lysine -...

Luận văn

Công nghệ tổng hợp Lysine

ii

Mục lục

Danh mục hình ........................................................................................................... iv

Danh mục bảng ........................................................................................................... vi Danh mục đồ thị .......................................................................................................viii CHƯƠNG I : TỔNG QUAN ....................................................................................... 1

1. 1.Giới thiệu về lysine ............................................................................................ 1

1.1.1. Khái niệm .................................................................................................... 1

1.1.2. Cấu tạo ........................................................................................................ 1

1.1.3. Vai trò và ứng dụng ..................................................................................... 2

1.1.4. Các dạng tồn tại của lysine .......................................................................... 4

1.2. Các phương pháp thu nhận lysine ...................................................................... 8

1.2.1. Phương pháp thủy phân ............................................................................... 8

1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học .................................................................... 9

1.2.3. Phương pháp lên men .................................................................................. 9

1.2.4. Phương pháp kết hợp ................................................................................... 9

1.3. Cơ chế sản xuất L-lysine từ tế bào vi sinh vật .................................................. 11

1.3.1. Sơ đồ chuyển hóa ...................................................................................... 11

1.3.2. Thuyết minh các giai đoạn chuyển hóa ...................................................... 13

1.5. Tổng hợp lysine từ Corynebacterium glutamicum............................................ 19

1.5.1. Đặc điểm hình thái của Corynebacterium glutamicum ............................... 19

1.5.2. Bộ gen của Corynebacterium glutamicum ................................................. 20

1.5.3. Lịch sử sử dụng Corynebacteria glutamicum ............................................. 24

1.5.4. Sản xuất lysine theo quy mô công nghiệp .................................................. 24

1.6. Cải tạo giống Corynebacterium glutamicum .................................................... 25

1.6.1. Khái niệm .................................................................................................. 25

1.6.2. Một số phương pháp dùng để cải tạo giống Corynebacterium glutamicum 26

1.6.3 Các plasmid nội sinh của Corynebacteria glutamicum sử dụng trong việc thiết kế vector: .................................................................................................... 28

1.6.4. Việc biểu hiện gen ở Corynebacterium glutamicum ................................... 30

1.6.5. Phương pháp cải tạo giống Corynebacterium glutamicum để thu dư lysine từ aspertate .............................................................................................................. 30

1.7. Cố định tế bào vi sinh vật ................................................................................ 37

1.7.1. Định nghĩa cố định tế bào .......................................................................... 37

1.7.2. Phương pháp cố định tế bào ....................................................................... 38

1.7.3. Chất mang cố định tế bào vi sinh vật: ......................................................... 38

iii

1.7.4. Chỉ tiêu đánh giá hiệu quả cố định tế bào .................................................. 39

1.8. Công nghệ lên men L-Lysine ............................................................................ 39

1.8.1. Các vi khuẩn lên men L-lysine .................................................................. 39

1.8.2. Môi trường lên men ................................................................................... 40

1.8.3. Các phương pháp lên men ......................................................................... 44

1.8.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ............................................. 46

1.8.5. Qui trình lên men ....................................................................................... 48

1.8.6. Thu nhận và tinh sạch sản phẩm ................................................................ 55

1.8.7. Phân tích chất lượng và số lượng L-lysine ................................................ 57

CHƯƠNG 2: CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ................................ 58

2.1. Nghiên cứu về các đối tượng sản xuất lysine ................................................... 58

2.1.1 Sử dụng dịch cỏ như một gradient trong sản xuất lysine ............................. 58

2.1.2 Đặc điểm con đường tổng hợp sinh học lysine trong Obligate Methylotroph Methylophilus methylotrophus............................................................................. 58

2.1.3. Các nghiên cứu về đối tượng sản xuất lysine là Corynebacterium glutamicum ......................................................................................................... 59

2.2. Công nghệ lên men L-lysine ............................................................................ 78

2.2.1. Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid amin L-lysine .................................. 78

2.2.2. Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine....................................................... 85

2.2.3. Nghiên cứu quá trình lên men thu nhận L-lysine ở các chế độ lên men khác nhau .................................................................................................................... 88

2.2.4. Nghiên cứu quá trình lên men liên tục L-lysine ......................................... 90

2.2.5. Nghiên cứu tổng hợp lysine bằng tế bào cố định ........................................ 96

CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN ....................................................................................... 100

Tài liệu tham khảo ................................................................................................... 101

iv

Danh mục hình

Hình 1. 1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine .................................................... 2

Hình 1. 2 Cấu trúc không gian của L-lysine. ................................................................ 2

Hình 1. 3 Nhu cầu của lysine, threonine và methionine trong thức ăn heo con và thành

phần của những amino acid này chứa sẵn trong thưc vật . ............................................ 3

Hình 1. 4 Sản xuất lysine lên men (tấn/năm) trong suốt 3 thập kỉ qua . ........................ 4

Hình 1. 5 L-lysine sulphate . ........................................................................................ 4

Hình 1. 6 L-lysine HCl ................................................................................................ 5

Hình 1. 7 Sản phẩm thương mại L-lysine với B6 ........................................................ 6

Hình 1. 8 Sản phẩm thương ......................................................................................... 6

Hình 1. 9 Sản phẩm thương ......................................................................................... 7

Hình 1. 10 Sản phẩm thương mại ................................................................................. 7

Hình 1. 11 Sản phẩm thương mại Lysine-1000 90ct. .................................................... 8

Hình 1. 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder ........................................................ 8

Hình 1. 13 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa tứ glucose ra lysine và các amino acid khác

Hình 1. 14 Con đường tổng hợp lysine từ glucose . .................................................... 13

Hình 1. 15 Sự chuyển hóa tạo thành Oxaloacetate và Malate . ................................... 14

Hình 1. 16 Con đường tổng hợp lysine . ..................................................................... 16

Hình 1. 17 Sơ đồ diều hòa dị lập thể ......................................................................... 18

Hình 1. 18 Corynebacterium glutamicum . ................................................................. 20

Hình 1. 19 Hệ gen của Corynebacterium glutamicum. ............................................... 23

Hình 1. 20 Bản đồ cắt giới hạn của các plasmid pHM1519 và pBL1 của

Corynebacterium glutamicum ................................................................................... 29

Hình 1. 21 Con đường tổng hợp phân nhánh của L-lysine trong giống Corynebacteria

glutamicum hoang dại. . ............................................................................................. 32

Hình 1. 22 Cấu trúc của Aspartate kinase . ................................................................. 33

Hình 1. 23 Trình tự DNA của vùng promoter dapA . ................................................. 36

Hình 1. 24 Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào . .................................................... 38

Hình 1. 25 Mô hình sản xuất các amino acid . ............................................................ 50

v

Hình 1. 26 Mô hình lên men thu L-lysine . ................................................................. 51

Hình 2. 1 Cô lập gen ddh của C. glutamicum và cấu trúc của một plasmid tổ hợp C.

glutamicum - E.coli . .................................................................................................. 68

Hình 2. 2 Nhuộm họat tính DDH sau polyacrylamide gel Electrophoresis . ............... 69

Hình 2. 3 Sơ đồ vật lý, phân tích và đánh dấu trình tự của DNA ................................ 70

vi

Danh mục bảng

Bảng 1. 1 So sánh các phương pháp thu nhận lysine . .................................................. 9

Bảng 1. 2 Đặc điểm hình thái của C. glutamicum ....................................................... 19

Bảng 1. 3 Thống kê lượng amino acid được sản xuất hiện nay. .................................. 24

Bảng 1. 4 Các plasmid nội sinh của Corynebacterium được sử dụng trong việc thiết kế

vector . ....................................................................................................................... 28

Bảng 1. 5 Ảnh hưởng của số lượng bản sao dapA khác nhau trên tốc độ tăng trưởng,

sự bài tiết L-lysine . ................................................................................................... 35

Bảng 2. 1 Các chủng vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic hoang dại theo báo cáo như là

chủng bố mẹ để sản xuất các amino acid và như là gen chủ cho nhân dòng . .............. 60

Bảng 2. 2 Kết quả thu được từ sáu chủng đột biến ở điều kiện lên men thu ................ 61

Bảng 2. 3 Hiệu quả của gen ddh trong C. glutamicum ............................................... 70

Bảng 2. 4 Cách sử dụng codon của gen ddh . ............................................................. 71

Bảng 2. 5 Giống C. glutamicum dùng trong bài nghiên cứu này . ............................... 73

Bảng 2. 6 Vị trí chuỗi primer đặc biệt được sử dụng phổ biến để thay thế trong G.

glutamicum bằng phương pháp PCR và chuỗi DNA tiếp theo sau . ............................ 73

Bảng 2. 7 Sản lượng và những đặc trưng của sự sản xuất lysine của .......................... 75

Bảng 2. 8 Sinh khối và các chất chuyển hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr

.................................................................................................................................. 77

Bảng 2. 9 Nhu cầu đồng hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp .... 78

Bảng 2. 10 Khả năng lên men của chủng CM24 trên 4 loại môi trường. ..................... 79

Bảng 2. 11 Ảnh hưởng của pH lên sản lượng L-lysine qui mô 50 lít. ......................... 80

Bảng 2. 12 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít. ......... 81

Bảng 2. 13 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít. ....... 82

Bảng 2. 14 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 1500 lít. ..... 83

Bảng 2. 15 Hiệu suất thu hồi L-lysine. ....................................................................... 83

Bảng 2. 16 Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%).

.................................................................................................................................. 87

vii

Bảng 2. 17 Sản lượng L-lysine thu được bằng các phương pháp lên men khác nhau. . 89

Bảng 2. 18 Ảnh hưởng của hàm lượng đường giới hạn lên năng suất và sản lượng L-

lysine. ........................................................................................................................ 89

Bảng 2. 19 Năng suất và sản lượng L-Lysine trong lên men repeat fed batch và liên

tục.............................................................................................................................. 89

Bảng 2. 20 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 lên sinh khối và nồng độ L-Lysine........... 97

Bảng 2. 21 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu và thời gian lên men lên sự tổng hợp

.................................................................................................................................. 97

viii

Danh mục đồ thị Đồ thị 2. 1 So sánh sản lượng L-lysine tạo bởi C. glutamicum từ sáu chủng đột biến

trong môi trường lên men theo phương pháp Fed-batch . ........................................... 62

Đồ thị 2. 2 Hoạt động invivo của fructose 1,6-biphosphatase trong các chủng C.

glutamicum khác nhau .................................................................................................. 75

Đồ thị 2. 3 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui

mô 50 lít ..................................................................................................................... 79

Đồ thị 2. 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít. ............... 80

Đồ thị 2. 5 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui

mô 150 lít. ................................................................................................................. 81

Đồ thị 2. 6 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng ................... 82

Đồ thị 2. 7 Sản lượng L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng các chế phẩm ... 87

Đồ thị 2. 8 Thời gian nuôi cấy liên tục ....................................................................... 91

Đồ thị 2. 9 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng lên các thông số trạng thái ổn định ........... 92

Đồ thị 2. 10 Ảnh hưởng của tỉ lệ đường bổ sung lên năng suất ................................... 93

Đồ thị 2. 11 Ảnh hưởng của khuấy đảo lên các thông số trạng thái ổn định. ............... 94

Đồ thị 2. 12 Ảnh hưởng của khí giàu oxy lên các thông số trạng thái ổn định. ........... 95

Đồ thị 2. 13 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu lên sự tổng hợp L-lysine bằng các tế

bào C.glutamicum cố định ......................................................................................... 98

Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu

1

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN

1. 1.Giới thiệu về lysine:

1.1.1. Khái niệm:

Lysine là một α-amino acid thiết yếu con người không thể tổng hợp được.

Lysine chứa hai nhóm (-NH2) và một nhóm (-COOH). Trong cấu tạo phân

tử lysine có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quang học:

D-lysine và L-lysine. Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau,

chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và

một sang trái làm tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác và cơ thể sinh vật

sống chỉ hấp thu được lysine dạng L.

Lysine tồn tại dạng rắn và tinh thể trong điều kiện bình thường, bị phân hủy

ở nhiệt độ 200-300°C, có màu tím xanh khi tương tác với ninhydrin [38].

Lysine là một trong 9 amino acid không thay thế trong tổng số 20 amino acid, tìm

thấy trong cấu trúc của những phân tử protein tự nhiên của tất cả sinh vật sống và

được tổng hợp từ vi sinh vật. Lysine thuộc họ aspartate, được tổng hợp qua con

đường phân nhánh.

Lysine là acid amin rất cần thiết cho hoạt động sống của người và động vật.

Nhu cầu lysine trên thế giới năm 2006 là 950,000-1000,000 tấn.

1.1.2. Cấu tạo:

Công thức phân tử: C6H14N2O2, khối lượng phân tử 146,188 g/mol, điểm

đẳng điện pH = 9.59, Codon của lysine là AAA và AAG. [38]

Công thức cấu tạo: NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH


2

Hình 1. 1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine [38].

Hình 1. 2 Cấu trúc không gian của L-lysine [38].

Tên gọi: Lysine còn có tên gọi khác là axit α-e-diaminocaproic và 2,6-

diaminohexanoic acid.

1.1.3. Vai trò và ứng dụng:

Lysine giữ vai trò sống còn trong tổng hợp protein, là chìa khóa trong sản

xuất enzyme, hoocmon và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng,

chống bệnh tật đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh mụn gộp môi

hay mụn gộp sinh dục.

Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ không hoạt động bình

thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm lớn, trí

tuệ phát triển kém. Chính vì thế lysine thường được đưa vào phần ăn của trẻ và của

gia súc.

L-lysine là một amino acid cần thiết và đòi hỏi phải luôn có sẵn trong thức

ăn để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của động vật, đặc biệt đối với thức ăn từ ngũ

cốc, lúa mì hoặc lúa mạch thì nghèo lysine. Do đó bổ sung nguồn giàu lysine vào là

D-lysine L-Llysine


3

cần thiết để tăng hiệu quả thức ăn. Ta có thể bổ sung bột đậu nành (chứa nhiều

lysine) hoặc thêm trực tiếp lysine vào thức ăn. Ưu điểm của việc bổ sung trực tiếp

lysine là các amino acid không thay thế khác không được thêm vào nên thành phần

của chúng trong cơ thể không bị thay đổi. Ví dụ thêm 0.5% lysine tăng chất lượng

đạm của thức ăn hiệu quả như là bổ sung 20% đậu nành. Từ đó, nitơ của amino

acid không giới hạn thêm vào thừa của chế độ ăn có hàm lượng đạm cao thì sẽ bị

chuyển hóa thành amoni và được động vật bài tiết ra ngoài, với việc bổ sung lysine

làm giảm lượng đạm bổ sung từ đó làm giảm ô nhiễm môi trường từ phân.

Hình 1. 3 Nhu cầu của lysine, threonine và methionine trong thức ăn heo con và thành phần

của những amino acid này chứa sẵn trong thưc vật [34].

Trong năm 2000, việc sản xuất L-lysine khắp nơi trên thế giới được sử dụng

như là một nguồn chất bổ sung vào thức ăn đạt sấp xỉ 550.000 tấn và trên thị

trường vẫn cho thấy một sự tăng trưởng tiềm năng từ 7-10% mỗi năm [34]. Vì chỉ

có L-lysine là có hiệu quả như là một nguồn chất bổ sung và tất cả các quy trình

sản xuất hiện nay sử dụng phương pháp lên men quen thuộc.


4

Hình 1. 4 Sản xuất lysine lên men (tấn/năm) trong suốt 3 thập kỉ qua [34].

Lysine có nhiều trong trứng, thịt, cá, đậu nành…nhưng dễ bị phá hủy trong

quá trình chế biến và nấu nướng thức ăn. Người ta bổ sung lysine cho động vật

dưới dạng thức ăn như cho lysine vào sữa. Ở người lysine được bổ sung vào thuốc

dạng viên và thuốc uống.

1.1.4. Các dạng tồn tại của lysine:

L-lysine Sulphate

Hình 1. 5 L-lysine sulphate [18].

Thành phần: Lysine Sulphate là muối sulphate với lysine

L-lysine : 51% min, trung bình là 65%..

Sulphate : 15% max


5

Các acid amin : 10% min.

Độ ẩm : 3% max

Muối amoni (như NH4) : 1% ma

Kim loại nặng : 0,003% max

Arsen : 0,0002% max.

Lysine Sulphate có thể được bổ sung vào L-lysine HCl làm thức ăn cho vật nuôi,

chúng có hiệu quả như L-lysine HCl.

L-lysine HCl (L-Lysine monohydrochoride) [18].

Xuất xứ : Trung Quốc

Hình thức : Màu nâu sáng.

Hình 1. 6 L-lysine HCl [18].

Thành phần : ≥ 98.5%

Ẩm : £1%

Amonium (NH4) : 0.04%

Kim loại nặng : £ 0.003%

pH (1 :10 nước) : 5 - 6.09 Hình 2.5: L-lysine HCl

L-lysine HCL 98.5% (Feed Grade) là một trong những amino acid được sử dụng

rộng rãi nhất. Đây là amino acid cần thiết yêu cầu có trong chế độ ăn của lợn, gà vịt

gia cầm.


6

1.1.5. Các sản phẩm lysine thương mại:

L-lysine với B6 [37].

Hình 1. 7 Sản phẩm thương mại L-lysine với B6 [37]

Thành phần: L-lysine, vitamin B6 (Pyridoxine hydrochloride), Mg, Si, men, gluten,

muối, đường và các sản phẩm sữa.

Mỗi Capsule sẽ cung cấp: L-lysine 500mg, Vitamin B6 6mg

Giá thành: 380000 VND.

Lysine power [40].

Thành phần của sản pham này là L-lysine HCl.

Hình 1. 8 Sản phẩm thương

mại Lisine Power [40].


7

Lysine capsures [40].

Hình 1. 9 Sản phẩm thương

mại Lysine Capsures.

Thành phần của sản phẩm này là L-lysine HCl [40].

Lysine Vit- B12 Granules [40].

Hình 1. 10 Sản phẩm thương mại

Lysine Vit – B12 Granules [40].

Thành phần: 300mg lysine, 15mg vitamin B12

Granule có hương vị ngọt.

Lysine-1000 90ct [40]

Lysine đóng vai trò quan trọng cho sự phát triển đúng đắn và đóng vai trò thiết yếu

trong sản xuất carnitine. Nó chịu trách nhiệm chuyển đổi các acid béo thành năng

lượng và giúp giảm cholesterol. Lysine xuất hiện để giúp cơ thể hấp thụ và chuyển

hóa canxi, nó đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành collagen, một chất

quan trọng cho xương và mô liên kết bao gồm da, gân và sụn.


8

Hình 1. 11 Sản phẩm thương mại Lysine-1000 90ct [40].

Lysine Powder [40]

Hình 1. 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder [40].

Thành phần L-Lysine.

1.2. Các phương pháp thu nhận lysine:[2]

1.2.1. Phương pháp thủy phân:

Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều

protein.

Các phương pháp này hiện nay vẫn đang được sử dụng rộng rãi.Tuy nhiên, phương

pháp này có nhược điểm là:

Thiết bị phải chịu được acid hay kiềm.

Trường hợp sử dụng kiềm để thủy phân sẽ tạo ra nhiều acid amin dạng D.

Trường hợp sử dụng acid để thủy phân sẽ ô nhiễm môi trường không khí do

lượng acid dư bay hơi trong quá trình thủy phân.


9

Giá thành thường cao.

1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học:

Ưu điểm của phương pháp là sản xuất ổn định, có thể tiêu chuẩn hóa điều

kiện sản xuất, đảm bảo hiệu suất nhưng nhược điểm là thu được các acid amin

dạng Racemic( L và D- acid amin) mà cơ thể không sử dụng dạng D nên công đọan

tách ra rất phức tạp.

1.2.3. Phương pháp lên men:

Ở đây ta tiến hành nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận các acid amin. Ưu điểm

của phương pháp là:Phương pháp này cho phép ta thu nhận acid amin dạng L.

Nguyên liệu để sản xuất rẻ, dễ kiếm. Tốc độ trao đổi chất, tốc độ sinh sản và phát

triển mạnh của vi sinh vật cho phép ta được năng suất cao. Giá thành sản phẩm

thấp hơn giá thành sản phẩm từ các phương pháp khác.

1.2.4. Phương pháp kết hợp:

Người ta kết hợp phương pháp hóa học và sinh học. Bằng con đường hóa

học, thu nhận hợp chất dạng L-Keto và các tiền chất của acid amin. Sau đó sử dụng

vi sinh vật để chuyển hóa những chất này thành acid amin.

Nhìn chung, phương pháp dùng vi sinh vật để chuyển các chất tiền thân của

acid amin thành acid amin tương ứng là một phương pháp có nhiều triển vọng và

thường được sử dụng trong sản xuất lysine. Cơ sở khoa học của phương pháp là:

trong quá trình trao đổi chất, vi sinh vật có khả năng tích lũy acid amin trong môi

trường. Ở điều kiện sống bình thường, lượng acid amin mà chúng tổng hợp được

thường đủ đáp ứng nhu cầu bản thân, nhưng trong điều kiện nào đó, lượng acid

amin này có thể vượt xa nhu cầu bản thân và tích lũy lại trong tế bào hay thoát ra

môi trường. Hiện tượng này được gọi là siêu tổng hợp acid amin của vi sinhvật.

Trong khoảng 10 năm gần đây, trên thị trường có một bước tiến mạnh mẽ

trong công nghệ sản xuất Lysine bằng con đường lên men.

Bảng 1. 1 So sánh các phương pháp thu nhận lysine [2].

Phương Khái niệm Ưu điểm Nhược điểm


10

pháp

Phương

pháp thủy

phân

Dùng acid hoặc kiềm

để thủy phân tinh bột

chứa protein.

- Sử dụng rộng rãi do

phản ứng nhanh và triệt

để.

- Dễ điều khiển và kiểm

soát.

- Sản phẩm ít tạp chất.

- Cần thiết bị chịu

acid hay kiềm.

-Tạo ra nhiều lysine

dạng D khi thủy

phân bằng kiềm.

- Dùng acid gây ô

nhiễm môi trường.

- Giá thành cao.

Phương

pháp hóa

học

Dùng hóa chất để

tổng hợp nên lysine.

- Phản ứng nhanh.

- Dễ thực hiện.

- Sản phẩm ít tạp chất.

- Cho ra raxemic

(hỗn hợpL-lysine

và D-lysine)_tốn

kém khi tách.

- Giá thành cao.

Phương

pháp

lên men

Nhờ khả năng tổng

hợp thừa của một số

vi sinh vật, nuôi cấy

thu nhận lysine.

- Thu lysine dạng L

- Nguyên liệu sản xuất

rẻ tiền, dễ kiếm.

- Năng suất cao do phản

ứng đặc hiệu.

- Không gây ô nhiễm

môi trường, có thể sử

dụng nguyên liệu phế

thải từ nhà máy.

- Giá thành thấp.

- Thời gian lên men

dài.

- Điều khiển phản

ứng khó, và phức

tạp do điều khiển tế

bào sống.

- Đòi hỏi phải có

kiến thức vi sinh.

- Sản phẩm có thể

bị lẫn tạp chất do tế

bào tiết ra.

- Sản phẩm ức chế

ngược lại tế bào

làm giảm hiệu suất

phản ứng.

Phương

pháp

- Kết hợp giữa con

đường hóa học và

- Rút ngắn được thời

gian lên men.

- Con đường hóa

học có thể gây ô


11

kết hợp hóa

học và sinh

học

sinh học.

- Con đường hóa học

thu nhận được hợp

chất dạng L-keto và

các tiền chất của

lysine, sau đó sử dụng

vi sinh vật để chuyển

hóa những chất này

thành lysine.

- Tạo ra các hợp chất

trung gian kích thích sự

sinh amino acid của tế

bào nhiều.

-Năng suất cao.

nhiễm môi trường.

- Tốn nhiều kinh

phí.

- Giá thành sản

phẩm cao.

1.3. Cơ chế sản xuất L-lysine từ tế bào vi sinh vật:

1.3.1. Sơ đồ chuyển hóa:

Điểm quan trọng trong cơ chế tổng hợp lysine của vi khuẩn là lysine được

tổng hợp cùng với methionine, threonine và đều xuất phát từ một chất chung đó là

Aspactat - β - semialdehyde. Quá trình tổng hợp xảy ra theo sơ đồ tổng quát sau:


12

Hình 1. 13 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa tứ glucose ra lysine và các amino acid khác [2]

Dựa vào sơ đồ trên, nhận xét tổng quát đầu tiên là muốn vi khuẩn tạo ra

nhiều lysine thì làm sao để sự chuyển hóa phải theo nhánh [3].


13

1.3.2. Thuyết minh các giai đoạn chuyển hóa:

Sự chuyển hóa từ glucose ra lysine với sự tham gia của các enzyme:

Hình 1. 14 Con đường tổng hợp lysine từ glucose [2].

Từ sơ đồ hình 1.14 ta thấy vai trò của Oxaloacetate như là một tiền chất cho

họ Aspartic acid. Do đó Oxaloacetate thì có tầm quan trọng thiết yếu cho việc sản

xuất lysine.


14

Vào những năm trước 1969, Ozaki và Shiio đã khảo sát các quy luật của

phosphoenolpyruvate carboxylase và pyruvate kinase trong Brevibacterium

lactofermentum để tìm hiểu điểm phân nhánh của quá trình chuyển hóa glucose.

Tăng cường các phosphoenolpyruvate carboxylase thì thấy có thể kích thích sự tạo

thành acid aspartic thu được nhiều acid amin trong Brevibacterium

lactofermentum. Sau đó, người ta có thể thấy trong Corynebacterium glutamicum,

phosphoenolpyruvate carboxylase thì không cần thiết cho tăng trưởng và việc sản

xuất lysine. Điều đó cho thấy rõ ràng là đã có phản ứng phục hồi khác phải chịu

trách nhiệm bổ sung các nguồn oxaloacetate. Nổi bật nhất là pyruvate carboxylase,

một enzyme xúc tác sự chuyển đổi pyruvate và CO2 tạo ra oxaloacetate dưới sự

thủy phân của ATP.

Hình 1. 15 Sự chuyển hóa tạo thành Oxaloacetate và Malate [34].

Khi oxaloacetate được sử dụng để làm tiền chất tổng hợp aspartate thì để

giúp cơ thể giữ được cân bằng của chu trình ATC, oxaloacetate đã được bù đắp

bằng một số phản ứng phục hồi (hình 1.15). Trong đó chủ yếu có sự tham gia của

các enzyme xúc tác phản ứng gắn CO2 sử dụng vitamin biotin làm coenzyme. Đó

là các phản ứng gắn CO2 lên pyruvate, phosphoenolpyruvate (PEP) tạo thành


15

oxaloacetate và malte được xúc tác bởi pyruvate carboxylase, PEP carboxylase,

PEP carboxykinase và enzyme malic. Trong đó pyruvate carboxylase là enzyme

điều hòa quan trọng nhất xúc tác phản ứng phục hồi pyruvate thành oxaloacetat ở

gan và thận của động vật có vú và bị ức chế mạnh khi không có acetyl-CoA, còn

khi xuất hiện trở lại, acetyl-CoA sẽ kích thích enzyme này xúc tác phản ứng tạo

oxaloacetate. Các phản ứng:

Pyruvate

carbonxylase

Pyruvate + HCO3- + ATP Oxaloacetate + ADP +Pi

Oxaloacetate

Decarboxylase

PEP carboxylase

Phosphoenolpyruvate + CO2 + GDP Oxaloacetate + GTP

PEP carboxykinase


16

Giai đọan tổng hợp lysine từ aspartate:

Hình 1. 16 Con đường tổng hợp lysine [34].

Trong cơ chế sinh tổng hợp lysine của vi khuẩn thì lysine được tổng hợp

cùng lúc với methionie, threonine, isoleunine và đều thuộc họ aspartate có chất


17

chung là Aspartate-β- semialdehyde. Điều khiển quá trình tổng hợp lysine ở tế bào

vi khuẩn ta có thể chia ra thành 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Giai đoạn tạo ra oxaloacetate (tiền chất để tổng hợp aspartate):

Để tổng hợp lysine thì phải cung cấp nguồn nguyên liệu giàu glucose ( hoặc các

nguyên liệu cung cấp nguồn cacbon khác nhưng hiệu suất chuyển hóa giảm). Từ

glucose, tế bào vi khuẩn thực hiện chuyển hóa theo con đường EMP ( chu trình

đường phân) tạo ra fructose 1,6-diphosphate và chất này sẽ tiếp tục chuyển hóa tạo

thành pyruvic (pyruvate). Một phần piruvate bị oxy hóa tạo ra Acetyl-CoA- tiền

chất của chu trình Krebs tạo ra năng lượng cho tế bào, một phần pyruvat chuyển

hóa tạo ra oxaloacetate-tiền chất của họ aspartate. Aspartate là cơ chất cung cấp

toàn bộ nguồn cacbon cho lysine. Do đó, để tổng hợp nhiều lysine thì nguồn

aspartat phải đủ và ổn định. Vì vậy, một trong những hướng để cải tạo giống sản

xuất nhiều lysine là ta có thể điều khiển quá trình tổng hợp oxaloacetate theo các

cơ chế như đã trình bày phía trên.

Giai đoạn 2: Quá trình sinh tổng hợp lysine từ aspartate: Từ aspartate qua

các phản ứng tạo ra Aspartate-β- semialdehyde, tại đây thì con đường chuyển hóa

chia làm 2 nhánh. Một nhánh đi theo con đường tổng hợp ra homoserin tạo ra các

amino acid khác như methionine, threonine, isoluenine, một nhánh tổng hợp ra

lysine. Quá trình này được thực hiện với sự tham gia của nhiều enzyme trong đó

enzyme xem như là enzyme chìa khóa quyết định hiệu suất thu nhận lysine là

aspatokinase, aspartate semildehydedehydrogenase và Dihydrodipicolinate

synthase. Do đó để sản xuất lysine ta có thể điều khiển ba enzyme này. Ngoài ra ở

hình 1.16, ta thấy để rút ngắn con đường chuyển hoá tạo sản phẩm lysine ta có thể

điều khiển enzyme diamino pimelatedehydrogenase để từ piperideine-2,6-

dicarboxylate tạo ra diaminopimelate. Bên cạnh đó ta có thể điều khiển hoạt động

của enzyme permease để kiểm soát lượng lysine tiết ra ngoài (Hình 1.16).


18

1.4. Điểu kiện tổng hợp dư L-lysine:

Sơ đồ điều hòa dị lập thể tổng hợp lysine:

Hình 1. 17 Sơ đồ diều hòa dị lập thể [5].


19

Giải thích sơ đồ:

Phổ biến nhất trong quá trình tổng hợp lysine (amino acid) là cơ chế điều hòa

ngược phản ứng đầu tiên của chuỗi phản ứng bởi sản phẩm cuối. Thông thường đây là

phản ứng một chiều và được xúc tác bởi enzyme điều hòa dị lập thể.

Phản ứng đầu tiên nhất được xúc tác bởi 3 enzyme đồng phân (A1, A2,A3)được

điều hòa độc lập nhau cho phép duy trì sự tổng hợp hài hòa của 4 amino acid.

Các hiệu ứng ức chế ngược được phối hợp bởi lysine và threonine có ảnh

hưởng trên enzyme đầu tiên là aspartokinase. Ngoài ra, enzyme đầu tiên của nhánh

threonine là homodehydrogenase bị ức chế bởi threonine và quá trình tổng hợp

threonine bị ức chế bởi methionine.

Muốn điều chỉnh sơ đồ trên nhằm mục đích chỉ sản xuất lysine và đạt hàm

lượng cao thì cải tạo giống để enzyme aspartokinase không bị mẫn cảm với hỗn hợp

sản phẩm trên và ức chế enzyme hemoserin dehydrogenase.

1.5. Tổng hợp lysine từ Corynebacterium glutamicum:

1.5.1. Đặc điểm hình thái của Corynebacterium glutamicum: Bảng 1. 2 Đặc điểm hình thái của C. glutamicum.

Đại thể

Kích thước 1-1.5 mm

Hình dạng Trơn bong, tròn, đầy

Màu sắc Màu vàng nhạt

Đặc điểm Hiếu khí

Vi thể

Kích thước 1 x 1.5 - 2µm

Hình dạng Hình que ngắn, có

nhánh.

Sắp xếp tế bào Chuỗi ngắn

Bào tử Không

Gram +

Khả năng di

động Không

Sinh lý, sinh

hóa

pH 7

Nhiệt độ 30


20

Catalase +

Glucose +

Gelatin +

Sản lượng

lysine 32g/ml

Ngoài ra, C. glutamicum có vách tế bào chứa arabino-galatan và acid

mycolic gồm 26-36 cacbon, có thể cô lập từ đất, thành phần GC là 54.1%, có quan

hệ rất gần với vi khuẩn có C. melassecola, Brevibacterium thiogenitalis, B.

lactofermentum và B . flavum, hai cơ thể sinh vật sau được chứng minh là những

giống của C. glutamicum.

Hình 1. 18 Corynebacterium glutamicum [39].

1.5.2. Bộ gen của Corynebacterium glutamicum:

1.5.2.1. Phân tích hệ thống gen Corynebacterium glutamicum-xác định tất cả

gen từ việc bổ sung đường để tiết lysine.[39]


21

Hơn 10 năm qua, nhờ kĩ thuật di truyền các nhà sinh học phân tử đã điểu

khiển được con đường quan trọng trong việc sản xuất L-lysine. Khi mô tả hệ

thống gen với mục đích là điều chỉnh quá trình trao đổi chất trong những giống

sản xuất C. glutamicum hướng tới hiệu quả chuyển đổi cao cơ chất glucose

thành sản phẩm cuối cùng L-lysine. Các phương pháp như đột biến gen nhảy,

chuyển DNA bằng kỹ thuật điện biến nạp chuyển những phần nhỏ của plasmid

hoặc đột biến gen gián đoạn và thay thế gene đã được thiết lập một cách thành

công cho Corynebacterium để tối ưu hóa giống nhờ thực hiện kỹ thuật di

truyền. Một loạt các gene C. glutamicum đã được tạo dòng nhờ sự bổ sung đầy

đủ của heterologous những thể đột biến E. coli hoặc bằng cách sử dụng kỹ thuật

PCR. Hơn nữa, các tác động của hầu hết các gene trong việc tổng hợp lysine

acid amin trên con đường sản xuất amino acid đã được thiết lập.

Tuy nhiên, mặc dù sự thành công về kĩ thuật trao đổi chất còn có một số

bí mật vẫn còn tồn tại trong các con đường chuyển hóa trung tâm của vi khuẩn

nhóm coryneform cái mà không chỉ quan trọng đối với khoa học thế giới mà

còn là sự quan tâm lớn đối với kĩ thuật sinh học công nghiệp. Chỉ có một ít kiến

thức về các quy luật của các mạng lưới tiêu thụ đường trong C.glutamicum và

về ảnh hưởng đến hiệu suất tăng trưởng. Các công cụ mạnh nhất để điền vào

các thông tin vào mảng kiến thức này là phân tích về toàn bộ trình tự hệ thống

gen.

Ngày nay, việc xác định toàn bộ hệ thống gen của một cơ thể được thực

hiện trong vòng một thời gian nhất định và ít tốn công sức. Toàn bộ hệ gen của

27 vi sinh vật đã được xác định trình tự và có thể truy cập dữ liệu trong cơ sở

dữ liệu công cộng, các chú thích của 17 hệ gen là tiến bộ và hơn 70 dự án xác

định trình tự gen sẽ được hoàn tất trong vòng năm đầu tiên của thiên niên kỷ

mới (www.tigr.org, www.ncbi.nlm.nih.gov, www.geta.life.uiuc.edu). Với sự

phát triển của những khả năng xác định trình tự đạt mức cao thì trình tự hệ gen

đã cung cấp thông tin về tất cả các gen xác định trong một cơ thể như

C.glutamicum.

Trong năm 1999, các công ty sản xuất các amino acid như công ty

BASF, Degussa và Kyowa Hakko đã hoàn tất việc xác định trình tự hệ gen

C.glutamicum. Về nguyên tắc, có hai cách khác nhau để bắt đầu một dự án xác


22

định trình tự, xác định trình tự hệ gen bằng súng bắn gen và việc xác định trình

tự đó dựa vào những thư viện về trật tự cosmid/bac.

Phương pháp súng bắn gen Shotgun: ở đây hệ gen được cắt một cách

ngẫu nhiên và trình tự DNA trong khoảng 1,5 kb thì được chèn vào những

plasmid có trình tự đã được xác định. Những đoạn chèn nhỏ này thường chỉ

chứa một phần của một gene do đó thì thích hợp với sự trao đổi chất của tế bào.

Sử dụng kỹ thuật này, một lượng DNA lớn hơn phải được xác định trình tự để

cung cấp đầy đủ các sự thừa thải (gấp khoảng 10) để tập hợp tính toán với

những trình tự lặp đi lặp lại. Trong thời gian gần đây, những bất lợi này được

đền bù bằng chi phí xác định trình tự thấp hơn và thông tin về sinh học rõ hơn.

Thư viện trật tự cosmid/BAC.

Các phương pháp tiếp cận khác được dựa trên các thư viện cosmid hoặc

BAC, được biểu diễn những phần che lấn lên nhau tối thiểu bằng kỹ thuật lai tại

chỗ. Bằng cách này sự thừa thải cần thiết thì được tối thiểu hoá.

1.5.2.2. Xác định trình tự hệ gen của C. glutamicum sản xuất amino acid:

Đối với việc giải mã gen C. glutamicum, Degussa AG áp dụng chiến

lược bằng cách sử dụng một bản đồ vật lý của hệ gen như một điểm bắt đầu.

Được biết, nhiều gene từ C. glutamicum được biểu hiện một cách hiệu quả

trong E. coli dẫn đến hiệu ứng độc hại làm cho nhân dòng của nhiều khu vực

của hệ gen trên vector có bản sao chép cao rất khó khăn hoặc không thể đạt

được.

Tương tự như những bài thí nghiệm được tiến hành để xác định trình tự

gen Bacillus subtilis. Bằng cách xác định trình tự gen Mycobacterium

tuberculosis, một số yếu tố DNA lặp đi lặp lại được xác định. Ngoài ra, khoảng

10% khả năng mã hóa của hệ gen được hiện diện bởi hai polymorphic khác

nhau lặp đi lặp lại những trình tự. Bởi vì Mycobacterium tuberculosis thì liên

quan đến Corynebacterium glutamicum nên những sự kiện tương tự đã được dự

kiến cho các dự án xác định trình tự này.

Vì vậy, các bản đồ vật lý được cung cấp một khuôn khổ quan trọng trong

suốt cả kế hoạch xác định trình tự gen. Chiến lược đã được chia thành 6 bước:


23

(i) Hệ gen C. glutamicum đã được cắt bằng cách sử dụng ba enzyme cắt

giới hạn hiếm thấy là SwaI, PacI và PmeI và với kĩ thuật PFGE, một bản đồ vật

lý của hệ gen đã được thành lập. Khoảng 40 gen được biết từ cơ sở dữ liệu phổ

biến trên bản đồ nhờ kĩ thuật lai tại chỗ.

(ii) Một thư viện cosmid của khoảng 2300 cosmid đã được thành lập.

(iii) Thư viện cosmid đã được xem xét và những dòng có phần lấn ác

nhỏ nhất được chọn lựa từ thư viện nhờ kĩ thuật lai tại chỗ bằng cách sử dụng

bản đồ vật lý như là một hướng dẫn trong suốt dự án.

(iv) Xác định trình tự của hệ gen 3.282 Kbp của C. glutamicum ATCC

13032 bằng một cosmid-của- chiến lược trình tự cosmid. Một thiết lập của 98

cosmid bao gồm khoảng 90% toàn bộ hệ gen được nhân dòng và xác định trình

tự.

(v) Tập hợp dữ liệu, xác định các khoảng trống còn lại.

(vi) Hoàn thành các khoảng trống còn lại trong trình tự 3,282 Kbp được

tiến hành bằng cách thiết lập một thư viện BAC và sau đó xác định trình tự

khoảng trống còn lại trên các mẫu BAC.

Hình 1. 19 Hệ gen của Corynebacterium glutamicum [39].


24

1.5.3. Lịch sử sử dụng Corynebacteria glutamicum:

Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum là đối tượng vi sinh vật có quy trình

trao đổi chất của tế bào được nghiên cứu hơn 40 năm qua. Sau khi khám phá ra

chúng như là một vi khuẩn bài tiết L-glutamate thì những giống đột biến hữu ích

cho sản xuất lên men L-glutamate trên một quy mô lớn đã được gây giống. Đột

biến gen và lên men quy mô nhỏ đã được thực hiện để lựa chọn trong số hàng trăm

giống tìm ra giống có khả năng sản xuất cao nhất. Giống sau này sau đó phải chịu

đột biến gen lần nữa để thích nghi quy mô lên men nhỏ để lựa chọn lại giống tốt

nhất. Các bước này được lặp đi lặp lại nhiều lần để tạo một dòng có thể sản xuất L-

glutamate tăng lên rỏ rệt. Rõ ràng, những giống có khả năng sản xuất cao được

thực hiện bằng những nguyên tắc này. Sự cô đặc thu được lượng L-lysine và L-

glutamate vượt quá 150g/l với sản lượng hơn 0.5g/g chất khô. Về cơ bản cùng một

nguyên tắc áp dụng để có được.

1.5.4. Sản xuất lysine theo quy mô công nghiệp:

Sản xuất trên quy mô lớn với C. glutamicum đã bắt đầu vào trước những

năm 1958 trong kế hoạch của Kyowa Hakko ở Nhật. Những công ty khác tham gia

vào việc kinh doanh và sau đó suốt 4 thập kỉ sản xuất với C. glutamicum, quy trình

sản xuất lysine bằng kỹ thuật sinh học đã được cải thiện liên tục bằng các kỹ thuật

cải tiến giống. Những tối ưu này làm cho lượng lớn lysine đủ để đáp ứng nhu cầu

ngày nay.

Bảng 1. 3 Thống kê lượng amino acid được sản xuất hiện nay.

Quy mô sản xuất

(tấn/năm)

Amino acid Phương pháp sản

xuất ưa chuộng

Mục đích sử dụng

1200000 L-Glutamate Lên men Tăng mùi vị

600000 L-lysine Lên men Bổ sung thức ăn

550000 D,L-Methionine Tổng hợp hóa học Bổ sung thức ăn

40000 40000 L-Threonine Lên men Bổ sung thức ăn

16000 Glycine Tổng hợp hóa học Bổ sung thực phẩm,

chất tạo vị ngọt

14000 L-Aspartate Enzyme xúc tác Tạo vị ngọt, polymer


25

13000 L-Phenylalanine Lên men Tạo vị ngọt

4500 L-Cysteine Giảm lên men

cystine

Bổ sung thực phẩm,

dược phẩm.

3500 L-Cystine Lên men, tách chiết Cysteine,dược phẩm

2000 t-Arginine Lên men, tách chiết Dược phẩm, chất tạo

vị ngọt.

15000 L-Alanine Lên men, tách chiết Chất tạo vị ngọt

1200 L-Tryptophan Lên men Thức ăn, dược phẩm

1200 L-Leucine Lên men, tách chiết Dược phẩm

1000 L-Valine Lên men, tách chiết Dược phẩm

500 Lên men, tách chiết Dược phẩm

Dựa vào bảng 1.3 ta thấy lượng L-lysine được sản xuất hàng năm cũng rất

lớn chỉ đứng sau L-Glutamate. Chi phí sẽ quyết định vị trí của những nhà máy sản

xuất. Những yếu tố chính bao trùm là giá của nguồn carbon và thi trường địa

phương. Những nhà máy sản xuất L-glutamate với lượng lớn có mặt trên khắp thế

giới, nhiều nhất ở Viễn Đông, như Thái Lan và Indonesia nhưng trường hợp của L-

lysine thì lại khác. Chỉ có khoảng 1/3 thị trường trên thế giới ở vùng Bắc Mỹ có

điều kiện thuận lợi, chẳng hạn như nguyên vật liệu cung cấp cho quá trình lên men.

Trong hầu hết các trường hợp, những công ty sản xuất L-lysine đều có mối liên hệ

với công nghiệp xay ngô, có sự nối kết các dự án cũng như có mối liên hệ với các

nhà cung cấp đường rẻ. Điều này minh họa cho một chi tiết, đó là việc sản xuất

amino acid thương mại đang được phát triển mạnh mẽ, thay đổi nhiều lĩnh vực và

tác động toàn cầu.

1.6. Cải tạo giống Corynebacterium glutamicum:

1.6.1. Khái niệm:

Cải tạo giống là quá trình làm đổi mới một phần bộ máy di truyền của tế bào

nhằm đáp ứng nhu cầu, mục đích sử dụng của con người.

Có nhiều phương pháp cải tạo giống cho động vật, thực vật và vi sinh

vât.Mỗi phương pháp có nhiều ưu điểm và nhược điểm đặc trưng, tùy theo mỗi

hòan cảnh và mỗi đối tượng mà ta chọn lựa phương pháp thích hợp.


26

1.6.2. Một số phương pháp dùng để cải tạo giống Corynebacterium glutamicum:

1.6.2.1 Huấn luyện thích nghi: [2]

Nguyên tắc của phương pháp:

Khả năng thích nghi với điển kiện sống của vi sinh vật rất cao do cơ thể

chúng là cơ thể đơn bào. Mọi tác động của môi trường đều có thể là những tác

động trực tiếp. Mặt khác, cơ thể vi sinh vật thực hiện những quá trình trao đổi

chất, sinh sản, phát triển rất nhanh trong một chu kỳ sống rất ngắn. Do đó giai

đoạn thích nghi phải được xảy ra nhanh và mạnh trong một giai đọan phải rất

ngắn so với chu kỳ phát triển và chu kỳ sống của chúng.

Khi đã tạo được khả năng thích nghi của giống vi sinh vật đối với một

tác động môi trường nào đó phải luôn luôn duy trì tác động đó ở mức độ tạo ra

tính thích nghi.

Thực chất của tính thích nghi là thường biến nên không di truyền, do đó

đặc điểm này không bền, dễ bị mất đi khi ngưng tác động hoặc làm thay đổi

mức độ tác động.

1.6.2.2. Kỹ thuật di truyền:[1], [4], [9]

a. Kỹ thuật di truyền cổ điển:

Phương pháp lai: là tiến hành cho lai giữa hai tế bào có đặc điểm di

truyền tốt khác nhau để tạo ra dòng chứa đặc điểm di truyền tốt của cả 2 tế

bào ban đầu. Phương pháp này không phức tạp nhưng có sự giới hạn về sự

pha trộn đặc tính di truyền chỉ trong một vài loài.

Phương pháp gây đột biến nhân tạo nhờ tác nhân hóa học (acid nitric

– HNO2), Bromode xiuridine, 5-bromuraxil, EMS, MMS, EI, NG…) hoặc

tác nhân vật lý (tia tử ngoại): là phương pháp gây đột biến điểm, đột biến

này nằm trong cấu trúc của các nucleotide ( trong cấu trúc của các base chứa

nitơ).

Ưu điểm: Dễ thực hiện, tạo ra được giống vi sinh vật có rất nhiều đặc

tính quý.

Nhược điểm: Tần số xảy ra đột biến thấp, không định hướng, không

ổn định.


27

Do những nhược điểm trên mà kĩ thuât di truyền cổ điển ít được sử

dụng để cải tạo Corynebacterium glutamicum mà thường áp dụng các kĩ

thụật hiện đại.

b. Kỹ thuật di truyền hiện đại:

Kỹ thuật sử dụng polyethylenglycol (PEG): Các protoplast sẽ được

biến nạp trong điều kiện có PEG và ion Ca2+. Tần số biến nạp khỏang 105-

106 thể biến nạp/mg DNA. Để đạt được hiệu suất biến nạp cao, trước khi

biến nạp DNA cần phải được methyl hóa để tránh việc giới hạn của vật chủ.

PEG không chỉ hữu dụng trong biến nạp mà còn hữu dụng trong quá trình

dung hợp protolast của các chủng Corynebacterium sinh tổng hợp lysine.

Kỹ thuật sử dụng calcium phosphate (calcium phosphate technique)

đã được phát triển đầu tiên là để xác định sự lây nhiễm của DNA virus

(Graham,1973) và hiện nay được sử dụng rộng rãi để thử nghiệm hoạt động

biến nạp của DNA virus cũng như DNA tách chiết từ các tế bào eukaryote

(Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980). Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế

bào nhận với các chất đồng kết tủa DNA và calcium phosphate. Kết tủa này

bám vào tế bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩm bào

(Loyter, 1982). Trong tế bào, các phân tử DNA ngoại lai nằm trong không

bào được tạo thành do tế bào và lysosome thứ hai nhưng rất ít DNA đi đến

nhân và hợp nhất vào genome chủ. Cho đến nay, đây là kỹ thuật vô cùng có

giá trị đối với các nghiên cứu chuyển gen vào các tế bào soma nuôi cấy và

đang được sử dụng nhiều để chuyển các dòng genome vào tế bào đích. Tỷ lệ

các tế bào được biến nạp ổn định của kỹ thuật này là tương đương với

phương pháp vi tiêm nhưng khác với vi tiêm là nhiều tế bào được biến nạp

cùng một lần. Hơn nữa, biến nạp DNA tách chiết từ các tế bào ung thư vào

các tế bào nhận không ung thư đã cho thấy đây là phương pháp duy nhất để

nghiên cứu sự kiểm soát di truyền của ung thư. Phương pháp này được sử

dụng phổ biến bởi vì đơn giản, protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào

chết sau biến nạp không đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc

ổn định và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp. Tuy nhiên

hiệu quả biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp dựa vào sự hình


28

thành một phức hợp DNA-calcium dễ được tế bào thu nhận qua cơ chế thực

bào.[1]

Kỹ thuật điện biến nạp: dung dòng điện có điện áp cao có khả năng

tạo lỗ thủng trên màng tế bào khiến DNA từ môi trường dễ xâm nhập vào

bên trong. Lực điện trường là 12,5kV/cm. Phương pháp này ít tốn thời gian,

dễ thực hiện và rất phổ biến. hiệu quả 4.107 thể biến nạp.

Phương pháp tiếp hợp hay dùng plasmid chuyển gen từ vi khuẩn

gram âm (E. coli) vào vi khuẩn gram dương (Corynebacteria). Quá trình

tiếp hợp này được thực hiện bằng cách sử dụng màng lọc nitrocellulose,

màng lọc này dùng làm giá thể cho vi khuẩn. Ta có thể xử lý nhiệt cho

chủng Corynebacteria glutamicum ở 48-49°C trong 9 phút để tăng tính hữu

thụ.

1.6.3 Các plasmid nội sinh của Corynebacteria glutamicum sử dụng trong việc

thiết kế vector: Bảng 1. 4 Các plasmid nội sinh của Corynebacterium được sử dụng trong

việc thiết kế vector [4].

Tên plasmid Nguồn gốc Kích

thước

(kb)

Marker Tài liệu tham khảo

pTP10 C. xerosis 50 Tc,Cm,Em,Km Kono ET AL.,1983

pHM1519 C. glutamicum 3.055 cryptic MIWA etal.,1984

pCC1 C. callunae 4.2 cryptic

SANDOVAL et al.,

1984

pCG2 C. glutamicum 6.8 cryptic OZAKI et al., 1984

pCG4 C. glutamicum 26 Spc, Str

Katsumata ET

AL.,1984

pXZ10145 C. glutamicum 5.3 Cm ZHEN et al., 1987

PẢG C. melassecola 4.5 cryptic TAKEDA et al.,1990

pAG1 C. melassecola 20.4 Tc Takeda ET AL.,1990

pCL1 C. lilium 4.1 cryptic CHAN KWO


29

CHION et al.,1991

pGÁ C. glutamicum 4.9 cryptic SONNEN et al.,1991

Dung hợp các loại phasmid trên với các vector, các vector thường được sử

dụng là vector tạo dòng của E.coli, tạo ra hệ thống vector trên khuôn là plasmid

cho Corynebacterium.

Các loại plasmid nhỏ tiềm ẩn số lượng bản sao lớn. Một vài plasmid lớn hơn

có mang gen kháng kháng sinh đã được phân lập.

Trong các plasmid ở bảng trên, loại pBL1 và pHM1519 là được sử dụng

nhiều nhất. Cả hai đơn vị sao chép được sử dụng để thiết kế các vector có đồng

thời hai chức năng mà có thể sao chép ở E.coli và Corynebacteria, cũng như là các

vector chỉ có một chức năng duy nhất. Các vector plasmid dựa trên cơ sở của các

đơn vị sao chép này có khỏang từ 5-30 bản sao/1 tế bào vi khuẩn Corynebacterium.

Hình 1. 20 Bản đồ cắt giới hạn của các plasmid pHM1519 và pBL1 của Corynebacterium

glutamicum [4]

Nhìn vào bản đố cắt giới hạn trên, ta thấy các vị trí cắt của enzyme cắt giới

hạn trong khung đọc – mở lớn được suy ra từ các trình tự nucleotide. Đơn vị sao

chép nhỏ (biều thị bằng đường gạch xiên) và vùng ori V (màu đen) được xác định

trong pHM1519.


30

Chú ý các plasmid pHM1519, pBL1, pCG1, pGA1 có thể tồn tại trong cùng

một tế bào.

1.6.4. Việc biểu hiện gen ở Corynebacterium glutamicum:

Việc biểu hiện của các gen tương đồng và dị tương đồng ở Corynebacterium

đòi hỏi những hiểu biết chi tiết về cấu trúc và chức năng của các tín hiệu phiên mã

và dịch mã. Các tín hiệu khởi đầu dịch mã từ các vi khuẩn khác bao gồm E.coli

hòan tòan có chức năng trong Corynebacterium. Khía cạnh tín hiệu phiên mã thì

phức tạp hơn. Bằng cách sử dụng các vector dò tìm vùng promoter đã kiểm tra các

promoter hiệu quả cao của E.coli như Ptrp, PlacUV5, Ptac, lPRPL ở

Corynebacterium. Hiệu quả của những promoter này cũng như là tính chất điều

hòa của chúng được xác định bởi các gen ức chế tương ứng Trp, LacI, CI. Điều này

giới hạn việc thiết kế các vector biểu hiện cao bằng cách sử dụng hệ thống

lacI/Plac. Để kết thúc phiên mã sử dụng một nhân tố kết thúc phiên mã nội sinh

của B. lactofermentum.

1.6.5. Phương pháp cải tạo giống Corynebacterium glutamicum để thu dư lysine

từ aspertate:

1.6.5.1. Các hướng truyền thống:

Sau khi khám phá những khả năng của Corynebacterium glutamicum để

bài tiết acid amin, sản xuất quy mô lớn lysine đã được bắt đầu bằng cách sử

dụng thể đột biến khuyết dưỡng amin acid. Những thể đột biến sớm này đã hiển

thị một khả năng sản xuất lysine vượt trội. Trong vòng 70 giờ, một trong những

giống thế hệ đầu tiên là giống ATCC 13287 khuyết dưỡng homoserine được

công khai vào năm 1961 là 2979439 US, thu sản lượng là 44g/l với sự chuyển

đổi sản lượng xấp xỉ 26% g lysine HCl/(g đường). Ngoài ra sự phát triển giống

đã được thực hiện bằng cách giới thiệu thêm những khuyết dưỡng amino acid

bổ sung vào, khuyết dưỡng vitamin và chống lại sự ức chế trao đổi chất. Những

giống này sản xuất lysine tăng đến một sản lượng chuyển đổi hơn 50% dựa trên

lượng đường.

Vào trước những năm 1970, đã có những nỗ lực để vượt qua những bất

lợi của các giống khuyết dưỡng vì dịch lên men cần phải được bổ sung các nhân


31

tố tăng trưởng xác định và dáng kể. Việc tìm kiếm những giống có những đòi

hỏi thấp cho nhu cầu về phức chất dẫn đến như vậy gọi là leaky strains: con

đường tổng hợp sinh học có nhiều thất thoát vẫn còn chức năng nhưng chỉ có

thể cung cấp rất hạn chế số lượng theo nhu cầu trao đổi chất. Vì thế, việc trao

đổi chất này sẽ trở nên hạn chế tốc độ tăng trưởng mà không cần hiển thị các

mô hình trao đổi chất điển hình nghèo nàng. Hậu quả là dịch nội bào sẽ rất ít do

đó tránh được sự ức chế ngược và sự ức chế của một enzyme quan trọng trong

con đường sản xuất mong muốn. Ví dụ là những giống làm giảm hoạt động

tổng hợp citrate hoặc giảm homoserine dehydrogenase. Sugimoto và cộng sự

cho thấy sự đột biến leaky có thể được gây ra bởi một cơ sở dẫn đến những thay

đổi có liên quan thay thế acid amin trong hoạt động xúc tác của các enzyme.

1.6.5.2. Kỹ thuật gen đối với các enzyme chìa khóa là Aspartase kinase và

Dihydrodipicolinate Synthase:

Con đường tổng hợp sinh hợp lysine từ oxaloacetate và pyruvate trong

C. glutamicum xảy ra thông qua một con đường phân chia. Nhưng một con

đường phân chia thì không đặc trưng cho một con đường tổng hợp sinh học.

Điều đó đã được chứng tỏ rằng, thêm vào sự hình thành L - lysine thì cơ chế

con đường tổng hợp này bảo đảm sự cung cấp đáng tin cậy của tế bào với chất

trung gian D, L-diaminopimelate- một đơn vị liên kết quan trọng trong lớp

peptidoglycan. Một trong những bước kiểm soát dòng chuyển hóa thông qua

con đường tổng hợp là ở cấp độ của enzyeme aspartate kinase,nó được xem

như là enzyme điển hình ở đầu con đường tổng hợp, enzyme kinase được kiểm

soát trong hoạt động xúc tác. Hoạt động enzyme bị ức chế khi L-Lysine cộng L-

threonine cùng có mặt vượt quá giới hạn cho phép của tế bào. Do đó, tầm quan

trọng của điều này trong việc kiểm soát dòng chuyển hóa tại một trong những

dòng của đối tượng sản xuất là việc kiểm soát phản ứng ngược thì được lấy ra

nhờ những thể đột biến trong tiểu đơn vị β của enzyme kinase. Ngoài ra, một

giống với hai bản sao của gen kinase đã được thực hiện và cho kết quả hiển thị

tăng việc tích lũy L-lysine.


32

Hình 1. 21 Con đường tổng hợp phân nhánh của L-lysine trong giống Corynebacteria

glutamicum hoang dại. [10].

Enzyme aspartate kinase xúc tác phản ứng đầu tiên trong quá trình tổng

hợp L-lysine. Enzyme này được chứng tỏ như là một enzyme chìa khóa trong

tổng hợp sinh học L-lysine.

Đối với Escherichia coli, ba enzyme đồng phân với các hoạt động và

biểu hiện được kiểm soát bởi các cơ chế khác nhau. Ngược lại với E. coli, chỉ

có một aspartate kinase đã được phát hiện trong C. glutamicum. Trong thời gian

đầu của việc sản xuất lysine từ C. glutamicum, người ta thấy rằng enzyme

aspartate kinase trong C. glutamicum bị ức chế bởi hai sản phẩm cuối của quá

trình tổng hợp, đó là L-lysine và L-threonine và việc kiểm soát chính cho dòng

carbon được điều hòa bằng phản ứng ức chế ngược.


33

Trong quá trình kiểm tra để có được giống kháng ức chế ngược, những

thể đột biến kháng hỗn hợp L-lysine tương tự AEC (amino-ethyl-cysteine) và

L-threonine được cô lập. Sự giảm tính nhạy cảm của aspartate kinase đối với

phản ứng ức chế ngược là bước quan trọng nhất trong sự phát triển của giống để

sản xuất L-lysine.

Năm 1990, gen tương ứng của một thể đột biến kháng AEC, aspartate

kinase kháng ức chế ngược của giống DM 58-1 với hoạt động của enzyme

LysC hoàn toàn không nhạy cảm với sự ức chế ngược đã được cô lập. Sự đột

biến hướng đến kháng AEC của gen lysC đã được thiết lập. Các nghiên cứu cho

thấy locus lysC mã hóa aspartate kinase là gồm hai gene chồng chéo lên nhau,

lysCa và lysCb với lysCβ chịu trách nhiệm cho việc kháng ức chế ngược của

enzyme. Ngoài ra các enzyme có một cấu trúc thú vị được hiển thị trong hình

1.22.

Hình 1. 22 Cấu trúc của Aspartate kinase [34].

Hai tiểu đơn vị α và hai tiểu đơn vị β của vị trí amino acid 421 và 171

tương ứng với nhau, dưới hình thức enzyme hoạt động với trình tự của các tiểu

đơn vị β được đồng nhất với phần carboxy cuối cùng của tiểu đơn vị α.

Xác định trình tự của một số gene lysC từ những giống mang aspartate kinase

bị ức chế ngược cung cấp thêm bằng chứng rằng lysC β mã hóa tính năng quy

định của các enzyme.


34

Được biết là protein LysC không nhạy cảm khi C. glutamicum tiết ra một

ít L-lysine.

Tạo dòng một gen lysC (fbr) trên plasmid có khả năng sao chép cao

trong loại giống C. glutamicum hoang dã ATCC 13032 kết quả tích lũy khoảng

38 mM L-lysine so với không có sự tiết lysine của giống gốc.

Trong một nghiên cứu gần đây sử dụng đột biến điểm, một thể đột biến

gen lysC đã được xây dựng. Trong những thể đột biến gene này, thay thế

nucleotide của codon 279 (threonine) của tiểu đơn vị α (tương ứng với vị trí

acid amin 30 của tiểu đơn vị β) tiết lộ chín thể đột biến với sự đột biến các acid

amin khác nhau tại điểm đột biến. Đối với thể đột biến vị trí proline giới thiệu

tại vị trí 279, sự giảm nhiều nhất về khả năng nhạy cảm với ức chế L-lysine đã

được quan sát. Sự đột biến này là rất có thể có hiệu quả mạnh nhất đến cấu trúc

của các enzyme của tất cả vị trí các acid amin được chọn trong bài nghiên cứu

này. Từ đó, trong vị trí proline, những phản ứng dây chuyền được cố định theo

thứ tự của chuỗi protein, có ít sự thích nghi tự do trong sườn của chuỗi protein.

Jetten và cộng sự phân tích ảnh hưởng của các bản sao của một gen

aspartate kinase không bị ức chế ngược trong việc sản xuất L-lysine và sự tăng

trưởng trong Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799. Giống B.

lactofermentum ATCC21799 đã được lựa chọn bởi vì khả năng kháng AEC cao

của chúng và khả năng sản xuất lysine cao kết quả này có được nhờ một

enzyme không bị ức chế ngược aspartate kinase. Trong nghiên cứu này, giống

gốc đã được so sánh với một giống mang thể đột biến gen lysC có khả năng sao

chép 2 lần cho thấy tốc độ tăng trưởng của hai giống thì không khác nhau nhiều

nhưng giống với khả năng sao chép 2 lần bản sao lysC sản xuất L-lysine nhiều

hơn một cách đáng kể. Với gen lysC(fbr) trên plasmid có số lượng bản sao chép

cao thì giống tạo ra không tăng trưởng tốt như giống gốc nhưng sản xuất lysine

với lượng lớn hơn. Tuy nhiên, tốc độ sản xuất lysine chậm hơn. Những kết quả

này cho thấy trong một vài trường hợp enzyme aspartate kinase không bị ức chế

ngược thì không đủ để vượt qua những bước giới hạn đầu tiên trong sản xuất L-

lysine nhưng hoạt động enzyme tối ưu phải được điều chỉnh để tối đa hóa tốc

độ sản xuất.


35

Bước thứ ba trong con đường tổng hợp sinh học L-lysine bắt đầu từ

aspartate là sự kết hợp của L-aspartate semialdehyde với pyruvate để tạo ra l-

2,3-dihydrodipicolinate. Đây là phản ứng được xúc tác bởi enzyme

dihydrodipicolinate synthase. Các enzyme synthase được đặt tại các điểm phân

nhánh để chi phối quá trình trao đổi chất hoặc là lysine hoặc là threonine và

cạnh tranh với enzyme homoserine dehydrogenase vì chúng cùng có cơ chất

chung là L-aspartate semialdehyde.

Tạo dòng và tăng biểu hiện của gen dapA mã hóa enzyme

dihydrodipicolinate synthase cho thấy enzyme DapA có thể cung cấp một mục

tiêu mạnh mẽ trong sự phát triển của đối tượng sản xuất L-lysine. Việc biểu

hiện chỉ của gen dapA trong giống hoang dại ATCC 13032 có kết quả trong

việc sản xuất vào khoảng 11 mM L-lysine. Đây là một kết quả tương tự như

việc nâng cao biểu hiện enzyme aspartate kinase.

Để phân tích chức năng của enzyme DapA trong con đường chuyển hóa

tạo ra L-lysine, một vài giống đã được xây dựng với các cấp độ khác nhau của

việc tăng biểu hiện gen dapA. Người ta thấy rằng mức độ biểu hiện của gen

dapA có liên quan đến một dòng chuyển hóa giảm theo hướng homoserine

dehydrogenase. Các giống với bản sao chép thứ hai của gen dapA đưa vào hệ

gen, gen dapA được tạo dòng trên plasmid có số lượng bản sao thấp và trên

plasmid có số lượng bản sao cao đã được thiết lập. Số lượng bản sao gia tăng

của gene dapA dẫn đến tăng hoạt động của enzyme DapA và kết quả là gia tăng

việc hình thành L-lysine. Tuy nhiên, thật thú vị là tốc độ tăng trưởng của giống

tạo ra thì bị giảm so với sự gia tăng hoạt động của enzyme DapA. Điều này

tương tự như kết quả của việc tăng biểu hiện gen lysC trong B. lactofermentum

theo quan sát của Jetten và cộng sự. Một phản ứng chung của quá trình trao đổi

chất đối với hoạt động của enzyme DapA đã trở nên rõ ràng.


36

Bảng 1. 5 Ảnh hưởng của số lượng bản sao dapA khác nhau trên tốc độ tăng trưởng, sự bài

tiết L-lysine [34].

Giống Số bản sao

dapA

Hoạt động

tổng hợp

Tốc độ tăng

trưởng (h-1)

L-lysine

nội bào

(mM)

Tốc độ

bài tiết

13032 1 0.051 0.43 3 0.0

13032::dapA 2 0.072 0.37 6 0.25

13032/pKW3::dap 6 0.250 0.36 8 0.70

13032/pJC23 20 0.630 0.22 9 3.80

Với: Hoạt động của enzyme dihydrodipicolinate synthase (mmol.min-1.mg-

1protein) và tốc độ bài tiết (mmol.min-1(mg trọng lượng khô)-1).

Hình 1. 23 Trình tự DNA của vùng promoter dapA [34].

Bên cạnh việc tăng số bản sao của một gene có một số cách để điều

khiển trong biểu hiện gene ở prokaryotes. Một trong những cách này là để sửa

đổi các tín hiệu bắt đầu phiên mã. Tuy nhiên, sự hiểu biết sẵn có về cấu trúc

promoter trong C. glutamicum và cách thức làm thế nào để tối ưu hóa dấu hiệu

phiên mã để gia tăng biểu hiện gen vẫn còn hạn chế. Nghiên cứu về cấu trúc

pronoter và chức năng trong C. glutamicum cho thấy hoạt động của promoter

gen dapA là cao so với các promoter khác của vi khuẩn.

Trong so sánh với E. coli hoặc B. subtilis, có sự bảo tồn thấp của vùng -

10 trong những promoter C. glutamicum và trong một số trường hợp, khu vực -

35 bị thiếu.

Một sự phân tích về đột biến của promoter gen dapA đã được thực hiện

nhằm xác định các khu vực đặc biệt và các nucleotide quan trọng đối với chức

năng của gen đó. Đã phát hiện một khoảng rộng Ts sáu ở vị trí -55 đến -50 và


37

một khu vực đã được mở rộng -10 là những yếu tố quan trọng nhất trong chức

năng promoter. Đối với promoter gen dapA việc mở rộng khu vực -10 đã được

xác định (AGGTAACCTTG) khu vực-35 không có. Vị trí khu vực này thì

tương tự như E. coli sigma promoter phụ thuộc -70 với một mở rộng khu vực -

10. Vasicova và cộng sự đã chứng minh rằng hoạt động promoter dapA có thể

được tăng lên 3,9 lần sự thay thế một nucleotide trong việc mở rộng vùng-10

(Hình 1.23).

Các nghiên cứu với những thể đột biến C. glutamicum MH20-22B mang

một bản sao thứ hai của gene dapA với promoter loại hoang dại hoặc sự đột

biến MA16 hoặc MC20 đã được thực hiện (Bảng 1.4). Theo dự kiến, hoạt động

của enzyme DapA của những giống đã được tăng cường đáng kể so với giống

gốc H20-22B dẫn đến kết quả là tăng cường việc sản xuất L-lysine .

Kết luận:

Công nghệ gen trong sản xuất L-lysine ở Corynebacterium glutamicum là

ngăn chặn hiệu ứng ức chế ngược cho aspartokinase, sau đó các mức độ enzyme

riêng lẻ có thể được gia tăng bằng các khuếch đại siêu biểu hiện các gen quan trọng

trong con đường sinh tổng hợp. Có hai phương pháp khác nhau để ngăn cản sự ức

chế ngược đối với aspartokinase.

Một là chọn lọc các thể biến dưỡng homoserine để không tạo ra nhiều

thremosine.

Hai là liên quan tới việc sử dụng các đồng đẳng acid amin để chợn lọc các

chủng đột biến có aspartokinase không nhạy cảm với tác nhân ức chế ngược. Đồng

đẳng của lysine được sử dụng rộng rãi là S-(-2-aminoethyl-)-L-cystine (AEC)-

phương pháp tạo dòng các gen kháng AEC.

Ngoài ra, người ta còn tạo dòng và tăng cường biểu hiện enzyme

dihydrodipicolinate synthase nhằm tăng khả năng sản xuất lysine và kiểm soát việc

sản xuất L-lysine ở mức độ xuất lysine ra ngoài (Hình 1.23).

1.7. Cố định tế bào vi sinh vật:

1.7.1. Định nghĩa cố định tế bào:

Theo định nghĩa của hội Công nghệ enzyme, cố định tế bào có nghĩa là các

tế bào về mặt vật lý được giữ lại hay định vị trong một khu vực không gian nhất


38

định sao cho các tế bào đó giữ được tính chất xúc tác sinh học của chúng và có thể

sử dụng lại nhiều lần.

Ngoài ra, cố định tế bào còn được định nghĩa đơn giản hơn, đó là việc gắn

các tế bào vào chất mang không hòa tan trong nước. Tế bào sau khi được cố định

có thể sử dụng được nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng

phản ứng theo ý muốn [7].

1.7.2. Phương pháp cố định tế bào:

Có nhiều cách để phân loại các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật. Tuy

nhiên các phương pháp cố định vi sinh vật có thể tóm tắt như sơ đồ sau đây .

Hình 1. 24 Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào [15].

1.7.3. Chất mang cố định tế bào vi sinh vật:

1.7.3.1. