High Performance Liquid Cromatography (HPLC)

GAMBARAN UMUM

HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography, yaitu alat

yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube

dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase

bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam

volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika

sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam

organik.

PRINSIP KERJA

Prinsip kerja dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk

selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing

komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial

point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua

adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan

proses analisa.

METODE ANALISIS

Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif.

Penentuan Kualitatif

HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi.

Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan

standar.

Penentuan Kuantitatif

Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan

secara kuantitatif adalah Parameter percobaan sama antara standar dan sampel, Penentuan

berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama, Penentuan kadar dilakukan

berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu

retensi tertentu, Berdasarkan area kromatogram, dan Berdasarkan tinggi puncak

kromatogram. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam

kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen

dalam sample.

Fase normal HPLC

Normal phase HPLC (NP HPLC) merupakan metode yaang mengeksplorasi perbedaan

kepolaran antara analit dalam campuran dengan fase diam. semakin kuat interaksi fase diam

dengan analit, semakin lama retensi analit. Normal phase HPLC (NP HPLC) merupakan

metode yaang mengeksplorasi perbedaan kepolaran antara analit dalam campuran dengan

fase diam. semakin kuat interaksi fase diam dengan analit, semakin lama retensi analit.

Pemilihan normal phase HPLC berhubungan dengan kelarutan sampel dalam fase gerak.

Dengan pelarut utama nonpolar, biasanya fase normal dipilih sebagai metode untuk

pemisahan senyawa yang sangat hidrofobik, yang tidak larut dengan senyawa polar atau air.

Fase balik HPLC

Pada fase ini ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui

pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik

berupa atom karbon 8 atau 18. akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan

molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat

atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-

molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan

menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non

polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena

adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam

pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-

senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya,

senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat

dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui

kolom.

INSTRUMEN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk

memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase

gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

Wadah Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu

laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat

menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri

atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya

elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,

polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam

lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas

pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),

kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat

sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang

umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa

yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu

mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa

yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin

proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas

dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan

pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang

konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang

mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari

tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)

internal atau eksternal.

Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom

merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses

pemisahan solut/analit.

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN HPLC

Keuntungan dari penggunaan HPLC yaitu :

1. Lebih teliti

2. Sudah digital sehingga penggunaannya cepat dan lebih praktis

Sedangkan kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :

1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu

2. Hanya bisa digunakan untuk asam organik

3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi

4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas