Állatkísérletek az Orvostudományban(Az (Az áállatkllatkíísséérletek elmrletek elméélete lete éés gyakorlata) s gyakorlata)

SZTE ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet2013 / 2014 / 1

Mi a kurzus(ok) célja ?

Az Európai Unió az állatkísérletek végzését engedélyhez köti (részleteket ld: http://www.felasa.eu/recommendations.htm )FELASA = Federation of European Laboratory Animal Science Associations). A képzettség és engedély megszerzése az SZTE-n is szükséges.

A Kormány 40/2013. (II. 14.) rendelete előírja a Magyar Felsőoktatási Akkreditációs Bizottság (MAB) által akkreditálásra kötelezett oktatási követelményeket.

2013/1. félévi új SZTE ÁOK kurzusok:Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata – A szintű specializációs képzésAz állatkísérletek elmélete és gyakorlata – B szintű specializációs képzés

„A” szint (12 hét); 40 kontaktóra, ebből 20 óra elmélet, 20 óra gyakorlat„B” szint (13 hét); 80 kontaktóra, ebből 40 óra elmélet, 20 óra szeminárium, 20 óra gyakorlat

Állatkísérletek az Orvostudományban(szabadon választható elméleti kurzus)

� A teljesítés (leckekönyv aláírás) feltétele: részvétel az előadások 2/3-án

� Írásbeli tesztvizsga (min. 50%-os eredményesség, 5 fokozatú jegy).

� Időpont: az utolsó előadást követő héten. Helyszíne: Sebészeti tanterem

� Az elméleti tanfolyam megfelel az „Állatkísérletek elmélete és gyakorlata „A” szintű specializációs képzés elméleti részének.

Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata specializációs képzésekről (A, B)

A képzés hátterét az 1998. évi XXVIII. törvény az állatok védelméről és kíméletéről 30. § (1), valamint a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelv uniós rendelkezései jelentik, melyeket 2013. január elsejétől hazánkban is alkalmazni kell.

E kötelezettség teljesítése érdekében az irányelvben foglalt előírások átvétele, a kapcsolódó hazai szabályozás átalakítása megtörtént, az erre vonatkozó rendelet (40/2013. (II. 14.) Korm), részletesen előírja az állatkísérletetekkel foglalkozó személyek elméleti és gyakorlati képzését, a rendeletben foglalt tematika alapján.

„A” szintű specializációs képzettség szükséges:Laboratóriumi kísérleti állatok gondozásával, kezelésével,

tenyésztésével, állatkísérletek végzésével, kísérletek kivitelezésével foglalkozó

• tudományos diákköri munkát végző graduális hallgatók• laboratóriumi asszisztensek• technikusok• általában a fenti munkakörben foglalkoztatott, érettségivel rendelkező munkatársak számára.

„B” szintű specializációs képzettség szükséges:Laboratóriumi kísérleti állatok felhasználásra épülő kísérletek

és kísérleti projektek tervezésével, végzésével és vezetésével foglalkozó• PhD hallgatók• tudományos minősítéssel nem rendelkező kutatók• kutatás-vezetők, akiknek a PhD védése 5 éven belül történt• általában a fenti munkakörben foglalkoztatott, felsőfokúvégzettséggel rendelkező munkatársak számára, akiknek a PhD védése 5 éven belül történt.

1. Bevezetés. Az állatkísérletek törvényi szabályozása, az engedélyezések menete (BM).

2. Az állatkísérletek etikai vonatkozásai; Az állati jólét szempontjai; Az állatok tudományos célra való felhasználása mellett és ellen szóló érvek (BM)

3. Az állatkísérletek elméleti háttere és jelentősége; A helyettesítés, csökkentés és tökéletesítés (3R) követelménye; Állatmodellek az orvosbiológiai kutatásokban (BM)

4. A kísérleti állatok species specifikus biológiája I; Kis állatok (rágcsálók) bonctana, élettana, örökléstana, immungenetikája, viselkedés biológiája

5. A kísérleti állatok species specifikus biológiája II; Nagy állatok bonctana, élettana, örökléstana, immungenetikája, viselkedés biológiája

6. Állatokkal való bánásmód és kezelési formák

7. A kísérleti állatok tartásának jogi szabályozása és a környezetgazdagítás; A kísérleti állatok és állatházak higiénés fokozatai, a kísérleti állatház működtetése

8. A fájdalom, a szenvedés és a stressz felismerése; Az altatás és a fájdalomcsillapítás általános szabályai; Kíméletes végpontok és az eutanázia alkalmazása

9. A műtétek általános elvei, az aszepszis szabályai, alapvető sebészi beavatkozások és sebkezelés

10. Kísérletek tervezése; Életjelenségek megfigyelése, rögzítése, nyilvántartása

11. Kísérletek és projektek tervezése, kivitelezése. A kísérleti adatok feldolgozása, a statisztikai analízis alapjai

ElmElmééleti rleti réész (szabadon vsz (szabadon váálaszthatlaszthatóó éés s ‘‘AA’’ szint) idszint) időőpontja: pontja: hetente hhetente héétftfőőn n 1177.00.00--18:318:300; helysz; helyszííne: ne: SebSebéészeti Klinika tantermszeti Klinika tantermee

Gyakorlati időpontok

AZ ÁLLATKÍSÉRLETEK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA „A” szint

Szerda: 17.00-18.30 (19.30)4 x 2 óra; + 4 x 3 óraElső gyakorlat: szeptember 25.Helyszín: Sebészeti Műtéttani Intézet(Sebészeti Klinika épület alagsor)

AZ ÁLLATKÍSÉRLETEK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA „B” szint

Elmélet – szeminárium – gyakorlatCsütörtök: 8.00-11.00Péntek: 8.00-10.00

Első gyakorlat: szeptember 19.Helyszín: Sebészeti Műtéttani Intézet(Sebészeti Klinika épület alagsor)

Mi nem célja a szabadon válaszhatókurzusnak?

Gyakorlati képzés

A gyakorlati képzések (A, ill. B) = specializációs részhez tartoznak (Állatkísérletek elmélete és gyakorlata - lásd ETR)

Csak az elméleti képzés és a gyakorlati oktatás (együttesen) jogosítja fel állatkísérletek végzésére az illetőt az ország, ill. (hamarosan) az EU bármely intézményében.

„Te mit teszel az állatkísérletek ellen?”Semmit; nem érdekelnek 9%

Igyekszem tájékozódni róluk 24%

Ha tehetem, bojkottálom az állatokon tesztelt készítményeket

63%

Aktív állatvédő vagyok 4%

…általában NEM célja a kurzusoknak:

„Mi a véleményed Csernus doktorról?”

Fogalmam sincs, ki azFogalmam sincs, ki az 5%5%

Fantasztikus szakember lehet Fantasztikus szakember lehet 12%12%

Eladta magEladta magáát a mt a méédidiáánaknak 11%11%

KemKeméény legny legéényny 3%3%

ÉÉrdekes, szimrdekes, szim--patikus egypatikus egyéénisniséégg

22%22%

Ki nem Ki nem áállhatomllhatom 36%36%

Nem tartom hitelesnekNem tartom hitelesnek 11%11%

Állatkísérletek Kókai Kata, 2005-02-16 20:45:51

Amikor megveszünk egy jó nevű kozmetikumot, vagy akár egy egyszerű szappant, többnyire nem tudhatjuk, hány állat életébe került annak kifejlesztése. Az Interneten borzasztó képeket látni kétfejű, és megcsonkított állatokról, s az állatvédők odaadó küzdelme ellenére a legnagyobb cégek többsége nem hagy fel a kísérletekkel.

Az általános tévhittel szemben kísérleteket nem csupán rágcsálókon végeznek, majmok, kutyák, macskák is áldozatul esnek az emberi törekvésnek. Ráadásul a kísérletek nagy részére nem új gyógymódok kifejlesztésére, hanem nélkülözhetőkozmetikai cikkek tesztelésére irányul. Több olyan rémhírt is olvashattunk az Interneten, miszerint állateledelt gyártó cégek kutyákat és macskákat hizlaltak fel-vagy éppen fogyasztottak le, brutális körülmények között tartva őket. Sok esetben szánt szándékkal megcsonkították, lebetegítették az állatokat, hogy megfigyeljék a táplálék rájuk gyakorolt hatását.

http://www.csaladinet.hu/hirek/csaladi_temak/allatbarat/1834/allatkiserletek/

„Állatkísérletek” a közgondolkodásban

A bevezető előadás témakörei

• A tudományos módszer: problémák definiálása és megoldásuk

• A tudományos módszer része: a modellalkotás

• Az orvostudományi modellalkotás gyakorlata:

- a modellalkotás oka és célja

- a modellalkotás (az állatkísérletek) korlátai

- modellek főbb csoportjai az orvostudományi gyakorlatban

Wikipedia: ”Individualdividualss who use thewho use thescientific method”

Kit nevezünk „tudományos” kutatónak ?

A tudományos kutatás elvi alapjai

A „módszerről” általában

„Blind men and the elephant” John Godfrey Saxe (1816-1887)

It was six men of Indostan To learning much inclined, Who went to see the elephant, Though all of them were blindThat each by observation Might satisfy his mind.

And so these men of IndostanDisputed loud and long,Each in his own opinionExceeding stiff and strong.Though each was partly in the rightAnd all were in the wrong.

1. Következtetés

A ”tények” megismerését lehetővé tevővizsgálati módszer többféle megközelítésre és

korrekciókra is alkalmas

Többféle megközelítésre és korrekciókra is alkalmas módszer

Új információ

(a felismerést átadjuk másoknak)

Mit tudunk eddig?

(mások eredményeinek összegzése)

Hipotézis

(javaslat – próba)

Eredmények

(az új adatok elemzése, mérlegelés)

HipotHipotéézis alapzis alapúú mmóódszer dszer -- az az orvos(tudomorvos(tudomáányi)nyi) kutatás lényege

Megfigyelés

Hipotézis

Predikció

ElfogadElvet

Megjegyzések

1. Hipotézisünk csakis kontrollálható lehet (!)

2. Gyakrabban lesz elvethető, mint megerősíthető (!)

Teszt

Nincs örökös érvényű elmélet

Az ismeretanyag teljeselfogadása

‘B’ módszer‘A’ módszer

A tudásanyag folyamatos integrálása és korrekciója

„Tudományos” „Nem tudományos”

Változatlan/változhatatlan elmélet

A kutatás célja: az „igazság” keresése

Van tehVan teháát egy hipott egy hipotéézisemzisem……

Mit Mit éés milyen ls milyen lééppééseket tegyek, hogyseket tegyek, hogy

1.1. a dolog (az a dolog (az „„igazsigazsáágg””) v) vééggéére jre jáárjak;rjak;

2.2. éés a ks a köövetkeztetvetkeztetéés ms máások szsok száámmáára is ra is elfogadhatelfogadhatóó legyen legyen ??

