Álvaro edmundo simÕes ulhoa cintra - … dragosavac, dr. nelson adami andreollo, dra. josé...

ÁLVARO EDMUNDO SIMÕES ULHOA CINTRA

“Enterocolite Necrosante: a influência da L-Arginina nas alterações histopatológicas e bioquímicas da parede intestinal de ratos recém-nascidos submetidos às condições

de hipóxia e reoxigenação”

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) para obtenção do Título de Doutor em Ciências

São Paulo

- 2008 -

2

ÁLVARO EDMUNDO SIMÕES ULHOA CINTRA



Tese apresentada à Universidade Federal de São Paul o (Unifesp)

para obtenção do Título de Doutor em Ciências

Orientador: Prof. Dr. José Luiz Martins

São Paulo

- 2008 -

3

Cintra , Álvaro Edmundo Simões Ulhoa. “Enterocolite Necrosante: a influência d a L-Arginina nas alterações histopatológicas e bioquímicas da pare de intestinal de ratos recém-nascidos submetidos às condições de hipóxia e reoxigenação” / Álvaro Edmundo Simões Ulhoa Cintra - São Paulo, 2008. 92 f Tese: (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo (Unifesp / EPM) Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação. Título em Inglês: “Necrotizing Enterocolitis: the L-Arginin’s protector effect into histopathological and bioquimical changes on the newborn rat’s intestinals wall” 1. hipóxia 2. reoxigenação 3. L-Arginina 4. rato 5. Enterocolite necrosante 6. óxido nítrico 7. peroxidação lipídica.

4

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA - UNIFESP -

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIRURGIA E EXPERIMENTA ÇÃO - strictu sensu -

Coordenador: Prof. Dr. José Luiz Martins

TESE DE DOUTORADO

Autor: Álvaro Edmundo Simões Ulhoa Cintra Orientador: Prof. Dr. José Luiz Martins

Título: “Enterocolite Necrosante: a influência da L-Arginina nas alterações

histopatológicas e bioquímicas da parede intestinal de ratos recém- nascidos submetidos às condições de hipóxia e reoxigenação”.

BANCA EXAMINADORA

Presidente: Prof. Dr. José Luiz Martins Professor Titular de Cirurgia Pediátrica – Departamento de Cirurgia Universidade Federal de São Paulo (Unifesp). Membros Prof. Dr. Joaquim Murray Bus torff Silva Efetivos: Professor Titular de Cirurgia Pediátrica – Departamento de Cirurgia Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Prof. Dr. Mário Ma ntovani Professor Titular de Cirurgia do Trauma – Departamento de Cirurgia Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Prof. Dr. João Jos é Fagundes

Professor Livre Docente Disciplina do Aparelho Digestivo “coloproctologia”- Departamento de Cirurgia

Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Prof. Dr. Jacques Pinus Professor Adjunto de Cirurgia Pediátrica – Departamento de Cirurgia Universidade Federal de São Paulo (Unifesp). Membros Prof. Dr. Pedro Munhoz Ferna ndez Suplentes: Professor Adjunto do Departamento de Saúde Materno-Infantil Faculdade de Medicina da Fundação Universitária do ABC. Prof. Dr. Fábio Luis Peterlini Professor de Cirurgia Pediátrica – Departamento de Cirurgia. Universidade Federal de São Paulo (Unifesp).

5

GRATIDÃO A Deus – Criador do Universo, fonte de amor e sabedoria. Pela Vida , dádiva outorgada a cada um de nós, Por Sua Misericórdia e Graça que nos alcança a todos e ultrapassa a toda compreensão e, sobretudo pelo Plano da Redenção do ser humano. “Deus ama os seres humanos de tal maneira que deu seu Filho único, para que todo aquele que Nele crê..., tenha vida eterna”. João 3:16 “Ele tomou sobre si as nossas enfermidades, Ele carregou sobre si mesmo as nossas dores... verdadeiramente Ele foi ferido pelas nossas transgressões e moído pelas nossas iniqüidades; e o castigo que nos traz Paz estava sobre Ele, e pelas suas pisaduras fomos sarados”. Isaías 53:4 e 5 A Família - meu esteio, referência e segurança. Meus saudosos pais Edmundo Ulhoa Cintra e Aurora Simões Cintra que me ensinaram o valor da dignidade humana e do empenho pessoal. Minha amorosa esposa Ellen Rose Lehr Ulhoa Cintra, linda, sempre preocupada comigo, com atento cuidado, companhia e atenção, sorrindo ao meu lado nos dias bons, apoiando e incutindo ânimo quando as circunstâncias são difíceis. Meus queridos filhos Everton Ulhoa Cintra , Clayton Ulhoa Cintra e Telma Ulhoa Cintra, razão de ser de minha vida. Meus irmãos Carlos Edmundo Simões Ulhoa Cintra e Eliana Aurora Cintra Canteruccio , meus cunhados, sobrinhos e familiares pela convivência feliz em cada encontro. A cada um daqueles que observaram uma oportunidade, acreditaram na possibilidade e me incentivaram a prosseguir, com persistência, dedicação e apoio em todo tempo.

6

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. José Luiz Martins , modelo de cirurgião dedicado e homem de ciência, humilde e altruísta, pelo incentivo e apoio irrestrito, disponibilidade de atenção e de tempo, pela condução, correções e criticas construtivas, buscando sempre me ensinar a fazer pesquisa de valor. Aos meus primeiros “mestres” na cirurgia pediátrica Prof. Dr. Virgilio Alves de Carvalho Pinto, Dr. Plínio Campos Nogueira, Dr. Man oel Reis Gonçalves Salvador, Dr. Geraldo Modesto de Medeiros, Dr José Osório de Oliveira Lira , pela paciência, simpatia e bondade para comigo, perseverança ao tomar residentes pela mão e ensinar a arte de avaliar, operar e participar no processo de mitigar o sofrimento do pequeno paciente. Aos Profs. Dr. John Cook Lane, Dr. Renato Giuseppe Giovanni Te rzi, Dr. Mário Mantovani, Dr. Juvenal Ricardo Góes, Dr. Domingo Ma rcolino Braile, Dr. João José Fagundes, Dra. Desanka Dragosavac, Dr. Nelson Adami Andreollo, Dra. José Antonio Gontijo, Dr. Konadin Metze e outros mais, que na Unicamp me ensinaram o “processo” de ensino e aprendizagem em medicina, mostraram o prazer de estudar, pesquisar e descobrir, de conhecer e transmitir, de maneira atrativa aos estudantes, o maravilhoso, o fantástico universo que é o Organismo Humano. Aos Profs. Dr. Luiz Francisco Poli de Figueiredo, Dr. Djalma José Fagundes, Dr. Saul Goldenberg, Dr. Álvaro Nagib Atallah, Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo, Dr. Murched Omar Taha, Dr. Eliézer da Silv a, Dra. Miriam Ghiraldini Franco, Dr. Hélio Plapler, Dr. Ulysses Dória Filho, Dr. Afonso Caricati Neto e muitos outros que na Unifesp, contribuem na formação da massa crítica do pensamento médico-científico, na busca do conhecimento experimental, na compreensão baseada em evidências, no aprendizado com metodologia, na procura da verdade fisiológica. As Profas. Dra. Francy Reis da Silva Patrício , Dra. Elisa Mieko Suemitsu Higa , Dra. Guiomar Nascimento Gomes , Dra. Gui Mi Ko, Dra.Edna Frasson de Souza Montero que participaram no desenvolvimento deste trabalho experimental, pela disposição e boa vontade ao levar avante a pesquisa, analisar sem tendências e buscar compreender os resultados obtidos. Aos preciosos amigos Ricardo José Morelo (fotomicrografias), a Sonia Maria da Silva (dosagens), a Thais M. Fonseca (espectrofotometria/ MDA), a Margareth Gori Moura (NO), ao Davi Augusto Marski Filho (diagramação/formatação). A Fapesp por acreditar, avaliar e investir em nosso projeto de estudo, liberando os recursos financeiros para equipamento e materiais necessários a realização da

7

pesquisa, como também disponibilizar verbas para podermos ir aos congressos e fórum para apresentar o resultados de nosso trabalho. As queridas e sempre atuantes: Valdelice Justiniano Soares, Nancí Cristina Vieira e Elaine Maria Alves Bazzi Dantas secretarias na disciplina de Cirurgia Pediátrica e na pós-graduação em Cirurgia e Experimentação, pela amizade e disposição para comigo. Aos Pós-Graduandos da Unifesp com os quais tive o privilégio e a oportunidade de conviver nestes últimos anos, pela amizade e companheirismo construtivo, cada qual com suas ocupações e dificuldades, buscando sempre alcançar um melhor preparo para ser útil. Meu profundo respeito aos animais de experimentação que tiveram sua vida sacrificada durante a realização deste trabalho científico. Pensamentos: “Assim é a vida. Quando paramos demais para avaliar os problemas e as dificuldades, perdemos tempo e nos distanciamos das nossas metas”. “Encontrar defeitos é muito fácil, qualquer um pode fazê-lo, entretanto encontrar qualidades é tarefa para quem tem espírito nobre, capaz de inspirar êxito nas pessoas”. “Todos temos tendência de sonhar com sucesso, prosperidade e bem estar, confundindo realização com objetivo. Objetivo é o alvo a ser alcançado, conquistando terreno passo a passo. Realização é o resultado dessa conquista”.

“Bons professores são caros; maus professores mais caros ainda”.

8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 e 2 - fotografias - ratas com as crias, inoculação intra-peritoneal de L-Arginina.........34

Figura 3 e 4 - fotografias de câmara de gases para hipóxia e reoxigenação............................36

Figura 5 - fotografia – laparotomia do animal de experimento..................................................37

Figuras 6 e 7- fotografia – dissecção e exérese dos intestinos.................................................38

Figura 8 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 0, HE 200x............................................41

Figura 9 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 0, HE 200x............................................41

Figura 10 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 1, HE 400x..........................................42










Figura 20 - fotomicrografia: plexo mioentérico – proteína S-100 (íleo) 400 X...........................48

Figura 21 - fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 1) grau 3 - HE 100X..........................55

Figura 22 - fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 1) grau 4 - HE 40X ..........................55


Figura 24 - fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 2) grau 2 – HE 100X.........................56



Figura 27 a 29 - fotomicrografia: gânglios (proteína S-100) 100x, 200x, 400x (grupo 3).........61

Figura 30 a 32 - fotomicrografia: gânglios (proteína S-100) 100x, 200x, 400x (grupo2)..........62

Figura 33 - fotomicrografia: gânglios (proteína S-100) 400x (grupo2)......................................63

Figura 34 – fotomicrografia: neurônios (NSE) 400x (grupo 2)..................................................63

9

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - grupos de estudo (H/R, ARG, CTL).................................................................33

Tabela 2 - classificação e Score - Análise das lesões intestinais.....................................54

Tabela 3 - media e desvio padrão - gânglios do plexo nervoso intestinal de ratos..........58

Tabela 4 - media e desvio padrão - neurônios do plexo nervoso intestinal......................60

Tabela 5 - estatística - concentração do NO (µMol) no Íleo..............................................64

Tabela 6 - estatística - concentração do NO (µMol) no Cólon..........................................65

Tabela 7 - estatística - concentração do MDA (nMol/mg proteínas).................................68

10

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - morfologia - grau de lesão tecidual intestinal ..........................................................54

Gráfico 2 - Comparação entre as médias dos gânglios do plexo nervoso intestinal.................59

Gráfico 3 - Comparação entre as médias dos neurônios do plexo nervoso intestinal...............60

Gráfico 4 - comparação dos grupos 1 e 2 - concentração do NO (µMol) no Íleo.......................64

Gráfico 5 - comparação entre os 3 grupos - concentração do NO (µMol) no Íleo......................65

Gráfico 6 - comparação dos grupos 1 e 2 - concentração do NO (µMol) no Cólon...................66

Gráfico 7 - comparação entre os 3 grupos - concentração do NO (µMol) no Cólon..................66

Gráfico 8 - Media - concentração do NO (µMol) - Íleo e Cólon..................................................67

Gráfico 9 - Desvio Padrão - concentração do NO (µMol) Íleo e Cólon......................................67

Gráfico 10 - comparação – concentração de MDA (nMol/mg proteínas) ..................................68

11

ABREVIATURAS - SÍMBOLOS

A.......................................................absorbância

ANOVA.............................................análise de variância

BSA...................................................soro - albumina bovina

° C................................................ .....graus Celsius

CBB...................................................coomassie brilhant blue

CEDEME...........................................Centro de desenvolvimento (Biotério)

cm .....................................................centímetro

CO2....................................................gás carbônico

dp......................................................desvio padrão

ECN...................................................enterocolite necrosante neonatal

EPM...................................................Escola Paulista de Medicina

et al ...................................................colaboradores

G........................................................grupo

g.........................................................grama

H2O2...................................................peróxido de oxigênio

H/R.....................................................hipóxia e reoxigenação

I/R......................................................isquemia e reperfusão

Kg......................................................quilograma

µg.......................................................micrograma

µMol...................................................micromol

M........................................................mol

MDA...................................................malondialdeido

mg .....................................................miligrama

ml ......................................................mililitro

µl........................................................microlitro

N........................................................número

NO.....................................................óxido nítrico

12

NOS...................................................óxido nítrico sintetase

NPP....................................................nutrição parenteral prolongada

O2.......................................................oxigênio

OUT..................................…..............out-bread

pH.......................................................potencial hidrogênio iônico

pO2 .....................................................pressão de oxigênio

RN.......................................................recém-nascido

rpm .....................................................rotações por minuto

TBA.....................................................ácido tiobarbiturico

TRIS....................................................solução tampão de tris-hidroximetil-aminometano

UI........................................................unidade internacional

x..........................................................vezes

13

RESUMO Objetivo: Investigar o efeito da L-Arginina em roedores submetidos às

condições de hipóxia e reoxigenação num modelo experimental de

enterocolite necrosante através da avaliação bioquímica dos valores

teciduais do óxido nítrico e do malondialdeido, como também pelas

alterações histopatológicas e imuno-histoquimicas dos intestinos.

Métodos: Utilizou-se 80 ratos recém-nascidos da linhagem Wistar EPM-1

ambos os sexos, pesando 4,4 a 6,6 g. Os animais foram distribuídos

aleatoriamente em 3 classes: grupo 1 (H/R) = (n 32) hipóxia e

reoxigenação, grupo 2 (ARG) = (n 32) pré-tratamento com L-arginina mais

H/R e grupo 3 (CTL) = (n 16) controle. Os animais dos grupos H/R e ARG

foram submetidos em câmara de gás numa atmosfera com CO2 a 100%

por 5 minutos em temperatura de 22° C e a seguir re oxigenados com O2 a

100% por outros 5 minutos, 2x/dia nos primeiros três dias de vida.

Morreram 7 animais do grupo 1 (H/R), 5 animais do grupo 2 (ARG) e

nenhum animal morreu do grupo 3 (CTL). No 3º, 6º e 13º dias de vida oito

animais dos grupos 1 e 2 e quatro do grupo 3 foram anestesiados,

laparotomizados e os intestinos ressecados. Amostras de íleo e de cólon

foram conservadas em formalina para exame histopatológico e imuno-

histoquimico, outras amostras foram resfriadas em – 80°C e preparadas

14

para dosagens do óxido nítrico e malondialdeido tecidual. As lesões

intestinais foram classificadas segundo Chiu et al.

Resultados: Os grupos H/R e ARG apresentaram lesões características

da enterocolite necrosante, porém com melhor preservação das estruturas

no grupo ARG. A quantidade de gânglios do plexo mioentérico foi mais

numeroso no grupo que recebeu H/R e L-arginina (14.93 ± 0.51)

comparado ao que só recebeu H/R (11.10 ± 0.43) - estatisticamente

significante. O numero dos neurônios contados dentro dos gânglios

apresentou diferença estatisticamente significativa entre os grupos de

estudo (p = 0.0044). No íleo, a concentrações do NO revelou-se

significativamente mais elevado: G-H/R = 7,3 ± 2,0 µMol e G-Arg =16,5 ±

4,1 µMol (p=0,0019); entretanto, no cólon este efeito não foi significativo:

G-H/R = 10,7 ± 4,6 µMol e G-Arg = 15,6 ± 8,7 µMol (p=0,2480). Observou-

se significativa diferença entre os grupos 1 e 3 (0,0030), e grupos 1 e 2

(0,0213) quanto a presença de peroxidação lipídica, mas não se constatou

entre os grupos 2 e 3 (0,2771).

Conclusão: OOffeerrttaa ddee LL--aarrggiinniinnaa ccoonnttrriibbuuii ppaarraa aauummeennttaarr os níveis de NO

tecidual, rreedduuzziirr aa ccoonncceennttrraaççããoo ddoo MMDDAA ee ddiimmiinnuuiirr aass lesões na parede

intestinal ddee rraattooss ssuubbmmeettiiddooss aa HH//RR..

15

ABSTRACT Aim: This study highlights the relevance of the mechanism injury on

developmental of the Necrotizing Enterocolitis a pediatric surgical condition

and the investigative interest in L-Arginine - substance with bowel

protective effects at the events of hipóxia/reoxygenation. There is

histopathological and immuno-histochemical evaluation of the intestinal

wall, tecidual analysis of the NO levels and comparisons among the

concentration of the MDA.

Methods: 80 newborn rats Wistar EPM-1 were raffled and labeled as

group 1: hypoxia/reoxygenation (n 32); group 2: L-Arginine pretreatment

and H/R (n 32); group 3: control (n 16). The rats of groups 1 and 2 were

exposed twice a day during 3 consecutive days and gas chamber with CO2

(100%) for 5 minutes followed of reoxygenation with O2 (100%) for others 5

minutes. Thirty minutes before H/R there was injected 0,2 ml of L-Arginine

solution (5%) in peritoneum of group 2. Twelve rats of the groups 1 and 2

died after the experiments. Eight animals of groups 1 and 2, and four of

16

group 3 were anaesthetized and sacrificed on 3º, 6º and 13º days. Total

intestinal were cut off to evaluation histopatology (HE, S-100 and NSE),

frosted (-80°C) to NO and MDA analysis. Intestinal injuries were classified

to Chiu’s criteria.

Results: Macroscopically were not observed signs of H/R-induced

intestinal injury. NEC characteristic damage showed groups 1 and 2, more

grades 4 injuries in group 1 and grades 2 injuries in group 2 (p< 0,05).

There is signification difference on ganglions and neurons numbers of the

mioenteric plexus. The NO levels in the ileum were much higher with group

2 (16.5 ± 4.9; p = 0.0019) and group 1 (7.3 ± 2.0), but were not in colon (p

= 0.2480). The MDA compare groups 1-3 (0,0030) and 1-2 (0,0213) were

significance, but were not groups 2-3 (0,2771).

Conclusions: Arginine attenuate the newborn rats intestinal injury

unchained to H/R.

17

SUMÁRIO

1. Introdução.....................................................................................................pág 18 2. Objetivos.......................................................................................................pág 31

3. Métodos........................................................................................................pág 32 3.1 amostras.......................................................................................pág 32

3.2 experimento..................................................................................pág 35 3.3 histopatologia................................................................................pág 39 3.4 óxido nítrico...................................................................................pág 48 3.5 malondialdeido..............................................................................pág 49 3.6 analise estatística..........................................................................pág 52

4. Resultados...................................................................................................pág 53 4.1 exame histopatológico.................................................................pág 53 4.2 exame imuno-histoquimico..........................................................pág 58 4.3 determinação do NO....................................................................pág 64 4.4 determinação do MDA.................................................................pág 68 5. Discussão....................................................................................................pág 69

6. Conclusão....................................................................................................pág 78

7. Referências..................................................................................................pág 79

8. Anexos.........................................................................................................pág 91

18



1. INTRODUÇÃO

A Enterocolite Necrosante (ECN) é a emergência gastrintestinal mais

freqüente do recém-nascido, com alta prevalência na UTI neonatal e

elevada incidência no prematuro de muito baixo peso (11% em menores

de 1.500 g) 1, 2. Comumente se instala nas primeiras semanas de vida

causando intensa lesão na parede intestinal. Ressecções intestinais

extensas são realizadas nas complicações – perfuração e peritonite;

contribuindo para o alto grau de morbidade e mortalidade (45%) 3. Os

recém-nascidos sobreviventes geralmente desenvolvem graves distúrbios

disabsortivos e necessitam NPP.

19

Conquanto o mecanismo de ação não seja inteiramente conhecido,

estudos demonstram que hipóxia perinatal, isquemia intestinal,

prematuridade, baixo peso, deficiência de imunidade e sepsis são fatores

predisponentes na ECN 4, 5. A privação tecidual dos níveis de oxigênio

(O2) pela interrupção do suprimento sanguíneo (isquemia) desencadeia

uma serie de alterações no metabolismo celular que resulta na

desorganização da estrutura das células vivas, acarreta colapso no seu

funcionamento e pode evoluir para falência e morte celular.

Paradoxalmente, o aporte de O2 ao tecido isquêmico (reperfusão) inicia

uma seqüência de eventos geralmente mais danosa que o insulto

isquêmico.

A célula mantém-se viva em virtude do funcionamento adequado de

inúmeros processos bioquímicos dependentes de energia. Para tanto, as

células eucariontes produzem sua energia a partir da oxidação de

diversos compostos orgânicos utilizando o O2 molecular. Esses processos

oxidativos ocorrem no interior da mitocôndria onde a reação da glicose

com O2 molecular (glicólise) gera um quantum de energia que permite a

ligação de fosfato inorgânico (Pi) na molécula de adenosina difosfato

(ADP) formando o trifosfato de adenosina (ATP). O ATP é uma molécula

que contém alta quantidade de energia (8,4 Kcal) em cada ligação fosfato.

20

A glicólise produz 36 moléculas de ATP e a liberação de energia contida

nas ligações fosfato se dá pela ação de ATPases celulares. Esta energia,

ativa as moléculas envolvidas na manutenção e controle dos processos

vitais das células vivas. O transporte ativo de íons pela membrana,

atuação da bomba de sódio, transporte de cálcio, de glicose e outras

substâncias essenciais para o metabolismo, são processos celulares

vitais.

Na isquemia, a falta de O2 produz um colapso na produção de

energia na forma de ATP pela mitocôndria. Uma das conseqüências

desse colapso energético é o acumulo de cálcio no meio intracelular

devido ao aumento de sua entrada na célula e redução de sua saída para

o meio extracelular. O acumulo de cálcio intracelular ativa varias enzimas

que aumentam a produção de substâncias capazes de lesar as

membranas celulares (membrana plasmática, mitocondrial, lisossomal). A

lesão da membrana mitocondrial compromete ainda mais a produção de

energia e a lesão da membrana lisossomal libera enzimas proteolíticas

capazes de promover a “autodigestão” da célula. Ainda durante a fase de

isquemia o ATP existente é “catabolizado” a AMP, adenosina, inosina e a

hipoxantina. Em mamíferos a falta de energia celular (ATP) resulta no

desequilíbrio ou falência da bomba iônica das membranas, permitindo a

21

passagem passiva do CL-, Na+ e Ca2+ para dentro da célula e do K+ e

MG2+ para fora. O acúmulo de cálcio intracelular ativaria a protease

calpaína e a transformação de xantina-dehidrogenase (XDH) em xantina-

oxigenase (XO). A XO é uma enzima altamente versátil, exercendo um

papel importante no catabolismo das purinas 9. Anóxia acarreta oxidação

incompleta de compostos químicos pela mitocôndria, dando origem a

moléculas com valências livres capazes de doar (redutores) ou receber

elétrons (oxidantes).

A reintrodução do oxigênio (reperfusão) não restabelece a função

mitocondrial e a membrana lesada mantém o acúmulo de cálcio no interior

da célula, a hipoxantina é oxidada em xantina e ácido úrico pela XO,

liberando radicais livres de O2 (RLO) - hidroxila (XOH) e ânions

superóxido (O2-), assim como espécies reativas de O2 (ERO) - peróxido de

hidrogênio (H2O2), que se ligam às proteínas, lipídeos (fosfolipídios de

membrana), carboidratos e ácidos nucléicos (DNA e RNA), podendo

produzir modificações da estrutura molecular com perda ou redução de

sua atividade biológica7. Nestas condições a XO é a maior fonte de

radicais livres de oxigênio no intestino 8. O radical hidróxido (OH) participa

na peroxidação lipídica, danosa reação biológica na qual radicais O2-

agridem ácidos graxos das cadeias fosfolipídicas presente nas

22

membranas das organelas e celular. Em condições fisiológicas, os efeitos

danosos do O2- é prevenido pela superoxido-dismutase (SOD), mas

durante a reperfusão dos tecidos isquêmicos essas defesas naturais

podem não estar respondendo 9. Mediadores inflamatórios e radicais

livres incluindo o fator de ativação plaquetaria, o fator de necrose tumoral

e os leucotrienos têm um importante papel na ECN 4, 5.

Nos intestinos, isquemia seguida de reperfusão (I/R) desencadeia

uma resposta inflamatória aguda motivada por severa redução do fluxo

sangüíneo local e também pela degranulação de mastócitos, formação

e/ou liberação de proteinases, radicais superóxidos, cascata da

coagulação, causando disfunção celular, lesão tissular, necrose e

apoptose 10, 11. Tal compreensão é relevante nas situações em que o fluxo

sanguíneo torna-se repentinamente muito reduzido – trama, choque; ou

precisa ser interrompido – aneurisma; quando o sistema circulatório

apresenta colapso ou cessa a perfusão tecidual. As lesões decorrentes da

I/R também são um importante determinante tanto da precoce disfunção,

como da tardia sobrevida de um enxerto de intestino delgado

transplantado 12.

O tecido intestinal é excepcionalmente sensível as manifestações de

hipóxia seguidas de re-oxigenação 13. O intestino provavelmente é o órgão

23

interno mais sensível à influência de I/R 14. Enterócitos localizados no topo

das vilosidades são mais frágeis aos efeitos da isquemia e essa labilidade

poderia ser devido sua localização – no termino da arteríola central, no

ápice da cripta 15. Estudando isquemia em ratos, Hinnebusch e cols

demonstraram que a sensibilidade dos enterócitos à isquemia seria

dependente do estado de diferenciação dessas células 16. Degeneração da

inervação intrínseca intestinal pode ocorrer também após isquemia

intestinal relativa, mesmo não ocorrendo à necrose intestinal. Alterações

na função absortiva dos nutrientes tem sido observada após I/R do

intestino 17. Através do epitélio intestinal lesado a I/R facilitaria a passagem

de bactérias viáveis da luz intestinal a alcançar gânglios linfáticos

mesentérios e baço - translocação bacteriana. Estudos revelam que a

hipóxia também diminui o ritmo das contrações intestinais 18. Entretanto

Chan e cols observaram que o intestino de ratos prematuro é altamente

resistentes à lesão pós I/R, levantando a hipótese que a I/R sozinha na

ausência de outros fatores predisponentes, não seria suficiente para

causar a ECN 19. Tais dados sugerem que a ECN é causada pela

associação de fatores diversos. I/R no intestino propicia a formação de

citocinas inflamatórias e produção de radicais livres de oxigênio, que

podem lesar órgãos à distância, desencadeando a síndrome da resposta

24

inflamatória sistêmica (SIRS) e levando a falência de múltiplos órgãos

(MOF) 20. As lesões intestinais causadas por hipóxia e reoxigenação são

principalmente mediadas pelos radicais livres do O2 18

.

Já em 1969, Lloyd ao estudar perfuração intestinal em RN com ECN,

encontrou que 80% dessas crianças apresentaram evidências clínicas de

asfixia perinatal e enfatizou a importância da hipóxia neonatal na

etiopatogenia da doença, introduzindo o conceito de redistribuição do fluxo

sangüíneo durante a asfixia – desvio do sangue dos vasos mesentérios

para órgãos mais vitais, com conseqüente isquemia intestinal mais intensa

neste sitio 21. Estudos recentes em animais corroboram que a asfixia

produz lesões intestinais, semelhantes da ECN 22. O íleo parece ser mais

resistente que o jejuno diante da I/R e o teor de óxido nítrico parece ser o

fator responsável por essa habilidade do íleo, mas a alta resistência do

intestino de prematuros não foi acompanhada de elevados níveis de óxido

nítrico 23.

A terapêutica das lesões na I/R deveriam incluir agentes

farmacológicos que atuam na etiopatogenia. Pesquisadores têm se

ocupado a procura de substancias capazes de proteger os tecidos da

agressão na I/R. Vários agentes farmacológicos tem sido descritos como

atenuantes dessa lesão no intestino: 21-amino-esteróides, pentoxifilina,

25

somastatina, n-acetilcisteina, glucagom, perfluorocarbono intraluminal,

glicina, etc. Recentemente estudos tem mostrado o papel dos receptores

das proteinase

Estudos têm demonstrado que o Óxido Nítrico (NO) exerce um

importante papel regulador/modulador em condições homeostáticas e nas

inflamatórias. Ele pode atuar como vasodilatador e inibidor plaquetário,

assim como pode interferir prevenindo a adesão de neutrófilos. O NO

liberado pode também levara formação de espécies altamente reativas

como o peroxinitrito e nitrosotiois capazes de causar dano mitocondrial,

alem de inibir a proliferação celular via inibição da poliamino sintetase 19, 23,

76. NO é um radical livre, gasoso que causa vasodilatação arteriolar.

Resulta da produção endógena nos neurônios, plaquetas, neutrófilos e

células endoteliais, aumenta os níveis citoplasmáticos de GMP-cíclico,

inibindo a agregação e a adesão plaquetaria e reduzindo a ocorrência de

eventos tromboembólicos 24. A liberação basal de NO pelas células

endoteliais modula o tônus vascular sistêmico, e a inibição da síntese de

NO resulta num aumento da pressão arterial em ratos normotensos 25. NO

é sintetizado a partir da L-Arginina por uma complexa reação onde se

forma citrulina e catalisada pela óxido nítrico-sintetase (NOS). São

identificadas 3 formas dessa enzima: endotelial NOS (eNOS), neuronal

26

NOS (nNOS) e induzivel NOS (iNOS) 26. Nos intestinos, NOS é encontrada

no epitélio, musculatura lisa, plexos nervosos, além dos leucócitos 27. As

denominadas formas construtivas (eNOS e nNOS), são as que mais se

manifestam e liberam NO por curtos períodos, em resposta à estimulação

física. A induzida (iNOS), se manifesta após ativação dos macrófagos e de

outras células imunitárias geralmente em condições patológicas 28.

Quando ativadas sintetizam por períodos longos, mas podem ser inibidas

por N-Mono-Metil-Arginina (L-NMMA) e pelos glicocorticoides. A indução

da iNOS produz aumento de NO e de peróxi-nitrito que lesa os tecidos,

sendo benéfico sua inibição 29. Suspeita-se que iNOS seja um importante

mediador na lesão da reperfusão30. Cuzzocrea e cols não confirmaram

esse achado, Wu e cols demonstraram que a formação de iNOS após I/R

do intestino induz a apoptose 31, 32. Os receptores das células endoteliais

quando estimulados por substancias vasodilatadoras – acetilcolina,

bradicinina, substancia P, histamina, ou por estímulo mecânico - aumento

do fluxo sanguíneo local na hipertensão; induzem a síntese de NO.

Quando produzido pela célula endotelial estimulada, o NO ao atingir

as fibras musculares lisas da camada media do vaso, liga-se ao

grupamento heme da enzima guanilato-ciclase. Esta enzima é responsável

pela conversão do trifosfato de guanosina (GTP) em monofosfato de

27

guanosina-cíclica (GMPc) que em ultima analise responde pela ação e

efeitos do NO. Elevadas taxas de GMPc determinam diminuição de cálcio,

redução da força de contração muscular, relaxamento da musculatura,

conseqüente vasodilatação e queda da pressão arterial.

Uma vasoconstrição localizada de um segmento vascular provoca o

aumento compensatório e liberação local de NO, que modula o

relaxamento, participando do mecanismo de adaptação cardiovascular

para a manutenção da pressão arterial dentro de valores normais. A

administração exógena de NO pode produzir seletiva vasodilatação da

artéria pulmonar. A infusão venosa de inibidores da NOS, como a L-NMMA

– com bloqueio da síntese, determina a elevação da pressão sistêmica em

animais e da pressão na artéria braquial em seres humanos voluntários.

Evidências significativas sugerem que o NO é o mesmo composto

reconhecido como fator relaxante derivado do endotélio33. O fator relaxante

derivado do endotélio (EDRF) e o fator hiperpolarizante derivado do

endotélio (EDHF) induzem vasodilatação por mecanismos distintos. O

componente ativo do EDRF é o NO, que induz relaxamento da

musculatura lisa vascular mediada pela guanil-ciclase 34, 35, 36.

Em condições fisiológicas, NO predomina na microcirculação com

efeitos benéficos no intestino, entre eles o de manter a permeabilidade

28

vascular normal, reduzir a aderência de leucócitos no endotélio, inibir a

agregação plaquetaria, reduzir a proliferação da musculatura lisa, limpar a

circulação dos radicais livres 37, 38. Entretanto durante a fase precoce da

reperfusão na I/R do intestino há acumulo de radicais livres (O2-). Nestas

circunstancias há uma tendência para os polimorfonucleares (PMNs)

aderirem ao endotélio e ocorrer agregação das plaquetas 39. O2- sofre

dismutação espontânea para H2O2 que pode promover a ativação da

fosfolipase A2 (PLA2) e levar ao acumulo de mediadores inflamatórios tais

como fator de ativação plaquetaria (PAF) e leucotrienos (LTB4). Diante

disso uma diminuição da produção endógena de NO tem conseqüências

desastrosas resultando em disfunção no endotélio e lesão tissular mediada

pelo PMNs.

A L-Arginina, é um aminoácido não essencial, e precursor do NO.

Conquanto a L-Arginina exógena não cause relaxamento dependente do

endotélio, peptídeos de alto peso molecular contendo arginina (poli-L-

arginina) podem fazer 40. A vasodilatação produzida por ele pode ser

inibida por bloqueio competitivo no metabolismo endotelial da L-Arginina

pelas enzimas NG-nitro-L-Arginina e NG-monometil-L-Arginina 41, 42. Foi

demonstrado que poli-L-arginina (10-11 a 10-7 M) induz relaxamento

dependente do endotélio em artéria pulmonar bovina por mecanismo

29

semelhante ao relaxamento produzido pelo NO 43. Outros autores

observaram que poli-L-arginina induz relaxamento dependente do

endotélio em coronárias normais e em reperfundidas de cães 44. Isso se

daria pelo bloqueio exclusivo da ciclo-oxigenase. O pré-tratamento com a

oxihemoglobina (10-5 M) atenuou o relaxamento dependente do endotélio

causado pela poli-L-arginina, com glibenclamida (10-6 M) não afetou e com

azul de metileno (10-6 M) que inativa a guanil-ciclase na musculatura

vascular, não inibiu. O cloreto de potássio em concentração 40nM inibiu

completamente o relaxamento dependente do endotélio causado pela poli-

L-arginina 45. Assim em animais, tem-se observado que embora o NO

liberado no endotélio seja fundamental na modulação do tônus vascular

periférico, as poliaminas da L-Arginina exercem um papel importante no

relaxamento dependente do endotélio, fator primordial na prevenção da

lesão tecidual que acontece durante e após a I/R. Estudos tem sugerido

que o NO e a L-Arginina atuam na manutenção da integridade mucosa do

intestinos. Os mecanismos através dos quais exercem essa ação ainda

não são claros, mas o efeito na proliferação celular e a redução da

apoptose pelo NO, e o estimular a recuperação da mucosa intestinal

através da liberação de hormônio do crescimento e/ou produção de

poliaminas pela L-Arginina, devem ser lembrados 46, 47, 48, 49.

30

Baseado nestes conhecimentos propusemo-nos estudar em

roedores recém-nascidos, a influência da L-Arginina nas lesões intestinais

causadas por H/R. O estudo foi focado na agressão das estruturas da

parede intestinal – mucosa, submucosa, musculatura e vasos, mas

principalmente o efeito da L-Arginina sobre o plexo miontérico – gânglios

nervosos e neurônios. Avaliamos também, os níveis do NO tecidual e o

grau de peroxidação lipídica ocorrida nos intestinos. Buscou-se

compreender melhor a fisiopatologia da ECN e avaliar um provável efeito

protetor da L-Arginina nas condições de H/R intestinal.

31

2. OBJETIVO

2.1. Geral: Estudar um aminoácido cujas características intrínsecas

possivelmente exerçam ação protetora na lesão tecidual observada na

enterocolite necrosante.

2.2. Específico:

Avaliar a ação da L-Arginina exógena nas estruturas da parede

intestinal em ratos recém-nascidos submetidos a hipóxia e reoxigenação.

Constatar através dos indicadores de lesão tecidual – alterações

histopatológicas e imuno-histoquimica, peroxidação lipídica e

concentração do óxido nítrico tecidual, a existência ou não, de um efeito

protetor significativo em lesões intestinais.

32

3. MÉTODOS

O protocolo de pesquisa encaminhado para exame e avaliação do

Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de São Paulo -

Unifesp/EPM, sob n. 1662/05, foi aprovado em 06 de janeiro de 2006.

(anexo 1)

3.1 Amostras:

Doze (12) ratas prenhas fornecidas pelo CEDEME / Unifesp da

linhagem Wistar EPM-1 outbread (Rattus norvegicus albinus, Rodentia

mammalia), foram separadas e mantidas em ambiente assistido:

acomodação, higiene, temperatura (21 a 23°C), ciclo claro/escuro de 12

hs, ração própria para a espécie e água à vontade. Após 21 dias as ratas

pariram noventa e três (93) crias com peso entre 3,8 e 7,0 g. Utilizando

como fator de exclusão o peso (4,4 a 6,6 g), oitenta (80) filhotes recém-

33

nascidos de ambos os sexos foram sorteados e separados em três grupos

de estudos.

Grupo 1: (n=32)

Animais recém-nascidos submetidos somente a hipóxia-

reoxigenação

Grupo 2: (n=32)

Animais recém-nascidos recebendo um pré-tratamento de L-

Arginina e submetidos a hipóxia-reoxigenação

Grupo 3: (n=16)

Animais recém-nascidos não submetidos a hipóxia-reoxigenação

Tabela 1: grupos de estudo

Grupo 1 grupo H/R Grupo 2 grupo ARG Grupo 3 grupo CTL

34

Figuras 1 e 2: fotografias – rata e crias, inoculação intra-peritoneal de L-Arginina.

35

3.2 Experimento:

Os animais do grupo 3 (G3) não sofreram qualquer

estimulo ou agressão artificial durante o experimento. Nos animais do

grupo 2 (G2) foram infundidos via intraperitonial 0.2 ml de solução com L-

Arginina (5%) 30 minutos antes dos eventos de hipóxia e reoxigenação

(H/R). Numa câmara de acrílico transparente especial para inalação

controlada de gases, medindo 32 cm de altura, 34 cm de largura e 50 cm

de comprimento (modelo CGS CO2 G – marca Beira-Mar - Brasil), as

ninhadas dos grupos 1 (G1) e 2 (G2) foram submetidas a uma atmosfera

contendo CO2 a 100% por 5 minutos e a seguir de O2 a 100% por outros 5

minutos. Eventos de hipóxia e reoxigenação foram repetidos 2x ao dia

durante 03 dias consecutivos (1º, 2º e 3º dias de vida). Esse modelo já

consolidado em outros trabalhos reproduz o stress oxidativo tecidual no

intestino semelhante ao das crianças que desenvolvem ECN. Este

protocolo é uma modificação dos métodos de Okur et al 50 e de Özkan et

al 51. Após os eventos as crias novamente gozaram da companhia

materna em temperatura apropriada. Ocorreram as mortes de sete (7)

animais do grupo 1(H/R) e cinco (5) ratos do grupo 2 (ARG).

36

Figuras 3 e 4: fotografias de câmara de gases para hipóxia e reoxigenação

37

No 3º, 6º e 13º dia de vida, oito (8) filhotes dos grupos 1 e 2 e

quatro (4) do grupo 3 foram submetidos à anestesia intraperitonial com 0,1

ml de uma mistura de anestésicos - 0,2 ml de Ketamina (10%) com 0,1 ml

de Xilazina (2%). Praticou-se laparotomia e procurou-se a existência de

sinais macroscópico de lesão isquêmica - edema, distensão, perfuração,

necrose ou hemorragia nas víceras. Os intestinos foram totalmente

retirados e amostras separadas, fixadas e conservadas em formalina para

coloração de rotina e imuno-histoquimica ou acondicionadas e congeladas

à – 80°C para dosagem do óxido nítrico tecidual e d o malondialdeido

(MDA).

Figura 5: fotografia – laparotomia do animal de experimento.

38

Figuras 6 e 7: fotografia – dissecção e exérese dos intestinos

39

3.3 Histopatologia: De cada animal, um fragmento do íleo (1 cm) e do cólon (1 cm) foi

isolado e fixado em formol, tamponado, desidratado, embebido em bloco

de parafina e cortado. A seguir montado em laminas, parte foi corada pela

hematoxilina-eosina (HE) para exame morfológico (mucosa, submucosa,

vasos e fibras musculares) e parte processada pelo método imuno-

histoquimica da avidina-biotina peroxidase para a pesquisa de estruturas

do sistema nervoso entérico através da proteína S-100 e da Neuron

Specific Enolase (NSE) para visualizar a presença de gânglios nervosos e

realizar a contagem desses, como também o número de neurônios no

interior. Cortes com 06 micrômetros foram analisados em microscopia

óptica, por uma mesma patologista que desconhecia o grupo dos

fragmentos examinados.

Análise histológica - hematoxilina-eosina Utilizou-se microscópio binocular óptico com aumentos de 100 e 400

vezes para examinar as lâminas coradas pelo método da hematoxilina-

eosina e a morfologia intestinal foi classificada segundo Chiu et al 52.

40

Grau 0: mucosa integra sem alterações.

Grau 1: mucosa apresenta vilosidades bem constituídas, sem

processo inflamatório, sem lise celular, mas com formação do espaço sub-

epitelial de Grunhagen.

Grau 2: mucosa com presença de espaço de Grunhagen, lises

celulares e espaçamento maior entre as vilosidades.

Grau 3: a mucosa apresenta destruição das criptas das vilosidades,

capilares dilatados e células inflamatórias.

Grau 4: destruição da estrutura das vilosidades, algumas somente

com o esboço, contendo células inflamatórias e material necrótico, com

hemorragia e ulceração glandular.

Grau 5: destruição de toda mucosa, não se observando qualquer

estrutura glandular integra, presença de material amorfo depositado sobre

a tela submucosa.

41

Figura 8 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) - vilosidades bem

constituídas, unidas, sem sinais de infiltração, de lise celular, ausência de espaço subepitelial

de Grunhagen, sem infiltrado celular e dilatação vascular - grau 0 - HE 400x

Figura 9 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) - vilosidades bem

constituídas unidas, ausência de espaço subepitelial de Grunhagen, sem sinais de infiltração

ou de lise celular, sem infiltrado celular e dilatação vascular - grau 0 - HE 400x.

42

Figura 10 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – vilosidades e criptas bem

estruturadas, inicio da formação dos espaços de Grunhagen, sem infiltração, sem lise de células

grau 1 - HE 400x.

Figura 11 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – vilosidades e criptas

bem estruturadas, inicio da formação dos espaços de Grunhagen, sem infiltração, sem lise de

células - grau 1 - HE 400x

43

Figura 12 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – vilosidades alargadas,

intumescidas, espaços sub-epitelial de Grunhagen desenvolvidos, distanciamento do epitélio

absortivo, estase capilar, inicio de lise celular - grau 2 - HE 400x.

Figura 13 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – vilosidades

intumescidas, espaços sub-epitelial de Grunhagen, distanciamento e perda de continuidade do

epitélio absortivo, estase capilar, inicio de lise celular - grau 2 - HE 400x.

44

Figura 14 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – destruição do ápice das

vilosidades, lise celular, dilatação vascular, infiltrado inflamatório, presença de espaços sub-

epitelial de Grunhagen - grau 3 - HE 400x.

Figura 15 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – dilatação vascular,

perda área absortiva, grandes espaços de Grunhagen, destruição das criptas das vilosidades, lise

celular, células inflamatórias - grau 3 - HE 400x.

45

Figura 16 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – comprometimento da

submucosa, dilatação vascular, infiltrado inflamatório, lise celular, destruição das vilosidades,

presença de espaços sub-epitelial de Grunhagen - grau 4 - HE 400x.

Figura 17 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – lise celular, evidencia

de material necrótico, submucosa comprometida, destruição do ápice das vilosidades e criptas

algumas com ulceração glandular e hemorragia, dilatação vascular - grau 4 - HE 100x

46

Figura 18 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – submucosa com

infiltração inflamatória e depósito de material amorfo, vilosidades rotas, ulceração e

hemorragia, presença de material necrótico na luz, vasos dilatados - grau 5 - HE 200x.

Figura 19 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – deteriorização das

estruturas absortivas, material amorfo disperso, lesão da túnica submucosa, presença de material

necrótico, alteração muscular e serosa - grau 5 - HE 200x

47

Análise histológica - imuno-histoquimica

Para a coloração da Proteína S-100 foi utilizado o kit: S-100 protein, P bovina,

1ml, DAKO, código Z 0311-1 e para coloração NSE o kit: neuron specif

enolase, BBS / NC / VI – H13, MxH. 0,2ml, DAKO, código M0873-129. Foram

realizadas contagens das estruturas ganglionares de tecido nervoso da

parede intestinal (Proteína S-100) nas amostras de cada grupo. Os números

de gânglios foram contados em 10 campos consecutivos, a partir de um

campo aleatório inicial e seguindo da esquerda para a direita. No interior dos

gânglios nervosos dos plexos mioentérico e submucoso os neurônios corados

foram contados num total de 8 gânglios consecutivos na parede intestinal das

amostras de cada grupo. Utilizou-se aumento de 400 vezes, e a identificação

de tipos celulares pela imuno-histoquimica é possível pela presença de

determinadas proteínas sintetizadas pelas células ganglionares e responsável

por funções específicas no organismo. Moore isolou duas proteínas acidas

solúveis no sistema nervoso que aparentemente não ocorriam em outro tipo

de tecido 53. A proteína S-100 foi identificada no citoplasma da glia e a

proteína NSE nos neurônios – corpo, dendritos, axônio. Essa propriedade é

importante no estudo das doenças que afetam a inervação do trato

gastrintestinal 54.

48

Figura 20 – gânglios do plexo nervoso mioentérico – proteína S-100 (íleo) 400 X

3.4 Determinação do Óxido Nítrico Tecidual:

O óxido nítrico (NO), também conhecido com fator relaxante

derivado do endotélio (EDRF) é um gás muito instável, com peso

molecular de 30d e vida média próximo de 3 a 5 segundos quando em

solução aquosa e condições fisiológicas de temperatura, pH, e tensão de

oxigênio, embora haja relatos de variações na sua vida média de até 50

segundos. É produzido intensamente nas células endoteliais nos vasos,

49

como também em diversos outros tecidos: neutrófilos, macrófagos,

fibroblastos, plaquetas, cérebro, miocárdio, hepatócitos; acreditando-se

que todas as células possam ser capazes de produzir NO. Sintetizado a

partir do substrato L-arginina sob a ação da enzima óxido-nítrico-sintetase

(NOS), atua provocando vasodilatação na microcirculação, maior perfusão

nos tecido e melhor aporte de oxigênio e nutrientes.

Amostras do intestino resfriadas a –80°C, são desco ngeladas,

homogeneizadas e desproteinizadas. Pela reconversão dos nitritos

formados as concentrações do NO foram medidas indiretamente no

aparelho “Sievers Instruments Model 280 NOA” unidade em microMol

(µMol) – em dosagens duplicadas.

3.5 Determinação de Malondialdeido: A dosagem do malondialdeido (MDA) é tradicionalmente usada

como uma indicação da existência de peroxidação lipídica induzida pela

presença de radicais livres nos tecidos. A peroxidação lipídica é uma

reação biológica danosa que se processa durante a reperfusão, na qual

os radicais hidróxidos (OH) estimulados pelos radicais livres do oxigênio

50

(O2-) agridem a membrana celular e das organelas, atuando sobre os

ácidos graxos das cadeias fosfolipídicas nelas presentes, prejudicando a

função de barreira seletiva que essas membranas realizam e

desorganizando a estrutura e a atividade celular. Em condições de

normalidade fisiológica os radicais livres formados, são neutralizados pela

superóxido dismutase.

MDA é um metabólito, o produto final gerado da peroxidação lipídica

e um parâmetro estabelecido para detectar/determinar o aumento de

radicais livres do oxigênio no tecido intestinal, após uma fase de

isquemia/reperfusão. Para dosar o MDA foi empregado o método de

Ohkawa et al 55 sendo os valores expressos em nanomoles (nmol) de

MDA por miligrama (mg) de proteína por grama (g) de tecido.

Dosagem do homogeneizado: - proteína.

Amostras do intestino congeladas à -800C foram descongeladas em

gelo fresco e pesadas, homogenadas em solução tampão de TRIS 0,01 M

com KCL 0,2 M (pH 7.4) em volume de 1ml/50mg, em 4 series de 30

segundos e então centrifugadas por 05 minutos a 10.000 rpm a 4 0C.

51

Dosagem do sobrenadante: - aldeído.

Utilizou-se o kit: Oxi-Tek TBARS, BL/+4, AXXORA, código ZMC –

0801192-KI01. Em 50 ul do sobrenadante do homogeneizado (amostras

em duplicata) se adiciona 50 ul de SDS (standard solution) contendo

sulfato de sódio e 1,25 ml de TBS (solução tampão) preparada

antecipadamente com acido tiobarbitúrico, ácido acético e hidróxido de

sódio. Mantido em banho quente (95°C) durante 60 mi nutos. A seguir

resfria-se em gelo por 10 minutos, centrifuga-se por 15 minutos a 3000

rpm e realiza-se a medida da absorbância em espectrofotômetro (510,

532 e 560 A) 56.

Uma curva de calibração (sample standard curve) é traçada

utilizando-se uma solução padrão de MDA (100nmol/ml de malondialdeido

bis – acetilmetilo) e serve de referência. Os níveis de malondialdeido

serão expressos em nanomoles por grama de tecido.

52

3.6 Analise Estatística:

As variáveis quantitativas foram representadas pela média e desvio

padrão. Para amostras independentes, na análise do grau das lesões

tecidual utilizamos o teste de Kruskal-Wallis. Para verificar a

homogeneidade entre os grupos para as variáveis numéricas, utilizou-se o

teste estatístico ANOVA e os testes comparativos de Bonferroni e

Student-Newman-Keuls. Considerou-se o nível de significância de 0,05

(a = 5%) e os valores abaixo desse padrão foram considerados

significativos.

53

4. RESULTADOS

Ao exame macroscópico da cavidade abdominal dos animais

estudados não se observou alterações na superfície do peritoneo e das

viceras ocas como sinais de distensão, edema, perfuração ou hemorragia

nas alças intestinais.

4.1 Exame Histopatológico: hematoxilina-eosina

Nas laminas dos grupos 1 e 2 foram observadas lesões teciduais

características da ECN no íleo. O grupo 1 (H/R) apresentou

preponderantemente lesões do grupo 4 (mais intensas) enquanto que do

grupo 2 (ARG) lesões do grupo 2 (moderadas). Os animais do grupo 3

(CTL) em sua maioria, não apresentaram alterações morfológicas em

mucosa e submucosa (grau 0).

Foi comparado estatisticamente o grau de lesão tecidual dos

intestinos nos animais dos grupos de estudo, considerando (p < 0,05).

Entre os animais dos grupos 1 e 3 observou-se diferença estatisticamente

significativa (p1-3 = 0,0025) no grau de lesão intestinal.

54

Tabela 2: classificação – Análise comparativa das lesões intestinais.

Entre os grupos 1 e 2 também observou-se significativa diferença

(p1-2 = 0,0233). Não se revelou diferença estatisticamente significativa

quando se comparou o grau de lesão entre os grupos 2 e 3 (p 2-3 = 0,334).

Grafico 1 – grau de lesão tecidual intestinal e score.

Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03

Grau N = 8 Score (%) N = 8 Score (%) N = 4 Score (%)

0 0 0.00 0 0.00 3 75.00

1 0 0.00 2 25.00 1 25.00

2 0 0.00 4 50.00 0 0.00

3 3 37.00 1 12.50 0 0.00

4 4 50.00 1 12.50 0 0.00

5 1 12.50 0 0.00 0 0.00

55

Figura 21 – fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 1) grau 3 - perda área absortiva,

grandes espaços de Grunhagen, destruição das criptas das vilosidades, dilatação vascular, lise

celular, células inflamatórias - HE 100X.

Figura 22 – fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 1) grau 4 - destruição das vilosidades

e criptas, dilatação vascular, lise celular, submucosa comprometida, material necrótico - HE

40X

56

Figura 23 – fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 2) grau 2 – vilosidades alargadas,

intumescidas, espaços sub-epitelial de Grunhagen presente, distanciamento do epitélio

absortivo, estase capilar, inicio de lise celular - HE 400X.

Figura 24 – fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 2) grau 2 – rompimento das

vilosidades, espaços de Grunhagen, perda epitélio absortivo, alteração nas criptas - HE 100X

57

Figura 25 – fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 3) grau 0 vilosidades bem

constituídas, sem espaços sub-epitelial de Grunhagen, ausência de infiltração ou lise celular

HE 400X

Figura 26 – fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 3) grau 0 - vilosidades bem

constituídas, unidas, sem sinais de infiltração, de lise celular, ausência de espaço sub-epitelial

de Grunhagen, sem infiltrado celular e dilatação vascular - HE 200X

58

4.2 Exame Imuno-Histoquímico: proteína S-100 e NSE

A comparação entre as médias do número de gânglios dos plexos

miontérico e submucoso da parede intestinal revelou diferença

estatisticamente significante entre os grupos 1 e 3 (p = 0,0117), grupos 1

e 2 (p < 0,05) e grupos 2 e 3 (p = 0,0295). Observou-se subjetivamente na

microscopia um aumento moderado no volume dos gânglios do grupo 1,

nos dias 3º, 6º e 13º, que não foi verificado nos grupos 2 e 3.

Tabela 3: média e desvio padrão; contagem de gânglios do plexo nervoso intestinal de ratos.

Proteína S 100 3º dia 6º dia 13º dia Média Desvio Padrão

Grupo 1 10.80 10.90 11.60 11.1000 0.4359

Grupo 2 14.80 14.50 15.50 14.9333 0.5132

Grupo 3 20.70 16.90 21.80 19.8000 2.5710

59

Gráfico 2: Comparação entre as médias dos gânglios do plexo nervoso intestinal - Bonferroni

Constatou-se diferença estatisticamente significativa nas médias do

número de neurônios encontrados dentro dos gânglios entre os grupos 1 e

3 (p < 0,05) e os grupos 2 e 3 (p < 0,05) , porém não significativa entre os

grupos 1 e 2 (p = 0,1376)

60

Tabela 4: média e desvio padrão; número de neurônios nos gânglios do plexo nervoso intestinal.

Gráfico 3: Comparação entre as médias dos neurônios do plexo nervoso intestinal - Bonferroni

NSE (enolase) 3º dia 6º dia 13º dia Média Desvio Padrão

Grupo 1 2,12 2,64 2,87 2,5433 0,3842

Grupo 2 2,45 2,96 3,18 2,8633 0,3745

Grupo 3 3,88 3,97 4,38 4,0767 0,2665

61

Figura 27, 28, 29 – fotomicrografias de gânglios nervosos do plexo mioentérico – Proteína S-100

(seqüência de aumentos 100x, 200x, 400x) - grupo 3.

62

Figura 30, 31, 32 – fotomicrografias de gânglios nervosos do plexo mioentérico – Proteína S-100

(seqüência de aumentos 100x, 200x, 400x) - grupo 2.

63

S 100

NSE

Figuras 33 e 34 – fotomicrografias de gânglio (Proteína S 100) e neurônio (NSE) do plexo

mioentérico - análise comparativa da mesma estrutura - grupo 2 (400x).

64

4.3 Determinação do Óxido Nítrico Tecidual:

Nas amostras de íleo, do 3º dia de vida, foi encontrada diferença

estatisticamente significativa na concentração média de óxido nítrico entre

os grupos 1 e 2 (p = 0.0023) e entre 1 e 3 ( 0,0040) mas não entre 2 e 3 (p

= 0,6915). O grupo do pré-tratamento com L-Arginina registrou maior

quantidade tecidual de NO: grupo 1 = 7,3 ± 2,0 µMol e grupo 2 = 16,5 ±

4,9 µMol (p=0,0019).

Tabela 5 - estatística – concentração do NO (µMol) no íleo.

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8

grupo 1

grupo 2

Gráfico 4 – comparação dos grupos 1 e 2 - concentração do NO (µMol) no Íleo.

H/R ARG CTL Kruskal-Wallis Resultados

Média 7.30 16.48 17.85 p = O.0019

Desvio Padrão 2.02 4.91 6.10 p (1 e 2) = 0.0023

p (1 e 3) = 0.0040

p (2 e 3) = 0.6915

65

Gráfico 5 – comparação entre os 3 grupos - concentração do NO (µMol) no Íleo.

A comparação do nível do NO em cólon nas amostras do 3º

dia, entre os grupos 1 e 2, grupos 1 e 3, e grupos 2 e 3, não apresentou

diferença estatisticamente significativa ( p = 0,3568).

Tabela 6 - estatística – concentração do NO (µMol) no cólon


Média 10.7 15.6 15.9 p = 0.3568

Desvio Padrão 4.60 8.69 7.73 Grau de liberdade = 2

H = 2.0614

66

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1 2 3 4 5 6 7 8

grupo 1

grupo 2

Gráfico 6 – comparação dos grupos 1 e 2 - concentração do NO (µMol) no Cólon.

Gráfico 7 – comparação entre os 3 grupos - concentração do NO (µMol) no Cólon.

67

Gráfico 8 - Média - concentração do NO (µMol) - Íleo e Cólon.

Gráfico 9 - desvio padrão - concentração do NO (µMol) - Íleo e Cólon

68

4.3 Determinação de Malondialdeido:

Nas amostras intestinais dos roedores no 3º dia de vida foram observados entre os grupos 1

(H/R) e 3 (CTL) e entre os grupos 1 (H/R) e 2 (ARG) diferença estatisticamente significativa nas

médias da concentração do MDA, respectivamente p = 0,0030 e p = 0,0213. Entre os grupos 2

(ARG) e 3 (CTL) com (p = 0,2771) a diferença das médias do MDA não foi estatisticamente

significativa.

Tabela 7 - estatística – concentração intestinal do MDA (nMol/mg proteínas)

Gráfico 10 : comparação da concentração de MDA entre grupos - Student-Newman-Keuls


Média 8,91 6.01 4.73 p = O.0059

Desvio Padrão 1,90 1.81 0.93 p (1 e 2) = 0.0213

p (1 e 3) = 0.0030

p (2 e 3) = 0.2771

69

5. DISCUSSÃO

Apesar de diversos estudos experimentais ainda não é inteiramente

compreendido o mecanismo de lesão tecidual na ECN, permanecendo a mais

grave doença gastrintestinal do período neonatal com elevada mortalidade

(45%) 1, 3, 6. A gravidade e o prognóstico na ECN estão também

correlacionados com o comprometimento de outros órgãos devido a liberação

de mediadores inflamatórios na corrente sangüínea 75. Vários fatores

agravantes e predisponentes já foram descritos, porém não se estabeleceu

um tratamento padrão de sucesso para a ECN. Modelos têm sido propostos

buscando reproduzir em animais as lesões intestinais características da ECN

objetivando estudar os fatores desencadeantes, os mecanismos de agressão

tecidual e avaliar possíveis substâncias protetoras. A isquemia intestinal

desempenha um importante papel na fisiopatologia da ECN devido à

sensibilidade da mucosa a hipóxia 2, 57. Durante a asfixia neonatal e hipóxia,

ocorre redistribuição da volemia com perfusão preferencial para órgãos mais

imprescindíveis em detrimento da pele e sítios esplâncnicos que sofrem

vasoconstrição e isquemia 20, 21, 22. A lesão da mucosa intestinal na H/R ocorre

pela redução do oxigênio indispensável à respiração celular dos tecidos, mas

também por um complexo processo de agressão celular durante a

70

reoxigenação envolvendo aumento da permeabilidade vascular, produção de

mediadores inflamatórios, ativação e adesão de polimorfonucleares,

agregação plaquetaria, infiltração de células inflamatórias, produção de

radicais livres, causando peroxidação lipidica e apoptose5, 14. Citocinas,

radicais superóxidos, fator de ativação plaquetaria, fator de necrose tumoral e

leucotrienos tem importante papel na ECN15, 16.

O tecido intestinal é excepcionalmente susceptível as manifestações

de hipóxia seguidas de reoxigenação 13. Autores observaram alterações

precoces na mucosa e no endotélio intestinal de animais expostos à hipóxia,

outros relataram necrose isquêmica intestinal nestas condições4, 8, 59.

Pesquisadores reproduziram as lesões da ECN utilizando alimentação

artificial com formula láctea acompanhada de múltiplos eventos de hipóxia e

hipotermia 2. Um modelo de H/R utilizando câmara de gás com atmosfera

controlada foi proposto por autores turcos com obtenção de elevados índices

de lesões características de ECN em ratos 50, 51.

Substâncias diversas com potencial protetor dos tecidos

metabolicamente ativos tem sido alvo de pesquisa. Lactobacilos

acrescentados na dieta dos recém-nascidos diminuem os níveis de

fosfolipase A2 intestinal e de endotoxinas plasmática, reduzindo o risco de

ECN 20. Omeprazol e gentamicina, estudados por Biçakçi e cols reduzem os

71

marcadores bioquímicos da H/R e tem alguns efeitos benéficos nas

alterações histopatológicas dos intestinos de ratos induzidos a injuria 8. Entre

nós, Meyer e cols comprovaram que a glicina reduz a peroxidação lipidica

tecidual em ECN induzida por H/R em ratos 63. Sukhotnik e cols encontraram

que a exposição dos ratos a L-arginina oral em modelo de H/R, não previne o

intestino do dano isquêmico, mas acelera significativamente a reparação da

mucosa intestinal lesada 49, 61, 65. Interleucina recombinante humana poderia

reduzir as lesões intestinais de ratos 6, 64.

O NO participa em importantes processos biológicos e contribui para

manter a integridade da mucosa intestinal protegendo os intestinos das

agressões de mediadores inflamatórios 29, 37, 39. Atuando como vasodilatador

arteriolar o NO contribuiria para manter a perfusão distal e periférica dos

tecidos submetidos as condições de isquemia. Uma suplementação de NO

atenua a agressão tecidual intestinal em animais submetidos a I/R 23. Os

receptores das células endoteliais quando estimulados por substâncias

vasodilatadoras – acetilcolina, substancia P, bradicinina, histamina, ou pelo

aumento do fluxo sanguíneo local, induzem a síntese de NO 36. O NO alcança

as fibras musculares lisas da camada média do vaso e liga-se ao grupamento

heme da enzima guanilato-ciclase. Esta enzima converte o trifosfato de

guanosina (GTP) em monofosfato de guanosina cíclica (GMPc) que em última

72

análise é a responsável pela ação e efeitos vasodilatadores do NO. Taxas

elevadas de GMPc determinam uma diminuição de cálcio, redução da força de

contração muscular, relaxamento da musculatura, conseqüente vasodilatação

e queda da pressão arterial 72. Vasoconstrição localizada induz ao aumento

compensatório e liberação local de NO, que modula o relaxamento,

participando do mecanismo de adaptação cardiovascular para a manutenção

da pressão arterial 35, 38. Inalação do NO em baixas concentrações exerce

efeito atenuante na aderência leucocitária em I/R 62, 68. Em baixas

concentrações, o NO parece ter uma função fisiologia protetora, enquanto que

quando produzido em altas doses pode causar agressão intestinal 6. O NO é

sintetizado a partir da L-arginina sob a ação da enzima óxido nítrico-sintetase

(NOS) na formação de L-citrulina. As formas eNOS, nNOS, iNOS são

encontradas amplamente nos intestinos. Luo e cols constataram aumento no

grau das lesões intestinais em ratos após utilizar L-NAME para bloquear a

síntese do NO 60, 69. A arginase compete com a NOS na síntese do NO

reduzindo sua concentração tecidual 71. Em condições fisiológicas, NO

predomina na microcirculação com efeitos benéficos no intestino, entre eles

manter a permeabilidade vascular, reduzir a aderência de leucócitos no

endotélio, inibir a agregação plaquetaria, reduzir a proliferação da musculatura

lisa, limpar a circulação dos radicais livres 37, 38, 66, 67. Tem sido demonstrado

73

que uma suplementação de NO atenua a agressão tecidual intestinal em

animais submetidos a I/R 5. O íleo parece ser mais resistente que o jejuno

diante da I/R e o teor de NO parece ser o fator responsável por essa

habilidade do íleo. Entretanto nos intestinos de prematuros não se observou

aumento nos níveis de NO, apesar de apresentarem grande resistência a

injuria 19.

Conquanto a L-arginina exógena não cause relaxamento dependente

do endotélio, peptídeos de alto peso molecular contendo arginina (poli-L-

arginina) podem fazer 40, 41, 45. Autores observaram que poli-L-arginina induz

relaxamento dependente do endotélio em coronárias normais e em re-

perfundidas 27, 42, 43, 44. Isso se daria pelo bloqueio exclusivo da

ciclooxigenase.

Nosso experimento buscou reproduzir as lesões típicas da ECN

utilizando um modelo de H/R em ratos recém-nascidos. Nossa hipótese foi

avaliar o efeito da L-arginina no tecido intestinal quando submetido às

condições de H/R. Nossas observações constataram que nos animais

submetidos exclusivamente a H/R, foram intensas às lesões teciduais

intestinais com alteração na estrutura. O grupo que recebeu previamente a L-

Arginina revelou agressão tecidual em menor grau. Seria a oferta do

74

substrato de síntese do NO com a conseqüente produção aumentada e ação

vasodilatadora, o fator preservador do tecido intestinal?

Microscopicamente observou-se uma menor densidade de gânglios no

bordo anti-mesentérico em contraste com gânglios grandes, extensos e

alinhados no bordo mesentério. Entretanto os animais do grupo H/R

evidenciaram intensa dilatação vascular e um intumescimento dos gânglios

do plexo mioentérico. Tais estruturas estavam subjetivamente mais alargadas

ou aumentadas, mas não foram realizadas medidas específicas e essa

observação não foi notada nos outros grupos de estudo. Constatou-se,

entretanto nos animais do grupo ARG gânglios redondos e grandes no bordo

mesentério e pequenos e raros no bordo anti-mesentérico. No grupo CTL os

gânglios apresentavam-se abundantes e bem formados, também mais

numerosos no bordo anti-mesentérico quando comparado aos outros grupos.

As densidades de neurônios nos gânglios do bordo mesentérico foram

notadamente maiores. Numericamente os gânglios nervosos apresentaram

quantidades estatisticamente diferentes (H/R < ARG < CTL), enquanto que a

quantidade de neurônios dentro dos gânglios apresentou diferença

estatisticamente significativa somente entre os grupos H/R e CTL. Seriam as

alterações do plexo nervoso só observadas mais tardiamente como sugerido

por Silva e cols 58?

75

Sendo a L-arginina um substrato do NO, postulamos que sua oferta

aumentaria os níveis de NO tecidual e diante de eventos de H/R os intestinos

estariam mais protegidos. As concentrações teciduais de NO nos intestinos

foram dosadas. Nossos resultados no íleo confirmaram esse raciocínio. As

comparações entre os grupos 1 e 2 e entre os grupos 1 e 3 tiveram diferença

significativa, não observado entre os grupos 2 e 3. Ainda no íleo, os animais

que receberam L-arginina apresentaram concentrações maiores de NO (16,5

µM ± 4,91) comparadas com os que não receberam (7,3µM ± 2,02) - uma

elevação significativa da concentração de NO. No cólon não se observou

diferença estatisticamente significativa entre os níveis do NO entre os grupos

que receberam e não a L-arginina. Seria esses valores do NO tecidual o que

reduz no íleo a lesão intestinal? Essas diferenças de concentração de NO

entre os grupos em íleo e não marcante em cólon poderia ser atribuída ao

elevado metabolismo e maior vascularização que ocorre no íleo? Chan e cols

relatam concentração de NO intestinal muito baixas em ratos prematuros

(1µM ± 1,5) e em recém-nascidos a termo (3µM ± 2,5), porem com nível

elevado nos ratos de 30 dias (22µ M± 3,5) e acredita num menor atividade ou

quantidade de NOS no intestino desses animais 19. Seria o intestino desses

animais recém-nascidos incapazes ou imaturos para sintetizar NO? Haveria

NOS disponível ou em condições de sintetizar NO quando a oferta de

76

substrato fosse alta? Certamente há outros fatores limitantes e concorrentes

na síntese do NO70, 73, 74. Há também relatos que o NO não teria papel

protetor no intestino de ratos prematuros como tem nos animais mais

maduros 19. Em nosso trabalho os ratos a termo apresentaram NO mais

elevado que os valores expostos na literatura, e com clara comprovação de

menores graus de lesão nos intestinos dos animais que receberam L-

arginina. Os valores de MDA obtidos demonstraram que a ocorrência de

lesão tecidual (peroxidação lipídica) mais elevada ocorreu no grupo 1 (H/R)

que apresentou intensamente mais alta que o grupo 3 (CTL) e

significativamente maior que o grupo 2, corroborando com o encontrado por

outros pesquisadores 63 .

É difícil determinar quais mecanismos são responsáveis pelo efeito da

L-arginina na atenuação das lesões intestinais produzidas pelos eventos de

H/R. Postula-se ser pela maior oferta do substrato seguido de produção do

NO. Outros mecanismos de estimulo e regulação do NO provavelmente

existem e talvez diferentes em cada órgão. O NO é sintetizado por diferentes

isoformas de NOS e enquanto o NO produzido pela NOS endotelial parece

responder pela manutenção da hemodinâmica intestinal, os efeitos lesivos

estão ligados à elevada e continua produção de NO derivado da NOS indutiva

26, 27, 28, 32. O tempo de atuação do NO na hipóxia se durante ou depois dela e

77

na reoxigenação, são ainda desconhecidos. O presente estudo demonstrou

que a oferta exógena de L-arginina a ratos submetidos a eventos de H/R

contribui a níveis mais elevados de NO intestinal, menor grau de lesão e

alteração na estrutura e acarretando intensidade menor de peroxidação

lipídica tecidual. Porem em relação ao plexo nervoso intestinal se constatou

que houve variação e redução das estruturas nervosas entre os grupos

estudados. O estudo não permitiu assegurar que a proteção intestinal durante

a H/R esta relacionada a uma dose dependente e uma maior ou menor

concentração do NO produzido pela L-arginina.

78

6. CONCLUSÃO

Nas circunstancias em que nosso trabalho experimental foi

desenvolvido utilizando um modelo experimental de enterocolite necrosante concluímos que a utilização da L-Arginina exógena:

- Não é capaz impedir a ocorrência de lesões intestinais produzidas pela H/R. - Evidenciou menor grau nas alterações morfológicas encontradas na parede intestinal dos animais que receberam a L-Arginina.

- Revelou diferença estatisticamente significativa quanto a quantidade de gânglios nervosos e ao numero de neurônios dentro dos gânglios do plexo mioentérico e submucoso dos animais estudados.

- Elevou de forma relevante o nível do NO do tecido intestinal no grupo de animais que receberam a L-Arginina exógena.

- Contribuiu para reduzir a peroxidação lipídica intestinal, observada através das analise comparativa das concentrações do MDA nos tecidos dos três grupos estudados.

Com base nestas observações podemos afirmar que a oferta de L-Arginina exerce um efeito protetor nos tecidos intestinais de roedores

quando submetidos às condições de Hipóxia/Reoxigenação.

79

7. REFERÊNCIAS

1. Neu J, Weiss MD: Necrotizing Enterocolitis: Pathophysiology and

prevention. J PEN 23:S13-S17, 1999.

2. Caplan M, Miller-Catchpole R, Kaup S, et al: Bifidobacterial

supplementation reduces the incidence of necrotizing enterocolitis in a

neonatal rat model. Gastroenterology 117:577-83, 1999.

3. Ladd AP, Rescorda FJ, West KW, et al: Long-term follow-up after

bowel resection for necrotizing enterocolitis: Factors affecting outcome. J

Pediatr Surg 33:967-72, 1998.

4. Caplan MS, Sun XM, Hsueh W, et al.: Role of platelet activating

factor and tumor necrosis factor-alpha in neonatal necrotizing enterocolitis.

J Pediatr 116:960-4 1990.

5. Furukawa M, Lee EL, Johnston JM: Platelet-activating factor-

induced ischemic bowel necrosis: the effect of planelet-activating factor

acetihydrolase. Pediatr Res 34:237-41, 1993.

6. Stallion A, Kou TD, Miller KA, et al: IL-10 is not protective in

intestinal ischemia-reperfusion injury. J.Surg Re 105(2): 145-52, 2002.

80

7. Tardini MAS, Yoshida WB: Lesões cerebrais decorrentes de

isquemia e reperfusão na cirurgia de endarterectomia de carótida. J.Vasc

Br 2:119-28, 2003.

8. Biçakçi Ü, Tander B, Aritürk E.et al: Effects of omeprazole and

gentamicin on the biochemical and histpathological alterations of the

hypoxia/reoxygenation induced intestinal injury in newborn rats. Pediatr

Surg Int 21: 800-5, 2005.

9. Harrison R: Structure and function of xantine oxidoredutase:

Where are we now? Free Radic Biol Med 33(6):776-97, 2002.

10. Ossovskaya VS, Bunnett NW: Protease-activated receptors:

contribution to physiology and disease. Physiol Rev 84: 579-621, 2004.

11. Raithel M, Winterkamp S, Pacurar A, et al: Release of mast cell

tryptase from human colorectal mucosa in inflammatory bowel disease.

Scand J gastroenterol 36: 174-9, 2001.

12. Kakinoki K, Fujino Y, SuzukiY, et al: Protection against

ischemia/reperfusion injury by the cavitary two-layer method in canine

small intestinal transplantation with reduction of reactive oxygen species. J

Surg 135(6):642-48, 2004.

81

13. Nakao A, Kimizuka K, Stolz DB, et al: Carbon Monoxide

inhalation protects rat intestinal grafts from ischemia/reperfusion injury. Am

J Pathology 163: (4) 1587-98 oct 2003.

14. Yamamoto S, Tanabe M, Wakabayashi G, et al: The role of

tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta in ischemia-reperfusion

injury of the rat small intestine. J. Surg Res 99(1):134-41, 2001.

15. Kong SE, Blennerhassett LR, Mc Cauley RD, et al: Ischemia-

reperfusion injury to the intestine. Aust NZ J Surg 68(8):554-61, 1998.

16. Hinnebusch BF, Ma Q, Henderson JW, et al: Enterocyte

response to ischemia is dependent on differentiation state. J Gastrointest

Surg 6(3):403-9, 2002.

17. Sileri P, Morini S, Schena S, et al: Intestinal ischemia-reperfusion

injury produces chronic abnormalities of absorptive function. Transplant

Proc 34(3):984, 2002.

18. Bielefeldt K, Conklin JL: Intestinal motility during hypoxia and

reoxygenation in vitro. Dig Dis Sci 42:878-84, 1997.

19. Chan KL, Zhang XH, Fung PCW, et al: Role of nitric oxide in

intestinal ischemia-reperfusion injury studied using electron paramagnetic

resonance. Br J Surg 86:1427-32,1999.

82

20. Ceppa EP, Fuh KC, Bulkley GB: Mesenteric hemodynamic

response to circulatory shock. Curr Opin Crit Care 9(2): 127-32, 2003.

21. Lloyd JR: The etiology of gastrointestinal perforation in the

newborn. J Pediatr Surg 4:77-84, 1969.

22. Nanthakumar NN, Fusunyan RD, Sanderson I, et al:

Inflammation in the developing human intestine: a possible

pathophysiologic contribution to necrotizing Enterocolitis. Proc Natl Acad

Sci USA 97(23): 6043-8, 2000.

23. Guo WH, Chan KL, Fung PCW, et al: Nitric oxide protects

segmental intestinal graft ischemia and reperfusion injury. Transplant Proc

32:1297-8, 2000.

24. Brunini TMC, Moss MB, Soares de Moura R, et al: Inibição do

transporte de L-arginina em plaquetas de pacientes hipertensos:

implicações para aterotrombose. Laboratório de transporte de membrana

– UERJ, anais do XXXIV Congresso Brasileiro de Farmacologia e

Terapêutica Experimental, 01.069.

25. Silva LFA, Antunes MA, Brunini TMC, et al: A via L-arginina-

óxido nítrico em um modelo animal de hipertensão. Laboratório de

transporte de membrana – UERJ, anais do XXXIV Congresso Brasileiro

de Farmacologia e Terapêutica Experimental, 01.001.

83

26. Busnardo C, Oliveira EB, Martins-Pinge MC, et al: Envolvimento

da via indutiva da formação do óxido nítrico (iNOS) no edema pulmonar.

Departamento de ciências fisiológicas – UEL, anais do XXXIV Congresso

Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, 01-018.

27. Albrecht EW, Stegman CA, Heeringa P, et al: Proctetive role of

endothelial nitric oxide synthase. J Pathol 199(1):8-17, 2003.

28. Salzman AL: Nitric oxide in the gut. New Horiz 3(2): 352-64

1995.

29. Kubes P and McCafferty DM: Nitric oxide and intestinal

inflammation. Am J Med 109(2): 150-58, 2000.

30. Suzuki Y, Deitch EA, Mishima S, et al: Inducible nitric oxide

synthase gene knockout mice have increased resistence to gut injury and

bacterial translocation after an intestinal ischemia-reperfusion injury. Crit

Care Med 28(11):3692-96, 2000.

31. Cuzzocrea S, Zingarelli B, Caputi AP: Role of construtive nitric

oxide synthase and peroxynitrite production in a rat model of splanchnic

artery occlusion shock. Life Sci 63(9): 789-99, 1998.

32. Wu B, Iwakiri R, Tsunada Set al: iNOS enhances rat intestinal

apoptosis after ischemia-reperfusion. Free Radic Biol Med 33(5):649-58,

2002.

84

33. Láinez MJ, Monzón MJ: Chronic daily headache. Curr Neuroc

Rep 1(2):118-24, 2001.

34. Palmer RMJ, Ferrige AG, Moncada S: Nitric oxide accounts for

the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature

327:524-6, 1988.

35. Ignarro LJ, Buga GM, Wood KS, et al: Endothelium-derived

relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide.

Proc Natl Acad Sci USA 84:9265-9, 1987.

36. Feletou M, Vanhoutte PM: Endothelium–dependent

hyperpolarzation of canine coronary smooth muncle. Br. J Pharmacol

93:515-24, 1988.

37. Kosonen O, Kankaanranta H, Malo-RantaU, et al: Nitric oxide-

releasing compounds inhibit neutrophil adhesion to endothelial cells. Eur J

Pharmacol 382(2):111-17, 1999.

38. Lefer AM, Lefer DJ: The role of nitric oxide and cell adhesion

molecules on the microcirculation in ischaemia-reperfusion. Cardiovasc

Res 32(4):743-51, 1996.

39. Gauthier TW, Davenpeck KL, Lefer AM: Nitric oxide attenuates

leukocite-endothelial interation via P-selectrin in splanchnic ischemia-

reperfusion. AM J Physiol 267 (4,Pt 1): G562-G568, 1994.

85

40. Thomas G, Mostaghim R, Ramwell PW: Endothelium-dependent

vascular relaxation by arginina containing polypeptides. Biochem Biophys

Res Comm 141:446-51, 1986.

41. Rees DD, Palmer RMJ, Hodson HF, et al: A specific inhibitor of

nitric oxide formation from L-arginine attenuates endothelium- dependent

relaxation. Br J Pharmacol 96:418-24, 1989.

42. Moore PK, al-Swayeh OA, Chong RA, et al: L-NG-nitro arginine

(L-NOARG), a novel, L-arginine-reversible inhibitor of endothelium-

dependent vasodilatation in vitro. Br J Pharmacol 99:408-12, 1990.

43. Ignarro LJ, Gold ME, Buga GM, et al: Basic polyamino acids rich

in arginine, lysine, or ornithine cause both enhancement of and

refractoriness to formation of endothelium-derived nitric oxide in pulmonary

artery and vein. Circ Res 64: 315-29, 1989.

44. Évora PR, Pearson PJ, Schff HV: Impaired endothelium-

dependent relaxation after coronary reperfusion injury: evidence for G-

protein dysfunction. Ann.Thorac Surg 57:1550-6, 1994.

45. Évora PR, Pearson PJ, Rodrigues AJ, et al: Relaxamento

dependente do endotélio causado pela poli-L-arginina. Implicações sobre

a hiperpolarização como mecanismo de vasoconstrição. Arq Brás Cardiol

80:621-5, 2003.

86

46. Cynober L: Can arginine and ornitine support gut functions? Gut

35(suppl)42-45, 1994.

47. Sukumar P, Loo A, Magur E: Dietary supplementation of

nucleosides and arginine promotes healing of small bowel ulcers in

experimental ulcerative ileitis. Gig Dis Sci 42: 1530-6, 1997.

48. Gurbuz AT, Kunzelman J, Ratzer EE: Supplemental dietary

arginine accelerates intestinal mucosal regeneration and enhances

bacterial clearance following radiation enteritis in rats. J Surg Res 74:149-

54, 1998.

49. Sukhotnik I, Helou H, Mogilner J: Oral arginine improves

intestinal recovery following ischemia-reperfusion injury in rat. Pediatr Surg

Int 21:191-6, 2005.

50. Okur H, Kucukaydin M, Kose K, et al: Hypoxia-induced

necrotizing enterocolitis in the immature rat: the role of lipid peroxidation

and management by vitamin E. J Pediatr Surg 30:1416-9, 1995.

51. Özkan K U, Özokutan B H, Ínanç F, et al: Does maternal nicotine

exposure during gestation increase the injury severity of small intestine in

the newborn rats subjected to experimental necrotizing enterocolitis. J

Pediatr Surg 40:484-8, 2005.

87

52. Chiu CJ, McArdle AH, Brown R, et al: Intestinal mucosa lesion in

low-flow states. Arch Surg 101:478-83, 1970.

53. Moore BW: Brain-specific proteins. In: Schneider, DJ, Angeletti

RH, Grasso A, et al: Proteins of the nervous system. 1.ed New York,

Raven Press, p. 1-12, 1973.

54. Rocha MMB: Estudo histológico e imuno-histoquímico de

segmento jejunal neovascularizado por omentopexia em ratos. Tese de

doutorado apresentado a Unifesp/EPM, 2001.

55. Ohlawa H, Ohishi N, Yagi K: Assay for lipid peroxides in animal

tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical Biochemistry 95:351-8,

1979.

56. Pyles LA, Stejskal EJ, Einzig S: Spectrophotometric

measurement of plasma 2-thiobarbituric acid-reactive substances in the

presence of hemoglobin and bilirubin interference. PSEBM 202:407-19,

1993.

57. Hsueh W, Caplan M S, Qu XW: Neonatal necrotizing

enterocolits: clinical considerations and pathogenetic concepts. Pediatr

Dev Pathology 6: 6-23, 2002.

88

58. Silva MACP, Meirelles LR, Bustorff-Silva JM: Changes in

intestinal motility and in the myenteric plexus in rats model of intestinal

ischemia-reperfusion. J Pediat Surg 42: 1062-65, 2007.

59. Hakgüder G, Akgür FM, Ates O, et al: Short-term intestinal

ischemia-reperfusion alters intestinal motilitythat cam be preserved by

xanthine oxidase inhibition. Dig Dis Sci 47(6): 1279-83, 2002.

60. Luo CC, Shih HH, Chiu CH, et al: Reduced apoptosis in newborn

compared to adult rat intestine after ishemia-reperfusion injury. Biol

neonate 85: 90-3, 2004.

61. Fukuyama K, Iwakiri R, Noda T, et al: Apoptosis induced by

ischemia-reperfusion and fasting in gastric mucosa compared to small

intestinal mucosa in rats. Dig Dis Sci 46: 545-49, 2001.

62. Biswas K, Bandyopadhyay U, Chattopadyay I, et al: A novel

antioxidant and antiapoptotic role of omeprazole to block gastric ulcer

through scavenging of hydroxyl radical. J Bio Chem 10993-11001, 2003.

63. Meyer KF, Martins JL, Freitas Filho LG, et al: Glycine reduces

tissue lipid peroxidation in hypoxia-reoxygenation-induced necrotizing

enterocolitis in rats. Acta Cirúrgica Brasileira. 21:161-67, 2006.

89

64. Öztürk H, Dokucu Ai Ögun C, et al: Protetive effects of

recombinat human interleukin–10 on intestines of hypoxia-induced

Necrotizing enterocolits in immature rats. J Pediatr Surg. 37: 1330-3, 2002.

65. Sukhotnik I, Mogilner J, Krausz MM et al: Oral arginine reduces

gut mucosal injury caused by lipopolisacharide endotoxemia in rat. J Surg

Res. 122: 1530-36, 2004.

66. - Moncada S, Higgs E A: The discovery of nitric oxide and its role

in vascular biology. Br J Pharmacol 147: S 193-201, 2006.

67. Kawata K, Takeyoshi I, Iwanami K, et al: An espontaneus nitric

oxide donor ameliorates small bowel ischemia-reperfusion injury in dogs.

Dig Dis Sci. 46 (8): 1748-56, 2001.

68. Fox-Robichaud A, Payne D, Hasan SU, et al: Inhaled NO as a

viable antiadhesive therapy for ischimia-reperfusion injury of distal

microvascular beds. J Clin Invest 101 (11): 2497-505, 1998.

69. Luo CC, Chen HM, Chiu CH, et al: Effect of N-nitro-L-arginine

methyl ester on intestinal permeability following intestinal ischemia-

reperfusion injury in a rat model. 80: 60-63, 2001.

70. Moore PK, al-Swayeh OA, Chong RA, et al: L-NG-nitro arginine

(L-NOARG), a novel, L-arginine-reversible inhibitor of endothelium-

dependent vasodilatation in vitro. Br J Pharmacol 99:408-12, 1990.

90

71. Durante W, Johnson FK, Johnson RA: Arginase: A critical

regulator of nitric oxide synthesis and vascular function. 34 (9): 906-11,

2007.

72. Brunini TMC, Perin N, Costa E, et al: The role of L-arginin-nitric

oxide pathway in pulmonary diseases. Pulmão RJ 15(3): 184-90, 2006.

73. Kurata H, Takaoka M, Kubo Y, et al: protective effect of nitric

oxide on ischemia/reperfusion-induced renal injury and endothelin-1

overproduction. Eur J Pharmacol 517:232-39, 2005.

74. Cattaruzza F, Cenac N, Barocelli E, et al: Protective effect of

proteinase-activated receptor 2 activation on mobility impairment and

tissue damage induced by intestinal ischemia/reperfusion in rodents. Am J

of Pathology 169:177-88, 2006.

75. Schettini ST, Miyoshi MH: Enterocolite necrosante neonatal.

Pediatria Moderna 35:45-88, 1999.

76. Blantz RC, Munger K: Role of Nitric Oxide in Inflammatory

Conditions. Nephron 90:373-378, 2002.

91

8. ANEXOS Anexo 1 : Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa - 06/01/2006 - Unifesp

92

Anexo 2 : Curva de calibração do MDA - leitura de absorbância (A)

y = 0,006x + 0,0009

R2 = 0,9991

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0 20 40 60 80 100 120

Seqüência1

Seqüência2

Linear

0,0 0,000

12,5 0,072

25,0 0,147

50,0 0,311

100,0 0,592 Padrão de absorbância (A) utilizado.

Álvaro edmundo simÕes ulhoa cintra - … dragosavac, dr. nelson adami andreollo, dra. josé...

Documents