lezione 2-3 13/x/06
DESCRIPTION
Lezione 2-3 13/X/06. La doppia elica: orientamento dei due filamenti 5’-3’ DNA pol i cromatidi da cosa sono costituiti ? quale è il verso di trascrizione della RNA pol II “coding strand”* = filamento trascritto = mRNA * non è il templato - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Lezione 2-3 13/X/06
Cosa dobbiamo sapere
La doppia elica: orientamento dei due filamenti 5’-3’ DNA poli cromatidi da cosa sono costituiti ?
quale è il verso di trascrizione della RNA pol II“coding strand”* = filamento trascritto = mRNA * non è il templato
cDNA (DNA complementare al messaggero)
da distinguere dalla Coding Sequence a volte confusa col cDNA
La sequenza codificante corrisponde all’ RNA messaggero contiene i codoni che vengono tradotti
Trascrizione e complemetarietà
In banca dati la sequenza di un gene è indicata nel versodi trascrizione e corrisponde alla coding sequenceche è uguale al messaggero (salvo T U)Le sequenze per convenzione si scricvono sempre 5’3’ salvo quando si mostra una doppia elica in cui c’è la complementare che è antiparallela
Trascrizione orientamento e versoLa sequenza “coding” non è il templato
SBAGLIATO
Quale strand è trascritto? che verso ha ?
Rna polimerasi II
DNA templato della trascrizione Tutte le pol sintetizzani 5’-3’ su un templato 3’- 5’ antiparallelo
schema giusto
Cosa è un Southern blotDNA digerito con enzimi di restrizione - trasferito su filtro- Ibridato con una sonda marcata di DNA a doppio filamento denaturato o con singolo filamento
Studio di mappe di restrizione genomiche per individuare i frammenti di restrizione che contengono una data porzione di DNA o un frammento di un gene,
Studio di un gene a partire da un cDNA
Gel BrEt x Southern
Foto SouthernA: Genomic P1 clone (0.3 ug) and B: human genomic DNA (10 ug) were digested with EcoRI (E), BamHI (B), HindIII (H) and PstI (P). The digested samples were separated on a 1% agarose TBE gel, blotted and hybridized with a PEDF cDNA probe. A 1 kb ladder is given to show relative sizes of the hybridizing bands. The figure shows similarities in restriction pattern between the genomic DNA and the P1 clone.
Cosa si analizza con un Northern blot La trascrizione cellulare
Foto Northern (lattato deidrogenasi)
Le sonde (probes)
Sonde a DNA doppio o singolo filamento anche ad RNA**
Sonde clonate o amplificate
Plasmidi con promotore di trascrizione Sp6**
Sonde marcate (32 P) o fluorescenti
Southern o Northern tipi di sonde uguali
Per Northern uso di sequenze trascritte
Dall’espressione al genomae viceversa
Con le sonde dei cDNA al genoma (mappa e regioni non trascritte)
Con le sonde genomiche ricerca di geni
Uso dei marcatoriRicerche di tutte le sequenze trascritte come marcatori
Da sequenze ripetute mappature cromosomiche
Struttura e regolazione dei geni
Perché i geni sono regolati
Meccanismi di regolazione dei geni
Differenze tra procarioti ed eucarioti
Differenti strutture regolative analizzate con geni reporter e utilizzate all’interno di plasmidi
e vettori per espressione
Dovete sapere come è strutturato un gene, differenze tra procarioti ed eucarioti, geni costitutivi e “house keeping”, geni inducibili, regolati e tessuto specifici. (corso di bio molec.)
Che vuol dire clonare a che serve come si fa
I cloni in microbiologia o genetica dei microoranismi
I colonia (clone) deriva dalle mitosi di una singola cellulae contiene qualche centinaio di migliaia di cellule
Cloni di cellule eucariotiche
Esperimenti olistici (≠ progr. euristici autoincr.)
Phenotypic alteration of eukaryotic cells using randomized libraries of artificial transcription factors Nature Biotechnology 21, 1208 - 1214 (2003)Published online: 7 September 2003; | doi:10.1038/nbt868Kyung-Soon Park1, 2, Dong-ki Lee1, 2, Horim Lee1, Yangsoon Lee1, Young-Soon Jang1, Yong Ha Kim1, Hyo-Young Yang1, Sung-Il Lee1, Wongi Seol1 & Jin-Soo Kim1Correspondence should be addressed to Jin-Soo Kim [email protected]
We have developed a method in which randomized libraries of zinc finger−containing artificial transcription factors are used to induce phenotypic variations in yeast and mammalian cells. By linking multiple zinc-finger domains together, we constructed more than 100,000 zinc-finger proteins with diverse DNA-binding specificities and fused each of them to either a transcription activation or repression domain. The resulting transcriptional regulatory proteins were expressed individually in cells, and the transfected cells were screened for various phenotypic changes, such as drug resistance, thermotolerance or osmotolerance in yeast, and differentiation in mammalian cells. Genes associated with the selected phenotypes were also identified. Our results show that randomized libraries of artificial transcription factors are useful tools for functional genomics and phenotypic engineering.
Clonaggio come manipolazione di DNA
Clonaggio : plasmidi enzimi di restrizione
Clonaggio perché i cloni sono isogenici e se contengono un plasmide si moltiplica con le cellule
Le cellule trasfettate col plasmide si clonano
Strategia e metodo di clonaggio
Extraction of Viral RNA and Conversion to DNA
RNA
Reverse Transcription
DNA
Cloning a Gene into a Plasmid
PCR
DNA encodinggene of interest
Cloning
pl plasmid
Amplificazione tramite PCR
Gene codificante di interesse
clonaggio
Plasmide di espressione
Growth and Purification of Plasmids
Plasmid growthin bacteria Purification of
plasmid
ExtractionTransfectiontrasfezione
crescita batterica col plasmidetramite selezione
estrazione del DNA
Purificazione del plasmide
Recombinant DNA Technology and Vaccine Development
CHO, yeast,or insect cells
In vitro antigenproduction
In vivoantigen
production
Vaccine vector
Cellule eucariotiche
produzione dell’antigeneIn vitro
vettorecol vaccino
Produzione dell’antigene in vivo