43, 44]. Ces protozoaires se nourrissent de bactéries par phagocytose, ce qui entraîne normalement une digestion de ces dernières. Cependant, certaines d’entre elles sont capables de résister à cette digestion et même parfois – c’est le cas pour Legionella pneumophila – d’utiliser les amibes comme site de multi-plication [1]. La phagocytose amibienne étant similaire à la phagocytose par certaines cellules du système immu-nitaire comme les macrophages [45], les bactéries résis-tantes aux amibes sont ainsi potentiellement résistantes aux macrophages. Les amibes ont donc été décrites non seulement comme un réservoir mais aussi comme un « terrain d’entraînement » pour des bactéries pathogènes secondairement capables d’infecter l’homme [46].La phagocytose amibienne comprend différentes étapes : 1) entrée de la bactérie et formation d’une vésicule intra-amibienne nommée phagosome ; 2) maturation du pha-gosome et production de molécules antimicrobiennes (molécules oxydantes dérivées de l’oxygène ou de l’azote, diminution du pH) ; 3) formation du phagolysosome par fusion du phagosome avec le lysosome qui contient de nombreuses enzymes de dégradation (protéases, nucléases, lysozyme…) permettant la digestion des microorganismes.Les bactéries ont mis en place plusieurs mécanismes pour résister à la phagocytose [47-49] : i) certaines bactéries, comme Yersinia, capables d’inhiber la phagocytose,


cellulaires de l’amibe, la phagocytose va ainsi être détour-née et les phagosomes seront transformés en vésicules de réplication dans lesquelles L. pneumophila trouvera un environnement favorable à sa multiplication [57]. Cette bactérie modifie également l’autophagie et l’apoptose, et il a été montré récemment qu’elle provoquait des modifications épigénétiques sur le génome [58]. Il est important de souligner que les amibes semblent être le site principal de multiplication de L. pneumophila dans l’environnement. Les amibes sont donc un réservoir de bactéries mais représentent aussi pour elles un véhicule et une protection contre les conditions extracellulaires hostiles.Concernant Listeria monocytogenes les résultats sont peu nombreux et contradictoires. Certains auteurs ont montré que cette bactérie pouvait résister à la digestion ami-bienne [59] alors que d’autres suggèrent le contraire [60]. Une étude récente a confirmé que L. monocytogenes n’était pas capable de survivre dans les amibes mais était accumulée dans une sorte d’agrégat extracellulaire qui sera ensuite phagocyté par l’amibe, conduisant à la digestion de la bactérie [61].Coxiella burnetii, quant à elle, est capable de survivre et de se multiplier dans les macrophages malgré une maturation des phagosomes (diminution de pH…) et une fusion avec les lysosomes [62]. La bactérie possède un système de sécrétion de type IV similaire à celui de L. pneumophila. Elle va interagir, notamment grâce aux effecteurs produits par ce système de sécrétion, avec les mécanismes d’autophagie et d’apoptose. Cette bactérie est également capable de survivre à la phagocytose par les amibes [63].Il faut souligner que les amibes semblent également être un lieu propice aux échanges génétiques entre les bac-téries qui s’y trouvent [64] et même entre les bactéries et l’amibe [65], échanges particulièrement documentés pour L. pneumophila dans laquelle de nombreux gènes eucaryotes ont été retrouvés, probablement utiles à la bactérie pour influer sur la biologie de son hôte.Les amibes sont également capables de protéger les bactéries intracellulaires contre différents traitements. Évidemment la barrière physique qu’elles représentent limite l’atteinte bactérienne, comme cela a été montré pour L. pneumophila avec un traitement biocide et antibiotique [66, 67]. Il est clair que si des bactéries sont présentes dans les kystes amibiens, comme notre équipe l’a montré pour A. castellanii et Acinetobacter baumanii [68] (figure 10), elles seront encore mieux protégées, le kyste étant une forme amibienne plus résistante aux traitements que les trophozoïtes. Les formes kystiques seraient donc impor-tantes pour la survie et la dissémination des bactéries bien que leur impact dans l’environnement ne soit pas véritablement établi. Ainsi les amibes, par leur présence au sein de différents types d’eaux utilisées pour les soins, pourraient avoir une responsabilité dans un certain nombre d’infections bactériennes nosocomiales.Outre les bactéries, il a été démontré que les amibes libres ont des relations privilégiées avec des champignons, en particulier des levures. L’exemple de Cryptococcus neoformans est particulièrement intéressant. Dès 2001, Steenbergen et al. émettent l’hypothèse, au vu des

ne sont pas internalisées ; ii) d’autres, comme Mycobacterium tuberculosis, agissent sur la maturation du phagosome afin d’éviter ou de limiter la production de molécules antimicrobiennes ; iii) d’autres encore, comme Liste-ria monocytogenes, vont sortir du phagosome et se retrouver dans le cytoplasme de la cellule phagocytaire ; iv) L. pneumophila, par exemple, va détourner la matura-tion du phagosome et transformer cette vésicule en site favorable pour sa multiplication ; v) Coxiella burnetii et d’autres bactéries semblent enfin capables de résister aux conditions défavorables trouvées dans les phago-somes ou même les phagolysosomes. Les mécanismes moléculaires conduisant à cette résistance ont été bien décrits pour les différentes bactéries citées précédemment.Les bactéries résistantes aux amibes sont collectivement appelées ARB pour « Amoebae resistant bacteria », terme proposé par Greub et Raoult dans une revue faisant le point des connaissances sur le sujet et publiée en 2004, dans laquelle L. pneumophila, Pseudomonas, Parachlamydia et Mycobacterium étaient répertoriées. D’autres bacté-ries, principalement retrouvées dans l’eau, ont depuis été décrites comme potentiellement résistantes aux amibes, retrouvées également en milieu hydrique [44, 50]. Enfin, il faut souligner que les bactéries résistantes aux amibes deviennent plus virulentes car les caractères mis en place pour cette résistance favorisent ensuite leur virulence envers les macrophages humains.Plusieurs espèces du genre Mycobacterium sont poten-tiellement résistantes aux amibes, M. leprae étant la première décrite, mais plusieurs autres espèces, dont M. tuberculosis et M. avium, ont montré un comporte-ment similaire [51]. Les mycobactéries inhibent la matu-ration du phagosome en agissant sur son acidification comme l’ont démontré des études menées chez l’amibe Dictyostelium et dans certains cas, elles peuvent même sortir du phagosome et se développer dans le cytosol. Un système permettant l’éjection de M. tuberculosis et M. marinum hors de la cellule de Dictyostelium a par ail-leurs été mis en évidence [52]. Une étude récente montre que M. marinum se comporte de façon similaire avec Acanthamoeba et avec les macrophages, la polymérisation de l’actine intracellulaire permettant le déplacement de cette bactérie dans le cytosol [53]. Quelques publications suggèrent même que certaines souches de mycobacté-ries sont capables d’une multiplication intra-amibienne [54]. Enfin, l’interaction entre mycobactéries et amibes semble là aussi renforcer la pathogénicité bactérienne [55]. De plus, en fonction des souches et des espèces, la présence des mycobactéries peut induire ou non une lyse amibienne.L. pneumophila est l’archétype de la bactérie capable de se multiplier dans les amibes. Leur interaction a été décrite pour la première fois par Rowbotham en 1980 [56], quelques années après l’identification de cette bac-térie comme agent responsable d’une pneumopathie, la légionellose. Dans cette étude, il a été montré que L. pneumophila était capable de se multiplier dans des vésicules à l’intérieur d’amibes du genre Acanthamoeba et Naegleria, cette bactérie étant néanmoins capable d’infec-ter d’autres amibes et d’autres protozoaires. La bactérie sécrète des protéines qui vont modifier les fonctions



à des cultures d’amibes, ont ensuite été décrits, comme le Mamavirus, le Marseillevirus ou le Lausannevirus, certains accompagnés d’un virophage. Mimivirus est phagocyté par les amibes, ce qui est un mode de pénétration intracellulaire très inhabituel pour les virus. L’amibe est secondairement lysée et libère les virions dans le milieu extérieur [74]. Très récemment, le premier Mimivirus a été mis en évidence chez un homme souffrant d’une pneumonie [75].

8. Conclusion

L’intérêt porté aux amibes libres dépasse ainsi largement le champ des pathologies dont elles sont directement responsables. Heureusement rarissimes lorsqu’il s’agit de méningo-encéphalites à N. fowleri, elles sont plus fréquem-ment retrouvées dans le cas de kératites à Acanthamoeba dont la prévention pourrait être facilitée par des conseils simples d’entretien à l’usage des porteurs de lentilles cor-néennes. Il est plus difficile de mesurer l’impact sur la santé publique de la présence de ces amibes lorsqu’elles jouent le rôle de réservoirs et/ou de vecteurs de bactéries (ou de virus) pathogènes, comme dans le cas de L. pneumophila. De la même manière que certaines d’entre elles ont été particulièrement étudiées en tant que modèles pour com-prendre la mobilité, la différenciation cellulaire ou la simili-tude de leur comportement avec celui des macrophages, l’approfondissement des connaissances de leurs relations avec les autres micro-organismes, tant sur le plan cellulaire que moléculaire, reste indispensable.

RemerciementsLes auteurs tiennent à remercier pour les images, Mmes Béatrice Hernandez et Nathalie Quellard, de l’Unité de pathologie ultrastructurale et expéri-mentale du Laboratoire d’anatomie et cytologie pathologiques au CHU de Poitiers.

Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de

conflits d’intérêts en relation avec cet article.

Figure 10 – Kyste d’Acanthamoeba castellanii au microscope électronique à transmission.

On remarque (flèches) des bactéries groupées (Acinetobacter baumanii) entre l’endokyste et l’ectokyste.

Figure 11 – Trophozoïte d’Hartmanella vermiformis

au microscope électronique à transmission.

Les flèches indiquent des blastospores de Candida albicans internalisées.

résultats de la mise en coculture de cette levure avec A. castellanii, que la virulence de C. neoformans pour cer-taines cellules de mammifères serait la conséquence de l’adaptation fongique aux prédateurs environnementaux [69]. D’autres auteurs [70] ont également montré que les amibes libres internalisent la levure, cette dernière étant capable d’exocytose sans lyse de l’amibe. Notre équipe s’est quant à elle intéressée aux relations amibes-Candida dans le cadre d’infections liées aux soins dentaires, car des amibes libres et différents pathogènes potentiels peuvent être retrouvés dans l’eau des units de soins den-taires. L’amibe H. vermiformis (Vermamoeba vermiformis) est capable d’ingérer des blastospores de C. albicans (figure 11) et d’augmenter la croissance fongique dans l’eau du robinet [5]. Certains auteurs ont également montré l’influence positive de ces protozoaires sur des champi-gnons filamenteux [71].Les amibes libres peuvent également être des réservoirs de virus. Une étude récente a montré que des amibes du genre Acanthamoeba jouent un rôle dans la dispersion et le transport d’adénovirus [72]. Enfin, c’est à l’intérieur de ces amibes qu’une équipe française a découvert il y a une dizaine d’années un virus qualifié de « géant » [73], d’une taille de 400 nm et alors dénommé Mimivirus pour mimicking microbe puisqu’il est – au moins par sa taille – proche d’une bactérie. D’autres virus proches, isolés grâce


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les amibes libres: un danger méconnu

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