Lovro Žiberna

GENSKI DOPINGGENSKI DOPING

Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani

OPREDELITEV DOPINGA

Definicija po MOK [2000]:• uporaba snovi ali metod, ki so

potencialno škodljive za športnikovo zdravje in/ali lahko izboljšajo dosežke, ali

• prisotnost prepovedanih snovi v organizmu ali če je iz prisotne snovi v organizmu razvidna uporaba prepovedane tehnike.

GENSKA TERAPIJA

Pričetek genske terapije leta 1990.

GENSKI DOPING

Definicija: Neterapevtska uporaba genov, genskih elementov, celic ali modulacije genske ekspresije, katere cilj je izboljšati sposobnost športnika.

Gre za gensko “terapijo” na zdravem človeku.

Na prepovedani listi [WADA] od leta 2003.

MOŽNOSTI UPORABE

Možnosti vgraditve umetnega gena v telesno celico:• direktna injekcija DNA v mišico (lokalna in vivo tehnika)• uporaba virusnega vektorja (sistemska ali lokalna in vivo tehnika)• vstavitev genetsko modificiranih celic (ex vivo tehnika)

VEKTORJIGenski prenos Vektor Lastnosti

NevirusniLiposomi Z DNA pokriti zlati delciDNA proteinski kompleksiGola DNA

manj efektivna transdukcijaprehodna ekspresijanizka imunogenostlažja priprava

Virusni

Adenovirus okuži mitotične / postmitotične celicenizka citotoksičnostpogost imunski odziv

Adeno-asociacijski virus nizka toksičnostnizka imunogenostvisoka perzistenca vstavljenega genanizka kapaciteta za genski insert

Retrovirusi nizka toksičnostnizka imunogenostokuži samo mitotično aktivne celicenizka kapaciteta za genski insert

Herpes simplex okuži mitotične / postmitotične celicevisoka kapacitetapogost imunski odzivperzistira v celicah v CŽS

30V, 10 krat po 20ms pulzi.Insercija pCAGGS-Lac-Z plazmidne DNA kot vektorja za vnos tarčnega gena.

ELE

KT

RO

PO

RA

CIJ

A

LIP

OS

OM

ILI

PO

SO

MI

VIRUSNI VEKTORJI

EX VIVO princip genske terapije/dopinga

ERITROPOETIN

1997:

• adenovirusni vektorji z genom za EPO i.m. v miške. Opazili so ↑c [Hb] in ↑ Ht iz 49% na 81%. Efekt je trajal >1 leto.

• Podobno v opice: ↑ Ht iz 40% na 70%. Stabilno 90 dni.

2004:• AAV in vivo prenos gena za

EPO• vbrizgali v skeletne mišice

8 opic• Rezultati:

4 opice: ↑ Ht do kritične meje

4 opice: naglo upadanje c[EPO] -> huda anemija

AVTOIMUNSKA REAKCIJA!

2004 (Nacionalni anti-doping laboratorij v Franciji):

• gen za EPO injicirali v opice i.m.• razlike v strukturi med nativnim in

novim eritropoetinom• post-translacijske modifikacije!

(imunski odziv)• zaznava genskega dopinga

IGF-1

• hiperplazija in hipertrofija miocitov skeletnih mišic

• genska terapija: degenerativne mišične bolezni in ↑mišične moči pri starostnikih

• s starostjo propadajo hitra mišična vlakna, podobno pri mišični distrofiji (hitreje, izraziteje)

Regeneracija miocitov:

1) intaktni distrofin

2) satelitne celice

• AAV – IGF-1 i.m. mladim miškam: 15-30% povečanje mišične mase in ↑hitrosti pridobivanja mišične mase

• enako na srednje starih miškah: ohranile povečano mišično moč v starosti. Enaka hitrost kontrakcije kot pri mladih miškah.

• Transgenske miši: ↑ IGF-1 v skeletnih mišicah -> 20-50% večja mišična moč.

SIMULACIJA GENSKEGA DOPINGA:

• V eno nogo i.m. vbrizgali AAV-IGF-1, drugo nogo pustili intaktno.

• intenzivni 8-tedenski trening

• Noga (AAV-IGF-1) je razvila 2x večjo mišično moč kot druga noga + izguba mišične moči počasneje po prenehanju treninga

MIOSTATIN

• miostatin = inhibirajoči rastni faktor (GDF-8) član družine TGF-

• omejuje prekomerno rast satelitnih celic -> mišičnih celic

• embrionalni razvoj in v odrasli dobi

• atrofija mišic ob zmanjšani funkcionalni potrebi

• vloga pri nalaganju maščob

• 1999: transgenske miši (“knock-out” za MSTN)• rezultati: hiperplazija in hipertrofija mišičnih

vlaken -> “Shwarzenegger” ali “Mighty mouse”• živali: “double muscled” govedo. 2 pasmi:

Belgian Blue, Piedmontese. Mutacija na MSTN: neefektivna oblika miostatina.

• 2001: miši z intaktnim MSTN, vendar naknadno povzročili mutacije na tem genu. Podobni rezultati.

• 2004: v Nemčiji diagnosticirali dečka z mutacijo MSTN. Mati imela mutacijo gena na enem kromosomu.

• 2005: uporaba topnega activin type IIB receptor – molekula normalno na celicah, kamor se veže miostatin. Rezultati: do 60% povečanje mišične mase.

Starost : 7 m

esecev

• v letu 2005: zaenkrat ni še nobenih inhibitorjev miostatina na trgu

• v fazi kliničnega testiranja: pripravek s protitelesi proti miostatinu

• cilj za prihodnost: ustvariti manjše verzije miostatina brez signalnega dela molekule (genski prenos genskega zapisa)

• uporaba: terapija mišične distrofije, genski doping

VEGF

Odgovoren za produkcijo novih žil - ANGIOGENEZA

LEPTIN

•Hormon, ki sodeluje pri regulaciji občutka lakote.

• OB gen, OB-R gen

•Za razliko od miši: pri debelih ljudi ponavadi ↑konc. leptina od normalne, v likvorju pa nižja

•Motnja: pri vstopu leptina v cerebrospinalno tekočino, verjetno zaradi zmanjšane ekspresije OB-R –> manj receptorjev za leptin na endotelijskih celicah v možganih

•Uravnavanje vnosa hrane in občutka za lakoto in sitost je izrazito kompleksno: NpY, CRH, monoaminski NT

1997: virusni vektor z genskim zapisom za leptin injicirali v miši -> upad telesne teže

ENDORFIN

•Endogeni opioidi. Normalno izločata hipofiza in hipotalamus.

•descendentne poti endogene analgezija

•genski doping, lajšanje bolečin pri bolnikih s terminalnimi boleznimi

PPAR delta

• ustvarili transgenske miši z PPAR delta s povečano aktivnostjo

• miši pričele izgubljati maščevje

• remodeliranje skeletnih mišic:

- ↑ št. počasnih vlaken

- št. hitrih vlaken

• več mitohondrijev, večja kapaciteta aerobnega metabolizma

• v miši aplicirali zdravilo GW501516, ki ga razvija GlaxoSmithKline. Je aktivator PPAR delta.

• ugotovili podobne spremembe kot pri transgenskih miših

• miši kljub dieti bogati z maščobami in nizki telesni aktivnosti niso pridobivale na telesni masi tako hitro kot kontrolna skupina

• te miši so poimenovali “maratonske” miši:

pretekle 1800m (kontrolna sk. : 900m), tek brez prekinitve 150 min (kontrolna sk. : 90 min)

• ostale spremembe: povečana prekrvavitev, zvečana motorična inervacija skeletnih mišic,spremembe na srčni mišici

• doping:

- z zdravili povečevanje aktivnosti PPAR delta

- prenos genskega zapisa za PPAR delta v telo z uporabo vektorjev (genski doping)

ŠPORTNE POŠKODBE

• rehabilitacijski programi, nove operativne tehnike

• omejitve pri celjenju poškodb muskuloskeletnega sistema: ligamenti, tetive, meniski, sklepni hrustanec, kostnina.

• biološki pristopi: terapija z rastnimi faktorji

• izločajo celice na mestu poškodbe: fibroblasti, endotelijske celice, mezenhimske zarodne celice

ali

• vnetne celice (makrofagi, monociti)

• delovanje: stimulacija celične proliferacije, migracije, diferenciacije in ↑sinteza ECM

Rekombinantna zdravila vs. genska terapija

• lokalna koncentracija pomembna• pri rekombinantnih proteinih: nizek razpolovni

čas in vivo -> visoke doze in pogosta aplikacija• visoke koncentracije v plazmi: rast tumorjev,

angiogeneza

Tkivno inženirstvo• razvoj bioloških substitutov za

popravilo, rekonstrukcijo, regeneracijo ali nadomestilo tkiv

• genska modifikacija tkiv• Uporaba mioblastov, katerim ex

vivo vgradimo zapise za rastne faktorje in jih nato injiciramo lokalno. Ohranjena sposobnost diferenciacije: v mišico, ligament, kostnino ali meniskus.

SKELETNE MIŠICE

• 10-55% vseh športnih poškodb

• večje poškodbe: tvorba fibroznih brazgotin – slabijo mišično funkcijo, nastanek kontraktur, kronične bolečine

• dobre rezultate: bFGF, BGF, IGF-1

• pristopi z npr. AAV-IGF-1• meja med terapijo in

dopingom?

KRIŽNA VEZ (lig.ant. cruciatum)• pretrganje sprednje križne

vezi – med najbolj pogoste poškodbe

• kirurški poseg: rekonstrukcija• vez, da doseže polno

stabilnost in moč potrebuje 3 leta

• športniki bi naj vsaj 6 mesecev bili odsotni od tekmovanj

• Lokalna ↑konc. PDGF-AB, EGF, bFGF – “ligamentizacija”

• Genska terapija: virusni vektorji in vgradnja zapisov za rastne faktorje in citokine

• Med operacijo ali predhodni odvzem tkiva (ex vivo)

NEVARNOSTI

Razdelitev:

1) tveganje odvisno od vektorja

2) tveganje odvisno od transgena

• kontrolirano okolje - laboratorij

• virus lahko pridobi patogenost v telesu

• imunogenost virusnih proteinov – vnetja

• naključna vgradnja genskega zapisa v genom -> prekinitev onkogena

Uspešnost genske terapije

• ozdravili okoli 3000 pacientov• tragični zapleti

1999 prostovoljec umrl pri genski terapiji deficience ornitin dekarboksilaze zaradi prekomernega imunskega odziva

• avtoimunski zapleti pri opicah (EPO)• X-vezana huda kombinirana imunska deficienca: pri

2 nastanek T-celične levkemije. Retrovirusni vektor je vgradil transgen blizu onkongena LMO-2.

• pomanjkljivo znanje o interakcijah med posameznimi geni

• terapevtski geni se vedno ne vgradijo na ustrezno (predvideno) mesto

• skoraj vedno prisotni simptomi podobni gripi: vročina, drgetanje, občutek mrzlice, občutek slabosti, neugodja, suh kašelj, izguba apetita, bolečine po telesu

• kontaminacija: kemična ali biološka• nevarnost za razvoj novih oblik virusa –

replikacijsko kompetentni virusi (RCV)• večkratno doziranje – imunski sistem

Nevarnosti - EPO• prekomerno izločanje eritropoetina:

↑eritrocitov (policitemija) in ↑viskoznost krvi –> TROMBOZA in obremenitev srčne mišice

• AMI, možganska kap,periferne ishemije

• Terapija: antikoagulativna +

1. kateter in kontrolirana krvavitev ob hkratni infuziji fiziološke raztopine

2. citofereza (izločijo se celice, ostale sestavine krvi nazaj)

• Kontrola genske ekspresije!

Nevarnosti – IGF-1,blok. miostatina

• povečanje mišične moči za 20-40% v kratkem času

• problem le pri starostnikih ali pri ljudeh z osteoporozo: lahko pride do zlomov na mestih, kjer se tetiva vrašča na kost

Nevarnosti – IGF-1 in VEGF• rastni faktorji v krvnem

obtoku potencial iniciacije tumorske rasti

Tveganje za okolje

• izločanje iz telesa genetsko modificiranih celic ali izločki, ki vsebuje vektorje z genskim insertom

• v protokolu: kontrola krvi, blata, urina, sperme in sline.

• genski doping izven kontroliranih razmer

DETEKCIJA

• problem: preneseni geni identični človeškim

• genetska “črtna koda”

• lokalno injiciranje vektorjev v skeletne mišice – iskanje ostankov

• preproste infekcije,npr. adenovirusi povzročajo 25% vseh prehladih obolenj

• potrebno natančno vedeti, kam so bili geni vnešeni – “iskanje šivanke v senu”

• 2004: strukturne razlike med proteini zaradi različnih post-translacijskih modifikacij

• iskanje določenih proteinskih označevalcev – “screening” več sto proteinov naenkrat

• PET in SPECT neinvazivne molekularne slikovne metode: detekcija specifične mRNA v tkivih, kjer je normalno ni. Hibridizacija s primerni antisense oligonukleotidnimi probami, ki so označene.

RNAze H -> zato razvijajo peptidne nukleinske kisline

HVALA ZA POZORNOST!