”A tudomány nem magyaráz, vagy interpretál, hanem modelleket állít”

(Neumann János)

Man’s urge to model

Man finds the real world too difficult to comprehend. He lives in a bewildering infinity of space and time but his mind can understand only within finite limits.Man’s realization and definition of these limits form the basis for modelling.

Arthur B. Otis (1972)

Mit nevezünk modellnek ?A „modell” helye és szerepe

1. A valóságos rendszer egyszerűsített, a vizsgálat szempontjából lényegi tulajdonságait kiemelőmása.

2. A világ leírásának, megértésének az eszköze, a világra vonatkozó ismereteinknek kifejezője.

1. A modell legfontosabb jellemzője a jóság.

2. A modellt alkalmazásakor kísérletek útján összevetjük a forrásául szolgálóvalóságos jelenséggel, és a megfigyelésekből következtetünk a modell használhatóságára.

3. A modell alkalmazásakor méréseket végzünk. A mérés az ismeretszerzés legalapvetőbb módszere. Minden tudományterület a természet jelenségein végzett mérésekre épít.

Modellezési alapfogalmak

Jóság, használhatóság és mérések:a „tudományos” modell jellemzői

?

?

Jóság, használhatóság és mérések:a „tudományos” modell jellemzői

„2012 második felében

hatalmas természeti csapás éri

a Földet. Négy óra leforgása

alatt mínusz 40-60 fokra lehűl a

hőmérséklet, és ez a helyzet

2013 májusáig áll majd fenn.”

A modellalkotás általános érvényű elvei

- Szeparáció- Szelekció- Gazdaságosság

Alapfogalmak

1. Szeparáció: a modellezendő rendszert vagy jelenséget a többitől (külsőkörnyezettől, a világtól) el kell különíteni.

2. Szelekció: a modellezés során a megvalósítandó cél szempontjából szelektálni kell (a kölcsönhatások között).

3. Gazdaságosság: a modellnek (a vizsgálat célkitűzésének megfelelve) a lehetőségek közül a legegyszerűbbnek kell lennie.

Occam borotvája: ”Entia non sunt multiplicanda praeter necessitatem" (szükségtelenül ne szaporítsuk a dolgokat, és a redundáns dolgok leválaszthatók - ”Pluralitas non est ponenda sine necessitate”)

1. Következtetés

1. A szeparáció és a szelekció elvéből adódóan a modell a valóság egyszerűsített és hibás képe.

2. Hibás, DE szeparáció és szelekció nélkül a modellalkotás elképzelhetetlen.

A modellezés alapfogalmai

A modell felállításához szükséges információk forrásai:

1. A priori ismeretek: a modellezendő jelenségre vonatkozó, a vizsgálat megkezdésekor rendelkezésre álló ismeretek összessége;

2. A posteriori ismeretek: a modellezési eljárás befejezésével rendelkezésünkre álló ismeretek (előzetes ismeretek + a jelenség megfigyelése során nyert információk összessége).

A modellezés alapfogalmai

Deduktív modellalkotás => kizárólag a priori ismereteket használ

Általános érvényű törvényszerűségekből kiindulva (természettudományos ismeretanyagra támaszkodva) egy konkrét, ismert jelenség leírására törekszik.

Induktív modellalkotás => kizárólag kísérleti adatokra épít

- A kísérletek során végzett megfigyelések információt tartalmaznak a jelenség és annak környezete között érvényesülő kölcsönhatásokról (a rendszer bemenőés kimenő jeleiről)

- A kísérleti vizsgálatok célja a jelenség olyan modelljének felállítása, mely utánozni képes a jelenség tényleges lefolyását.

2. K2. Köövetkeztetvetkeztetééss

Az orvostudomAz orvostudomáányi kutatnyi kutatáás ls léényegenyegea modella modell

RelevRelevááns, jns, jóó modellmodell => „„GGood ood ssciencecience””

A modellek alaptípusai

In vitro modell

In vivo modell

In vitro modellek

• Egész szerv perfúzió

• Szövet superfusio

• Primér sejttenyészet

• Immortalizált sejtvonal tenyészet

• Szubcelluláris vizsgálatok

• Molekuláris vizsgálatok - gén, protein expresszió

Értékes adatokat szolgáltatnak – DE sohasem biztos, hogy ezek pontosan reflektálják az integratív, élő természetet.

In vivo modellek

Humán vizsgálatok

- (általában) nem lehet invazív

- a háttér információk kérdései

Nem humán (pl. állati) vizsgálat

- a fenti problémákat megoldja

- DE: nem biztos, hogy az eredmények alkalmazhatók lesznek humán esetekre

In vivo modellek

• Krónikus vizsgálatok

- Problémák: pl. tartósan beültetett eszközök, katéterek, etc. kérdésköre

• Akut vizsgálatok

- Problémák: pl. anaesthesia hatása

- Eltérések az élettani állapottól

�A hipotézis érvényessége (modell) kísérletekkel igazolható

� Kísérleti alaptípus a tárgy alapján élő vagy élettelen (alcsoport: in silico),

� in vivo kísérleti lehetőség: emberi vagy nem emberi (állati vagy növényi) lehet.

