lp 10 - histochimie +
DESCRIPTION
biocel lp 2009TRANSCRIPT
HISTOCHIMIE SI HISTOENZIMOLOGIE
1
METODA FROTIURILOR se realizeazse realizeazăă intinderea celulelor intinderea celulelor îîn n
monostrat pe o lamelmonostrat pe o lamelăă de sticl de sticlăă.. Pot fi examinate :Pot fi examinate :1.1. celulele sangvinecelulele sangvine2.2. celulele epiteliale descuamate sau celulele epiteliale descuamate sau
exfoliateexfoliate3.3. sedimentele celularesedimentele celulare4.4. amprente de amprente de ţţesuturi sau organe esuturi sau organe
parenchimatoaseparenchimatoase2
TIMPII recoltarerecoltare întindere: întindere: se folosesc douse folosesc douăă lame de lame de
sticlsticlăă lama portobiect – cea pe care se lama portobiect – cea pe care se
efectueazefectueazăă frotiul frotiul lama executoare – cu care se lama executoare – cu care se
îîntinde frotiul , prin glisare la un ntinde frotiul , prin glisare la un unghi de 45unghi de 45..
uscareuscare3
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM
pentru colorarea frotiului sangvin.pentru colorarea frotiului sangvin.
1.1. solutia May-Grunwald solutia May-Grunwald – con– conţţine ine EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic solubilizat in amestec de alcool metilic şşi i gliceringlicerinăă neutr neutrăă
2.2. solutia Giemsasolutia Giemsa – contine EOZINAT DE – contine EOZINAT DE AZUR DE METILEN solubilizat in AZUR DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic si glicerina amestec de alcool metilic si glicerina neutraneutra
4
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM
Frotiul trebuie sa fie :Frotiul trebuie sa fie : subsubţţire – cu un singur strat de celuleire – cu un singur strat de celule îîntins uniformntins uniform ambele margini pe lama ambele margini pe lama se terminse terminăă îîn franjuri pe lamn franjuri pe lamăă , ocup , ocupâând nd
cca. 2/3 din aceastacca. 2/3 din aceasta la margine se scrie numele pacientului la margine se scrie numele pacientului
sau un nr. sau un nr. dde ordinee ordine
5
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM
REZULTATEREZULTATE nuclei – violetnuclei – violet citoplasmele agrcitoplasmele agraanulocitelor – albastru nulocitelor – albastru
citoplasmele granulocitelor – rozcitoplasmele granulocitelor – roz ggranularanulaţţiiii::
neutrofile – roneutrofile – roşşu- violetu- violetbazofile – albastru bazofile – albastru îînchis spre negrnchis spre negruueozinofile – roeozinofile – roşşu –portocaliu u –portocaliu
6
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM
7
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM
8
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM
9
HISTOCHIMIA
interpretarea biochimicinterpretarea biochimicăă a celulelor a celulelor sau sau ţţesuturilor esuturilor îîn raport cu n raport cu oranizarea lor celularoranizarea lor celularăă..
PRINCIPIUPRINCIPIUSe bazeazSe bazeazăă pe afinitatea pe care o pe afinitatea pe care o au unii coloranau unii coloranţţi pentru anumite i pentru anumite grupgrupăări chimice pe care vrem sri chimice pe care vrem săă l lee localizlocalizăămm..
10
HISTOCHIMIA SubstanSubstanţţele chimice celulare ele chimice celulare şşi i
tisulare se identifictisulare se identificăă prin reac prin reacţţii ii chimice care duc la obchimice care duc la obţţinerea de inerea de compucompuşşi colorai coloraţţi , insolubili i , insolubili şşi i observabili la M.O.observabili la M.O.
HISTOFOTOMETRIA = HISTOFOTOMETRIA = analiză analiză cantitativă, în funcţie de intensitatea cantitativă, în funcţie de intensitatea culoriiculorii
11
Conditiile minime necesare unei reactii histochimice
substansubstanţţa analizata analizatăă ssăă se conserve “in situ” , se conserve “in situ” , fixarea utilizatfixarea utilizatăă trebuie s trebuie săă conserve conserve
structura celulei structura celulei şşi si săă îîmpiedice mpiedice deteriorarea componentelor celulare deteriorarea componentelor celulare
mmetoda folositetoda folosităă trebuie s trebuie săă fie specific fie specificăă pentru substanpentru substanţţa sau grupa sau grupăările chimice rile chimice care vor fi examinate. care vor fi examinate.
12
Conditiile minime necesare unei reactii histochimice
produsul de reacprodusul de reacţţieie
- - insolubil – previne dispersia sau insolubil – previne dispersia sau difuzia produsului de reactiedifuzia produsului de reactie coloratcolorat – permite examinarea– permite examinarea
reactivul histochimicreactivul histochimic – trebuie s – trebuie săă fie fie
specificspecific. .
