légúti infekciót okozó baktériumok terápiás hatékonyságot...
TRANSCRIPT
Légúti infekciót okozó baktériumok terápiás hatékonyságot befolyásoló rezisztenciáinak és
rezisztencia mechanizmusainak vizsgálata
Doktori (PhD) értekezés tézisei
Dr. Hajdú Edit
Témavezetők: Dr. Nagy Erzsébet Dr. Vágvölgyi Csaba
Szegedi Tudományegyetem Biológia Doktori Iskola Vezető: Prof. Dr. Maróy Péter
Szegedi Tudományegyetem Szent-Györgyi Albert Orvos és Gyógyszerésztudományi
Centrum Általános Orvostudományi Kar
Klinikai Mikrobiológiai Diagnosztikai Intézet
Szeged
2007
2/24
3/24
BEVEZETÉS A baktériumok okozta légúti fertőzések az infekciózus kórképek között a
legnagyobb számban fordulnak elő. Kezelésük sokszor jelent terápiás nehézséget,
mert a különböző típusú rezisztencia mechanizmusok révén a légúti infekcióban
szerepet játszó baktériumok egyre több antibiotikum hatásával szemben válnak
ellenállóvá.
A Streptococcus pneumoniae törzsek tok polysacharid antigén alapján 90
különböző szerotípusba sorolhatók. Az egyes szerotípusokkal szemben termelődött
specifikus ellenanyag véd az azonos szerotípusú tok polysachariddal rendelkező
baktérium által okozott invazív infekciótól. A kifejlesztett védőoltásoknak ez az
alapja.
A S. pneumoniae korábban 100%-ban érzékeny volt penicillinre. A
penicillin célmolekulája a baktérium citoplazma membránjában elhelyezkedő fehérje
– penicillin binding protein (PBP) -, amely transzpeptidáz, transzglikoláz működése
révén a sejtfal peptidoglikán szintézisében játszik szerepet. A penicillin
irreverzibilisen kötődik a PBP-ekhez, ezáltal inaktiválja azokat. A PBP-k szintézisét
mozaik gének irányítják, így a változás mértékétől függően létrejöhet alacsonyabb és
magasabb szintű penicillin, valamint amoxicillin és 3. generációs cefalosporinokkal
szembeni rezisztencia. A pneumococcus okozta infekciókban ma már nem a
penicillin-G az első választandó antibiotikum, de in vitro nagyon jól reprezentálja a
béta-laktám antibiotikumokkal szembeni érzékenységet. Az egészséges emberek közel
50%-a tünetmentesen hordozza a baktériumot a nasopharynxban, elsősorban
kisgyermek korban. A vírusfertőzés fokozza a baktérium kötődését a légúti hámhoz.
A nasopharynxból a baktérium a belélegzett levegővel az alveolusokba kerül, ahol
tova terjed és gyulladást okoz. Az alsó légúti infekciók, elsősorban a közösségben
szerzett pneumónia leggyakoribb kórokozója még ma is a S. pneumoniae. Amerikai
felmérések szerint a pneumococcus fertőzések miatt elhunytak fele megmenthető
volna a pneumococcus ellenes vakcinák széleskörű alkalmazásával. Számos európai
ország, így hazánk is, kidolgozta a saját vakcinációs politikáját a pneumococcus
fertőzések megelőzésére.
Lélegeztetett és cysticus fibrosisban (CF) szenvedő betegeknél a
Pseudomonas aeruginosa okozta pneumónia kialakulásában meghatározó szerepe van
a baktérium biofilm képző tulajdonságának. Az antibakteriális gyógyszerek a
szervezet saját védekező mechanizmusa nélkül nem képesek fellépni a kórokozók
ellen. A biofilm mögé bújt baktériumok gyakran még a fagocitákkal szemben is
4/24
ellenállóak. A kezelés hatékonyságának biztosításához szükséges a biofilm képzés
csökkentése, vagy a biofilm roncsolása. Egyes makrolid antibiotikumok bizonyítottan
hatékonyak a pseudomonasok alginát produkciójának visszaszorításában, amelyet
kiegészítő kezelésként alkalmaznak a CF-es betegek kezelésében. A multirezisztens
törzsek okozta infekciók kezelése sokszor megoldhatatlannak látszó feladat.
A Klebsiella pneumoniae, az Enterobacter aerogenes és Enterobacter
cloacae, az Escherichia coli, a Serratia marcescens és a Pseudomonas aeruginosa a
leggyakrabban kórházi eredetű pneumóniát okozó Gram-negatív baktériumok. A béta-
laktám antibiotikumok túlzott használatával egyre gyakrabban izolálnak klinikai
mintákból széles spektrumú béta-laktamázt termelő törzseket. A súlyos infekciók
mortalitása igen magas, 50-100% között van, ezért igen fontos ismerni adott esetben a
terápiás lehetőségeket, az egyes osztályokon az ott infekciót okozó baktériumok
pontos spektrumát és antibiotikum rezisztenciáját.
CÉLKIT ŰZÉSEK
1. Munkánk egyik célja az Intézetünkben 1997-2005 között izolált S. pneumoniae
törzsek rezisztencia adatainak elemzése volt korcsoportonként, mintánként, járó-
és fekvőbetegek szerint. A tünetmentes óvodások pneumococcus
orrhordozásáról adatokat kívántunk gyűjteni. Választ kerestünk arra, hogy az
Intézetünkben random gyűjtött S. pneumoniae törzsek szerotípusa milyen
arányban esik egybe a hazánkban forgalomban lévő pneumococcus elleni
védőoltásokban található szerotípusokkal, így a védőoltás alkalmazása várhatóan
milyen hatékonyságot eredményezhet. A penicillinre magas rezisztenciát mutató
törzseknél vizsgáltuk egy új, orális 3. generációs cefalosporin, a cefditoren-
pivoxil hatékonyságát, mint a penicillinre rezisztens pneumococcusok által
okozott fertőzések egyik potenciális kezelési alternatíváját.
2. Célunk volt vizsgálni és követni a cysticus fibrosisban (CF) szenvedő betegek
légutait kolonizáló ismert patogén baktériumok előfordulási arányát a Szegedi
Gyermekkórház Cystás Fibrosis Ambulanciáján gondozott betegeknél 1999-
2001 között. Olyan könnyen alkalmazható detektáló rendszert kívántunk
beállítani, amellyel a cysticus fibrosisos betegek légúti mintáiból izolált P.
aeruginosa törzsek biofilm képzését, továbbá a baktériumok tenyészetében in
vitro körülmények között a makrolid antibiotikumok biofilm képzést csökkentő
hatását mérni tudjuk.
5/24
3. Az SZTE ÁOK Belgyógyászati Intenzív Osztályán alsó légúti infekció miatt
kezelt betegek különböző módon vett mintáiból kitenyészett baktériumok
egyezőségét vizsgáltuk az optimális mintavételi mód meghatározása céljából. A
nozokómiális alsó légúti infekciókból származó mintákban az
Enterobacteriaceae családba tartozó Gram-negatív baktériumok, valamint
ugyanezen esetekben a széles spektrumú béta-laktamáz termelés előfordulási
arányát kívántuk meghatározni.
4. A Gram-negatív légúti patogén baktériumok multirezisztens törzseivel szemben
potenciálisan hatékony, szinergista antibiotikum kombináció lehetséges
alkalmazása céljából vizsgáltuk különböző módszerekkel a béta-laktám/béta-
laktamáz gátló, béta-laktám/fluorokinolon, béta-laktám/aminoglikozid
antibiotikumok együttes hatását.
5. A potenciálisan légúti patogén Gram-negatív baktériumok rezisztencia
mechanizmusait kívántuk tanulmányozni hagyományos és molekuláris
módszerekkel.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
Baktérium törzsek
A 35 tünetmentesen hordozott S. pneumoniae törzs 3-6 éves óvodás gyermekek
nasopharyngeális mintáiból származott, 93 törzset korábban a Heim Pál Kórház
betegeinek mintáiból izoláltak. A többi vizsgált S. pneumoniae törzset különböző
tünetekkel rendelkező betegek felső és alsó légúti mintáiból, hemokultúrából,
liquorból, mellűri punktátumából tenyésztettük ki Intézetünkben.
A vizsgált Gram-negatív pálcák közül a P. aeruginosa törzsek cysticus
fibrosisban szenvedő gyermekek felső és alsó légúti mintáiból származtak, a K.
pneumoniae, E. aerogenes, E. cloacae, S. marcescens törzsek klinikai izolátumok
voltak, melyeket elsősorban alsó légúti mintákból tenyésztettünk ki.
Mintavételi módszerek
A tünetmentes óvodások surveillance vizsgálata során nasopharynxból származó
mintákat, a CF-es betegek esetében torokváladék és köpet mintákat tenyésztettünk. Az
alsó légúti minták közül a köpetet előzetes citológiai megfelelés után (>25 fehérvérsejt
és <10 laphámsejt/látótér 100x-os nagyítással vizsgálva legalább 40 látóteret)
dolgoztuk fel. A lélegeztetett betegek trachea váladékát citológiai vizsgálat
eredményével is kiegészítettük. A szignifikáns baktériumszám >105 telepképző
6/24
egység/ml (colony forming unit-CFU/ml). A lélegeztetett betegekből származó védett
bronchoalveolaris lavage minta esetén a szignifikáns baktériumszám >103 CFU/ml.
Kis számban származtak a baktériumok pleurális punktátumból és hemokultúrából is.
A Streptococcus pneumoniae törzsek szerotipizálása
A S. pneumoniae törzseket specifikus antiszérumok alkalmazásával, agglutinációs
módszerrel (Mast Group Ltd. Bootle UK) szerotipizáltuk a gyártó utasításainak
megfelelően.
Antibiotikumokkal szembeni rezisztencia meghatározások
Az antibiotikum érzékenységet rutinszerűen korondiffúziós módszerrel vizsgáltuk. A
minimális gátló koncentrációt (minimum inhibitory concentration – MIC) egyrészt E-
teszttel (AB Biodisk), másrészt agardilúciós módszerrel, valamint mikroleves
hígítással határoztuk meg.
Antibiotikum rezisztencia mechanizmusok vizsgálata
A béta-laktamáz termelést nitrocefin tartalmú koronggal (Difco) mutattuk ki. A béta-
laktamáz termelő törzsek szubsztrát profiljának meghatározását mikrokolorimetriás
módszerrel, Escamilla szerint végeztük. Az enzim indukciós vizsgálatokhoz
korongdiffúziós módszert alkalmaztunk. Indukáló antibiotikumok: cefoxitin,
imipenem. Indikátor antibiotikumok: cefuroxim, cefoperazon, cefotaxim, ceftazidim. A
széles spektrumú béta-laktamáz (extended spectrum beta-lactamase-ESBL) termelés
korongdiffúzióval történő kimutatásához egyrészt két korongot (screening) (ceftazidim
és amoxicillin/klavulánsav), másrészt öt korongot (ceftazidim, cefotaxim, aztreonam,
cefepim és amoxicillin/klavulánsav) alkalmaztunk Jarlier és munkatársai szerint. Az
ESBL termelés E-teszttel való kimutatása során ceftazidim/ceftazidim-klavulánsav,
vagy cefotaxim/cefotaxim-klavulánsav tartalmú E-teszteket alkalmaztunk. Az ESBL
termelés molekuláris szinten történő vizsgálatához a K. pneumoniae, E. cloacae és S.
marcescens törzsekből a plazmid DNS-t Magic Miniprep DNA Purification Kittel
(Promega, Medison, WI) extraháltuk. Az elektroforézist 0, 7%-os agaróz gélen
végeztük, a gélt ethidium bromiddal festettük. A plazmid DNS TEM és SHV génjeit
TEM és SHV specifikus primerekkel amplifikáltuk. Az SHV gének egyes típusainak
elkülönítésére SSCP (single-stranded conformation polymorphism) analízist
alkalmaztunk. Az amplifikált terméket PstI enzimmel emésztettük, majd polyacrylamid
7/24
gélen szeparáltuk ismert SHV gén standardokkal együtt. Az ssDNS fragmenteket ezüst
nitráttal festettük.
Szinergizmus vizsgálatok
A cefoperazon - béta-laktamáz gátló (szulbaktám, klavulánsav) kombinációkat Lorian
leírása szerint chequerboard titrálással vizsgáltuk 96 lyukú Takátsi-féle mikrotitráló
lemezben. A kombináció nélküli és a kombinációban mért MIC értékekből kiszámoltuk
a frakcionális gátló koncentráció (fractional inhibitory concentration - FIC) indexet,
majd a kapott eredményt értékeltük. Az „ölési görbe” (killing curve) módszerrel a
cefoperazon 1xMIC, 2xMIC értékének megfelelő koncentrációjának a hatását önállóan,
valamint 1 mg/l klavulánsavval, 1mg/l ill. 16 mg/l szulbaktámmal kombinálva
vizsgáltuk. A tenyészeteket Ehrlen-Mayer lombikban rázatva inkubáltuk 37oC-on,
normál atmoszférán. Csíraszám meghatározást végeztünk minden tenyészetből 6 és 24
óra múlva. A kapott ml-kénti csíraszámok 10-es alapú logaritmusát az idő
függvényében ábrázoltuk. Az E-teszttel végzett szinergizmus vizsgálatok esetében a
vizsgált baktériumok friss tenyészetéből 0,5 McFarland sűrűségű szuszpenzióval
baktérium szőnyeget készítettünk. A Mueller-Hinton agar lemezre először a
kombináció „A” tagját, majd 30 perc elteltével az „A” csíkot eltávolítva a „B” tagot
tettük fel. Egy másik lemezen az antibiotikum csíkokat fordított sorrendben helyeztük
fel. A lemezeket 16-24 óráig 37oC-on, normál atmoszférán inkubáltuk. Az
antibiotikumok MIC értékét külön-külön és kombinációban is meghatároztuk. Az
egyedi és a kombinációban alkalmazott antibiotikumok esetén meghatároztuk a FIC
indexet és értékeltük a kombinációk hatását.
Biofilm termelés vizsgálat
A CF-es gyermekek légúti mintáiból izolált, vizuálisan is mucoid P. aeruginosa
törzsek biofilm termelését mértük Enzym-Linked Lectinsorbent Assay (ELLA)
módszerrel Leriche leírása szerint. A jól detektálhatóan biofilmet termelő törzseknél
vizsgáltuk a biofilm termelés gátlását clarithromycin hozzáadásával. Ennél a
vizsgálatnál Leriche módszerét úgy módosítottuk, hogy a tápfolyadékban
clarithromycint oldottunk 50, 100, 200, 300, 400 mg/l végső clarithromycin
koncentrációt létrehozva. A naponkénti tápfolyadék csere után peroxidázzal jelölt
lektint mértünk a kitapadt baktériumokra, majd meghatároztuk a biofilm termelés
változását ELLA módszerrel a kezeletlen törzshöz viszonyítva.
8/24
Direkt E-tesz vizsgálat CF-es betegek köpetmintáinak primer tenyészetén
A romló klinikai állapotú CF-es betegek köpetéből cytológiai vizsgálatot és mucolizist
követően 100 µl-nyi mintát véres agar táptalajra plétoltunk, majd antipseudomonas
hatású antibiotikumokat tartalmazó E teszteket helyeztünk fel. A lemezeket 16-24
órán át inkubáltuk 37 oC-on, normál atmoszférán. Vizsgáltuk a kísérő garatflóra
érzékenységét az antibiotikumokkal szemben, valamint a különböző MIC értékkel
bíró P. aeruginosa telepek és egyéb, multirezisztens baktériumok jelenlétét.
Antibiotikum fogyás meghatározása
1998 és 2005 között vizsgáltuk a béta-laktám antibiotikumok [anatómiai-kémiai–
terápiás - Anatomical - Therapeutic - Chemical (ATC) kódja: J01C] és a makrolid,
linkózamid [J01F] csoportba tartozó antibiotikumok fogyását Csongrád megyében és
országosan. Az éves antibiotikum felhasználási adatok forrása az IMS PharmMIS
adatbázis nagykereskedelmi eladásai voltak. Az antibiotikumok csoportosítása és
fogyasztásuk kalkulálása az egészségügyi világszervezet ATC–DDD (Defined Daily
Dose - átlagos napi dózis) indexének 2005-ös verziója alapján történt. A népességi
adataink a Központi Statisztikai Hivatal adatbázisából származtak. Az antibiotikum
fogyásnak a S. pneumoniae törzsek penicillinekkel és makrolidokkal szembeni
rezisztenciára való hatásának megítéléséhez csak az antibiotikumok per os formuláit
elemeztük. Az országos és a helyi (Csongrád megye) antibiotikum fogyási adatokat
DDD/1000 lakos/napban adtuk meg.
Az adatok statisztikai elemzése
A rezisztencia adatokat a laboratóriumunk informatikai rendszeréből gyűjtöttük. Egy
betegtől egy izolátum adatait vettük figyelembe. A vizsgált időszakokban a járó- és
fekvőbetegek mintáiból, valamint a 14 év alatti és feletti betegek mintáiból izolált
S. pneumoniae törzsek adatainak elemzésére Khi-négyzet és Fisher féle egzakt próbát
alkalmaztunk az SPSS program csomag segítségével (verzió 13.0). A statisztikai
elemzés során a p<0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak.
EREDMÉNYEK
1. Streptococcus pneumoniae törzsek vizsgálata során kapott eredményeink
Az 1990-es években különböző közleményekben ellentmondásos adatok
jelentek meg a hazai S. pneumoniae törzsek penicillin rezisztenciájának mértékéről.
Intézetünkben 1997-2005 között izolált S. pneumoniae törzsek penicillin, amoxicillin,
9/24
ceftriaxon, erythromycin és clindamycin rezisztencia arányát vizsgáltuk. Az
antibiotikum rezisztencia vizsgálatokat minden esetben az NCCLS/CLSI ajánlásainak
megfelelően végeztük. A saját eredményeink szerint a penicillin rezisztens törzsek
aránya 2002-ig jóval alatta maradt az országos adatoknak, melynek okát abban látjuk,
hogy nem minden magyarországi mikrobiológiai laboratórium követte szigorúan a
szakmai ajánlásokat, így a penicillin rezisztens törzsek aránya jóval magasabb volt a
ténylegesnél.
Más szempontok szerinti adatelemzésünk során két periódusra bontottuk a
vizsgált időszakot: 1998-2001, 2002-2005. A gyermekek mintáiból izolált törzsek
száma a második periódusban jelentősen emelkedett. Ennek oka egyrészt a házi
gyermekorvosok egyre nagyobb számú mintabeküldése, másrészt az egészségügyi
intézményekben történt átszervezés, amely során egyre több mintát kaptunk az
alapellátáshoz közeli területekről. A vizsgált 8 éves időszak alatt 2670 S. pneumoniae
törzset izoláltunk (1267 törzs fekvőbetegektől, 1403 járóbetegektől). A 0-2 éves
korcsoportban a vizsgált mindkét időszakban, mind járó- mind fekvőbetegek esetében
a penicillin rezisztens S. pneumoniae törzsek aránya jelentősen csökkent (20%-ról
4%-ra és 21%-ról 2%-ra). Azonos tendencia figyelhető meg a 3-14 éves gyermekek
mintáiból izolált törzsek esetében is. A felnőtt betegek mintáiból izolált S.
pneumoniae törzsek között igen alacsony volt a penicillin rezisztens törzsek aránya
mindkét időszakban (8,7% és 2,5%). Az amoxicillin rezisztens és mérsékelten
érzékeny, valamint a ceftriaxonra rezisztens törzsek előfordulási aránya egyaránt
nagyon alacsony volt. A vizsgált teljes időperiódusban az izolált erythromycin és a
clindamycin rezisztens S. pneumoniae törzsek aránya folyamatosan magas volt.
A penicillinek fogyása (J01C) Magyarországon viszonylag állandó volt
1998 és 2005 között (átlag ± SD: 8,45±0,51 DDD/1000 lakos/nap). A penicillinek
csoportján belül a széles spektrumú penicillinek (J01CA) fogyása csökkenő tendenciát
mutatott, míg a penicillinek béta-laktamázzal kombinált csoportjában (J01CR) a
fogyás folyamatosan emelkedett. A penicillinek csoportjának (J01C) és
alcsoportjainak (J01CA; J01CR) fogyása Csongrád megyében és országosan is azonos
tendenciát mutatott. A makrolid, linkózamid (J01F) csoport országos és megyei
fogyása emelkedett az évek során. A Csongrád megyei fogyás minden évben kissé
meghaladta az országos adatokat. A pneumococcusok rezisztencia változása nem volt
magyarázható az antibiotikum fogyás változásával.
Munkacsoportunk szerotipizált 57 - 2001. január és június között izolált -
random módon válogatott S. pneumoniae törzset. A két éves kor alatti gyermekek
10/24
mintáiból izolált törzsek (21 törzs) szerotípusa 95%-ban megegyezett az ebben a
korban alkalmazott immunogén konjugált vakcina szerotípusaival. A két évnél
idősebb páciensek mintáiból kitenyészett S. pneumoniae törzsek szerotípusa 97%-ban
volt azonos a 23 valens pneumococcus poliszacharid vakcinában található
szerotípusokkal.
Négy szegedi óvodában (kettő belvárosi, kettő külvárosi) megvizsgált 195
tünetmentes 3-6 éves gyermek közül 35 hordozott az orrában S. pneumoniae-t. 14
törzs rezisztens volt mind erythromycinre mind clindamycinre. Az egy darab
penicillin rezisztens törzs egyben rezisztens volt amoxicillinre, erythromycinre és
clindamycinre is. Figyelemre méltó, hogy a belvárosi óvodába járó, feltehetően jobb
szociális hátterű gyermekek kisebb arányban hordoztak S. pneumoniae-t, mint a
külvárosi óvodások (11% ill. 29%), de a kevésbé érzékeny törzsek aránya jóval
magasabb volt a belvárosi óvodába járó gyermekek esetében.
Egy újonnan bevezetett orális, 3. generációs cefalosporin (cefditoren-
pivoxil) hatékonyságát 93, a Heim Pál Kórház (Budapest) felső légúti infekcióban
szenvedő betegeitől származó S. pneumoniae törzspopuláción vizsgáltuk, melyek
24%-a érzékeny, 22%-a mérsékelten érzékeny és 54%-a rezisztens volt penicillinre. A
vizsgálatainkba bevontunk 35 felnőtt pneumóniás beteg mintájából izolált
pneumococcus törzset (30 köpetből, 5 hemokultúrából származott). Vizsgálataink
során a cefditoren MIC értékek a penicillin rezisztens törzseknél is igen alacsonyak
voltak. Az eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a cefditoren-pivoxil a magas
penicillin rezisztenciával rendelkező S. pneumoniae törzsek esetében hatékony
antibiotikum lehet.
2. A cysticus fibrosisos betegek mintáiból izolált Pseudomonas aeruginosa törzsek
vizsgálata során kapott eredményeink
A Szegedi Gyermekkórház Cystás Fibrosis Ambulanciáján kezelt 24 beteg
alsó és felső légúti mintáiból izolált potenciális patogén baktériumok megjelenését és
folyamatos jelenlétét vizsgáltuk és elemeztük 1999. július és 2001. június között. A
vizsgált időszakban a CF-es betegek légutaiban legnagyobb arányban P. aeruginosa
tenyészett ki egyedül vagy más patogénnel (1999-ben a betegek 38%, 2000-ben 33%,
2001-ben 36%-ánál), ami folyamatos kolonizációt, infekciós tünetek esetén a
legvalószínűbb kórokozót jelentette.
Munkánk során kísérletes modellt állítottunk fel a biofilm termelés, majd a
biofilm termelés gátlásának mérésére. A vizsgálatokba azokat a mucoid telepeket
11/24
képző P. aeruginosa törzseket vontuk be, amelyeket a CF ambulancián gondozott
gyermekek légúti mintáiból izoláltunk. Meghatároztunk egy, a baktériumok biofilm
termelésének mérésére alkalmas kísérleti rendszert: az inkubálás idejét, körülményét,
a biofilmhez legjobban kötődő szignál rendszert. Az alkalmazott kísérleti rendszerrel
jól detektálható a clarithromycin biofilm termelést gátló hatása.
A CF-es betegek kezelésének megválasztásában a biofilm ellenes
kiegészítő kezelés mellett nagyon fontos, hogy a légutakban megtelepedő, különböző
klónokba tartozó, ezért esetleg különböző antibiotikum rezisztenciával rendelkező
P. aeruginosa törzsek kimutatásra kerüljenek. Egy új tenyésztési és antibiotikum
rezisztencia vizsgálati módszert vezettünk be az akut infekciós tüneteket mutató
betegeknél a köpet bakteriológiai vizsgálatában. A mucolitikus kezelése után a mintát
közvetlenül plétoltuk véres agarra, erre antipseudomonas aktivitású antibiotikumot
tartalmazó E-teszteket helyeztünk. Ezzel a módszerrel elkülöníthettük a különböző
rezisztenciájú P. aeruginosa klónokat és a kisebb számban jelenlévő, a vizsgált
antibiotikumokra rezisztens, potenciálisan patogén baktériumtelepeket. A vizsgálattal
a terápia megválasztását is segíteni tudtuk, olyan antibiotikumot ajánlva, amely a
légutak normál flóráját nem pusztítja el, így meghagyja a természetes
védekezőképességet a kolonizáló patogénekkel szemben.
3. Alsó légúti mintákból izolált ESBL termelő Enterobacteriaceae családba
tartozó Gram-negatív baktériumok előfordulása beteganyagunkban
Az SZTE ÁOK Belgyógyászati Intenzív Osztályán 1997. július és 1999.
október között a lélegeztetett betegek kórházi pneumóniáinak trachealeszívással és
védett bronchoalveolaris lavage-al (miniBAL) vett mintáinak bakteriológiai
tenyésztési eredményeit hasonlítottuk össze. A vizsgált időszakban 63 betegnél alakult
ki kórházban szerzett pneumónia. A betegektől 95 miniBAL mintát vettek, 43 beteg
49 mintájából volt eredményes a bakteriológiai tenyésztés, összesen 66 kórokozót
mutattunk ki. A tracheaváladék és a miniBAL tenyésztések során kapott eredmények
66%-ban estek egybe. Megállapítottuk, hogy a védett bronchoalveolaris lavage
(miniBAL) mintavétel kórházi pneumoniák kórokozóinak meghatározásában nem
helyettesíthető a kevésbé eszközigényes tracheaváladék mintavétellel, mivel a hosszan
tartó kórházi kezelés alatt álló betegek felső légútjait kolonizáló baktériumok
szennyezik a nem védett eszközzel levett mintákat, így azok tenyésztése során kapott
eredmények klinikai használhatósága alacsony.
12/24
Intézetünkben az alsó légúti mintákból izolált ESBL termelő Gram-negatív
pálcák előfordulását vizsgáltuk 2002-től 2005-ig. Megállapítottuk, hogy az esetek
száma a vizsgált négy évben nem változott jelentősen, bár évenként változtak a
nagyobb arányban előforduló ESBL termelő baktérium speciesek.
4. Az antibiotikum szinergizmus vizsgálataink eredményei Gram-negatív, légúti
mintákból izolált törzsek esetében
A rutin bakteriológiai vizsgálataink során elsősorban légúti mintákból
izolált 7 E. coli és 9 K. pneumoniae törzsnél korongdiffúziós antibiotikum
rezisztencia vizsgálattal szinergén hatást tapasztaltunk a cefoperazon és az
amoxicillin/klavulánsav között. Mind a 16 törzs béta-laktamáz enzim termelőnek
bizonyult. Az ólési görbe (killing curve) és chequerboard titrálás módszerével azt
találtuk, hogy a cefoperazon/klavulánsav kombináció hatása jóval kifejezettebb és
hosszan tartóbb volt, mint a cefoperazon/szulbaktám kombinációé. Így ez az
antibiotikum kombináció is hatékony a béta-laktamáz termelő Gram-negatív
baktériumokkal szemben.
Továbbiakban 110 intenzív osztályon alsó légúti infekció miatt kezelt beteg
légúti mintáiból izolált Pseudomonas spp. törzsnél kerestünk hatékony antibiotikum
kombinációt E-teszttel vizsgálva. Harminc ciprofloxacin rezisztens, ebből 26
multirezisztens (legalább 3 antipseudomonas antibiotikum csoportra rezisztens)
pseudomonas törzset találtunk. Ezen törzsek közül 10 esetben találtuk a
ceftazidim/ciprofloxacin és a piperacillin/amikacin kombinációt szinergének, míg a
másik 7 törzs esetében a piperacillin/ciprofloxacin kombináció volt szinergista hatású
a FIC index meghatározása alapján. Vizsgálataink során gyakrabban találtunk
ciprofloxacin rezisztens törzseknél szinergista hatást: piperacillin/ciprofloxacin
(23,3%), imipenem/ciprofloxacin (16,6%) és ceftazidim/ciprofloxacin (33%). A
ciprofloxacinra mérsékelten érzékeny vagy az érzékeny törzsek között a szinergista
hatás jóval kisebb százalékban volt kimutatható. Vizsgálataink eredményei alapján
megállapítottuk, hogy a rutin laboratóriumi diagnosztikában az E-teszttel történő
szinergizmus vizsgálat gyors, jól standardizálható módszer.
5. A Gram-negatív bélbaktériumok béta-laktám típusú rezisztencia
mechanizmusainak vizsgálatával kapott eredményeink
Munkánk során 170 K. pneumoniae, 82 E. cloacae és 15 S. marcescens
klinikai izolátum béta-laktamáz enzim termelését vizsgáltuk, amelyek közül 109 törzs
13/24
(41%) hordozott valamilyen béta-laktamáz enzim gént. A nozokómiális járványból
izolált 15 S. marcescens törzs közül (12 klinikai minta, 3 környezeti minta volt) 14
törzs kétféle rezisztencia génnel is rendelkezett; kromoszómális indukálható béta
laktamáz és SHV-2 ESBL termelést meghatározó génnel. Nagy valószínűséggel a S.
marcescens az ugyanabban a betegben egyidőben jelen lévő K. pneumoniae törzsből
akvirálta az ESBL termelését meghatározó gént. Különösen a nozokomiális infekciók
esetén, amelyeket leggyakrabban a légutakon keresztül bejutó baktériumok okoznak,
számolnunk kell különböző, kromoszómális vagy plazmidon hordozott
rezisztenciával, s nem elhanyagolható az ilyen törzseknél a többszörös rezisztencia
jelenléte sem, valamint a különböző speciesek között a rezisztencia gének átjutása.
KÖVETKEZTETÉSEK
1. A S. pneumoniae, mint a közösségben szerzett penumóniának, valamint a felső
légúti infekcióknak a leggyakoribb kórokozója, súlyos, életet veszélyeztető
állapotot is okozhat. A saját retrospektív vizsgálataink alapján, amelyben 8 év
alatt izolált S. pneumoniae törzsek penicillin, amoxicillin, ceftriaxon és makrolid
rezisztencia adatait elemeztük, a penicillin rezisztencia előfordulása igen
alacsony volt (5,58%), különösen a felnőttek (4%) és az invazív mintákból
kitenyészett pneumococcusok esetében (3,8%). A penicillinre mérsékelten
érzékeny törzsek aránya a fekvőbetegek esetében 37%, a járóbetegeknél 39%
volt. Az antibiotikum rezisztencia vizsgálatokat a nemzetközileg elfogadott
ajánlások mindenkori betartásával végeztük. Ezek az adatok merőben eltértek az
1990-es években Magyarországról közölt adatoktól. A S. pneumoniae okozta
fertőzéseket leggyakrabban amoxicillinnel kezelik, amellyel szemben a
rezisztencia a saját vizsgálatainkban 2,62%-os volt. A pneumococcusok okozta
súlyos infekciók kezelésére a ceftriaxont alkalmazzák, a vele szembeni
rezisztencia arányt 1,12%-nak találtuk. Ezek az antibiotikumok a saját vizsgálati
eredményeink alapján biztonsággal alkalmazhatók a S. pneumoniae okozta
fertőzésekben. A makrolidokkal szembeni rezisztencia a vizsgált időszakban
egységesen magas volt, amiből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy
empirikusan a makrolidok a pneumococcusok okozta fertőzések kezelésére nem
alkalmasak.
14/24
A tünetmentes óvodások körében S. pneumoniae hordozást 33%-ban
találtunk, a penicillin, amoxicillin, ceftriaxon és a makrolid rezisztencia hasonló
volt, mint a klinikai mintákból izolált törzseknél.
A random módon kiválasztott, 2 év alatti gyermekek mintáiból izolált S.
pneumoniae törzsek szerotípusa 95%-ban megegyezett a konjugált
pneumococcus vakcina törzseinek szerotípusával, a 2 évnél idősebbek mintáiból
izolált törzsek szerotípusa 97%-ban volt azonos az ebben a korban javasolt
vakcinában lévő szerotípusokkal.
A vizsgálataink azt mutatták, hogy a cefditoren-pivoxil, amely egy új 3.
generációs orális cefalosporin, igen jó hatású a penicillin rezisztens és
mérsékelten érzékeny pneumococcusokkal szemben, így megfelelő alternatív
kezelési lehetőség.
2. A cysticus fibrosisos betegek légutait kolonizáló P. aeruginosa törzsek biofilm
képzésének in vitro mérésére könnyen kivitelezhető módszert vezettünk be,
amely alkalmas volt a biofilm termelés makroliddal (clarithromycin) történő
gátlásának mérésére is. Követtük a cysticus fibrosisos betegek bakteriális légúti
kolonizációjának kialakulását. Az infekciós tüneteket mutató betegeknél az alsó
légúti minta direkt E-teszttel történő vizsgálatával segítettük a leghatékonyabb
antibiotikum kiválasztását azzal, hogy a különböző antibiotikum érzékenységű
P. aeruginosa és egyéb patogén baktérium kolóniákat detektáltuk, és
meghatároztuk azt az antibiotikumot, amely nem pusztította el a normál légúti
flórát.
3. Az Enterobacteriacaea családba tartozó Gram-negatív baktériumok a
leggyakoribb kórokozói az intenzív osztályon kezelt betegek lélegeztetéssel
összefüggően kialakuló kórházi pneumóniáinak. Vizsgálataink alapján a
pneumónia kórokozóinak azonosítására intubált beteg esetében a miniBAL
mintavételi módszer sokkal alkalmasabb volt, mint a tracheaváladék. A légúti
mintákból izolált kórokozók között az ESBL termelés előfordulásának
meghatározása segíti a hatékony empírikus antibiotikum választást. A Gram-
negatív baktériumok között az ESBL termelés megjelenésével szükségessé válik
a béta-laktám antibiotikumok használatának a csökkentése. Az intenzív
osztályainkon a vizsgált időszakban az ESBL termelő baktériumok viszonylag
alacsony arányú előfordulása kedvező jelenség volt.
4. Különböző in vitro módszerek állnak rendelkezésünkre az antibiotikum
kombinációk hatásosságának vizsgálatára. A chequerboard titrálásal és az ölési
15/24
görbe módszerrel igazolni tudtuk a cefoperazon/klavulánsav kombináció
hosszan tartó és nagyobb mértékű szinergista hatását a cefoperazon/szulbaktám
kombinációval szemben. A fenti módszerek időigényesek és munkaigényesek,
így rutin laboratóriumban nem alkalmazhatók. Az antibiotikum szinergizmus
vizsgálatokra általunk újonnan bevezetett E-teszt módszer a mindennapi rutin
laboratóriumi munkában jól alkalmazható. Vizsgálataink során a nozokómiális
pneumóniát okozó multirezisztens Pseudomonas ssp-k esetében a vizsgált
antibiotikum kombinációkkal -piperacillin/ciprofloxacin,
imipenem/ciprofloxacin, ceftazidim/ciprofloxacin – jelentős számban szinergista
hatást tudtunk kimutatni. A kombináció hatékonysága alapvetően függött az
izolátumtól, az antibiotikum rezisztencia mértékétől és a kombinált
antibiotikumoktól. A multirezisztens kórokozók hatásos terápiájának
meghatározásához egyedi vizsgálatokra van szükség.
5. A béta-laktám antibiotikumokkal szembeni rezisztencia genetikai hátterének
vizsgálata igen fontos, hiszen, ha azokban az esetekben, amikor a béta-laktamáz
enzim plazmidon található, számolnunk kell ennek a rezisztencia plazmidnak az
adott osztályon belüli terjedésével is. Figyelembe kell venni azt is, hogy az
alkalmazott antibiotikum(ok) hatására mind a kromoszómán mind a plazmidon
hordozott rezisztencia gén megváltozhat, újabb típusú rezisztenciát hozva létre.
Vizsgálatainkkal a Gram-negatív baktériumok esetében az SHV és a TEM típusú
gének széleskörű elterjedtségét mutattuk ki. Igazoltuk az E. cloacae törzsek
között a kromoszómán elhelyezkedő indukálható béta-laktám enzim, valamint a
stabilan derepresszált béta-laktamáz enzim génjének együttes előfordulását.
Feltételezésünk szerint egy nozokómiálás járvány során egy SHV-2 gént
hordozó K. pneumoniae törzs átadta a rezisztencia génjét egy ClassC béta-
laktamázt termelő S. marcescens törzsnek. Mindkét törzs ugyanazon az
osztályon, ugyanabban a betegben egyidőben volt jelen.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Először is hálás köszönetemet fejezem ki témavezetőmnek és egyben
munkahelyi vezetőmnek Prof. Dr. Nagy Erzsébetnek, valamint másik
témavezetőmnek Dr. Vágvölgyi Csabának felbecsülhetetlen szakmai és emberi
segítségükért, támogatásukért, biztatásukért, bizalmukért.
Köszönöm a publikációkban szerzőtárs kollégáknak, Benkő Riának, Dr.
Blazsovszky Matildnak, Dr. Dobay Orsolyának, Dr. Fodor Eleonórának, Dr. Fogas
16/24
Jánosnak, Dr. Jeszenszky Máriának, Dr. Kóczián Zsófiának, Matuz Máriának, Mayer
Ilonának, Ordas Anitának, Dr. Prágai Zoltánnak, Dr. Rudas Lászlónak, Dr. Soós
Gyöngyvérnek, Dr. Szabó Ágnesnek, Szabó Ákosnak, Dr. Szurdi Máriának a
nagyszerű közös munkát.
Hálásan köszönöm munkatársaimnak – Dr. Urbán Edit, Dr. Terhes
Gabriella, Rátkai Csilla, Pappné Ábrók Marianna, Bjelik Annamária, Dr. Lázár
Andrea, Bönde Anita, Deák Tünde, Gáborné Hevesi Márta, Marincusné Karasz Erika,
Müller Ferencné, Nagyné Dósa Éva, Redetzky Andrea, Révészné Tóth Zsuzsanna,
Szappanos Edina – a pontos, precíz laboratóriumi munkát és a vizsgálatainkban való
részvételt.
Külön köszönöm Dr. Hulesch Helgának az irodalmazáshoz nyújtott
segítségét, és a dolgozatom végső kialakításában hasznos kritikai észrevételeit.
Köszönöm Édesanyámnak, testvéreimnek, hogy most is, mint életem
eddigi útján mindig biztattak, támogattak. Nagyon köszönöm családomnak
(férjemnek, Horváth Zoltánnak, fiaimnak, Csabának és Attilának, kislányomnak,
Andreának), hogy buzdítottak és türelemmel, megértéssel viselték, amíg sokszor
dolgozatom megírásával voltam elfoglalva.
Az óvodás gyermekek S. pneumoniae hordozásának vizsgálatához
szükséges mintavevőket és a MIC érték meghatározáshoz szükséges E-teszteket a
GlaxoSmithKline bocsátotta rendelkezésünkre. Köszönöm a segítségüket.
17/24
KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezéshez felhasznált közlemények
1. Hajdu E, Matuz M, Benko R, Ordas A, Nagy A: An 8-year evaluation of antibiotic consumption and antibiotic resistance among Streptococcus pneumoniae from in- and out-patients in Szeged, Hungary. Journal of Chemotherapy (közlés alatt)
2. Hajdú Edit , Benkő Ria, Matuz Mária, Ordas Anita, Blazsovszky Matild, Jeszenszky Mária, Szurdi Mária, Nagy Erzsébet: S. pneumoniae törzsek antibiotikum érzékenységének retrospektív értékelése 1998-2005 között az antibiotikum fogyasztás tükrében. Infektológia és Klinikai Mikrobiológi (közlés alatt)
3. Nagy E, Hajdú E, Földes J: Antimicrobial activity of cefoperazone with clavulanic acid or sulbactam against. Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 29: 701-703. (1990) IF: 3,886
4. Nagy E, Prágai Z, Kóczián Zs, Hajdú E, Fodor E: Investigation of the presence of different broad-spectrum beta-lactamase among clinical isolates of Enterobacteriaceae. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 45: 433-446. (1998)
5. Hajdú Edit , Fogas János, Rudas László, Nagy Erzsébet: Lélegeztetett betegek alsó légúti infekciójának mikrobiológiai diagnózisa védett bronchoalveolaris lavage mintavétel alkalmazásával. Infektológia és Klinikai Mikrobiológia IX: 65-71. (2002)
6. Nagy E, Marton A, Hajdú E: In vitro activity of cefditoren against a special collection of clinical isolates of Streptococcus pneumoniae from Hungary. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 50: 119-124. (2003)
7. Mayer Ilona, Szabó Ágnes, Hajdú Edit , Nagy Erzsébet: Hazai cystás fibrosis centrum betegeinek légúti mintáiból származó izolátumok prospektív analízise. Gyermekgyógyászat 54: 739-745. (2003)
8. Fodor E, Hajdú E, Nagy E: Use of Etest to assess synergy of antibiotic combinations against clinical isolates of Pseudomonas spp. International Journal of Antimicrobial Agents 25: 177-184. (2005) IF: 2,428
Az értekezés témájával összefüggő közlemények 1. Hajdú Edit: Konzultatív klinikai mikrobiológia a Szent-Györgyi Albert
Orvostudományi Egyetemen. Infektológia és Klinikai Mikrobiológia V: 134-135. (1998)
2. Nagy Erzsébet, Hajdú Edit, Dósa Erika: Különböző Gram-negatív izolátumok aminoglycosid érzékenységének összehasonló analízise országos és helyi adatok alapján.
Infektológia és Klinikai Mikrobiológia II: 75-80. (2001) 3. Benkő Ria, Bácskay Tamás, Hajdú Edit, Matuz Mária, Soós Gyöngyvér:
Fekvőbeteg részlegek antibiotikum felhasználásának elemzése különös tekintettel a hematológiai betegek kezelési sajátosságaira. Acta Pharmaceutica Hungarica 72: 245-251. (2002)
4. Dobay O, Rozgonyi F, Hajdú E, Nagy E, Knausz M, Amyes SGB: Antibiotic susceptibility and serotypes os Streptococcus pneumoniae isolates from
18/24
Hungary. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 51: 887-893. (2003) IF: 3,886
5. Dobay O, Rozgonyi F, Hajdú E, Nagy E, Knausz M, Amyes SGB: The relationship between serotypes and PFGE genotypes in isolates of Streptococcus pneumoniae from Hungary. Clinical Microbiology and Infection 8: 673-676. (2005) IF: 2,679
6. Matuz M, Benko R, Doro P, Hajdu E, Nagy G, Nagy E, Monnet DL, Soos G: Regional variations in community consumption of antibiotics in Hungary, 1996-2003. British Journal of Clinical Pharmacology 61: 96-100. (2006) IF: 2,777
7. Benkő Ria, Matuz Mária, Doró Péter, Hajdú Edit , Nagy Gábor, Nagy Erzsébet, Soós Gyöngyvér: Antibiotikum-felhasználás 1996-2003: hazai áttekintés és nemzetközi kitekintés. Orvosi Hetilap 147: 1215-1222. (2006)
Az értekezés témájával összefüggő idézhető absztraktok 1. Hajdú E., Urbán E., Lázár A., Fogas J., Rudas L., Nagy E.: Value of
quantitative cultures of protected bronchoalveolar lavage in ventilated patients (poster) Clinical Microbiology and Infections, 6. (Suppl.1) 190. 2000 IF: 2,679
2. O. Dobay, E. Hajdú, E. Nagy, M. Knausz, F. Rozgonyi, S.G.B. Amyes: Comparisone of serotyping and genotyping of Hungarian Streptococcus pneumoniae isolates. Clinical Microbiology and Infection Vol. Vol. 9, (Suppl 1. 355. 2003) IF: 2,679
3. E. Fodor, E. Hajdú, E. Nagy: Investigation of the synergistic effects of combinations of beta-lactam and fluoroquinolone or aminoglycoside against clinical isolates of Pseudomonas spp. With E-test technology. Clinical Microbiology and Infection Vol. 9,(Suppl 1. 165. 2003) IF: 2,679
4. Hajdú E., Renkő R., Matuz M., Pető Z., Molnár A., Rudas L., Vér I., Jánosi G., Soós E., Nagy E.: Evaluation of antibiotic consumption and resistance patterns in a tertiary care surgical ICU and a medical ICU. Clinical Microbiology and Infection 11: 138, 2005 IF: 2,679
5. Hajdú E., Kóczián Zs., Fogas J., Urbán E., Dósa E., Lázár A., Nagy E., Rudas L.: Alsó légúti infekciók mikrobiológiai diagnosztikája védett bronchoalveoláris lavage mintákból. Infektológia és Klinikai Mikrobiológia 6: (1. suppl.) 18. 1999
6. Dobay Orsolya, Dominic Hoar, Rozgonyi Ferenc, Hajdú Edit , Nagy Erzsébet, Knausz Márta, Sebactian G.B. Amyes: Hazai pneumococcus törzsek genotipizálásával nyert adatok összehasonlítása a szerotipizálás eredményeivel. Clinical and Experimental Laboratory Medicine Vol. 29. 1. 17. (2002)
7. Hajdú Edit , Komáromy Hedvig, Fogas János, Rudas László, Nagy Erzsébet: Gépi lélegeztetéssel összefüggő pneumonia esetek egy éves beteganyagunkban. Infektológia és Klinikai Mikrobiológia Supplemen1. 2003. S12.
8. Peres Bota Daliana, Hajdú Edit , Palágyi Péter, Hortobágyi Annamária: Are infections with resistant pathogens worsening the outcome of surgical ICU patients? Aneszteziol. Intenz. Ter. 33; Suppl. 1. 24, 2003.
9. Gilyán J., Hajdú E ., Nagy E.:Súlyos infekciókból izolált Streptococcus pneumoniae törzsek rezisztencia viszonyai az SZTE klinikáin 2002-2005 között (poszter). Infektológia és Klinikai Mikrobiológia XII.évf.(1 suppl). 15.old. 2005
19/24
20/24
21/24
22/24
23/24
24/24