luẬn vĂn thẠc sĨ ngÀnh: hÓa hỮu cƠ
TRANSCRIPT
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Phạm Long Khánh
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH: HÓA HỮU CƠ
NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC HỢP BAO CỦA B-CYCLODEXTRIN VỚI
MỘT SỐ POLYPHENOL ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG Y
SINH
Hà Nội – tháng 11 năm 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Phạm Long Khánh Lớp: Hóa Hữu cơ, Khóa 2018B
LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ
NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC HỢP BAO CỦA B-CYCLODEXTRIN VỚI
MỘT SỐ POLYPHENOL ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG Y
SINH
Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số: 8440114
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn 1: TS. Phạm Thị Lan
Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Ngoan
Hà Nội - 2020
1
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình của bản thân. Các nội dung nghiên cứu
và kết quả trong đề tài này là trung thực, chưa từng được ai công bố trong bất cứ
công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2020
Tác giả
Phạm Long Khánh
2
LỜI CẢM ƠN
--------
Đầu tiên, tôi xin chân thành biết ơn TS. Phạm Thị Lan và TS. Nguyễn Thị
Ngoan đã truyền đạt những kinh nghiệm nghiên cứu và hướng dẫn tôi trong suốt
quá trình tôi thực hiện công trình nghiên cứu và hoàn tất luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giảng dạy tại Học viện Khoa
học và Công nghệ đã truyền đạt những tri thức khoa học uyên bác, nhiều kinh
nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi trân trọng cảm ơn các đồng chí cán bộ công tác tại Viện Hóa học- Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong nhiệm vụ đo đạc,
phân tích mẫu nghiên cứu trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi chân thành cảm ơn Ban giám đốc Học viện Khoa học và Công nghệ, các
bạn học lớp Hóa Hữu cơ đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt hai năm học qua.
Thành quả này tôi xin kính tặng hai đấng sinh thành–một đời hy sinh vì con.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn anh, chị luôn cổ vũ, động viên tôi, là chỗ dựa tinh thần
vững chắc cho tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt khóa học.
Chân thành cảm ơn!
PHẠM LONG KHÁNH
3
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ......................................................... 5
DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................................. 6
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................ 7
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 9
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 11
1.1. KHÁI QUÁT VỀ NHÓM FLAVONOID VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC ... 11
1.1.1. Khái niệm chung về nhóm flavonoid ......................................................... 11
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo phân tử của nhóm chất quercetin ............................... 12
1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của quercetin và rutin .......................... 14
1.1.4. Các phương pháp chiết xuất rutin từ hoa hòe và điều chế quercetin............... 16
1.2. CYCLODEXTRIN VÀ PHỨC HỢP THÀNH PHẦN LỒNG NHAU ........ 17
1.2.1. Khái quát về các cyclodextrin và β-cyclodextrin ..................................... 17
1.2.2. Phức chất thành phần lồng nhau ............................................................... 21
1.2.3. Các phương pháp điều chế phức hợp thành phần lồng nhau (phức hợp
bao)…………………………………………………………………………………23
1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về phức nano của β-
cyclodextrin. ............................................................................................................. 25
1.3. PHỨC HỢP BAO CỦA Β-CYCLODEXTRIN VỚI NHÓM QUERCETIN
……………………………………………………………………………...30
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 32
2.1. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ............................................................................ 32
2.1.1 Thiết bị ......................................................................................................... 32
2.1.2 Dụng cụ ........................................................................................................ 32
2.2. CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ RUTIN TỪ HOA HÒE ................................... 32
2.2.1 Phương pháp chiết xuất rutin. ................................................................... 33
2.2.2 Tinh chế rutin .............................................................................................. 34
2.3. BÁN TỔNG HỢP QUERCETIN ................................................................. 35
2.4. TỔNG HỢP PHỨC NANO CỦA Β-CYCLODEXTRIN VỚI RUTIN VÀ
QUERCETIN ............................................................................................................. 36
2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 36
2.5.1 Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier ....................................... 36
2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC ......................................................... 37
4
2.5.3 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR ........... 38
2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ....................................... 40
2.5.5 Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis ........................................... 40
2.5.6 Phương pháp nhiệt lượng quét vi sai DSC ............................................... 42
2.5.7 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM) ........................................ 43
2.5.8 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa .............................................. 43
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 44
3.1.1 ĐẶC TRƯNG TÍNH CHẤT CỦA RUTIN VÀ QUERCETIN ................... 44
3.1.1 Kiểm tra và xác định cấu trúc rutin và quercetin ................................... 44
3.1.2 Kiểm nghiệm độ tinh sạch rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. ......... 52
3.2.1 HIỆU SUẤT TỔNG HỢP PHỨC CỦA β-CYCLODEXTRIN VỚI MỘT SỐ
POLYPHENOL TRONG DUNG MÔI HỖN HỢP H2O-EtOH ............................... 53
3.3.1 PHÂN TÍCH MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA ĐẶC TRƯNG VÀ HÌNH
THÁI CẤU TRÚC CỦA PHỨC HỢP β-CYCLODEXTRIN-POLYPHENOL ....... 55
3.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại ............................................................ 55
3.3.2 Kết quả phân tích DSC ............................................................................... 58
3.3.3 Kết quả phân tích hình thái cấu trúc ........................................................ 60
3.3.4 Kết quả xây dựng giản đồ pha của quá trình hoà tan ............................. 61
3.3.5 Kết quả xác định độ hòa tan của rutin và phức hợp [RuTβCD] ............ 63
3.3.6. Kết quả xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH của rutin và phức hợp
[RuT-HPβCD] .......................................................................................................... 64
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 66
4.1 KẾT LUẬN ................................................................................................... 66
4.2 KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 68
5
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
1H-NMR Phổ cộng hưởng từ proton.
13C-NMR Phổ cộng hưởng từ cacbon 13
βCD β-cyclodextrin
d doublet
dd doublet of doublet
DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
DSC Phân tích nhiệt quét vi sai
FTIR Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier
GC Sắc ký khí
HPβCD 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
m multiplet
nm nanomet
PCL Poly(-Caprolactone)
PEO Poly(ethylene oxide)
PLA Polylactide
PMMA Poly(methyl methacrylate)
Quer Quercetin
s singlet
RuT Rutin
TEM Transmission Electron Microscopy
TLC Thin Layer Chromatography
m Micromet
WHO The World Health Organization
δH Độ dịch chuyển hóa học của proton
δC Độ dịch chuyển hóa học của carbon
6
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc tính của Cyclodextrin……………………………………………...…22
Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của quercetin bán tổng hợp
và mẫu quercetin so sánh.....................................................................................55
Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của rutin phân lập từ hoa hòe
và mẫu rutin so sánh...........................................................................................58
Bảng 3.3: Hiệu suất tổng hợp phức cyclodextrin-polyphenol trong dung môi
hỗn hợp EtOH-H2O.............................................................................................61
Bảng 3.4:
Bảng 3.5: Phương trình tương quan giữa % bắt gốc tự do DPPH và nồng độ dược
chất của rutin và phức hợp và giá trị IC50 tương ứng................................75
7
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Khung cấu tạo phân tử flavonoid.........................................................13
Hình 1.2: Phân loại các flavonoid.......................................................................14
Hình 1.3: Cấu tạo phân tử quercetin...................................................................15
Hình 1.4: Cấu tạo phân tử rutin..................................................................... . .16
Hình 1.5: phản ứng thủy phân rutin trong môi trường axit........................... . .20
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học và hình dạng phân tử của β-cyclodextrin (βCD)....21
Hình 1.7: Một số cyclodextrin tự nhiên điển hình……………………………….....21
Hình 1.8: So sánh cấu trúc βCD (R=H) và HPβCD (R=OH).............................24
Hình 1.9: Ảnh SEM của các hợp chất: (A) – lycopene; (B) – phức nano
lycopene/βcyclodextrin sử dụng DCM làm dung môi; (C) – β-cyclodextrin;
(D) – phức nano lycopene/βcyclodextrin sử dụng DMSO làm dung môi............29
Hình 1.10: Độ tan tương đối của dexibuprofen thuần, phức hợp với β-cyclodextrin
và nano hydrogel β-cyclodextrin trong các dung dịch có pH bằng 1,2; 6,8 và nước
cất pha tiêm (WFI)....................................................................30
Hình 1.11: Ảnh FE-SEM của β-cyclodextrin (a) và hạt nano hydrogel β-
cyclodextrin (b)....................................................................................................30
Hình 1.12: Sơ đồ tạo phức chất của curcumin và β-cyclodextrin........................32
Hình 1.13: Hình ảnh minh họa cơ chế tạo phức nano của β-cyclodextrin
với alginat............................................................................................................33
Hình 1.14: Ảnh SEM của β-cyclodextrin (a), alginat/Ca2+(b) và
alginat/Ca2+/βcyclodextrin (c).............................................................................34
Hình 1.15: Ảnh SEM (a) và TEM với độ phóng đại 30000 (b) lần và 100000 (c) lần
phức của ketoprofen với hạt nano alginat/Ca2+/β-cyclodextrin....................35
Hình 2.1: Sơ đồ chiết xuất, tinh chế từ nụ hoa hòe.............................................38
Hình 2.2: Chiết xuất rutin trong Na2CO3 2%......................................................39
Hình 2.3: Các mẫu khảo sát tinh chế rutin bằng axit acetic (1: dung dịch rutin thô
trong nước, rutin Đ/c : dung dịch rutin đối chứng trong nước)…………..…41
Hình 2.4: Quercetin thu được sau tinh chế..........................................................42
Hình 2.5: Cách tính giá trị Rf. .............................................................................43
8
Hình 2.6: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng..................................................44
Hình 2.7: Khoảng chuyển dịch hóa học của một số proton.................................45
Hình 2.8: Khoảng chuyển dịch hóa học các dạng carbon chọn lọc....................46
Hình 3.1: Sắc ký bản mỏng đối chứng rutin (a) và quercetin (b) (A: rutin thu được
từ nghiên cứu; B: rutin đối chứng; 1: quercetin thu được từ nghiên cứu;
2: quercetin đối chứng)…………………………………………………………….…..51
Hình 3.2: Sắc ký khảo sát quá trình thủy phân rutin trong HCl 5%....................52
Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của quercetin.................................................................53
Hình 3.4: Phổ 13C-NMR của quercetin................................................................54
Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của rutin........................................................................56
Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của rutin.......................................................................57
Hình 3.7: Phổ HPLC mẫu rutin tinh chế trong axit acetic ( a: nồng độ axit acetic
20%; b: nồng độ axit acetic 30%; c: nồng độ axit acetic 40%; d: nồng độ axit
acetic 50%)..........................................................................................................58
Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của rutin (a), phức chất [RuβCD](b) và βCD(c)......62
Hình 3.9: Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier của Quer (1), HPβCD (2) và phức hợp
[QuerHPβCD]..............................................................................................64
Hình 3.10: Các đường cong DSC của rutin (a); phức chất nano rutin (b) và β-CD
(c)..................................................................................................................66
Hình 3.11:Các đường cong DSC của Quer (1), HPβCD (2) và phức hợp (3....)67
Hình 3.12: Ảnh FESEM của các hạt RuT (a), Quer (b), [RuTβCD] (c) và
[QuerHPβCD] (d)...............................................................................................68
Hình 3.13: Phổ UV-Vis của quercetin khi không có HPβCD (đường cong a)
và khi có HPβCD với nồng độ tăng dần (đường cong 1-5)...............................70
Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ của cyclodextrin và
độ tan của RuT (a) và Quer (b)...........................................................................71
Hình 3.15: Phần trăm hòa tan của RuT và phức [RuT-βCD] theo thời gian trong
môi trường pH 7,4.....................................................................................72
Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa % bắt gốc tự do DPPH của rutin
và phức [RuT-HPβCD] theo giá trị nồng độ của rutin..............................73
9
MỞ ĐẦU
Hiện nay, việc nghiên cứu và bào chế dược phẩm từ các nguồn nguyên liệu
thiên nhiên đang là hướng nghiên cứu hấp dẫn bởi tính ưu việt, đa dạng và ít tác
dụng phụ. Flavonoid là nhóm chất phổ biến trong thực vật, có mặt trong hầu hết
các bộ phận của các loài thực vật bậc cao và có nhiều tác dụng sinh học. Rutin và
quercetin là hai trong số rất nhiều hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên được sử dụng
phổ biến trong điều trị bệnh nhờ những hoạt tính quý báu như hoạt tính chống oxi
hóa, chống dị ứng, kháng viêm, chống ung thư và khối u. Tuy nhiên, rutin và
quercetin lại kém tan trong nước, do đó, liều lượng cần để đưa vào cơ thể khá lớn,
độc tính cao, nhưng sinh khả dụng lại không đủ. Hiện nay, với việc ứng dụng công
nghệ nano trong ngành sản xuất dược phẩm, độ tan của nhiều dược chất đã được
cải thiện đáng kể. Trong đó, cyclodextrin được biết đến với khả năng bao gói giúp
độ tan của nhiều loại dược chất được tăng lên rõ rệt.
Do đó, trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu tạo phức hợp bao của β-
cyclodextrin với một số polyphenol định hướng ứng dụng trong y sinh” rutin sẽ
được chiết xuất và tinh chế từ hoa hòe có hàm lượng và hiệu suất cao; sau đó
quercetin sẽ được bán tổng hợp từ rutin bằng phương pháp thủy phân trong môi
trường axit; quá trình tạo phức với cyclodextrin để làm tăng độ tan của dược chất
sẽ được tiến hành. Sản phẩm của quá trình tạo phức sẽ được phân tích đặc trưng
bằng một số phương pháp hóa-lý hiện đại, đồng thời hoạt tính chống oxi của các
hoạt chất sẽ được khảo sát.
Mục tiêu của đề tài
- Chiết xuất và tinh chế thành công rutin từ hoa hòe có hàm lượng cao.
- Bán tổng hợp thành công quercetin từ rutin bằng phương pháp thủy phân
trong môi trường acid.
- Tổng hợp thành công phức chất rutin/β-cyclodextrin, quercetin/2-
hydroxypropyl-β-cyclodextrin với kích thước nano có độ tan cao hơn độ tan
của rutin và quercetin thuần.
Nội dung nghiên cứu
10
- Chiết xuất rutin từ hoa hòe sử dụng dung dịch kiềm loãng Na2CO3 2%.
- Tinh chế rutin bằng hai phương pháp: phương pháp kết tinh trong cồn và
phương pháp kết tủa bằng acid-base.
- Bán tổng hợp quercetin từ rutin trong môi trường axit.
- Tổng hợp phức hợp của rutin và quercetin với cyclodextrin có kích thước
nanomet.
- Đặc trưng sản phẩm tạo phức, xác định độ tan của dược chất bằng các
phương pháp hóa–lý hiện đại: FTIR, DSC, SEM, DLS, UV-Vis…
- Xác định hoạt tính chống oxi hóa của rutin và quercetin trước và sau khi tạo
phức bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn lựa các
điều kiện thích hợp để cải thiện độ tan của một số flavonoid trong nhóm quercetin
bằng phương pháp tạo phức hợp bao với cyclodextrin; là cơ sở cho việc nghiên cứu
hoàn thiện và phát triển sản phẩm rutin, quercetin bao gói bằng cyclodextrin ứng
dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Bên cạnh đó, các kết
quả nghiên cứu sẽ được sử dụng trong các bài giảng và phòng thí nghiệm trong các
khóa học dành cho cử nhân và thạc sĩ chuyên ngành "Hóa lý và hóa lý thuyết", và
“hóa hữu cơ”.
11
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁI QUÁT VỀ NHÓM FLAVONOID VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
1.1.1. Khái niệm chung về nhóm flavonoid
Flavonoid là nhóm chất phổ biến trong thực vật, có mặt trong hầu hết các bộ
phận của các loài thực vật bậc cao và có nhiều tác dụng sinh học. Có thể mô tả
khung công thức phân tử của flavonoid là: C6 (vị trí A) - C3 (vị trí C) - C6 (vị trí
B), chúng còn được gọi là polyphenolic do các tiểu phần có cấu trúc từ vòng thơm
benzen (hình 1.1). Flavonoid được ví von như “những người thợ sửa chữa sinh hóa
của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống dị ứng,
virus và các chất gây ra ung thư. Nhờ vậy chúng mang lại những hoạt tính quý báu.
Có thể nói hoạt tính chống oxi hóa là hoạt tính đặc trưng nhất của các hợp chất
flavonoid nhờ vào các đặc điểm cấu trúc phân tử như sau [1]:
- Chứa các nhóm hydroxy liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng
nhường hydro giúp các flavonoid có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa
khử, bắt giữ các gốc tự do.
- Chứa các vòng thơm (vòng benzen, vòng dị nguyên tố) và các liên kết bội
(liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp bền hóa các gốc tự do được
hình thành khi chúng bắt giữ các phần tử oxi hoạt động.
- Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như catechol
giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động.
Hình 1.1: Khung cấu tạo phân tử flavonoid.
12
Các flavonoid có thể được chia nhỏ thành các phân nhóm khác nhau tùy
thuộc vào vị trí cacbon của vòng C mà vòng B gắn vào cùng mức độ không bão
hòa và oxy hóa của vòng C (hình 1.2). Các flavonoid có vòng B được liên kết ở vị
trí C-3 của vòng C được gọi là isoflavone. Những chất trong đó vòng B được liên
kết ở vị trí C-4 được gọi là neoflavonoid, trong khi những chất trong đó vòng B
được liên kết ở vị trí C-2 có thể được chia nhỏ hơn nữa thành nhiều nhóm con trên
cơ sở đặc điểm cấu trúc của vòng C. Các phân nhóm này là: flavon, flavonols,
flavanones, flavanonol, flavanols hoặc catechin, anthocyanins và chalcones [2].
Hình 1.2: Phân loại các flavonoid.
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo phân tử của nhóm chất quercetin
Quercetin được phân loại là flavonol, một trong sáu phân lớp của các hợp
chất flavonoid. Theo IUPAC, công thức phân tử quercetin là 3,3',4',5,7-
pentahydroxyflavanone (hoặc 3,3',4',5,7-pentahydroxy-2-phenylchromen-4-one).
Trong cấu tạo, quercetin có 5 nhóm OH gắn ở các vị trí 3, 5, 7, 3’ và 4’ (hình 1.3)
[3].
13
Hình 1.3: Cấu tạo phân tử quercetin.
Quercetin là một aglycone, không gắn thêm gốc đường. Quercetin có màu
vàng, hoàn toàn không hòa tan trong nước lạnh, hòa tan kém trong nước nóng,
nhưng hòa tan khá tốt trong rượu và lipid. Một glycoside quercetin được hình thành
bằng cách gắn một nhóm glycosyl (đường như glucose, rhamnose, hoặc rutinose)
để thay thế cho một trong các nhóm OH (thường ở vị trí C-3). Nhóm glycosyl kèm
theo có thể thay đổi độ hòa tan, hấp thụ. Theo nguyên tắc chung, sự hiện diện của
nhóm glycosyl (quercetin glycoside) làm tăng khả năng hòa tan trong nước so với
quercetin aglycone [4]. Một số dẫn xuất quercetin cũng chứa disaccharide, chẳng
hạn như rutinose, bao gồm rhamnose và nhóm glucose và được đặt tên là α-L-
rhamnopyranosyl- (1→6)- β-D-glucopyranose. Avicularin chứa arabinofuranose
gắn với quercetin 3-OH. Hyperoside có nhóm 3-O-galactoside (oxy liên kết với
nhóm galactoside) ở vị trí C-3 chứ không phải là nhóm OH. Isoquercitin (được tìm
thấy trong xoài) có 3-O-glucoside [5].
Hình 1.4: Cấu tạo phân tử rutin.
14
Rutin (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone-3-rhamnoglucoside) là một loại
flavonoid thuộc nhóm flavon được phân lập lần đầu tiền vào năm 1842 từ cây Cửu
lý hương (Ruta graveolen) bởi Veyss [6].
Rutin cũng được coi là một loại vitamin P dạng glycoside chính (một dạng 3-
Orhamnoglucoside) của quercetin (hình 1.4). Bột rutin còn có đặc điểm là bột kết
tinh màu vàng hoặc hơi vàng ánh xanh, để ngoài ánh sáng màu có thể hơi sẫm lại.
Tinh thể rutin ngậm 3 phân tử nước, chuyển sang dạng khan khi sấy 12 giờ ở
100°C dưới áp suất giảm (10mmHg). Do cấu trúc là một glycoside nên rutin rất dễ
bị thủy phân bởi các men có sẵn trong dược liệu hoặc bởi các axit. Với dung dịch
kiềm nó rất ít bị ảnh hưởng, chỉ ở điều kiện dung dịch kiềm đặc và có nhiệt độ cao
thì cấu trúc của rutin bị phá vỡ, cụ thể là vòng C sẽ mở tạo thành một dẫn chất acid
thơm và một dẫn chất phenol [6].
1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của quercetin và rutin
Quercetin là một trong những bioflavonoid quan trọng có trong hơn 20 loại
thực vật, được biết đến với tác dụng chống viêm, hạ huyết áp, giãn mạch, chống vi
khuẩn và chống tăng cholesterol máu. Một số tác dụng có lợi khác bao gồm bảo vệ
tim mạch, chống ung thư và khối u, chống loét, chống dị ứng, chống tiểu đường,
tác dụng bảo vệ dạ dày, hạ huyết áp, điều hòa miễn dịch và chống nhiễm trùng.
Người ta cũng phát hiện ra rằng quercetin và các chất chuyển hóa liên hợp của
quercetin có thể bảo vệ hồng cầu khỏi tổn thương màng do hút thuốc gây ra [7],
[8].
Quercetin kết hợp với axit ascorbic làm giảm tỷ lệ tổn thương do oxy hóa đối
với các tế bào lympho và cấu trúc mạch thần kinh trên da và ức chế tổn thương tế
bào thần kinh. Nó được biết là có tác dụng bảo vệ tế bào não chống lại oxy hóa, tác
nhân làm tổn thương mô dẫn đến bệnh Alzheimer và các bệnh thần kinh khác [9].
Quercetin có đặc tính chống ung thư mạnh và được biết đến như là chất cảm
ứng apoptosis, nhờ đó làm giảm sự phát triển của khối u trong não, gan, ruột kết và
các mô khác và ức chế sự lây lan của các tế bào ác tính. Quercetin ức chế Cr[VI],
15
một biến đổi tế bào gây ung thư hóa học làm giảm khả năng hiển thị của tế bào, tạo
ROS và tăng MicroRNA-21 (miR-21) trong ung thư ruột kết ở người [10], [11].
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng quercetin ức chế tiết axit dạ dày và quá trình
peroxy hóa lipid của tế bào dạ dày do đó đóng vai trò như chất bảo vệ dạ dày. Nó
cũng ức chế sự lây nhiễm Helicobacter pylori [7].
Quercetin được biết là có tác dụng kháng khuẩn đối với hầu hết các chủng vi
khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn ảnh hưởng đến hệ tiêu hóa, hô hấp, tiết niệu và da. Khả
năng chống nhiễm trùng và chống tái phát của chúng có thể góp phần vào các đặc
tính kháng vi-rút. Các loại virus thường phản ứng với quercetin là adenovirus, virus
herpes simplex, virus viêm não Nhật Bản và virus hợp bào hô hấp [12], [13], [14].
Quercetin có tác dụng chống dị ứng bằng cách ức chế giải phóng histamine
từ các tế bào mast và các chất dị ứng khác, do đó hoạt động như một chất kháng
histamine tự nhiên. Khả năng ngăn ngừa các tác động dị ứng của quercetin có ý
nghĩa to lớn trong việc điều trị và phòng ngừa bệnh hen suyễn và viêm phế quản
[15].
Tương tự quercetin, rutin cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong
y học hiện đại. Rutin có tác dụng làm bền vững thành mạch, làm giảm tính thấm
của mao mạch, tăng sự bền vững của hồng cầu. Rutin có hoạt tính của vitamin P
bởi vì cấu trúc có 2 nhóm OH phenolic tự do. Rutin thể hiện hoạt tính chống đái
tháo đường bằng cách ức chế các cytokine gây viêm, đồng thời cải thiện khả năng
chống oxy hóa và lipid huyết tương trong chế độ ăn nhiều chất béo của người bệnh
tiểu đường týp 2 do streptozotocin gây ra. Do đó, rutin hữu ích trong điều trị bệnh
tiểu đường cùng với các loại thuốc trị tiểu đường tiêu chuẩn [16].
Rutin có thể đóng vai trò như một tác nhân tiềm năng để kiểm soát đường
huyết thông qua việc tăng cường hoạt động kinase của thụ thể phụ thuộc insulin, từ
đó tạo ra đường truyền tín hiệu insulin và làm tăng chuyển vị của chất vận chuyển
glucose 4 và tăng hấp thu glucose [17].
Rutin bảo vệ chống lại các tác động thoái hóa thần kinh của sự tích tụ prion
bằng cách tăng sản xuất các yếu tố hướng thần kinh và ức chế sự kích hoạt
16
apoptotic trong các tế bào thần kinh. Những kết quả này cho thấy rutin có thể có lợi
ích lâm sàng đối với các bệnh prion và các rối loạn thoái hóa thần kinh khác [18].
Rutin hữu ích như một chất bổ trợ trong điều trị bằng chất phóng xạ, vì flavonoid
này làm tăng sự hấp thụ iodide của tuyến giáp mà không ảnh hưởng nhiều đến chức
năng tuyến giáp [19].
1.1.4. Các phương pháp chiết xuất rutin từ hoa hòe và điều chế
quercetin
Rutin thường được chiết xuất bằng nước, dung dịch kiềm hoặc một số
ancohol như ethanol, methanol...
Chiết xuất rutin bằng dung dịch kiềm và axit loãng:
Phương pháp của tác giả T.R.Seshadri: hoa hòe được chiết xuất bằng dung
dịch nước chứa hỗn hợp NaOH và boric (tỉ lệ 1:2). Lọc, axit hóa dịch chiết thu
được rutin với hiệu suất 13% [20].
Phương pháp của các tác giả Nguyễn Văn Đàn- Đỗ Tất Lợi: Cân 200g hoa
hòe đã sấy khô ở 60-70oC, thêm vào 2L nước, đun sôi trong 1 giờ. Lọc nóng qua
vải, bã còn lại đun với lượng nước mới và lọc (làm 3 lần). Gộp chung tất cả các
dịch lọc, để nguội có rutin kết tủa vàng (thô). Kết tinh lại rutin thô bằng cách hòa
tan trong nước sôi, lọc nóng, để nguội. Rutin kết tủa, lọc lấy sản phẩm, sấy khô ở
70oC thu được bột rutin màu vàng thẫm [20].
Phương pháp của nhóm tác giả thuộc viện Nghiên cứu và phát triển sản phẩm
thiên nhiên (IRDOP) hoa hòe giã dập, rửa bằng HCl 0,5% rồi rửa bằng nước cho
hết axit. Chiết bằng dung dịch Na2CO3 1% hoặc natri borat 1-3%. Rutin sẽ tan
nhiều do có chức phenol trong phân tử. Rút dịch chiết ra và tiếp tục chiết cho đến
khi hết rutin (3-4 lần). Gộp các dịch chiết lại, dùng HCl điều chỉnh đến pH=2 ta có
rutin kết tủa. Lọc và rửa tủa bằng nước đến pH=4-5. Hoà tan, kết tinh lại trong cồn
thu được rutin tinh khiết [20].
Chiết xuất rutin bằng ancohol:
Phương pháp của nhóm tác giả Rusu, Mircea, Eugenia: Nụ hòe hoặc hoa hòe
được chiết bằng MeOH-H2O, lọc bỏ bã thu được thể huyền phù. Sau đó cho hỗn
17
hợp isopropanol-dầu (1:1) vào, đem lọc thu được rutin thô. Rutin thô được xử lý
bằng NaHCO3-NH3. Tinh chế lại lần nữa bằng EtOH [20].
Đun hồi lưu 1 kg hoa hòe sấy khô với 4L cồn 90o trong 2 giờ. Rút dịch chiết,
bã còn lại đun với 4L cồn mới và lọc (làm lại 3 lần). Gộp chung dịch lọc rồi cất thu
hồi dung môi đến khi còn 5L cồn. Đề nguội thu được rutin thô. Kết tinh lại rutin
thô trong cồn, tẩy màu bằng than hoạt ta có rutin tinh khiết. Phương pháp chiết
bằng cồn cho hiệu suất cao, tỷ lệ rutin trong hoa hoè có thể lên đến 20-30% [21].
Điều chế quercetin bằng thủy phân rutin:
Hình 1.5: phản ứng thủy phân rutin trong môi trường axit.
Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Jinwoo Yang và cộng sự, rutin được hòa
tan trong hỗn hợp dung môi axit và cồn (80% etanol và HCl 1,0 M trong nước).
Dung dịch được lắc trong máy lắc cách thủy ở 75°C trong 5 giờ với sinh hàn hồi
lưu. Khi phản ứng hoàn tất, sản phẩm phản ứng là quercetin được làm lạnh trong
nước lạnh. Dung môi của sản phẩm phản ứng được loại bỏ bằng cách cô quay chân
không và đông khô [22].
1.2. CYCLODEXTRIN VÀ PHỨC HỢP THÀNH PHẦN LỒNG NHAU
1.2.1. Khái quát về các cyclodextrin và β-cyclodextrin
Cyclodextrin là một nhóm các sản phẩm tự nhiên được hình thành trong quá
trình tiêu hóa cellulose của vi khuẩn. Cyclodextrin có cấu trúc là các oligosaccarit
tuần hoàn, bao gồm các đơn vị α-D-glucopyranose liên kết với nhau, tạo ra khoang
trung tâm ưa dầu và bề mặt ngoài ưa nước. Do cấu tạo dạng ghế của các đơn vị
glucopyranose, cyclodextrin có hình dạng giống một hình nón cụt hơn là hình trụ
hoàn hảo. Các nhóm chức hydroxyl được định hướng ra bên ngoài hình nón, các
nhóm hydroxyl chính của phần đường ở cạnh hẹp của hình nón và các nhóm
18
hydroxyl thứ cấp ở cạnh rộng hơn. Khoang trung tâm được nối bởi khung nguyên
tử carbon và oxy thuộc nhóm ether của phần glucose, tạo cho nó một đặc tính
lipophilic. Độ phân cực của khoang được ước tính tương tự như dung dịch etanolic.
Các α-, β- và γ-cyclodextrin tự nhiên bao gồm lần lượt sáu, bảy và tám đơn vị
glucopyranose tương ứng [23].
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học và hình dạng phân tử của β-cyclodextrin (βCD).
Các α- và β-cyclodextrin tự nhiên không giống như γ-cyclodextrin, không
thể bị thủy phân bởi các amylase trong nước bọt và tuyến tụy của con người. Tuy
nhiên, cả α- và β-cyclodextrin đều có thể được lên men bởi hệ vi sinh đường ruột.
Cyclodextrin hydrophilic được coi là không độc hại ở liều uống thấp đến trung
bình. Các dẫn xuất cyclodextrin lipophilic, chẳng hạn như cyclodextrin bị methyl
hóa, ở một mức độ nào đó được hấp thụ từ đường tiêu hóa vào hệ tuần hoàn và đã
được chứng minh là độc hại sau khi tiêm tĩnh mạch [20].
Hình 1.7: Một số cyclodextrin tự nhiên điển hình.
19
Bảng 1.1. Đặc tính của Cyclodextrin [24].