Az eddigiek összefoglalása

A tudományos módszer

Probléma-felvetés

A háttérelemzése

Hipotézismegfogal-mazása

Kísérletekelvégzése

További kísér-letek tervezése

KiértékelésElemzés

Végsőkövetkeztetés

Új kísérletekProbléma-megoldás

in vivo, in vitro

humán / nem emberi

Az orvosi döntéshozatal analógiája: az adatgyűjtéstől a betegség kezeléséig

Analógia

A tudományos módszer alkalmazása a klinikumban

PanaszokAnam-naesis

Differenciál-diagnózis

Vizsgálatok

Továbbivizsgálatok

Adatok alapjána diagnózis szűkítése

Végsődiagnózis

Több lehetőség Csak egylehetőség

Kezelés

A módszer ismételt

alkalmazása embereken

1. Az orvos kötelessége az alanyok életének, egészségének, magánélethez fűződő jogának, emberi méltóságának oltalmazása.

2. A kutatás feleljen meg az általánosan elfogadott tudományos elveknek.3. A kutatás alapuljon a tudományos irodalom alapos ismeretén.4. A kutatást előzze meg laboratóriumi és állatkísérlet.5. A kutatást meg kell tervezni és világosan megfogalmazott protokoll

szerint kell eljárni.

Hogyan lehet alkalmazni a tudományos módszert – azaz a modellalkotást - az orvosi

gyakorlatban, a klinikumban ?

Helsinki Deklaráció (1964)

SzabSzabáályozlyozáási rendszereksi rendszerek

Laboratóriumi eredmények

In vitro

modellek

Állatkísérletek

In vivo

modellek

Emberi (klinikai) vizsgálatok

In vivo modellek

Mi az Mi az ééllőő áállatokatllatokat igigéénylnylőő modellalkotmodellalkotáás oka ?s oka ?

(Mi(Miéért vrt véégzgzüünk nk áállatkllatkíísséérleteket?)rleteket?)

MMiiéért vrt véégzgzüünk nk áállatkllatkíísséérleteket?rleteket?

� Hogy megfeleljünk a törvények előírásainak

MMiiéért vrt véégzgzüünk nk áállatkllatkíísséérleteket?rleteket?

� Mert szükségesek a tudományos módszer alkalmazása –vagyis a jelen (és valószínűleg a jövő) tudományos fejlődése szempontjából.

� Mert bizonyos hipotéziseket nem lehet embereken vizsgálni (nem lehet emberi modelleken megoldani)

A tudományos módszer tárgyai az medicinában

� Terápia: veszettség (kutyák, nyulak); angolkór (kutya); lepra (majom, tatu); stb.

� Megelőzés: diftéria (ló); polio (nyúl, majom); bárányhimlő (majom); kanyaró (majom)

� Felfedezés: inzulin (kutya); modern anaesthesia (kutya); DNS (egér, patkány)

� Fejlesztés: laparoszkópos sebészet (disznó); nyitott szívműtét (kutya); stb.

Mi korlátozza az élő állatokat igénylőmodellalkotást (azaz az állatkísérleteket) ?

(a morális kérdésektől eltekintve ?)

A legfontosabb korlát: az eredmeredméényenyekk nem nem minden esetben minden esetben relevreleváánsak nsak –– nem mindig nem mindig

alkalmazhatalkalmazhatóók k -- humhumáán kn köörrüülmlméények knyek köözzöött (!)tt (!)

(1) Species különbségekCsokoládé (theobromin) toxikus a kutyákraKortizon teratogén egerekbenInzulin toxikus lehet több állatban (stb.)

(2) Egyes fontos jeleket, bizonyos változásokat nehéz / lehetetlen felismerni (pl. enyhébb fájdalom)

(c) Bizonyos esetekben alternatívák lehetségesek (ld. alább)

A 3 R - Russel & Burch (1959)

(a)(a) Refinement: az állati fájdalom és szenvedés csökkentése(b) Reduction: a kísérletekben felhasznált állatok számának

csökkentése a lehetőségek határáig (pl: az emberi reakcióknak megfelelően, genetikusan módosított állatok használata).

(c) Replacement: az állati modellek helyettesítése más modellekkel

(i) Relatív helyettesítés: olyan kísérletek, melyek teljesen megszüntetik az állati szenvedést, anélkül hogy mindez kizárnáa vizsgálatok további folytatását (tökéletes finomítás, absolute

refinement)(ii) Teljes helyettesítés: olyan kísérletek, melyekhez nem szükséges

állati eredetű biológiai anyag

Replacement / helyettesítés

(a) Információ-áramlás fokozása (szükségtelen ismétlések

számának csökkentése) (√)

(b) Computer-alapú rendszerek, matematikai modellezés (?)

(c) Fiziko-kémiai technikák, pl. a kemikáliák irritációs hatását

előrejelző EYTEX rendszer (Draize teszt helyettesítése), stb. (?)

(d) Alacsonyabb rendű szervezetek (baktériumok, gombák)

alkalmazása (pl. Ames teszt). (?)

(e) Emberi vizsgálatok, pl. önkéntesek, populációk (?)

(f) Sejt, szövet és szerv kultúrák (?)

Mi tehát az állatkísérletek

- vagyis az állatkísérletes modellalkotás –

gyakorlati célja ?

Az állatkísérletes modellalkotás célja

� Magának a fajnak, reakcióinak tanulmányozása (állatorvosi kutatás)

� Állati viselkedés kutatása (pl. stressz-tűrő képesség mechanizmusa)

� Nem gyógyszerészeti készítmények tesztelése (pl. toxicitási vizsgálatok)

� Gyógyszerek kipróbálása (pl. in vivo tesztek új gyógyszerek, vaccinák, fázis 2 vizsgálatok)

� Oktatási cél (pl. egyetemi hallgatók)

� Általános biológiai mechanizmusok tanulmányozása

- nem közvetlenül orvosi célú kutatás ( következtetések humán biológiai mechanizmusokra)

- általános orvostudományi cél (pl. rák, AIDS kutatás, xenotranszplantáció)

Általános biológiai mechanizmusok tanulmányozása = alapkutatások

LeLeíírróó vizsgvizsgáálatoklatok-- ÉÉlettan, klettan, kóórtanrtan, , etoletolóógiagia-- Nincs valNincs valóódi hipotdi hipotééziszis => => kkíísséérleti tervezrleti tervezéés, s,

minminőősséégbiztosgbiztosííttáás nehs nehéézz

VVáálaszreakcilaszreakcióó valamilyen intervencivalamilyen intervencióót kt köövetvetőőenen-- ÉÉlettan, klettan, kóórtan, viselkedrtan, viselkedééss-- A kA kíísséérleti tervezrleti tervezéés meghats meghatáározrozóó fontossfontossáággúú

Biológiai mechanizmusok vizsgálata, állatokat tanulmányozva, megfigyelve, a kapott következtetéseket extrapolálva -

ilyen a legtöbb kísérlet…

• Terápiás - “preklinikai vizsgálatok”

• Toxikológia / beavatkozások biztonsága

• Anatómia, sebészet

• Fertőzések és immunitás

• Daganatos mechanizmusok (kutatás, diagnózis)

• Viselkedés / pszichológia

Miért nem lehetséges (mindig) az extrapoláció?

Mert a fajok közötti összehasonlíthatóság mindig kérdéses lesz…

(kiragadott példa: LD50 értékek, eltérő toxikus szintek, stb…)

Világos következtetések levonására alkalmas, egyszerű modellre van szükség !

Állati modellek főbb csoportjai

11.. SpontSpontáánn modelmodelll

22.. IndIndukukáált lt modelmodelll

33.. NegatNegatíívv modelmodelll

44.. „„EgyEgyéébb”” modelmodelll

1. Spontán modellekHasonló (azonos) mechanizmusok emberben és állatban

Vizsgált

fajDefektus /

érzékenység

Humán

megfelelőjeMiért

alkalmazzák

Min egér Mutáns apc-gén Fam. adenomatosus polyposis (colon cc)

Azonos emberi végpont

Macska Asztma Asztma Azonos patológia

Ír szetter VIII faktor hiány

Hemophilia A Terápiás vizsgálat

Mormota Hepatitis B érzékenység

Hepatitis B Infekció vizsgálat

Tatu

(armadillo)

Lepra Lepra Terápiás vizsgálat

2. Indukált (kiváltott) modellek

Valamilyen manipuláció szükséges

� Viselkedés, pl. stressz – tanulásKérdés: azonos-e az emberi és állati stressz?

� Sebészi beavatkozások, pl. idegek átmetszése, erek elzárásaKérdés: mekkora az eltérés az élettani helyzettől ?

� Genetikai manipulációk, pl. transzgén, knock-out, knock-inKérdés: mekkora az eltérés az élettani helyzettől, mik a genetikai ”előkezelés” nem ismert következményei?

3. Negatív modell

“Miért nem modellek”

�� MiMiéért nemrt nem……

-- kapnak a kutykapnak a kutyáák atherosclerosist;k atherosclerosist;

-- lesznek AIDSlesznek AIDS--esek a esek a HIVHIV vvíírussal fertrussal fertőőzzöött csimptt csimpáánzok?nzok?

4. “Egyéb” modellek

Jellegzetességek, melyeknek fontos biológiai jelentőségük lehet

- Sertéseknek sok CD4+CD8+ T-sejtjük van

- Kérődzőknek sok γδT-sejtjük van

- Az állati leukosis fertőző

- Mutáció indukció, mint fontos kutatási terület

Az orvostudomAz orvostudomáányi modellalkotnyi modellalkotáás s alapfeltalapfeltéétele: atele: az állati biológia ismerete

A patkány mint standard modell

EmberEmber JellegzetessJellegzetesséégg PatkPatkáányny

++++ PlaPlazmazma--protein kprotein kööttééss alacsonyalacsony

OrrOrr--szszáájj LLéégzgzééss OrrOrr

Kis coecumKis coecum BBéélfllflóórara elteltéérrééss Nagy coecumNagy coecum

SzSzőőrtelenrtelen BBőőrr SzSzőőrrööss

EltEltéérrőő TeratogeniTeratogenittááss EltEltéérrőő

RitkaRitka AAlbilbinizmusnizmus 95%95%

++ EpehEpehóólyaglyag --

Eltérés: albinizmus

� Defektus: tirozináz hiány� Idegrendszeri eltérések

� Fényérzékenység, retina károsodás� Halláscsökkenés� Szövettani eltérések

� Alacsony P450 aktivitás� Alacsony szérum protein szintek (befolyásolja a

xenobiotikumok reakcióit):� streptomycin, clindamycin, klorokvin, klórpromazin,

nikotin, pilocarpin, serotonin, adrenalin, noradrenalin, dopamin.

Eltérés: viselkedés

• Éjszakai vagy nappal aktív (fordított fény ciklus?)

• Szociális rangsor (természetes viselkedés vagy csak indukciós modell - úsznak-e a patkányok?)

• Tigmotropizmus (egymáshoz tapadás) - túlzsúfoltság tenyésztés alatt és kísérletek közben

Eltérés: emésztőrendszer

� Fogak

� Gyomor (üres vagy sem?)

� A táplálék (rosttartalom)

� Coecum (coecotropok – koprofágia)

Eltérés: kórélettan

� Betegség jelei (láz vagy hipotermia)� Harder mirigy� Speciális betegségek

Porfirin nyomok az orrnyílás környékén

Eltérés: gyógyszerek reakciói

� A species választás befolyásolja a farmakológiát, toxikológiát, anaesthesiát

� A metabolizmus hőmérséklet függő� Species különbségek gyakran összefüggnek a testfelszínnel

Szalicilátok plazma fél-életideje A trimetoprim fél-életideje

Lehetséges megoldások

1. Allometrikus extrapoláció (Watanabe & Bois. Risk Analysis 16; Watanabe & Bois. Risk Analysis 16; 741741--754: 1996754: 1996; ; K. SchmidtK. Schmidt--Nielsen: Scaling, Cambridge 1984Nielsen: Scaling, Cambridge 1984))

� Y = dosage level� A = species independent scaling coefficient� bw = body weight� B = 1.00 - if Y depends upon body weight� B = 0,75 - if Y depends upon metabolic rate� B = 0,67 - if Y depends upon body surface

2. Egyszerű dózis-skálázási faktor a testsúlyhoz viszonyítva (Peters-Volleberg et al. Reg. Tox. Pharmacol. 20;248-258:1994)

Y AbwB

=

Body weight (kg) Scaling factor

Man 60 1Beagle 8 2Monkey 6 2Rabbit 2 3Rat 0,2 5Mouse 0,02 8

Modellek a gyakorlatban = a klinikai Modellek a gyakorlatban = a klinikai gyakorlat modellezgyakorlat modellezéésese

1. Szepszis – súlyos, gyakran halálos megbetegedés, főleg a pathomechanizmus tisztázatlan

2. Vérzéses shock – súlyos, gyakran halálos megbetegedés, főképp a kezelési elvek tisztázatlanok

Modellek a gyakorlatban I.

Rágcsáló modellek a humán szepszis vizsgálatára

Áttekintés:

� LPS (endotoxin)

� CLP – coecum lekötés és punctio

� Fecalis inokuláció

� Intravénás baktérium

� Pneumonia

LPS (endotoxin)

�� ElElőőnynyöökk�� EgyszerEgyszerűű –– pl. i.p. pl. i.p. injectinjectio, io, shock 4shock 4--6 6 óórráán beln belüüll

�� DE:DE:�� AntiAnti--LPS LPS hathatéékonykony LPS LPS ellen ellen áállatokban, de emberekben llatokban, de emberekben

(klinikumban) nem(klinikumban) nem

CLPCLP

�� ElElőőnynyöökk

�� Pl. perforPl. perforáált alt appendicitisppendicitishez hasonlhez hasonlóó

�� DE:DE:

�� SStandardiztandardizáálláás nehs nehéézz

�� MMűűttéétet igtet igéényel (behatolnyel (behatoláás, zs, záárráás, fels, felééppüülléés)s)

Fecalis inoculum

� Előny� Standard, konzisztens

� Alkalmazása egyszerű (IP injekció)

� DE� Nincs jelentős trauma

Pneumonia modellek

� Előnyök

� Egyszerű beadni (tracheába vagy az orrba)

� A dózis ellenőrizhető, reprodukálható

� DE

� Esetenként csak helyi reakció (nincs szisztémás gyulladás)

Intravénás baktérium

� Előny

� Könnyű dozírozni

� Szisztémás infekció

� DE

� Gyorsan elpusztul, befolyásolja a gazdaszervezet immunitását

EredmEredméényeknyek(intrav(intravéénnááss babaktktéérium rium éés kezels kezeléés)s)

Kezelés Iv. E. coli

(kísérlet)

Klinikai szepszis

(humán)

Methylprednisolon hatékony1 hatástalan2 / ront3

Anti-TNFα hatékony4 hatástalan5

1Hinshaw et al. Ann Surg 1981;194:51-562VA SSCSG N Eng J Med 1987;317:659-6653Bone et al. N Engl J Med 1987;317:653-6584Tracey et al. Nature 1987;330:662-6645Abraham et al. JAMA1995;273:934-941

Mi lehet a problMi lehet a problééma oka ?ma oka ?

JJóó a modell ? Elta modell ? Eltéérr--e a vale a valóóssáágtgtóól ?l ?

A modellA modell éés a vals a valóóssáág 1. g 1.

KKíísséérletes szepszisrletes szepszis Klinikai szepszisKlinikai szepszis

HomogHomogéén genetikai hn genetikai hááttttéér (egy nem)r (egy nem) HeterogHeterogéén (mindig kn (mindig kéét nem)t nem)

BeltenyBeltenyéészetszet „„OutbredOutbred””

EltEltéérrőő fajok: patkfajok: patkáány, kutya, sertny, kutya, sertééss Homo sapiensHomo sapiens

EgEgéészsszséégesekgesek TTáársbetegsrsbetegséégekgek

Fiatal felnFiatal felnőőttekttek ÚÚjszjszüüllööttek vagy idttek vagy időőseksek

EEndotoxinndotoxin éérzrzéékenyskenyséég eltg eltéérrőő(k(koprooproffáággiaia//szennyezett kszennyezett köörnyezetrnyezet))

Rendszerint tiszta kRendszerint tiszta köörnyezetrnyezet

A modell és valóság 2.

Kísérletes szepszis Klinikai szepszis

Általában előkezelés Addig nem lehet kezelni, amíg a betegség nincs jelen

Nincs adjuváns kezelés Aktív terápia (folyadék, antibiotikum, inotróp szerek)

Nincs pl. lélegeztetés Lélegeztetés gyakori

A fertőzés leggyakrabban hematogén utón történik

Fészek („nidus”)

Heparin, anesthesia, analgesia Optimális kezelés

Uniform inzultus Helye és mértéke változó

Gyors kialakulás Rendszerint lassú

A vizsgálat ideje standardizált Egyedi lefutás

Különféle végpontok (rendszerint nem a lethalitás)

Klinikai végpontok, szervfunkciók, mortalitás

Modellek a gyakorlatban 2.

A vérzéses shock

Alapvető lehetőségek a vérzés modellezésére

� Ellenőrzött véreztetés (konstans nyomás vagy térfogat)

� Éber vagy altatott

� Nem ellenőrzött vérzés

ÚÚjrajraéélesztlesztéésisi--kezelkezeléési ssi strattratéégigiáákk

A kezelA kezeléés klinikai lehets klinikai lehetőősséégeigei

�� HipotenziHipotenzióós s úújrajraéélesztlesztééss

�� Krisztalloid oldatok (pl. sKrisztalloid oldatok (pl. sóóoldatok)oldatok)

�� Kolloid oldatokKolloid oldatok

�� Hemoglobin sHemoglobin szzubsubsztitztitúúcicióó, teljes v, teljes véér adr adáásasa

�� FrFriss fagyasztottiss fagyasztott pplalazzmama

�� Etc.Etc.

• Vérzés az a. femoralis-ból egy nyitott reservoir-ba.

• Az érpálya hidrosztatikai nyomását az előre meghatározott artériás középnyomás (MAP) értékre állítják (MAP=40 Hgmm)

• Újraélesztés meghatározott időben (pl. 60perckor)

Az állandó nyomás modellWiggers, C.J. The present state of the shock problem. Wiggers, C.J. The present state of the shock problem.

Physiol. Rev. 1942;22:74Physiol. Rev. 1942;22:74--123.123.

Számított vértérfogat = testsúly %-a (≈60 ml vér/tskg).

Vérzés az artéria femoralisból 1 ml/perc sebességgel a 40% vértérfogat eléréséig

Reszuszcitáció 60 perckor

Állandó térfogat modell

Eredmények állandó térfogatúvérvesztés esetén

EsetszEsetszáámm SSúúlyly (g)(g) OxOxigigéén n felhasznfelhasznáálláássml/min/kgml/min/kg

Túlélés

n=n=88 289 289 ±± 1212 ≥≥ 66 +

n=n=1111 298 298 ±± 1616 ≤≤ 55 -

Tanulságok 1.

� A patkányok vértérfogat / testsúly aránya 100 és 400 g között a testsúly növekedésével lineárisan csökken.

� Rágcsálóknál a csoportok közötti kicsiny (pl. 20-30 g)súlykülönbséget nem könnyű felismerni.

� Arra következtethetünk, hogy a kezelés hatékony, pedig csupán az állatok súlya kissé alacsonyabb a kezeletlen kontrollokhoz képest.

� Rágcsálók esetén a kísérletes protokoll állandó része a testsúly szigorú ellenőrzése (!)

Tanulságok 2.

Nem árt ismerni a társ- vagy távoli szakterületek irodalmát (is).

A testsúly/vértérfogat következményét leíró eredeti közlemény: Lee, H.B. & Blaufox, MD. J. Nuclear Med. 1985;26:72-76.*

* The use of an arbitrary value of 7% for estimation of blood volume can lead to significant errors in calculating radiopharmaceutical distribution.

The use of the general formula for the blood-volume calculation described here should improve the accuracy and reliability of estimates of radiopharmaceutical distribution.

BV (ml) = 0.06 X BW + 0.77 (r = 0.99, n = 70, p < 0.001). The difference between male and female rats was not statistically significant.

Gainer és mtsai* vizsgálatai

� 280 g-os patkány

Kiindulási O2 felhasználás = 23 ml/perc/kg� 40% vérzés az O2 felhasználást 10 ml/perc/kg-val csökkenti� Vérzés alatt az O2 felhasználás = (23-10) 13 ml/perc/kg� Várhatóan túlélő

� 315 g-os patkány

Kiindulási O2 felhasználás = 15 ml/perc/kg� 40% vérzés az O2 felhasználást 10 ml/perc/kg-val csökkenti� A vérzés alatt az O2 felhasználás = (15-10) 5 ml/perc/kg� Várhatóan nem éli túl a vérzést

* Gainer JL et al. Hemorrhagic shock in rats. Lab Animal Sci 1995; 45(2): 169-172.

További tényezők - az anaesthesia hatása

TanulmTanulmáányny Watts et al.Watts et al.11 Custalow et al.Custalow et al.22

AnesthetiAnestheticumcum(mg/kg)(mg/kg)

ÉÉber*ber* AltatottAltatott

KetKetaminamin// Xylazin (70/3Xylazin (70/3 mg/kg)mg/kg)

SSúúlyly (g)(g) 300300--450450 350350--420420

MAP (HgMAP (Hgmmmm)) 40 40 ±± 0.80.8 38 38 ±± 11

VVéértrtéérfogatrfogat 15.5 15.5 ±± 0.60.6 14 14 ±± 0.40.4

LaLaktktáátt 6060’’ 16 16 ±± 0.50.5 7 7 ±± 0.50.5

ArtArt.. pH 60pH 60’’ 7.09 7.09 ±± 0.040.04 7.27 7.27 ±± 0.020.02

* * ÉÉber vber véérzrzééses modellek csak szigorses modellek csak szigorúú feltfeltéételek mellett engedtelek mellett engedéélyezhetlyezhetőőkk1Watts, JA, et al. AJP 2001;281:G498-G5062Custalow, CB, et al., Shock 2001;15(3):231-238

TanulságokÉber vs altatott modellek összefoglalása

� Az anaesthesia jelentősen befolyásolja a központi idegrendszer által irányított autonóm reflexeket.

� Az anaesthesia általában jelentősen befolyásolja (deprimálja) a légzést.

� Bizonyos anaesthetikumok jelentősen befolyásolják (csökkentik) a gyulladást.

Ellenőrzött vs ellenőrizetlen vérzéses modellek összefoglalása

� Állandó nyomás és állandó térfogatú ”ellenőrzött” vérzéses modellekben a kiindulási artériás középnyomás értékekig történő újraélesztés adta a legjobb eredményt (jobb túlélés).

� 1990 évek: az „aggresszív” reszuszcitáció káros lehet, „ellenőrizetlen” vérzéses modellben a hipotenziv újraélesztés jobb eredményeket adott.

N.B. 1918:N.B. 1918: Cannon et al.Cannon et al.:: The preventive treatment of wound shock. J. Am. Med. Assoc. 191The preventive treatment of wound shock. J. Am. Med. Assoc. 1918;15:13928;15:1392--1395.1395. ““If the pressure is If the pressure is

raised before the surgeon is ready to check the bleeding that maraised before the surgeon is ready to check the bleeding that may take place, blood that is sorely needed may be losty take place, blood that is sorely needed may be lost..

Tanulságok - a Nem szerepe

� A legtöbb vizsgálatra hímeket használnak… Azonban:

� Alacsony tesztoszteron és magas ösztradiol védő hatású (és pl. kivédi az immunszuppressziót is (Angle, M.K. et al.: Effect of gender and sex

hormones on immune responses following shock. Shock 2000;14(2):81-90)

� Azóta védőhatást igazoltak (állatokban):� Ivartalanítás� Estradiol� Flutamide (androgén receptor antagonista)� DHEA (ösztrogén agonista)� Etc. esetén

Tanulság: a ‘gyengébbik’ nem jobban tolerálja a traumás vérzést….

A vérzéses modellek tanulságai

�� A (pl. A (pl. 40 Hg40 Hgmmmm--es) kes) köözzéépnyompnyomáás css csöökkenkkenéésre adott sre adott reakcireakcióó nem uniform (ld. testsnem uniform (ld. testsúúlyly……).).

�� A nem A nem éés az altats az altatáás befolys befolyáásolja a ksolja a kóórlefolyrlefolyáást, a st, a ssúúlyosslyossáágot isgot is……

�� AA vvéérvesztrvesztéés (pl. s (pl. 40 40 HHggmmmm--es MAP eles MAP eléérréése) mse) móódja sem dja sem mellmelléékes, kes, éés a nyoms a nyomááscsscsöökkenkkenéés sebesss sebesséége is befolyge is befolyáásolja solja a vesztett va vesztett véértrtéérfogatot, krfogatot, küüllöönnöösen sen ééber ber áállapotbanllapotban..

A tanulságok összefoglalása

� Irreleváns, klinikailag nem megfelelő, alkalmatlan modellek→ elhibázott kísérletek → hibás klinikai vizsgálatok → hibás következtetések

1. Tanács

� A hatékony kutatómunkához alapos tervezésre - és az állati modellek korlátainak ismeretére van szükség.

� A célt világosan meg kell határozni és sohasem szabad túlbecsülni:� Élettani jelenség kutatása� Kórélettani mechanizmus kutatása� Kórélettani változások befolyásolása� Kezelések (pre-klinikai) vizsgálata

2. Tanács

� A modellt mindig a valósághoz viszonyítva kell kialakítani

� Minden állatkísérlet legfontosabb eleme (eredményeit és következtetéseit leginkább befolyásoló tényezője): a megfelelő kontroll csoport.

� A háttér alapos ismerete előtt nem szabad következtetéseket levonni saját eredményeink fontosságáról.

Ajánlott irodalom - összefoglalók

� Deitch, E.A. Animal models of sepsis and shock: A review and lessons learned. Shock 1998;9(1):1-11.

� Schulz, M.J., van der Poll, T. Animal and human models for sepsis. Ann. Med. 2002;34:573-581.

� Esmon, C.T. Why do animal models (sometimes) fail to mimic human sepsis? Crit. Care Med. 2004;34(5):S219-S222.

Gems of wisdom from Watson and his colleagues that should guide young scientists in all fields on how to be the best that one can and how to learn from

failures

1. Conventional wisdom is often wrong.2. Take real joy in the discoveries of others; what matters most is whether the

result is important.3. "Jim and Francis believed that in order to go fast, you must share

information in the expectation of learning things, rather than withhold it from fear of theft."

4. Sometimes, "a beautiful insight could solve a jigsaw puzzle even when the best solid evidence had been ignored."

5. There is value in scientific partnerships of equals.6. "Two people are better than one. Otherwise you get in a rut, you can get too

fond of your own ideas, you get the wrong idea, you can't get out of it."7. Young scientists who feel the need to assert their independence should not do

it by cloistering themselves.8. "Rosalind Franklin just needed a collaborator. She didn't have somebody to

break the pattern of her thinking."9. Above all, find the best mentor.Judah Folkman in Nature Medicine (April 2003): Watson and DNA: Making a

Scientific Revolution