13
HISTOCHIMIA GLUCIDELOR
monozaharide monozaharide
solubilesolubile oligozaharide oligozaharide ppolizaharideolizaharide - - libere libere sau sau combinate combinate
cu proteinecu proteine
14
HISTOCHIMIA GLUCIDELOR
METODA PAS ( per-iodic acid METODA PAS ( per-iodic acid Schiff)Schiff)
METODA CU CARMIN METODA CU CARMIN AMONIACAL BESTAMONIACAL BEST
BAZOFILIABAZOFILIA METACROMAZIAMETACROMAZIA
15
METODA PAS
evidenevidenţţierea glicogenului, GAG, ierea glicogenului, GAG, glicoproteinelor si glicolipidelor.glicoproteinelor si glicolipidelor.
PRINCIPIUPRINCIPIU
grupgrupăări glicolri glicol oxidare cu acid periodicoxidare cu acid periodic grupări grupări aldehidice + aldehidice + cu reactivul Schiff cu reactivul Schiff precipitat rosu violaceu vizibil la M.O.precipitat rosu violaceu vizibil la M.O.
16
METODA PAS- GLICOGEN
specificitatea metodei depinde de specificitatea metodei depinde de pretratamentul cu enzime pretratamentul cu enzime glicogenolitice de tipul amilazei glicogenolitice de tipul amilazei salivare. Se cosalivare. Se connsidersiderăă c căă structurile structurile colorate PAS care dispar colorate PAS care dispar îîn urma n urma pretratamentului cu amilazpretratamentului cu amilazăă con conţţin in glicogenglicogen
17
METODA PAS
18
CARMIN AMONIACAL BEST
evidenevidenţiazăţiază glicogenul glicogenul - - polimer cu polimer cu solubilitate redussolubilitate redusăă îîn apn apăă . Daca fixarea . Daca fixarea lui nu este promptlui nu este promptăă, enzimele hidrolitice , enzimele hidrolitice îîl descompun l descompun îîn glucozn glucozăă care este care este foarte solubilfoarte solubilăă îîn apn apăă şşi difuzeazi difuzeazăă..
REZULTATE :REZULTATE : granule ro granule roşşii ii îîn n citoplasmcitoplasmăă
19
CARMIN AMONIACAL BEST
20
BAZOFILIA
proprietatea substanproprietatea substanţţelor glucidice de elor glucidice de a se colora cu colorana se colora cu coloranţţi bazici de tipul i bazici de tipul albastru alcian albastru alcian şşi albastru de metil.i albastru de metil.
poate fi utilizatpoate fi utilizatăă şşi pentru evideni pentru evidenţţierea ierea lipidelor lipidelor şşi proteinelor cu caracter acidi proteinelor cu caracter acid
21
ALBASTRU DE METIL
22
METACROMAZIA Capacitatea unui substrat de a se Capacitatea unui substrat de a se
colora colora îîntr-o altntr-o altăă culoare dec culoare decâât cea a t cea a colorantului.colorantului.
PRINCIPIU:PRINCIPIU:- existenţa unor - existenţa unor grupgrupăări anionice aflate ri anionice aflate
la o distanla o distanţăţă foarte mic foarte micăă una de alta una de alta formformâând agregate cu proprietnd agregate cu proprietăţăţi de i de absorbabsorbţţie a luminii vizibile diferite de a ie a luminii vizibile diferite de a moleculelor neagregate.moleculelor neagregate.
23
METACROMAZIA
24
HISTOCHIMIA LIPIDELOR
PRINCIPIU:PRINCIPIU:
colorantul trebuie colorantul trebuie să fiesă fie mai solubil mai solubil în lipide decât în în lipide decât în propriul solventpropriul solvent
SUDANOFILIASUDANOFILIA ColoranColoranţţi Sudan :i Sudan : III – roIII – roşşu-portocaliuu-portocaliu IV – roIV – roşşuu B – negruB – negru BB – albastruBB – albastru
25
COLORAŢII SUDAN
26
HISTOCHIMIA PROTEINELOR
detecteazdetecteazăă structura primar structura primarăă a a proteinelor proteinelor
ReacReacţţii nespecifice ii nespecifice proteinele proteinele celulare celulare şşi tisulare sunt identificate i tisulare sunt identificate pe seama aminoacizilor pe seama aminoacizilor
ReacReacţţii specificeii specifice – folosite pentru – folosite pentru identificarea heteroproteinelor identificarea heteroproteinelor
27
HISTOCHIMIA PROTEINELORReacţii nespecifice
Tirozina – ReacTirozina – Reacţţia MILLONia MILLONArginina – ReacArginina – Reacţţia SAKAGUSHI ia SAKAGUSHI
– pentru studiul distributiei – pentru studiul distributiei proteinelor bazice in nucleu proteinelor bazice in nucleu
TriptofanTriptofan
28
HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice folosite pentru identificarea folosite pentru identificarea
hheteroproteinelor de ex. eteroproteinelor de ex. nnucleoproteinele care se evidenucleoproteinele care se evidenţţiaziazăă pe seama acizilor nucleici. pe seama acizilor nucleici.
1.1. Metoda FEULGENMetoda FEULGEN2.2. BazofiliaBazofilia3.3. Metoda BRANCHETMetoda BRANCHET
29
HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice
METODA FEULGENMETODA FEULGEN
Molecula AND Molecula AND hidroliza acida hidroliza acida dezoxiriboza dezoxiriboza + reactiv Schiff precipitat + reactiv Schiff precipitat roşu-violaceuroşu-violaceu
30
METODA FEULGEN
31
HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice
METODA BRANCHET( verde metil-pironinMETODA BRANCHET( verde metil-pironinăă))
cercetacercetarearea bazofili bazofilieiei dat datăă de acidul de acidul fosforic din structura acizilor nucleicifosforic din structura acizilor nucleici
verde de metilverde de metil – are afinitate pentru – are afinitate pentru ADN-ul nucleADN-ul nuclearar pe care pe care îîl coloreazl coloreazăă îîn n verdeverde
pironina pironina –– ARN-ul nucleolar si ARN-ul nucleolar si citoplasmaticcitoplasmatic,, pe care pe care îîl coloreazl coloreazăă îîn ron roşşuu
32
HISTOCHIMIA ENZIMELOR
evidenevidenţţiaziazăă localizarea localizarea şşi activitatea i activitatea enzimelor. enzimelor.
PRINCIPIU: PRINCIPIU:
- - reacreacţţii chimice care au ca rezultat un compus ii chimice care au ca rezultat un compus colorat colorat şşi insolubil. In cazul i insolubil. In cazul îîn care produsul n care produsul rezultat este solubil , se insolubilizeaza rezultat este solubil , se insolubilizeaza printr-printr-o o reacreacţţie de CAPTURie de CAPTURĂĂ..
33
ETAPELE OBŢINERII UNUI PREPARAT CITOENZIMOLOGIC recoltarea recoltarea fixarea – prin congelarea rapidfixarea – prin congelarea rapidăă la la
temparaturi foarte joasetemparaturi foarte joase secsecţţionarea ionarea incubarea –incubarea –într-într-un mediu care oferun mediu care oferăă
enzimei conditii cenzimei conditii câât mai apropiate de cele t mai apropiate de cele îîn vivo.n vivo.
montarea – se realizeaza montarea – se realizeaza îîn mediu n mediu hidrosolubil – glicerina sau sirop Apathyhidrosolubil – glicerina sau sirop Apathy
34
REACŢII CITOENZIMOLOGICE
METODA PEARSEMETODA PEARSE- - eevidenvidenţţiaziazăă dehidrogenazele dehidrogenazele
METODA GÖMÖRY ( captura de METODA GÖMÖRY ( captura de ioni metaliciioni metalici))-- evidentierea evidentierea hidrolazelorhidrolazelor
35
METODA PEARSE
peroxidazeperoxidaze SSuccinatdehidrogenazuccinatdehidrogenazăă
APLICAŢII PRACTICEAPLICAŢII PRACTICE
- SDH – enzima marker a - SDH – enzima marker a mitocondriilormitocondriilor
36
METODA PEARSE
37
METODA GÖMÖRY( captura de ioni metalici)
ppentru evidentierea fosfatazelor entru evidentierea fosfatazelor
PRINCIPIUPRINCIPIU o reacţie de precipitare a ao reacţie de precipitare a acidulciduluiui
fosforic eliberat de enzimfosforic eliberat de enzimăă de la nivelul de la nivelul substratului substratului
38
METODA GÖMÖRY
Compusul rezultat din acCompusul rezultat din acţţiunea iunea enzimei reacenzimei reacţţioneazioneazăă cu cu:: sulfura de amoniu pentru a sulfura de amoniu pentru a
produce un precipitat negruproduce un precipitat negrusulfura de cobalt pentru hidrolaza sulfura de cobalt pentru hidrolaza
alcalinalcalinăăsulfura de plumb pentru cea acidsulfura de plumb pentru cea acidăă
39
METODA GÖMÖRY
APLICAŢII PRACTICEAPLICAŢII PRACTICE
- evidenţierea fosfatazei alcaline – enzimă - evidenţierea fosfatazei alcaline – enzimă cu rol de transport cu rol de transport
40
METODA GÖMÖRY
41
42
43