Đặc tính α-
Cyclodextrin
β-
Cyclodextrin
γ-
Cyclodextrin
Số lượng đơn vị glucopyranose 6 7 8
Khối lượng phân tử (g / mol) 972 1135 1297
Độ hòa tan trong nước (% w /
v) ở 25ºC
14.5 1.85 23.2
Đường kính ngoài (Å) 14.6 15.4 17.5
Đường kính khoang (Å) 4.7-5.3 6.0-6.5 7.5-8.3
Chiều cao của hình xuyến (Å) 7.9 7.9 7.9
Thể tích khoang (Å3) 174 262 427
Khoảng 30 sản phẩm dược phẩm khác nhau có chứa cyclodextrin hiện đang
có mặt trên thị trường toàn thế giới. Trong ngành công nghiệp dược phẩm,
cyclodextrin chủ yếu được sử dụng làm chất tạo phức để tăng khả năng hòa tan
trong dung dịch nước, để tăng tính khả dụng sinh học và tính ổn định của chúng.
Ngoài ra, cyclodextrin có thể được sử dụng để làm giảm hoặc ngăn ngừa kích ứng
đường tiêu hóa và mắt, giảm hoặc loại bỏ mùi hoặc vị khó chịu, ngăn ngừa tương
tác giữa thuốc và thuốc, hoặc để chuyển đổi dầu và thuốc dạng lỏng thành dạng bột
tinh thể hoặc vô định hình [23].
β–cyclodextrin (βCD) là hợp chất được sử dụng phổ biến nhất trong nhóm
cyclodextrin vì tính an toàn và hiệu quả của nó. βCD được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực: dược phẩm, thực phẩm, dệt may…[23]
Trong lĩnh vực dược phẩm, βCD chủ yếu được sử dụng làm chất tạo phức để
tăng khả năng hòa tan trong nước với những hoạt chất có độ hòa tan trong nước
kém, để tăng tính khả dụng sinh học và tính ổn định của hoạt chất. Ngoài ra, βCD
20
đã được sử dụng để làm giảm hoặc ngăn ngừa kích ứng đường tiêu hóa hoặc mắt,
giảm hoặc loại bỏ mùi vị khó chịu; ngăn chặn tương tác thuốc; chuyển đổi dầu và
thuốc dạng lỏng thành bột tinh thể hoặc bột vô định hình. Một số nghiên cứu cho
thấy βCD được liên kết chéo, khả năng làm chậm quá trình giải phóng thuốc tan
trong nước qua màng bán thẩm thấu đóng vai trò điều chế quá trình giải phóng
thuốc [23].
Trong lĩnh vực thực phẩm, βCD có thể bao che mùi lạ và xấu của thực phẩm,
cải thiện sự ổn định của hương liệu và gia vị, giữ cho thực phẩm khô hoặc ẩm theo
yêu cầu sản xuất. Bên cạnh đó, βCD bảo vệ các hợp chất dễ bay hơi từ sự bay hơi,
và các sản phẩm hóa học nhạy cảm trong quá trình oxy hóa hoặc bị suy thoái vì ánh
sáng mặt trời [23].
Gần đây, có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của βCD đến công nghiệp dệt
may. Cụ thể, βCD có thể thay thế vai trò của chất hoạt động bề mặt được sử dụng
trong quá trình nhuộm mà không làm giảm chất lượng nhuộm, cải thiện độ bền giặt
trong trường hợp nhuộm vải sợi nylon và bông. Ngoài ra, một số nghiên cứu cho
thấy βCD có hiệu quả trong chống khuẩn, chống UV, xua đuổi côn trùng và là tác
nhân lưu hương… [23]
Tuy nhiên, khả năng hòa tan của các cyclodextrin tự nhiên như βCD không
cao, do đó nhiều nghiên cứu đã sử dụng cyclodextrin bán tổng hợp như 2-
hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) để cải thiện tính năng hòa tan và sinh khả
dụng của nhiều loại thuốc kị nước. HPβCD cũng có tính an toàn cao hơn các
cyclodextrin tự nhiên nên có thể sử dụng ở dạng bào chế qua đường tiêm. Gần đây,
các nghiên cứu về sự tạo phức của các cyclodextrin biến tính như HPβCD đã tăng
lên đáng kể [25,26,27].
Có thể dễ dàng nhận thấy cấu trúc không gian của βCD và HPβCD là giống
nhau, đều là hình nón cụt rỗng (hình 1.8). Tuy nhiên, HPβCD có kích thước lớn
hơn, dẫn đến khoảng không gian trống của HPβCD lớn hơn βCD. Điều này giúp
HPβCD có lợi thế hơn trong việc tạo phức hợp bao, vì các hoạt chất khác có thể dễ
dàng đi vào không gian rỗng.
21
Hình 1.8: So sánh cấu trúc βCD (R=H) và HPβCD (R=OH) [28].
1.2.2. Phức chất thành phần lồng nhau
Phức chất thành phần lồng nhau hay phức hợp bao là một dạng phức hợp hóa
học độc đáo, trong đó một phân tử được bao bọc trong một phân tử hoặc cấu trúc
của các phân tử khác. Sự kết hợp này được đặc trưng bởi sự vắng mặt của các liên
kết hóa học thông thường, trong đó, phân tử được bao bọc (phân tử khách) có kích
thước và hình dạng phù hợp để vừa với một khoang trong cấu trúc vững chắc được
tạo thành bởi các phân tử chất mang (phân tử chủ). Không gian rỗng do phân tử
chủ hình thành có thể ở dạng kênh, dạng lồng hoặc dạng lớp. [29]
Các phức hợp bao được phân loại như sau: [29]
- Các phức hợp bao đa phân tử: có khoang trống dạng kênh và khoang trống
dạng lồng.
- Các phức hợp bao đơn phân tử.
- Sản phẩm của phản ứng xanh-iot.
- Các phức hợp bao cao phân tử.
22
Các phức hợp bao đa phân tử: một số phân tử khách định hướng trong một
mạng tinh thể sắp xếp lỏng lẻo. Các phân tử riêng lẻ của mạng tinh thể (phân tử
chủ) được liên kết với nhau bằng các liên kết hydro để tạo thành một cấu trúc dạng
kênh hoặc lồng bao quanh phân tử khách. Tuy nhiên, chúng không được sắp xếp
theo một tỷ lệ số nguyên so với các phân tử khách như mong đợi của lý thuyết phối
trí.
Thuật ngữ "clathrate", có nguồn gốc từ tiếng Latin "clathratus," có nghĩa là
"được bao bọc bởi các thanh của lưới", được sử dụng để mô tả cấu trúc giống như
dạng lồng của các phức hợp bao hydroquinone. Các “clathrate” tạo nên nhóm thứ
hai của các phức hợp đa phân tử. Ngoài hydroquinone, nhóm này bao gồm: hydrat
nước hoặc khí, tetraetylamoni hydrat, phenol, hợp chất dianin, sản phẩm của sự
ngưng tụ phenol và mesityl oxit, xycloveratril và một số phức chất trong đó cấu
trúc dạng lồng là chất vô cơ còn chất khách là chất hữu cơ. Mặc dù trong sách
“Tóm tắt hóa học” và một số nguồn tài liệu tham khảo khác sử dụng thuật ngữ
“clathrate” như một mô tả chung cho các phức hợp bao, tuy nhiên thuật ngữ này
thích hợp hơn để mô tả các phức hợp bao đa phân tử dạng lồng.
Liên quan đến các phức hợp bao cả đa phân tử và đơn phân tử là sản phẩm
của phản ứng xanh-iot. Iốt tương tác với tinh bột, cyclodextrin, flavon, coumarin,
benzophenone, benzamide, cellulose và axit barbituric để tạo ra hợp chất màu xanh
lam. Hiện tượng này được cho là do sự trùng hợp của iốt trong các kênh duy nhất
được tạo thành bởi các phức hợp này.
Các thuật ngữ phức hợp bao đại phân tử và “rây phân tử” đã được sử dụng để
mô tả nhóm phức hợp bao cao phân tử. Các hợp chất này đã được nghiên cứu rộng
rãi và được sử dụng trong các quy trình công nghiệp và phòng thí nghiệm.
Phức hợp bao đơn phân tử thường tương tác trên cơ sở 1: 1 với phân tử
khách, được bao bọc trong một khoang trong phân tử chủ. Các hợp chất
cyclodextrin, bis N, N’-alkylenebenzidine, thuốc kháng sinh và một số protein nhất
định được phân loại trong nhóm này. Một số protein nhất định có thể hoạt động
như các phức hợp bao đơn phân tử, đưa ra lời giải thích khả thi để hiểu được các
tương tác kháng nguyên-kháng thể, phản ứng enzyme và các quá trình phụ thuộc
vào hình dạng khác.
23
1.2.3. Các phương pháp điều chế phức hợp thành phần lồng nhau (phức
hợp bao)
a. Phương pháp trộn vật lý [30]
Một hỗn hợp vật lý rắn của hoạt chất và chát mang (thường là cyclodextrin)
được điều chế đơn giản bằng cách biến đổi cơ học. Trong quy mô phòng thí
nghiệm, cyclodextrin và hoạt chất được trộn đều với nhau bằng cách nghiền nhỏ
trong cối và đi qua tấm sàng có kích thước lỗ thích hợp để tạo ra hạt có kích thước
mong muốn. Trong quy mô công nghiệp, việc sản xuất hỗn hợp vật lý dựa trên sự
pha trộn hoạt chất với cyclodextrin trong máy tạo hạt khối lượng lớn trong 30 phút.
Các hỗn hợp vật lý dạng bột này sau đó được bảo quản trong phòng ở điều kiện
nhiệt độ và độ ẩm có kiểm soát.
b. Phương pháp nhào [30]
Kỹ thuật nhào trộn thích hợp với những hoạt chất tan trong nước kém, vì
hoạt chất tan chậm trong quá trình tạo phức. Kỹ thuật nhào mang lại hiệu quả rất
tốt trong việc hình thành phức bao nhưng không thích hợp để sản xuất quy mô lớn.
Đầu tiên, chất lỏng hoặc chất rắn hòa tan được cho vào hỗn hợp chất mang
(cyclodextrin) và nhào (trong cối), sau đó hỗn hợp này được làm khô. Chất rắn thu
được được rửa bằng một lượng nhỏ dung môi để loại bỏ các phần tử tự do bị hấp
phụ trên bề mặt cyclodextrin và sau đó được làm khô trong chân không. Sự hình
thành phức hợp cyclodextrin bằng phương pháp nhào trộn đã được thử nghiệm với
ibuprofen, axit béo omega-3 trong tinh dầu thymol, tinh dầu cỏ xạ hương và dầu cá
cơm châu Âu (Engraulis encrasicolus L.)
c. Phương pháp đồng kết tủa [30]
Kỹ thuật đồng kết tủa rất hữu ích cho các hoạt chất không tan trong nước.
Phương pháp này cho hiệu suất kém do sự ức chế cạnh tranh từ các dung môi hữu
cơ được sử dụng làm chất kết tủa. Hoạt chất được hòa tan trong dung môi hữu cơ
(chẳng hạn như cloroform, benzen và dietyl ete, v.v.), và lượng chất mang thích
hợp hòa tan trong nước được thêm vào khi khuấy. Dung dịch được làm lạnh và các
tinh thể phức hợp tạo ra. Các tinh thể được rửa bằng dung môi hữu cơ và sau đó
24
được sấy khô ở 50°C. Kỹ thuật đồng kết tủa trước đây đã được áp dụng để bao bọc
các loại hoạt chất như oxaprozin và trans-anethole (thành phần chính của tinh dầu
hồi và thì là).
d. Phương pháp đồng kết tủa dựa trên độ hòa tan của pha [30]
Trong kỹ thuật đồng kết tủa, phức chất rắn có thể được thu hồi từ dung dịch
nước bão hòa. Kỹ thuật này không dành cho hệ thống có biểu đồ độ hòa tan pha
loại A và cũng không thích hợp cho việc sản xuất ở quy mô lớn vì lượng nước lớn
và tốn thời gian. Lượng hoạt chất và chất mang được sử dụng được ước tính từ biểu
đồ độ hòa tan pha loại B-S (không có hoạt chất nào chưa hòa tan và chất mang vẫn
nằm trong giới hạn hòa tan của nó). Chất mang và hoạt chất được hòa tan trong
nước nóng và làm nguội từ từ. Bột kết tủa được tách ra bằng cách lọc và sau đó
được làm khô.
e. Phương pháp làm nóng trong hộp kín [30]
Sau khi hấp phụ một lượng hơi nước xác định, một hỗn hợp vật lý gồm chất
mang và hoạt chất được đậy kín trong bình chứa và nung nóng đến nhiệt độ từ
43°C đến 142°C để thu được phức chất dạng tinh thể. Kỹ thuật này cũng được thực
hiện dưới áp suất khí nitơ và có thể được sử dụng cho các chất bay hơi có thể điều
nhiệt.
f. Đông khô [30]
Kỹ thuật đông khô thích hợp cho hoạt chất nhiệt rắn hoặc tan trong nước. Tỷ
lệ chất mang yêu cầu và phân tử hoạt chất được hòa tan trong nước kèm khuấy.
Dung dịch được đông khô và bột thu được được rửa bằng dung môi hữu cơ, sau đó
được làm khô trong chân không. Phương pháp này có hiệu suất cao và có thể mở
rộng quy mô. So với các kỹ thuật hiện có khác, kỹ thuật đông khô đã được áp dụng
rộng rãi để hình thành phức hợp bao cyclodextrin, đặc biệt là hydroxyproply-β-
cyclodextrin hòa tan trong nước. Một số loại tinh dầu và các hợp chất hoạt động
chính tinh khiết của chúng đã được bao trong hydroxyproply-β-cyclodextrin.
Chúng bao gồm quế và đinh hương, estragole (thành phần chính của tinh dầu húng
quế và ngải giấm), tinh dầu hạt tiêu đen.
25
g. Phun khô [30]
Chất mang và phân tử hoạt chất được hòa tan trong nước khử ion và sau đó
dung dịch được làm khô bằng máy sấy phun. Máy sấy phun được vận hành trong
các điều kiện thích hợp nhất như nhiệt độ đầu vào và tốc độ cấp mẫu. Khi sử dụng
nhiệt độ 50–70°C, kỹ thuật này chỉ được sử dụng cho các phân tử có thể điều nhiệt.
Gần đây, kỹ thuật sấy phun đã được sử dụng để đóng gói axit folic trong
cyclodextrin.
1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về phức nano
của β-cyclodextrin.
Sử dụng cyclodextrin để tạo phức nano trong ngành dược phẩm đã bắt đầu
được nghiên cứu trong vòng một thập kỷ gần đây. Một số phương pháp được áp
dụng để chế tạo phức nano của cyclodextrin như: CO2 siêu tới hạn [31], đông khô
[32], dung dịch [33], tạo gel ion [34]. Trong nghiên cứu của Hazuki Nerome và
cộng sự, các tác giả đã tổng hợp thành công phức nano của cyclodextrin với
lycopene bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn, kích thước hạt đạt được 40 nm (hình 1.9),
[31].
Hình 1.9: Ảnh SEM của các hợp chất: (A) – lycopene; (B) – phức nano
lycopene/βcyclodextrin sử dụng DCM làm dung môi; (C) – β-cyclodextrin;(D) –
phức nano lycopene/βcyclodextrin sử dụng DMSO làm dung môi.
26
Trong công bố của Quandeel Khalid cùng các cộng sự đã nghiên cứu chế tạo
phức nano của dexibuprofen với các hạt nano hydrogel β-cyclodextrin [33].
Hình 1.10: Độ tan tương đối của dexibuprofen thuần, phức hợp với β-
cyclodextrin và nano hydrogel β-cyclodextrin trong các dung dịch có pH bằng 1,2;
6,8 và nước cất pha tiêm (WFI), [33].
Hình 1.11: Ảnh FE-SEM của β-cyclodextrin (a) và hạt nano hydrogel β-
cyclodextrin (b), [33].
Các hạt nano hydrogel β-cylodextrin được tổng hợp bằng phản ứng trùng
hợp gốc tự do, sau đó tạo phức với dexibuprofen bằng phương pháp đông khô. Khi
tạo phức với β-cyclodextrin, độ tan của dexibuprofen tăng lên (1,2- 2,2 lần) so với
dexibuprofen thuần. Bằng các tạo phức nano, độ tan của dexibuprofen đã được cải
27
thiện rõ rệt (6 lần), (hình 1.10). Kết quả phân tích XRD và FESEM cho thấy, các
hạt nano có độ xốp khá cao với kích thước trung bình là 287 nm (hình1.11). Sự giải
phóng thuốc đạt kết quả lớn nhất tại pH 1,2 và 6,8.
Ở nước ta, lĩnh vực hóa học siêu phân tử đã bắt đầu nhận được sự quan tâm
nghiên cứu từ 10 năm trước và có xu hướng tăng mạnh trong vài năm gần đây xét
về lượng công bố và các đơn vị tham gia nghiên cứu. Đầu tiên phải kể đến nhóm
nghiên cứu của PGS. TS. Bùi Quang Thuật, Viện Công nghiệp thực phẩm, Bộ
Công thương. Các tác giả đã xây dựng công nghệ sản xuất cyclodextrin, công nghệ
chế biến và tạo các hương thơm dạng lỏng phù hợp cho các sản phẩm thực phẩm,
dược phẩm và mỹ phẩm phục vụ cho sản xuất hương liệu dạng bột, công nghệ sản
xuất hương dạng bột từ cyclodextrin và các hình hương dạng lỏng [34]. Trường Đại
học Y dược thành phố Hồ Chí Minh có nhóm nghiên cứu của tác giả Huỳnh Văn
Hóa chủ yếu tập trung vào nghiên cứu nâng cao sinh khả dụng của viên nén
piroxicam bằng cách tạo phức với β–cyclodextrin [35, 36]. Nhóm nghiên cứu của
tác giả Phùng Đức Truyền, Viện Sốt rét–ký sinh trùng- côn trùng thành phố Hồ Chí
Minh công bố kết quả nghiên cứu tốc độ tan và độ tan của một số dược chất trong
đó có rutin sau khi tạo phức với dẫn xuất của β-cyclodextrin [37].
Hình 1.12: Sơ đồ tạo phức chất của curcumin và β-cyclodextrin [38].
28
Đáng chú ý phải kể đến công trình nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Thanh
Thảo, Viện Công nghệ Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã tổng hợp thành công phức chất curcumin-cyclodextrin bằng kỹ thuật CO2 siêu
tới hạn [38]. Sản phẩm phức có độ bền sáng và khả năng hòa tan trong nước cao
gấp nhiều lần so với curcumin, cụ thể, kích thước hạt phức chất curcumin-β-
cyclodextrin trung bình 2,3 µm, độ tan cải thiện gấp 300 lần so với curcumin tự do.
Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa DPPH cho thấy phức chất curcumin-
cyclodextrin cho khả năng kháng oxy hóa cao, với giá trị IC50 đạt 12,67 (μg/mL).
Hình 1.13: Hình ảnh minh họa cơ chế tạo phức nano của β-cyclodextrin với
alginat [39].
Các nghiên cứu kết hợp chitosan với cyclodextrin ở nước ta hầu như chưa
có. Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Công Hào và cộng sự (Viện
Công nghệ hóa học - Viện Hàn lâm KH&CNVN) đã thu được những kết quả hết
sức khả quan trong ngành công nghệ sinh học nano, chế tạo thành công nano β-
cyclodextrin-alginat làm vật liệu vận chuyển thuốc chữa bệnh [39] (hình 1.13).
Kết quả phân tích SEM cho thấy, các hạt β-cyclodextrin và alginat/Ca2+ khi
tồn tại riêng rẽ có kích thước micromet và phân tán không đều (hình 1.14 a,b)
29
Hình 1.14: Ảnh SEM của β-cyclodextrin (a), alginat/Ca2+(b) và
alginat/Ca2+/βcyclodextrin (c) [36].
Khi kết hợp với nhau, các hình cầu có cấu trúc dày đặc, kích cỡ đồng đều với
độ lớn dưới 100 nm được hình thành bởi lực tương tác tĩnh điện của các
oligosaccarit với các ion Ca2+ (hình 1.14c), [39]. Sau đó, các hạt alginat/Ca2+/β-
cyclodextrin được nghiên cứu chế tạo phức hợp với ketoprofen [25]. Kết quả phân
tích SEM và TEM cho thấy, các hạt phức nano ketoprofen/alginat/Ca2+/β-
cyclodextrin có kích thước khá đồng đều với độ lớn 61,25nm (hình 1.15). Sự giải
phóng thuốc đạt kết quả tốt nhất 69% tại pH 5, [39].
Hình 1.15: Ảnh SEM (a) và TEM với độ phóng đại 30000 (b) lần và 100000
(c) lần phức của ketoprofen với hạt nano alginat/Ca2+/β-cyclodextrin [40].
Tác giả Nguyễn Cao Hiền và cộng sự đã tổng hợp hệ nano hydroxypropyl-
betacyclodextrin/alginate làm vật liệu mang thuốc [41]. Kết quả cho thấy, hệ nano
mới được hình thành từ alginate và hydroxypropyl-β-cyclodextrin bằng phương
30
pháp gel ion hóa qua tương tác tĩnh điện giữa Ca2+/alginate và hydroxypropyl-β-
cyclodextrin. Với kích thước hạt nano thu được khá đồng đều trong khoảng 50 - 80
nm. Artesunate (thuốc điều trị sốt rét) được chọn làm mẫu tạo phức với vật liệu,
hiệu suất mang thuốc đạt được 88%.
1.3. PHỨC HỢP BAO CỦA Β-CYCLODEXTRIN VỚI NHÓM QUERCETIN
Phức của rutin và quercetin với cyclodextrin đã được tổng hợp bằng một số
phương pháp: nghiền ướt, trộn khô, đồng kết tủa [42-44]. Trong đó, phức thu được
theo phương pháp đồng kết tủa bền vững hơn, tuy nhiên hiệu suất phản ứng lại rất
thấp (<23%) [42,43].
Trong nghiên cứu gần đây, nhóm tác giả T.V. Ilyich và cộng sự đã tổng hợp
phức hợp bao quercetin/βCD, quercetin/HPβCD bằng cách hòa tan quercetin (50
mg) và CD (250 mg) trong ethanol 96% (50 mL) [45]. Hỗn dịch được khuấy trên
máy khuấy từ trong 24 giờ, tốc độ 60 vòng / phút ở 20°C. Kết quả đã chứng minh
sự hình thành phức hợp đi kèm với khả năng hòa tan quercetin tăng lên, tuy nhiên,
khả năng hòa tan của quercetin/HPβCD cao hơn quercetin/βCD. Kết quả mô hình
hóa lượng tử cho thấy của các phân tử quercetin chui vào trong khoang rỗng của
βCD, chứng minh sự hình thành phức hợp xảy ra do hình thành liên kết hydro giữa
một số nhóm chức của quercetin và βCD dẫn đến sự thay đổi hình học (sự xoắn),
tính chất phân tử (mômen lưỡng cực và hiệu ứng nhiệt của phản ứng) của quercetin
và kích thước của khoang. Những kết quả này cho thấy kích thước khoang rỗng của
HPβCD lớn hơn βCD dẫn đến sự khác biêt về tính chất giữa hai phức này.
Phản ứng tạo phức của rutin với các cyclodextrin là phản ứng tự phát (G<0)
và tỏa nhiệt (ΔH <0) [46]. Sự khác biệt giữa đường kính lỗ hổng tâm phân tử
cyclodextrin và kích thước phân tử rutin ảnh hưởng khá nhiều đến độ bền của phức
chất, cụ thể, phức của rutin với β-cyclodextrin có độ bền lớn hơn cả so với phức
của α- và γ-cyclodextrin [47]. Theo tác giả bài báo, khoang của α-cyclodextrin quá
nhỏ gây khó khăn cho việc hình thành phức hợp dạng « lồng nhau », trong khi
khoang phân tử γ-cyclodextrin lại khá lớn không giữ được phân tử rutin một cách
« chặt chẽ » ở bên trong. Khi tạo phức hoạt tính chống oxy hóa của rutin tăng lên,
phức khá bền trong dung dịch cũng như dưới các tác nhân bên ngoài như tia cực
31
tím. Một số nghiên cứu đã chứng minh vòng A của rutin nằm trọn trong khoang
của cyclodextrin trong phức hợp [46, 47].
Từ tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước có thể thấy rutin đã được tinh
chế bằng nhiều phương pháp như nước, kiềm hoặc axit. Trong đó phương pháp kết
tủa bằng axit HCl được biết đến nhiều hơn. Tuy nhiên, nhược điểm của phương
pháp này là độc hại và ăn mòn thiết bị của axit. Bên cạnh đó, việc chế tạo phức có
kích thước nano của rutin và quercetin nhằm tăng sinh khả dụng lại chưa được
quan tâm thỏa đáng. Do đó, đề tài này sẽ tập trung nghiên cứu tinh chế rutin từ hoa
hòe có hàm lượng cao, bán tổng hợp rutin để thu được quercetin; sau đó sẽ tổng
hợp phức nano của cyclodextrin với rutin và quercetin nhằm tăng độ tan của dược
chất, đồng thời khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của rutin trước và sau khi tạo
phức.
32
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
2.1.1 Thiết bị
- Máy siêu âm (Saehan Sonic).
- Máy cất quay dung môi (SIBATA Model RE-10E-100).
- Máy khuấy từ gia nhiệt (Heating Magnetic Stirrer–VELP Scientifica).
- Máy đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Nicolet Nexus 670).
- Phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân (AVANCE III-Bruker BioSpin- Viện Hóa
học- Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam).
- Máy đo nhiệt lượng kế vi phân (DSC, DSC204F1-NETZSCH-Germany).
- Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM) số hiệu JSM-6510LV
Jeol, Nhật Bản).
- Tủ sấy thường, cân thường và cân vi lượng.
2.1.2 Dụng cụ
- Bình tam giác loại 50 mL, 100 mL, 250 mL.
- Bescher loại 50 mL, 100 mL, 250 mL.
- Ống hút, pipet, đũa thủy tinh, cá từ, lọ thủy tinh, chai đựng mẫu, ống đong 50
mL, 25 mL, 10 mL, 5 mL.
- Bình định mức 100 mL, 500 mL.
2.2. CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ RUTIN TỪ HOA HÒE
Rutin được chiết xuất, tinh chế từ nụ hoa hòe theo sơ đồ sau:
33
Hình 2.1: Sơ đồ chiết xuất, tinh chế từ nụ hoa hòe.
2.2.1 Phương pháp chiết xuất rutin
Hoa hòe sau khi thu hái được phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy ở nhiệt độ
60-70oC đến khi khô hoàn toàn. Thực hiện chiết xuất rutin từ nụ hoa hòe bằng dung
dịch kiềm Na2CO3 2%.
Phương pháp chiết xuất bằng dung dịch kiềm được thực hiện như sau: Rửa
bằng HCl 0,5% rồi rửa bằng nước cho hết axit. Cho 100g hoa hòe đã giã dập vào
800 mL dung dịch Na2CO3 2%, đun sôi trong 30 phút. Đem lọc trên phễu Buchner
thu dịch chiết; tiếp tục chiết thêm 1 lần với 500mL dung dịch Na2CO3 2%. Gộp hai
34
phần dịch chiết lại, dùng dung dịch HCl 10% điều chỉnh đến pH=2, để lạnh thấy
xuất hiện kết tủa màu vàng. Lọc thu lấy kết tủa, sau đó rửa lại bằng nước cất đến
khi pH=6-7. Sấy kết tủa thu được ở nhiệt độ 40-50oC trong 24h thu được sản phẩm
thô.
Hình 2.2: Chiết xuất rutin trong Na2CO3 2%.
2.2.2 Tinh chế rutin
Sau khi thu được rutin thô từ các phương pháp chiết xuất rutin từ hoa hòe,
tiến hành tinh chế trong các điều kiện và dung môi khác nhau dựa vào tính chất và
độ tan của rutin. Hai phương pháp tinh chế được sử dụng trong nghiên cứu bao
gồm: tinh chế rutin bằng cồn và tinh chế rutin bằng acid-base. Hiện nay, các nghiên
cứu vẫn chủ yếu sử dụng axit HCl để kết tủa rutin trong dung dịch kiềm, tuy nhiên
HCl có nhiều mặt hạn chế (độc hại, ăn mòn thiết bị…). Vì vậy, trong nghiên cứu
này rutin được kết tủa bằng axit acetic để khắc phục những nhược điểm trên. Trong
lĩnh vực dược phẩm, axit acetic là một trong số ít những axit được ưu tiên lựa chọn
vì tính an toàn cho người trực tiếp sản xuất và người sử dụng.
Phương pháp tinh chế rutin bằng acid-bazo: Chuẩn bị 5 cốc thủy tinh chứa
100mL dung dịch Na2CO3 2%, đun đến sôi. Thêm từ từ rutin thô vào bình chứa
35
dung dịch Na2CO3 sôi đến khi đạt trạng thái bão hòa. Lọc các dung dịch qua phễu
Buchner loại bỏ cặn và tạp chất, sau đó đun nóng ở 70oC. Chuẩn bị 5 cốc chứa
dung dịch acid acetic ở các nồng độ 10%-20%-30%-40% và 50%, đun nóng đến
70oC. Thêm từ từ acid acetic các nồng độ vào lần lượt từng bình chứa dung dịch
rutin đến khi đạt pH=4-5. Khuấy lắc mạnh đến khi xuất hiện tủa màu trắng đục. Để
nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng, lọc qua phễu Buchner thu kết tủa; rửa lại kết
tủa bằng nước cất đến pH=6-7 thu được rutin sạch. Sấy khô ở nhiệt độ 40-45oC thu
được sản phẩm.
Hình 2.2: Rutin thu được sau tinh chế bằng phương pháp acid-base.
2.3. BÁN TỔNG HỢP QUERCETIN
Sau khi thu được rutin tinh khiết, tiến hành bán tổng hợp quercetin bằng
dung dịch HCl nồng độ thấp. Đây là phương pháp đơn giản, các điều kiện thực hiện
không yêu cầu kỹ thuật cao; tuy nhiên thiết bị thực hiện cần có khả năng chống
acid ăn mòn.
Phương pháp bán tổng hợp quercetin : chuẩn bị 10g rutin tinh cho vào bình
cầu chứa 100ml dung dịch HCl có nồng độ 5%. Tiến hành đun sôi cách thủy các
bình cầu, có hồi lưu dung môi. Sau 2h, rutin trong dung dịch HCl 5% đã chuyển
36
hóa toàn bộ thành quercetin, kiểm tra quá trình biến đổi bằng phương pháp sắc ký
bản mỏng.
Phương pháp tinh chế quercetin: hòa tan quercetin thu được trong 50ml cồn
96o đun sôi, thêm từ từ 100 ml nước cất vào dung dịch đến khi xuất hiện kết tủa.
Giữ bình ổn định ở điều kiện thường trong 1h đến khi nhiệt độ bình bằng nhiệt độ
phòng. Lọc qua phễu lọc Buchner thu kết tủa màu vàng xanh, rửa tủa với nước cất
lạnh thu được quercetin tinh.
Hình 2.4: Quercetin thu được sau tinh chế.
2.4. TỔNG HỢP PHỨC NANO CỦA Β-CYCLODEXTRIN VỚI RUTIN VÀ
QUERCETIN
Dung dịch cyclodextrin được thêm vào các dung dịch chứa RuT và Quer,
mỗi lần 10 mL và được khuấy bằng máy khuấy từ trong 24 giờ ở 25oC. Hỗn hợp
dung dịch sau phản ứng được lưu giữ trong vòng 48h ở 4oC để tạo kết tủa màu
vàng mịn. Kết tủa được rửa nhiều lần với DMSO và được đem đi đông khô trong
vòng 48 giờ.
2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.1 Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier
Các phức hợp [RuT-βCD], [Quer-HPβCD] được phân tích cấu trúc bằng phổ
hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) trên máy Nicolet Nexus 670 bằng cách ép viên
37
với KBr. Các mẫu được quét phổ ở vùng 400 cm-1 – 4000 cm-1. Phổ FTIR được
ghi dưới dạng đường cong phụ thuộc phần trăm truyền qua vào số sóng (1/λ) sau
khi đã bù trừ phổ nền của không khí. Các hoạt chất và cyclodextrin cũng được phân
tích đồng thời để đối chứng. Trong hỗn hợp với KBr, hàm lượng của các mẫu đều
bằng 6% khối lượng.
2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC
Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động
di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh là chất hấp
phụ được lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, được trải mỏng đồng nhất và được
cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc
đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy theo mục đích cụ thể.
Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được
di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết
quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển
Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch
chuyển của dung môi (Hình 2.5).
Các bước tiến hành định tính RuT và Quer bằng sắc ký lớp mỏng (Hình 2.6):
Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng sử dụng trong nghiên cứu là bản mỏng tráng
sẵn silica gel Merck 60 F254, kích thước 20×20 cm, dày 0,2 mm. Bản mỏng trước
Hình 2.5: Cách tính giá trị Rf.
Rf =
38
khi dùng phải hoạt hóa trong tủ sấy và sấy ở 105-110°C trong một giờ. Dùng bút
chì mềm kẻ bản mỏng. Vạch đường chấm chất phân tích (cách mép dưới của bản
mỏng 1,2 cm), đường giới hạn di chuyển của dung môi (cách mép trên của bản
mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết chấm cách nhau 0,5 cm và cách
hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm).
Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc micropipet
chấm dung dịch RuT và Quer lên các vị trí đã đánh dấu. Các vết chấm phải nhỏ,
lượng chất phải đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng không
quá nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử.
Triển khai sắc ký: Bình triển khai thường là bình thủy tinh, có nắp đậy kín và
đáy phải bằng. Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình. Pha hệ dung môi với
tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Hệ dung môi triển khai đối với
rutin: Ethyl acetate-methanol: 7-3, hệ dung môi triển khai đối với quercetin:
hexane-ethanol: 4-6. Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Đặt bản mỏng gần
như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung
môi triển khai. Đậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi chạy
đến đường giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết.
Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bước sóng 254
và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong nghiên cứu là Ce(SO4)2).
2.5.3 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR
Mẫu rutin và quercetin thu được từ quá trình chiết xuất và bán tổng hợp được
xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-
Hình 2.6: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng.
39
NMR bằng phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân AVANCE III, hãng Bruker BioSpin,
Thụy Sĩ.
Phổ 1H-NMR cho biết môi trường hoá học của proton trong phân tử. Các
proton có môi trường hoá học khác nhau sẽ có chuyển dịch hoá học khác nhau,
thường nằm trong khoảng 0 – 14 ppm (Hình 2.7).
Hình 2.7: Khoảng chuyển dịch hóa học của một số proton.
Phổ 13C-NMR cung các cấp thông tin về môi trường hoá học của carbon. Độ
chuyển dịch của carbon nằm trong khoảng 0 – 240 ppm (Hình 2.8). Đây là ưu điểm
rất lớn của phổ 13C-NMR vì các tín hiệu phổ sẽ ít bị trùng lặp và đặc trưng đối với
mỗi chất. Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn,
mỗi vạch ứng với 1 carbon (hơn 1 carbon nếu chúng có chung môi trường hoá học)
của phân tử.
40
Hình 2.8: Khoảng chuyển dịch hóa học các dạng carbon chọn lọc.
2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực
khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với
nhau, một pha động và một pha tĩnh.
Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc
rây phân tử.
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ.
2.5.5 Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis
Cường độ của tia đơn sắc trước và sau khi đi qua môi trường hấp thụ được
liên hệ với nhau bởi định luật Lambert-Beer.
A = -lg(I/I0) = ɛ.l.C
41
Trong đó A: mật độ quang; C: nồng độ dung dịch (mol/l); l: chiều dài lớp
dung dịch (chiều dày cuvet đựng mẫu), (cm); ɛ: hệ số hấp thu phân tử có thứ
nguyên hay hệ số hấp thu mol đặc trưng cho cường độ hấp thu của chất nghiên cứu
ở bước sóng đã cho (l/mol.cm); I: cường độ chùm sáng đi qua dung dịch; I0: cường
độ chùm sáng đi qua dung môi.
Phương pháp quang phổ tử ngoại- khả kiến được áp dụng để xác định định
tính (nhận biết), xác định định lượng, cấu trúc trong nghiên cứu phức chất.
Trong khuôn khổ đề tài này, rutin, quercetin và các phức hợp tương ứng
được phân tích bằng phương pháp phổ tử ngoại-khả kiến (UV-Vis) trên máy
CINTRA 40, GBC (Mỹ).
a) Xác định độ hòa tan của dược chất trước và sau khi tạo phức
Độ hòa tan của các dược chất được khảo sát theo thời gian trong môi trường
pH 7,4 – tương ứng với môi trường vùng dịch tá tràng.
Trước khi xác định được độ tan của các dược chất ta cần phải xây dựng
phương trình đường chuẩn của rutin trong dung dịch đệm pH 7,4. Phương pháp
như sau: Tiến hành ghi phổ UV-Vis của các dung dịch RuT có nồng độ chính xác
để xác định mật độ quang tại bước sóng cực đại 365 nm đối với RuT. Dựng phương
trình phụ thuộc của mật độ quang với nồng độ dung dịch RuT tương ứng bằng phần
mềm Origin.
Khảo sát độ tan của các dược chất: Một khối lượng chính xác của vật liệu
được đưa vào bình có dung tích 500 ml chứa dung dịch đệm ở 370C. Sau các
khoảng thời gian cố định (5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút, 40
phút, 50 phút, 60 phút) để lắng và hút chính xác 5 ml phần dung dịch phía trên bình
phản ứng, lọc qua giấy lọc và đem đi đo phổ UV-Vis. Từ phương trình đường
chuẩn đã xây dựng ở trên xác định được chính xác nồng độ của rutin trong dung
dịch tại từng thời điểm lấy mẫu.
Độ hòa tan của các mẫu tại thời điểm t được tính toán như sau:
% hòa tan = m ở thời điểm t/ m chứa trong mẫu · 100%
42
b) Xây dựng giản đồ pha hòa tan
Giản đồ pha hòa tan được xây dựng theo phương pháp Higuchi-Connors
[52]. Đây là phương pháp khá phổ biến trong hóa học phức chất siêu phân tử.
Lượng dược chất dư được thêm vào 25ml các bình cầu có chứa CD với nồng độ
dao động trong khoảng từ 0 đến 9mM. Lắc các ống nghiệm liên tục trong 24 giờ ở
25 ± 1oC. Để xác định nồng độ của hoạt chất đã hòa tan trong các mẫu, thu hồi và
lọc qua màng có đường kính lỗ trống 0,45 μm. Sau đó pha loãng phần dung dịch
thu được đến nồng độ cần thiết và xác định độ hấp thụ ở 256 nm (với rutin) và 370
nm (với quercetin) bằng phương pháp quang phổ UV-Vis.
Hằng số bền của các phức chất (Ks) được xác định từ giản đồ pha của quá
trình hoà tan theo phương trình sau:
Trong đó, S0 là độ hoà tan của dược chất ở 25oC khi không có cyclodextrin;
Slope được xác định bằng hệ số góc từ đồ thị phụ thuộc nồng độ (mol/l) dược chất
đã hòa tan với nồng độ (mol/l) của CD trên biểu đồ pha hòa tan.
2.5.6 Phương pháp nhiệt lượng quét vi sai DSC
Đo nhiệt lượng quét vi sai (DSC) là một kỹ thuật cho phép nhận biết những
hiện tượng năng lượng xảy ra trong quá trình làm nóng hoặc làm lạnh của một chất
(hoặc hỗn hợp nhiều chất) và xác định biên thiên enthalpy, nhiệt dung riêng và
nhiệt độ ở đó xuất hiện các hiện tượng này. Kỹ thuật được dùng để xác định chênh
lệch tốc độ nhiệt giải phóng hoặc hấp thu bởi chất khảo sát so sánh với mẫu đối
chiếu theo sự thay đổi của nhiệt độ.
Mục đích của phương pháp đo nhiệt lượng quét vi sai (DSC) trong nghiên
cứu này là đo biến đổi thành phần hóa học, chứng minh rutin và quercetin đã được
bao bọc bởi các cyclodextrin.
Rutin, quercetin, cyclodextrin và các phức hợp được phân tích nhiệt bằng
máy đo nhiệt lượng kế vi phân (DSC, DSC204F1 (NETZSCH-Germany). Cân
chính xác các mẫu rắn (khoảng 3-4mg) trong chảo nhôm và quét từ nhiệt độ phòng
43
(25oC) đến 350°C với tốc độ gia nhiệt không đổi 10°C/phút trong môi trường khí
trơ (ni-tơ).
2.5.7 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho phép kiểm tra hình thái học của vật chất
bằng hình ảnh trực tiếp. Các kỹ thuật dựa trên kính hiển vi điện tử cung cấp nhiều
ưu điểm trong phân tích hình thái và kích thước.
Hình thái cấu trúc của các hạt phức nano [RuT-βCD] và [Quer-HPβCD]
được khảo sát bằng thiết bị kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM) số
hiệu JSM-6510LV (Jeol, Nhật Bản). Các mẫu được phủ bạch kim trước khi đo.
2.5.8 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa
Các chất chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen,
làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại (517 nm). Giá trị mật độ quang OD càng
thấp chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao.
Quy trình thí nghiệm thực hiện như sau: Bổ sung 5 ml DPPH (0,18 mM, pha
trong ethanol) vào mỗi ống nghiệm đã chứa 2 ml dung dịch hoạt chất tại các nồng
độ khác nhau (4.10-6M – 83.10-6M), lắc đều và ủ 30 phút trong điều kiện không có
ánh sáng. Sau đó, tiến hành đo mật độ quang OD tại bước sóng 517 nm trên máy
quang phổ UV-Vis. Giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng kháng oxy hóa
của mẫu.
Tỉ lệ phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa được xác định theo công thức sau:
Tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH = %
Trong đó, ODm: giá trị mật độ quang OD của mẫu thử;
ODc: giá trị mật độ quang OD của chứng âm.
Từ tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, chúng tôi xây dựng phương trình
tương quan tuyến tính, từ đó chúng tôi xác định giá trị IC50 (là nồng độ mà tại đó
bắt 50% gốc tự do DPPH) để làm cơ sở so sánh khả năng kháng oxy hóa giữa các
mẫu. Mẫu nào có giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao.
44
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.1 ĐẶC TRƯNG TÍNH CHẤT CỦA RUTIN VÀ QUERCETIN
3.1.1 Xác định cấu trúc rutin và quercetin
a. Sử dụng sắc ký lớp mỏng
(a) (b)
Hình 3.1: Kết quả phân tích bằng phương pháp sắc ký bản mỏng rutin (hình
a) và quercetin (hình b). Trong đó 1-mẫu nghiên cứu; 2-mẫu đối chứng.
Rutin sau khi chiết suất và quercetin sau khi bán tổng hợp được đem đi phân
tích bằng phương pháp sắc kí bản mỏng. Dễ dàng nhận thấy sự giống nhau giữa
rutin, quercetin thu được từ nghiên cứu và chất chuẩn đối chứng; có thể kết luận
sản phẩm thu được từ quá trình nghiên cứu là rutin và quercetin. Bên cạnh đó, sắc
ký đồ cho hình ảnh hiển thị là hai chấm tròn rõ nét, cho thấy sản phẩm thu được sau
kết tinh có độ tinh sạch cao.
Sử dụng sắc ký bản mỏng là phương pháp đơn giản nhất để xác định quá
trình chuyển hóa từ rutin sang quercetin đã kết thúc hay chưa.
45
(a) (b)
Hình 3.3: Kết quả phân tích bằng phương pháp sắc ký bản mỏng khảo sát quá
trình thủy phân rutin trong HCl 5% để thu được quercetin.
Hình 3.3a là sắc ký đồ khi chưa diễn ra quá trình thủy phân, hệ dung môi
khảo sát hexane:ethanol (tỉ lệ thể tích 4/6) không đủ phân cực để làm rutin dịch
chuyển nên rutin vẫn giữ nguyên ở điểm xuất phát. Hình 3.3b là sắc ký đồ khi quá
trình thủy phân diễn ra trong 2 giờ, lúc này chỉ xuất hiện 1 chấm tròn ở phía trên.
Đối chiếu quercetin thu được sau tinh chế với quercetin đối chứng bằng sắc ký bản
mỏng cho kết quả giống nhau (hình 3.2b).
b. Kết quả phân tích bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
Quercetin bán tổng hợp dạng bột màu vàng, điểm nóng chảy 313 - 314°C. Phổ
1H-NMR cho thấy hai tín hiệu doublet của hai proton thơm ở δH 6.18 (d, J = 2.0 Hz,
H-6) và 6,40 ppm (d, J = 2.0 Hz, H-8). Ngoài ra, ba proton ở 7,67 (d, J = 2,5 Hz, H-
2'), 7,54 (dd, J = 7,5, 2,5 Hz, H-6') và 6,89 ppm (d, J = 8,5 Hz, H-5') cho thấy tín
hiệu loại ABX. Phổ 13C-NMR cho thấy 15 tín hiệu trong khoảng δ 93,32-175,8
ppm của bộ khung flavonoid. Việc so sánh dữ liệu phổ với mẫu quercetin so sánh
xác định hợp chất tổng hợp được là quercetin.
46
Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của quercetin.
47
Hình 3.4: Phổ 13C-NMR của quercetin.
48
Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của quercetin bán tổng hợp và mẫu
quercetin so sánh.
Vị trí
Quercetin (DMSO) 500 MHz Quercetin so sánh 500 MHz [48]
δC ppm δH ppm (J,Hz) δC ppm δH ppm (J,Hz)
1 - -
2 146.78 - 146.9 -
3 135.69 - 135.8 -
4 175.80 - 175.9 -
5 160.69 - 160.8 -
6 98.15 6.18 (1H, d, J = 2.0 Hz) 98.2 6.18 (1H, d, J = 2.0 Hz)
7 163.85 - 163.9
8 93.32 6.40 (1H, d, J = 2.0 Hz) 93.4 6.40 (1H, d, J = 2.0 Hz)
9 156.11 - 156.2 -
10 102.98 - 103.1 -
1’ 121.93 - 122.0 -
2’ 115.04 7.67 (1H, d, J =2.5 Hz) 115.1 7.67 (1H, d, J = 2.5 Hz)
3’ 145.02 6.89 (1H, d, J = 8.5 Hz) 145.1 6.88 (1H, d, J = 8.5 Hz)
4’ 147.66 - 147.7 -
5’ 115.57 - 115.7 -
6’ 119.95 7.54(1H, dd, J = 7.5, 2.5Hz) 120.0 7.54 (1H,dd, J = 7.5, 2.5Hz)
49
Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của rutin.
50
Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của rutin.
51
Rutin được phân lập dưới dạng tinh thể màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 214 -
215°C. Cấu trúc của rutin có thể được làm sáng tỏ bằng cách so sánh phổ của nó
với phổ NMR của quercetin. Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của một vòng thơm
chứa ba nhóm thế ở 7,55 (m, H-2', 6') và 6,84 (d, J = 8,0 Hz, H-5') và hai proton
anomeric ở 5,34 (d, J = 7,5 Hz, glc H-1'') và 4,38 (d, J = 1,0 Hz, rham H- 1'''). Điều
này được chứng minh rằng rutin có cùng loại aglycone như quercetin. Tuy nhiên,
phổ 1H-NMR của mẫu rutin phân lập cho thấy sự hiện diện của tín hiệu proton của
hai glycoside ở mức 3,71-3,05 (m, 12H của các gốc đường) và nhóm methyl ở 0,99
(3H, d, J = 6.0, rham-CH3). Phổ 13C-NMR của quercetin cho thấy tín hiệu của 27
nguyên tử cacbon, bao gồm 15 nguyên tử khung flavonoid và 12 nguyên tử của hai
gốc đường của rutin (β-D-glucose: δC 101.3, 74.2, 76.5, 70.1, 76.0, 67.1 và α-L-
rhamnose: δC 104.0, 74.1, 71.9, 70.7, 70.5, 17.8). Việc so sánh dữ liệu phổ của của
mẫu rutin phân lập với mẫu rutin so sánh khẳng định hợp chất phân lập được là
rutin (quercetin-3-O- [α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D glucopyranoside).
Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của rutin phân lập từ hoa hòe và mẫu
rutin so sánh.
Vị trí
Rutin (DMSO) 500 MHz Rutin so sánh 500 MHz [48]
δC ppm δH ppm (J,Hz) δC
ppm
δH ppm (J,Hz)
1 - -
2 148.87 - 156.7 -
3 133.78 - 133.4 -
4 177.84 - 177.5 -
5 161.69 - 161.3 -
6 99.14 6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz) 98.8 6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz)
7 164.53 - 164.2
8 94.05 6.38 (1H, d, J = 2.0 Hz) 93.7 6.38 (1H, d, J = 2.0 Hz)
9 156.89 - 156.5 -
10 101.66 - 104.0 -
1’ 122.06 - 121.3 -
2’ 115.70 7.55 (1H, d, J =2.5 Hz) 115.3 7.54 (1H, d, J = 2.5 Hz)
52
3’ 145.21 6.84 (1H, d, J = 8.5 Hz) 144.8 6.84 (1H, d, J = 8.5 Hz)
4’ 147.66 - 148.5 -
5’ 115.70 - 116.4 -
6’ 121.66 7.55(1H, dd, J = 7.5, 2.5Hz) 121.7 7.54 (1H,dd, J = 7.5,2.5Hz)
1’’ 101.66 5.34 (1H, d, J = 7.0 Hz) 101.3 5.34 (1H, d, J = 7.0 Hz)
2’’ 74.55 3,51 (1H, brs) 74.2 3,51 (1H, brs)
3’’ 76.93 3,27 (1H, m) 76.5 3,42 (1H, m)
4’’ 70.48 3,24 (1H, m) 70.1 3,30 (1H, m)
5’’ 76.38 3,25 ( 1H, m) 76.0 3,34 (1H, m)
6’’ 67.46 3,71 (1H, m)
3,69 (1H, m)
67.1 3,84 (1H, m)
3,81 (1H, m)
1’’’ 99.14 4.39 (1H, brs) 100.8 4.38 (1H, brs)
2’’’ 70.48 3,37 (dd, J1=1,5; J2= 5,0) 70.5 3,65 (dd, J1=1,5; J2= 5,0)
3’’’ 70.84 3,31 (dd, J1= 3,5, J2= 13,0) 70.7 3,55 (dd, J1= 3,5, J2= 13,0)
4’’’ 71.04 3,22 ( 1H, m) 71.9 3,32 ( 1H, m)
5’’’ 68.70 3,29 (1H, m) 68.3 3,47 (1H, m)
6’’’ 18.19 1.00 (3H, d, J = 6.0) 17.8 1.0 3H, d, J = 6.0)
3.1.2. Kiểm nghiệm độ tinh sạch của rutin sau khi tinh chế
Hình 2.3: Các mẫu khảo sát tinh chế rutin bằng axit acetic (1: dung dịch rutin
thô trong nước, rutin Đ/c : dung dịch rutin đối chứng trong nước)
Từ hình.. ta nhận thấy, màu sắc của các mẫu kết tủa rutin trong axit acetic ở
nồng độ axit cao hơn (40-50%) giống màu sắc (vàng nhạt) của rutin sạch đối
chứng. Ở nồng độ axit thấp hơn (10-20%), màu sắc kết tủa là màu trắng đục, có vẩn
đen giống với rutin thô. Để khẳng định lại, thực hiện đo định tính xác định độ tinh
sạch của rutin bằng phương pháp HPLC. Kết quả được trình bày trên hình…
53
Các mẫu rutin tinh chế bằng phương pháp axit-bazo được kết tủa trong axit
acetic các nồng độ từ 10% đến 50% được kiểm độ tinh khiết bằng máy sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) số hiệu X500R-QTOF, hãng SCIEX.
Hình 3.7: Phổ HPLC mẫu rutin tinh chế trong axit acetic (a: nồng độ axit
acetic 20%; b: nồng độ axit acetic 30%; c: nồng độ axit acetic 40%; d: nồng độ
axit acetic 50%).
Hình 3.7 thể hiện sắc ký đồ của các mẫu rutin. Trường hợp kết tủa rutin bằng
axit acetic 20% (hình 3.7a) cho biết rutin sau tinh chế có độ tinh sạch 80.873% tính
theo diện tích pic; ở nồng độ axit acetic 30% (hình 3.7b) cho biết rutin thu được có
độ tinh khiết 91.115% tính theo diện tích pic. Đến sắc ký đồ hình 3.7c, rutin tinh
chế bằng axit acetic nồng độ 40% cho độ tinh khiết 98.827% tính theo diện tích pic.
Tuy nhiên, sắc ký đồ của mẫu rutin thu được từ quá trình kết tủa bằng axit acetic
50% (hình 3.7d) lại cho độ tinh khiết là 96.128% tính theo diện tích pic. Như vậy,
nồng độ axit acetic 40% là nồng độ phù hợp nhất trong khoảng nghiên cứu để kết
tủa rutin từ dung dịch rutin trong kiềm loãng.
3.2.1 HIỆU SUẤT TỔNG HỢP PHỨC CỦA β-CYCLODEXTRIN VỚI MỘT SỐ
POLYPHENOL TRONG DUNG MÔI HỖN HỢP H2O-EtOH
54
Trong phương pháp đồng kết tủa, phân tử khách và phân tử chủ cần được hòa
tan với nhau để tăng sự tiếp xúc. Cyclodextrin tan trong nước nhưng rutin và
quercetin lại tan trong một số dung môi hữu cơ. Do đó, cần lựa chọn được dung
môi thích hợp để cả cyclodextrin và các hoạt chất đều tan tốt, mặt khác lại dễ bay
hơi để dễ dàng bị loại khỏi sản phẩm sau phản ứng. Bên cạnh đó, một số nghiên
cứu trước đã chứng minh, khả năng tạo phức của các hợp chất hữu cơ với
cyclodextrin tăng lên rõ rệt khi cho thêm một lượng nhỏ nhất định dung môi hữu cơ
vào nước [49]. Do đó, trong nghiên cứu này, dung môi hỗn hợp nước-cồn tuyệt đối
được lựa chọn để điều chế các phức hợp.
Chúng tôi đã khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp phức [RuTβCD] và [Quer-
HPβCD] theo sự thay đổi hàm lượng ethanol trong dung môi hỗn hợp trong khoảng
0-50% (v/v). Các dung môi có hàm lượng ethanol lớn hơn 50% (v/v) không được
khảo sát do độ tan của cyclodextrin trong ethanol rất kém [50]. Kết quả cụ thể
được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Hiệu suất tổng hợp phức cyclodextrin-polyphenol trong dung môi hỗn
hợp EtOH-H2O.
XEtOH, v/v 0 10 15 20 25 30 40 50
[RuT-βCD] 25 73 - 56 - 50 46 41
[Quer-HPβCD] 38 50 73 80 70 66 - 52
Từ bảng 3.3 ta nhận thấy, hiệu suất tổng hợp đối với cả hai loại phức hợp trong
dung môi có chứa EtOH trong khoảng nghiên cứu đều lớn hơn giá trị tương ứng
trong môi trường nước. Điều này có thể giải thích được bằng thuyết nhiệt động học
– solvat hóa [51]. Theo đó, sự có mặt của các phân tử ethanol là nguyên nhân chính
làm giảm đi tính kị nước trong khoang rỗng của phân tử cyclodextrin, do đó gây
nên sự khác biệt trong cấu trúc và nhiệt động lực học của dung môi hỗn hợp so với
dung môi thuần, làm tăng lên khả năng cho phân tử khách “thâm nhập” vào bên
trong khoang rỗng của phân tử “chủ”. Hiệu suất tổng hợp [RuT-βCD] và [Quer-
HPβCD] đạt giá trị cực đại lần lượt bằng 73% và 80% trong những dung môi có
55
hàm lượng EtOH nhỏ (10-20%) có thể do sự tăng cường không gian ba chiều của
các liên kết hydro khi bổ sung thêm dung môi hữu cơ vào nước [52]. Trong những
dung môi có nồng độ EtOH lớn hơn 20% hiệu suất tổng hợp bị suy giảm, có thể là
do độ tan của phức hợp trong môi trường hữu cơ tốt hơn làm cản trở lên quá trình
thu hồi và do đó, giảm đi hiệu suất tổng hợp. Kết quả này cũng phù hợp với quan
điểm mà tác giả Al-Nasiri và cộng sự đã đưa ra trong bài báo [53].
3.3.1 PHÂN TÍCH MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA ĐẶC TRƯNG VÀ HÌNH
THÁI CẤU TRÚC CỦA PHỨC HỢP β-CYCLODEXTRIN-POLYPHENOL
3.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại
FTIR là một công cụ rất hữu ích để chứng minh phản ứng tạo phức dạng
khách - chủ xảy ra bởi các dao động đặc trưng của phân tử "khách" sau phản ứng
thường biến mất, bị dịch chuyển hoặc cường độ bị suy giảm [53,54].
Hình 3.8 biểu diễn kết quả phân tích quang phổ hồng ngoại của rutin, β-
cyclodextrin và phức hợp.
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
709
709754
754
1331
1365
3404
c
b
940
940
1455
1506
1158
1081
1031
808
1012
1062
1204
1294
1363
1602
1652
2925595
808
1012
1062
1204
1294
13631455
1506
1598
1656
2941
3431
857
940
10311081
1158
1417
1641
2929
Soá soùng, cm-1
Maät ñ
oä q
uan
g a
3425
Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của rutin (a), phức chất [RuT-βCD] (b) và βCD
(c).
56
Phổ FT-IR của rutin xuất hiện vân phổ rất rộng với số sóng 3431 cm-1 đặc
trưng cho dao động hóa trị của liên kết O-H [55] (Hình 3.8). Vân phổ tại 2941 cm-1
được gán cho dao động hóa trị của liên kết C-H trong các nhóm CH- và CH2- [56].
Một vân phổ khá mạnh và hẹp tại số sóng 1656 cm-1 tương ứng với dao động biến
dạng của liên kết O-H [56]. Các đỉnh pic khá mạnh và hẹp tại số sóng 1598 và 1506
cm-1 tương ứng với dao động hóa trị của liên kết C=C, 1363 và 1294 cm-1 tương
ứng với liên kết C-O [57].
Liên kết C-O-C của rutin được quan sát rất rõ bởi các dao động hóa trị với
đỉnh pic đặc trưng tại số sóng 1204, 1062 và 1012 cm-1 [57,64]. Các dải dao động
biến dạng của liên kết С-Н trong vòng benzen được đăng ký tại 808 cm-1 [58].
Trong phổ hồng ngoại của β-CD xuất hiện vân phổ rất mạnh và rộng với số
sóng 3404 cm-1 tương ứng với dao động hóa trị của liên kết O-H [67]. Ta cũng quan
sát thấy vân phổ với số sóng 2929 cm-1 được cho là dao động hóa trị của liên kết C-
H trong các nhóm CH- và CH2- của phân tử chủ [59]. Các dao động biến dạng của
liên kết O-H trong nhóm COH được quan sát thấy tại số sóng 1641cm-1 [59]. Vùng
tần số từ 1400 đến 1200 cm-1 xuất hiện các pic đặc trưng với số sóng cực đại 1417,
1365, 1331 và 1158 cm-1 tương ứng vơi dao động biến dạng của liên kết C-H các
nhóm hydroxyl bậc 1 và bậc 2 [59]. Các vân phổ trong vùng 1200 đến 1030 cm-1
tương ứng với dải hấp phụ dao động hóa trị của liên kết C-O trong ete đường và
nhóm hydroxyl của cyclodextrin (1081, 1031 cm-1) [58]. Các dải hấp phụ trong
vùng 950-700 cm-1 tương ứng với dao động biến dạng của liên kết C-H (940,
857,754 và 709 cm-1).
Phổ hồng ngoại của phức chất thể hiện cấu trúc của cả rutin và β-
cyclodextrin (hình 3.8b). Dải dao động hóa trị của liên kết O-H trong phức (3425
cm-1) hẹp hơn so với dao động tương ứng trong βCD và rộng hơn trong rutin thuần
chứng tỏ có sự hình thành phức hợp- hiện tượng phổ biến được quan sát bởi nhiều
nhà nghiên cứu trong tổng hợp phức của β-cyclodextrin dạng khách-chủ [57-59].
Ta cũng quan sát thấy dao động hóa trị của liên kết C-H tại số sóng 2925 cm-1. Dao
động biến dạng của liên kết O-H bị suy giảm cường độ và dịch chuyển về phía
bước sóng ngắn hơn (1652 cm-1) chứng tỏ nhóm OH đã tham gia vào phản ứng tạo
phức. Dao động hóa trị của liên kết C=C bị suy giảm khá mạnh và dịch chuyển về
57
vùng có bước sóng dài hơn (1602 cm-1). Trong phổ IR của phức chất, xuất hiện các
pic đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-O-C (1204, 1062 và 1012 cm-1).
Tuy nhiên, so với phổ của rutin, cường độ pic tại 1204 cm-1 bị suy giảm rất mạnh,
các pic tại 1062 và 1012 cm-1 gần như biến mất chứng tỏ rằng, liên kết C-O-C có
tham gia vào việc tạo phức với cyclodextrin.
Như vậy, sự khác biệt chủ yếu trong quang phổ của rutin và phức [RuT-
βCD] là việc dịch chuyển và suy giảm rất mạnh các rung động đặc trưng của liên
kết C=C, O-H và C-O-H do sự bao bọc một phần phân tử rutin bên trong khoang
của cyclodextrin và việc hình thành các liên kết hidro để tạo phức hợp [60,61].
Tương tự, kết quả phân tích quang phổ hồng ngoại của Quer, HPβCD và
phức hợp [Quer-HPβCD] được trình bày trên hình 3.9.
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
1
2
3
3423
16611613 1385 1267
1646
3424
2923
1648
1035
3424
1634
1036
Tra
nsm
itta
nce
Wavenumbers, cm-1
2924
Hình 3.9: Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier của Quer (1), HPβCD (2) và
phức hợp [Quer-HPβCD] (3).
Phổ hồng ngoại của Quer xuất hiện các vân phổ đặc trưng cho các liên kết:
3409 cm-1 (O-H), 1667 cm-1 (C = O), 1610 cm-1 (C = C), 1381 cm-1 (C-OH) và
1264 cm-1 (C-O-C). Phổ hồng ngoại của HPβCD xuất hiện vân phổ rất mạnh và
rộng với số sóng 3404 cm-1 tương ứng với dao động hóa trị của liên kết O-H. Ta
58
cũng quan sát thấy vân phổ với số sóng 2929 cm-1 được cho là dao động hóa trị của
liên kết C-H trong các nhóm CH- và CH2- của phân tử chủ. Một dải ngắn giữa 1600
và 1700 cm-1 và một dải lớn chứa các đỉnh riêng biệt trong vùng 900 đến 1200 cm-1
cũng được quan sát.
Phổ hồng ngoại của phức thể hiện cấu trúc của cả Quer và HPβCD. Sự khác
biệt chủ yếu trong quang phổ của phức so với Quer và HPβCD là: dải dao động hóa
trị của liên kết O-H trong phức (3424 cm-1) mở rộng hơn so với dao động tương
ứng trong HPβCD chứng tỏ có sự hình thành phức hợp; các dao động hóa trị của
liên kết carbonyl thơm đặc trưng trong quercetin chuyển sang vùng có số sóng ngắn
hơn 1646 cm-1 cùng với việc suy giảm cường độ rõ rệt, chứng tỏ liên kết C=O đã
tham gia vào việc tạo phức.
3.3.2 Kết quả phân tích DSC
Phương pháp nhiệt quét vi sai (DSC) thường được sử dụng trong hóa học
phức chất siêu phân tử để chứng minh sự khác biệt về thành phần cấu tạo của các
phân tử “khách” trước và sau khi tạo phức. Cụ thể, khi các đỉnh nội nhiệt nóng
chảy của sản phẩm phản ứng bị mất đi hoặc giảm cường độ là minh chứng cho sự
tạo phức.
100 200
-4
-2
0
1210C
174.80C
1110C
a
b
c
Nhieät ñoä, 0
C
Do
øng
nh
ieät,
W/g
1390C
Hình 3.9: Các đường cong DSC của rutin (a); phức chất nano rutin (b) và β-
CD (c).
59
Hình 3.9 biểu diễn các đường cong nhiệt của rutin, β-cyclodextrin và phức
chất nano được phân tích trong khoảng nhiệt độ từ 25 đến 300oC trong môi trường
khí trơ (ni-tơ).
Kết quả phân tích nhiệt quét vi sai của rutin là một vùng nhiệt rộng tương
ứng với quá trình đehydrat hóa, đỉnh nội nhiệt tại 174,80C tương ứng với điểm
nóng chảy của rutin.
Trong trường hợp của βCD, phổ DSC cho một vùng rộng hơn (từ 840C đến
1360C) (hình 3.10, đường cong c) tương ứng với quá trình giải phóng các phân tử
nước từ khoang bên trong của βCD; nhiệt độ nóng chảy của β-cyclodextrin là
121oC.
Đường cong b) biểu diễn kết quả phân tích nhiệt của phức nano [RuT-βCD].
Đỉnh nội nhiệt của βCD trong phức hợp là 1110C, thay đổi không nhiều nhưng
cường độ pic đã giảm đi so với βCD. Đáng kể hơn, đỉnh nội nhiệt của rutin trong
phức đã giảm đi khá nhiều cả về cường độ và nhiệt độ (tại 1390C). Đây là minh
chứng cho thấy đã có sự tương tác giữa rutin và βCD, một phần phân tử rutin đã đi
vào khoang rỗng của βCD và tạo phức.
50 100 150 200
1
790C
2
3
Temperature, 0C
Heat flow
880C
1400
1330C
Hình 3.11: Các đường cong DSC của Quer (1), HPβCD (2) và phức hợp (3).
60
Hình 3.11 biểu diễn kết quả phân tích nhiệt quét vi sai của Quer là một vùng
nhiệt rộng với đỉnh nội nhiệt tại 1400C tương ứng với điểm nóng chảy của Quer.
Tương tự như βCD, phổ DSC của HPβCD cho một vùng rộng hơn (từ 600C đến
1250C) tương ứng với quá trình giải phóng các phân tử nước từ khoang bên trong
của HPβCD với nhiệt độ nóng chảy là 88oC.
So sánh đường cong nhiệt của phức hợp với đường cong của Quer và
HPβCD cho thấy, đỉnh nội nhiệt của HPβCD trong phức hợp là 790C, thay đổi
không nhiều nhưng cường độ pic đã giảm đi đang kể so với HPβCD. Đỉnh nội nhiệt
của Quer trong phức đã giảm đi rõ rệt và gần như biến mất (1330C). Đây là minh
chứng cho thấy đã có sự tương tác giữa Quer và HPβCD, một phần phân tử Quer đã
đi vào khoang rỗng của HPβCD và tạo phức.
3.3.3 Kết quả phân tích hình thái cấu trúc
Hình thái học bề mặt của RuT, Quer, trước và sau khi tạo phức được thể hiện
trên hình 3.12.
a) b)
c) d)
Hình 3.12: Ảnh FESEM của các hạt RuT (a), Quer (c), [RuT-βCD] (b) và
[Quer-HPβCD] (d).
61
Từ hình 3.12 ta nhận thấy, RuT và Quer (hình a và b) có cấu trúc dạng thanh
nhỏ hoặc mảnh trên khắp bề mặt tinh thể. Sau khi tạo phức, (Hình c và d), các hạt
thu được có dạng hình cầu, khá đồng đều với kích thước trung bình 40-60 nm. Đây
là giá trị tương ứng với kích thước điển hình của các đơn vị chức năng trong cơ thể
sống, cho phép chúng tương tác hiệu quả với các phân tử sinh học, do đó làm tăng
tính khả dụng sinh học trong khi hạn chế một số tác dụng phụ do sự hiện diện lâu
dài trên niêm mạc dạ dày.
Trong ảnh hiển vi của phức hợp [Quer-HPβCD] (Hình 3.12d), các hạt nano
có bề mặt có độ xốp và nhám cao. Tuy nhiên, hình dạng của các hạt nano không
nhất quán và có xu hướng kết tụ. Kích thước của chúng thay đổi từ vài nm đến hơn
100 nm.
3.3.4 Kết quả xây dựng giản đồ pha của quá trình hoà tan
Xây dựng giản đồ của quá trình hòa tan thường được áp dụng trong lĩnh vực
hóa học siêu phân tử để xác định tỉ lệ phản ứng của các chất cùng hằng số bền của
phức chất. Khái niệm giản đồ pha hòa tan lần đầu tiên được đưa ra bởi các tác giả
Higuchi và Connors thể hiện độ hòa tan của thuốc thay đổi như thế nào khi nồng độ
của cyclodextrin tăng lên.
Trước khi xác định giản đồ pha hòa tan cần phải xây dựng phương trình
đường chuẩn của các hoạt chất trong dung dịch bằng phương pháp pha loãng đa
nồng độ trên máy quang phổ UV-Vis. Các phương trình đường chuẩn được sử dụng
để tính toán nồng độ hòa tan của RuT hoặc Quer trong dung môi có chứa
cyclodextrin.
Hình 3.13 trình bày một ví dụ về phổ hấp thụ UV-Vis của các dung dịch
quercetin khi không có HPβCD (đường cong a) và khi có nồng độ HPβCD tăng
(đường cong 1-5) trong khoảng 1 ÷ 8 mM. Có thể thấy rằng trong khoảng 300 - 450
nm, Quer thể hiện cực đại hấp thụ (đường cong a) ở bước song 370 nm, và có thể
được coi là chuyển tiếp trong vòng benzen đơn (Buchweitz M và cộng sự, 2016 ).
Các đường cong 1-5 trong hình 3.13 cho thấy sự hình thành phức hợp bao của Quer
với HPβCD dẫn đến hiệu ứng bathochromic: hấp thụ cực đại bị dịch chuyển về
phía bước sóng dài hơn (375 nm).
62
300 350 400 4500.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
= 370 nm
a
1
2
3
4
/ nm
Ab
so
rba
nce
= 375 nm
5
Hình 3.13: Phổ UV-Vis của quercetin khi không có HPβCD (đường cong a)
và khi có HPβCD với nồng độ tăng dần (đường cong 1-5).
Từ phương trình đường chuẩn của các hoạt chất ta xác định được chính xác
nồng độ của RuT và Quer hòa tan trong từng dung dịch cyclodextrin. Mối tương
quan giữa nồng độ của các phân tử chủ và độ tan của các phân tử khách được trình
bày trong hình 3.14.
0 1 2 3 4 5
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
C
Ru,
mm
ol/
l
CCD
, mmol/l
a)
0.0 2.0x10-3
4.0x10-3
6.0x10-3
8.0x10-3
2.0x10-5
4.0x10-5
6.0x10-5
8.0x10-5
1.0x10-4
CQ
uer, m
ol/l
CHPCD
, mol/l
b)
Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ của cyclodextrin và
độ tan của RuT (a) và Quer (b).
Kết quả cho thấy, độ tan của cả RuT và Quer tăng lên đáng kể và phụ thuộc
tuyến tính vào nồng độ của cyclodextrin trong dung dịch, kết quả cụ thể được trình
63
bày trong bảng 3.4. Hình dạng tuyến tính cũng chứng minh tỉ lệ hóa học tốt nhất để
tạo phức hợp 2 thành phần trong cả hai hệ là 1:1.
Bảng 3.4: Kết quả phân tích giản đồ pha của quá trinh hòa tan với các phức hợp
[RuT-βCD] và [Quer-HPβCD].
Phức hợp giản đồ pha của quá
trình hòa tan
Hệ số
hồi quy
Hằng
số bền
Biến thiên năng
lượng Gibbs,
kJ/mol
[RuT-βCD] y=0.0226x+0,00012 0,992 154 -12,48
[Quer-HPβCD] y=0,00792x+0,00002 0,989 363 -14,60
Biến thiên năng lượng Gibbs của phản ứng tạo phức được tính tóán dựa vào
phương trình: ∆rG = – RTlnK (3), kết quả được thống kê trong bảng 3.4.
Như vậy, phản ứng tạo phức tự diễn ra trong môi trường nước tại nhiệt độ
298K. Các kết quả thu được phù hợp với kết quả nghiên cứu mà tác giả I. M. Savic
và cộng sự thu được trong công bố.
3.3.5 Kết quả xác định độ hòa tan của rutin và phức hợp [RuT-βCD]
Tương tự như phần 3.3.4 trước khi xác định độ tan của rutin trong dung dịch
có pH 7,4 ta xây dựng phương trình đường chuẩn của RuT theo phương pháp pha
loãng đa nồng độ. Kết quả thu được phương trình đường chuẩn của RuT là
y=13752x-0,0031 với hệ số hồi quy R2=0,9995.
Hình 3.13 biểu diễn độ tan của rutin trước và sau khi tạo phức theo thời gian
trong môi trường pH 7,4.
64
Hình 3.15: Phần trăm hòa tan của RuT và phức [RuT-βCD] theo thời gian
trong môi trường pH 7,4.
Từ hình 3.15 có thể thấy, tại tất cả các thời điểm rút mẫu, phức có độ hòa tan
tốt hơn rutin thuần. Ở phút thứ 5 sau khi hòa tan, độ tan của phức đã đạt được giá
trị hơn 85% và đạt giá trị lớn nhất 97% trong khoảng thời gian nghiên cứu. Ngược
lại, độ tan lớn nhất của rutin ở dạng tự do là 78% sau 110 phút. Như vậy, việc tạo
phức nano với β-cyclocdextrin đã cải thiện rõ rệt độ tan của rutin.
3.3.6. Kết quả xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH của rutin và phức
hợp [RuT-HPβCD]
Khả năng bắt gốc tự do DPPH của các mẫu ở các nồng độ khác nhau được
trình bày trên hình 3.16.
Từ hình 3.16 ta nhận thấy, theo sự tăng dần nồng độ từ 0,5 µg/ml – 14
µg/ml, tỉ lệ % bắt gốc tự do DPPH của rutin và phức hợp tăng dần. Ở cùng một
nồng độ, % khả năng bắt gốc tự do DPPH của phức hợp cao hơn rutin thuần. Với
nồng độ 14 µg/ml, tỉ lệ % khả năng bắt gốc tự do của rutin và phức hợp lần lượt là
67% và 75%. Các phương trình hồi quy đơn giản thể hiện mối tương quan giữa tỉ lệ
% hoạt tính bắt gốc tự do DPPH và các nồng độ của dược chất được xây dựng dựa
vào phần mềm Origin. Trên cơ sở đó, phương trình được chọn là phương trình có
65
hệ số tương quan và tương quan hiệu chỉnh cao nhất với độ tin cậy > 95%. Từ
phương trình này ta xác định được giá trị IC50 của rutin và phức hợp là giá trị nồng
độ của dược chất, mà tại đó % khả năng bắt gốc tự do DPPH đạt được là 50%. Kết
quả được trình bày trong bảng 3.4.
0 2 4 6 8 10 12 14
10
20
30
40
50
60
70
80
CRuT, g/ml
Ho
aït t
ính
ch
oán
g o
xi h
oùa
, %
[RuT-CD]
RuT
Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa % bắt gốc tự do DPPH của
rutin và phức [RuT-HPβCD] theo giá trị nồng độ của rutin.
Bảng 3.5: Phương trình tương quan giữa % bắt gốc tự do DPPH và nồng độ dược
chất của rutin và phức hợp và giá trị IC50 tương ứng.
Phương trình tương
quan
Hệ số hồi quy Giá trị IC50,
µg/ml
RuT y=3,2346+5,63x 0,996 8,31
[RuT-HPβCD] y=11,54+5,287x 0,995 7,27
Từ bảng 3.5 ta nhận thấy sau khi tạo phức hoạt tính chống oxi hóa của rutin
đã tăng lên rõ rệt: giá trị IC50 đã giảm từ 8,31 xuống 7,27 µg/ml. Như vậy, việc tạo
phức nano với cyclodextrin đã cho thấy những kết quả khả quan trong việc cải
thiện độ tan và sinh khả dụng của dược chất.
66
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 KẾT LUẬN
-Trong nghiên cứu này, rutin được chiết xuất bằng dung dịch Na2CO3 2% và tinh
chế bằng axit axetic ở các nồng độ khác nhau trong khoảng 10-50%, quercetin thu
được từ rutin và tinh chế trong cồn 960. Kết quả phân tích sắc ký bản mỏng, phổ
cộng hưởng từ hạt nhân và sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy rutin thu được có
dạng bột màu vàng, độ tinh khiết đạt được giá trị cực đại 98,83% khi tinh chế bằng
axit axetic 40%; quercetin có dạng bột màu vàng xanh, độ sạch cao.
˗ Phức chất giữa rutin với β-cyclodextrin và quercetin với hydroxypropyl-β-
cyclodextrin đã được tổng hợp thành công trong dung môi hỗn hợp nước-cồn tuyệt
đối bằng phương pháp đồng kết tủa. Hiệu suất tổng hợp phức trong dung môi hỗn
hợp tại tất cả các điểm nghiên cứu đều lớn hơn giá trị tương ứng trong môi trường
nước. Giá trị hiệu suất đạt cực đại 73% và 80% trong dung môi có hàm lượng
EtOH 15-20% v/v.
˗ Kết quả nghiên cứu đặc trưng phức chất bằng các phương pháp FTIR, UV-
Vis, DLS, DSC và phân tích hình thái cấu trúc vật liệu FESEM cho thấy có sự dịch
chuyển và suy giảm rất mạnh các dao động đặc trưng cho liên kết C=C, O-H và C-
O-H trong phân tử rutin, chứng tỏ một phần phân tử rutin đã chui vào bên trong
khoang rỗng của phân tử chất mang; đỉnh nội nhiệt của rutin trong phức đã giảm đi
đáng kể cả về cường độ và nhiệt độ; kích thước hạt khá đồng đều với đường kính ~
50-60 nm.
˗ Sự khác biệt chủ yếu trong quang phổ IR của phức [Quer-HPβCD] so với
Quer thuần và HPβCD là: dải dao động hóa trị của liên kết O-H trong phức (3424
cm-1) mở rộng hơn so với dao động tương ứng trong HPβCD; các dao động hóa trị
của liên kết carbonyl thơm đặc trưng trong quercetin chuyển sang vùng có số sóng
67
ngắn hơn 1646 cm-1 cùng với việc suy giảm cường độ rõ rệt, chứng tỏ liên kết C=O
đã tham gia vào việc tạo phức. Kết quả DSC cho thấy, Đỉnh nội nhiệt của Quer
trong phức đã giảm đi rõ rệt và gần như biến mất (1330C).
˗ Kết quả xây dựng giản đồ pha của quá trình hòa tan cho thấy, trong nước
rutin và quer tạo phức với CD theo tỷ lệ stoichometric 1:1, độ tan của của các dược
chất tăng lên đáng kể và phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của CD trong dung dịch.
˗ Độ tan của rutin và phức hợp theo thời gian đã được khảo sát. Tại tất cả các
điểm rút mẫu, độ tan của phức đều cao hơn độ tan của rutin thuần.
˗ Khả năng bắt gốc tự do DPPH của phức hợp cao hơn của rutin thuần. Cụ thể,
hoạt tính chống oxi hóa của rutin sau khi tạo phức đã tăng lên rõ rệt: giá trị IC50 đã
giảm từ 8,31 xuống 7,27 µg/ml.
4.2 KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả nghiên cứu thu được chúng tôi nhận thấy:
˗ Việc sử dụng axit axetic để tinh chế rutin hoàn toàn có thể thay thế được axit
HCl với độ tinh sạch lên đến >98%. Hơn nữa việc sử dụng axit axetic có ưu điểm
an toàn với người lao động, không độc hại lại không gây tổn hao về thiết bị, máy
móc, do đó cần nghiên cứu trên quy mô rộng hơn.
˗ Việc tăng độ tan của các hoạt chất không những do phức hợp tạo thành mà
kích thước hạt cũng ảnh hưởng đáng kể. Do đó, việc tạo phức nano có kích thước
ổn định, nhỏ hơn sẽ được quan tâm trong các nghiên cứu tiếp theo.
˗ Độ tan, khả năng bắt gốc tự do của quercetin và phức [Quer-HPβCD] cần
được nghiên cứu.
68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Peng Z.F., Strackb D., Baumert A. et al, Antioxidant flavonoids from
leaves of Polygonum hydropip L, Phytochem, 2003 (62): 219-504.
2. A. N. Panche, A. D. Diwan and S. R. Chandra, Flavonoids: an overview.
Journal of Nutritional Science (2016), vol. 5, e47, page 1-15.
doi:10.1017/jns.2016.41.
3. Satyendra et al, A review of quercetin: Antioxidant and anticancer
properties, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Volumee 11,
Issue 1, 146-160.
4. Ross JA, Kasum CM, Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic
effects, and safety, Annu Rev Nutr 2002;22:19-34.
5. Hollman PC, Bijsman MN, van Gameren Y, et al, The sugar moiety is a
major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man, Free
Radic Res 1999;31:569-573.
6. Hosseinzadeh H, Nassiri-Asl M, Review of the protective effects of rutin
on the metabolic function as an important dietary flavonoid, J Endocrinol Invest.
2014; 37: 783–788.
7. Salvamani S, Gunasekaran B, Shaharuddin NA, Ahmad SA, Shukor MY,
Antiartherosclerotic effects of plant flavonoids, Biomed Res Int 2014. 2014:
480258.
8. Sultana B, Anwar F, Flavonols (Kaempeferol, quercetin, myricetin)
contents of selected fruits, vegetables and medicinal plants, Food Chem. 2008;
108:879–84.
9. Lakhanpal P, Rai DK, Quercetin: A versatile flavonoid, Int J Med Update,
2007; 2:22–37.
10. Akan Z, Garip AI, Antioxidants may protect cancer cells from apoptosis
signals and enhance cell viability, Asian Pac J Cancer Prev, 2013; 14:4611–4.
69
11. Vásquez-Garzón VR, Arellanes-Robledo J, García-Román R, Aparicio-
Rautista DI, Villa-Treviño S, Inhibition of reactive oxygen species and pre-
neoplastic lesions by quercetin through an antioxidant defense mechanism, Free
Radic Res. 2009; 43:128–37.
12. Johari J, Kianmehr A, Mustafa MR, Abubakar S, Zandi K, Antiviral
activity of baicalein and quercetin against the Japanese encephalitis virus, Int J
Mol Sci. 2012; 13:16785–95.
13. Cushnie TP, Lamb AJ, Antimicrobial activity of flavonoids. Int J
Antimicrob Agents, 2005; 26:343–56.
14. Ramos FA, Takaishi Y, Shirotori M, Kawaguchi Y, Tsuchiya K, Shibata
H, et al, Antibacterial and antioxidant activities of quercetin oxidation products
from yellow onion (Allium cepa) skin, J Agric Food Chem. 2006; 54:3551–7.
15. Coles LS. Quercetin: A Review of Clinical Applications, Available
: http://www.chiro.org/nutrition/ABSTRACTS/Quercetin_A_Review.shtml .
16. P. Stanley Mainzen Prince, N. Kamalakkannan, Rutin improves glucose
homeostasis in streptozotocin diabetic tissues by altering glycolytic and
gluconeogenic enzymes, J. Biochem. Mol. Toxicol, 20 (2) (2006), pp. 96-102
17. N. Kamalakkannan, P.S. Prince, Antihyperglycaemic and antioxidant
effect of rutin, a polyphenolic flavonoid, in streptozotocin-induced diabetic wistar
rats, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 98 (1) (2006), pp. 97-103
18. J. Nones, A.P. Costa, R.B. Leal, F.C. Gomes, A.G. Trentin, The
flavonoids hesperidin and rutin promote neural crest cell survival, Cell Tissue
Res., 350 (2) (2012), pp. 305-315
19. C.F. Gonçalves, M.C. Santos, M.G. Ginabreda, R.S. Fortunato, D.P.
Carvalho, A.C. Freitas Ferreira, Flavonoid rutin increases thyroid iodide uptake in
rats, PLoS One, 8 (9) (2013), p. e73908
70
20. Nguyễn Hoàng Hợp (2002). Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin từ hoa
hòe (Sophora japonica L. Fabaceae). Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ. Đại học Dược
Hà Nội.
21. Beatriz Gullon et al. Rutin: A review on extraction, identification and
purification methods biological activities and approaches to enhance its
bioavailability. Trends in Food Science � & Technology 67 (2017) 220-235
22. Jinwoo Yang et al. Conversion of Rutin to Quercetin by Acid Treatment
in Relation to Biological Activities. Prev Nutr Food Sci. 2019 Sep; 24(3): 313–320
23. A. Magnúsdóttir, M. Másson and T. Loftsson, J. Incl. Phenom. Macroc.
Chem. 44, 213-218, 2002.
24. Del Valle EMM (2004), Cyclodextrins and their uses: a review, Process
Biochem. 39: 1033-1046.
25. K. Miyake, H. Arima, F. Hirayama, M. Yamamoto, T. Horikawa, H.
Sumiyoshi, S. Noda, K. Uekama, Improvement of solubility and oral bioavailability
of rutin by complexation with 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, Pharm. Dev.
Technol. 5(3) (2000) 399–407. DOI: 10.1081/pdt-100100556
26. S. Shuang, J. Pan, S. Guo, M. Cai, C. Liu, Fluorescence study on the
inclusion complexes of rutin with β-cyclodextrin, hydroxypropyl-β-cyclodextrin and
γ-cyclodextrin, Anal. Lett. 30(12) (1997) 2261–2270. DOI:
10.1080/00032719708001737
27. I.M. Savic, I.M. Savic-Gajic, V.D. Nikolic, B.L. Nikolic, B.C.
Radovanovic, A. Milenkovic-Andjelkovic, Enhencemnet of solubility and
photostability of rutin by complexation with β-cyclodextrin and (2-hydroxypropyl)-
β-cyclodextrin, J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 86 (2016) 33–43. DOI
10.1007/s10847-016-0638-8
28. Azat Bilalov, Jonas Carlstedt et al, DNA with amphiphilic counterions:
tuning colloidal DNA with cyclodextrin, Soft Matter, 2012, 8, 4988–4994
71
29. Sylvan G. Frank. Inclusion Compounds. Journal of Pharmaceutical
sciences.Vol. 64, No. 10, October 1975. 1585-1604
30. Patil J.S. et al, Inclusion complex system; A novel technique to improve
the solubility and bioavailability of poorly soluble drugs: A review, International
Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, Volume 2, Issue 2, May
– June 2010; Article 006, 29-34. ISSN 0976 – 044X
31. Nerome H., Machmudah S., Wahyudiono et al. Nanoparticle
formation of lycopene/β-cyclodextrin inclusion complex using supercritical
antisolvent precipitation. The Journal of Supercritical Fluids. 2013 (83): 97-103.
32. Khalid Q., Ahmad M., Minhas M. U. Synthesis of β-cyclodextrin
hydrogel nanoparticles for improving the solubility of dexibuprofen;
Characterization and Toxicity Evaluation. Drug Development and Industrial
Pharmacy, 2017. DOI:10.1080/03639045.2017.1350703.
33. Coneac G., Gafiţanu E., Hădărugă N. G. et al. Quercetin and rutin/2-
hydroxypropyl-β-cyclodextrin nanoparticles: obtaining, characterization and
antioxidant activity. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies. 2009
(15) (3): 441-448
34. Bùi Quang Thuật. Nghiên cứu công nghệ tạo hương liệu bột từ
cyclodextrin, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2010, 48, 67-69
35. Nguyễn Ngọc Sao Mai, Nguyễn Thanh Hải, Võ Thụy Cẩm Vy, Huỳnh
Văn Hóa. Nghiên cứu điều chế và đánh giá phức hợp piroxicam-cyclodextrin. Tạp
chí Dược học, 2009, 5, 19-23.
36. Tiêu Vĩnh Thuận, Phạm Đình Duy, Huỳnh Văn Hóa. Tối ưu hóa quy
trình sản xuất viên nén chứa phức piroxicam-beta cyclodextrin bằng thiết kế thực
nghiệm. Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 2010, 1, 169-173.
37. Phùng Đức Truyền, Nguyễn Phước Trường, Huỳnh Văn Hóa, Đặng Văn
Tịnh. Nghiên cứu điều chế hệ phân tán rắn hydroxybutyl-beta-cyclodextrin làm
tăng độ tan của rutin. Tạp chí Dược học, 2013, 442, 53, 23-27.
72
38. Phan Thanh Thảo. Nghiên cứu tổng hợp phức chất curcumin-
cyclodextrin và curcumin-phospholipid bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn. Báo cáo đề
tài cấp Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, 2015.
39. Nguyen T.-D., Tran T. Hong-Ngan, Nguyen C.H. et al. Synthesis and
Characterization of β-Cyclodextrin/alginate Nanoparticle as a Novel Drug
Delivery System. Chem. Biochem. Eng. Q., 2015, 29(3), 429–435.
40. Z. Yuan, Y, Ye, F. Gao, H. Yuan, M. Lan, K. Lou, W. Wang, Chitosan-
graf-β-cyclodextrin nanoparticles as a carrier for controlled drug release. Int. J.
Pharm., 2013, 446, 191–198.
41. Nguyễn Cao Hiền, Tan Văn Hâu, Lê Thị Thanh Vân, Võ Tuấn Quốc,
Tổng hợp hệ nano hydroxypropyl-betacyclodextrin/alginate làm vật liệu mang
thuốc, Tạp chí Khoa học công nghệ và Thực phẩm, 2017, 13(1), 89-94.
42. Corciovă A., Caşcaval D. Characterization of rutin-cyclodextrin
inclusion compounds // Chemistry & Chemical Engineering, Biotechnology, Food
Industry. 2011 (12) (4): 341 – 346.
43. Coneac G., Gafiţanu E., Hădărugă N. G. et al. Quercetin and rutin/2-
hydroxypropyl-β-cyclodextrin nanoparticles: obtaining, characterization and
antioxidant activity. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies. 2009
(15) (3): 441-448.
44. Paczkowska M., Mizera M., Piotrowska H. Complex of Rutin with β-
Cyclodextrin as Potential Delivery System. PloS ONE. 2015 (10) (3): e0120858.
45. T. V. Ilyich et al. Inclusion Complexes of Quercetin with β-
Cyclodextrins: Ultraviolet and Infrared Spectroscopy and Quantum Chemical
Modeling. Biophysics, 2020, Vol. 65, No. 3, pp. 381–389.
46. Nguyen T. A., Liu B., Zhao J. et al. An investigation into the
supramolecular structure, solubility, stability and antioxidant activity of
rutin/cyclodextrin inclusion complex. Food Chemistry. 2013 (136): 186–192.
73
47. Savic I. M., Savic-Gajic I. M., Nikolic V. D. Enhencemnet of solubility
and photostability of rutin by complexation with β-cyclodextrin and (2-
hydroxypropyl)-β-cyclodextrin. Incl Phenom Macrocycl Chem. 2016 (86): 33-43.
48. Pham Thi Lan et al. Quercetin nanoparticles: Obtaining, characteristics
and potential application improved water solubility of quercetin by preparing
complexation with cyclodextrins in binary solvent.
49. Hand book of Thin Layer Chromatography, Sherma, J.and Fried, B.
(authors) 3rd ed. Marcel Dekker,New York.
50. Nguyễn Đình Triệu (2013), Các Phương Pháp Phổ Trong Hóa Học Hữu
Cơ, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia, Hà Nội
51. Malviya R, Bansal V., Pal O.P. and Sharma P.K. High performance
liquid chromatography: a short review. Journal of Global Pharma Technology.
2010; 2(5): 22-26
52. T. Higuchi, K.A. Connors, Phase-solubility techniques, Adv. Anal.
Chem. Instrum. 4 (1965) 117-212.
53. Molecular biology, vol.6 . Moscow. 1975. tr. 7–33
54. Joseph Goldstein, Dale E. Newbury, David C. Joy, Charles E. Lyman,
Patrick Echlin, Eric Lifshin, L.C. Sawyer, J.R. Michael (2003). Scanning Electron
Microscopy and X-ray Microanalysis. Springer; 3rd ed. ISBN-13 978-0306472923.
55. Brand – Williams, W., Cuvelier, M. E. & Berset, C. (1995), “Use of free
radical method to evaluate antioxidant activity”, LWT, Vol. 28, pp. 25 – 30.
56. Le Thi My Chau, Vu Dinh Hoang, Nguyen Thi Minh Tu, Tran Dinh
Thang. CHEMICAL CONSTITUENTS OF THE RHIZOMES OF Zingibercollinsii
Mood &Theilade (ZINGIBERACEAE) GROWING IN VIETNAM. Journal of
Science and Technology 54 (4A) (2016) 283-289
57. Yoshii H., Kometani T., Furuta T. et al. Formation of Inclusion
Complexes of Cyclodextrin with Ethanol under Anhydrous Conditions. Biosci.
Biotechnol. Biochem. 1998 (62): 2166-2170.
74
58. Coleman A.W, Munoz M., Chatjigakis A.K.. Classification of the
solubility behaviour of β-cyclodextrin in aqueous-co-solvent mixtures. J. Phys. Org.
Chem. 1993 (6): 651-659.
59. Kukushkin V.Yu., Kukushkin Yu.N. Theory and Practice of the
Synthesis of Coordination Compounds. Nauka, incl. Leningrad. 1990, 127-141.
60. Gamov G.A., Khokhlova A.Yu., Gushina A.S. et al. Protolytic and
tautomeric equilibria of pyridoxine in aqueous ethanol. J. Chem. Therm., 2016
(97): 322-330.
61. Al-Nasiri G., Cran M. J., Smallridge A. J., Bigger S. W. Optimisation of
β-Cyclodextrin Inclusion Complexes with Natural Antimicrobial Agents:Thymol,
Carvacrol and Linalool. J. Microencapsul. 2018 (35) (1): 26-35.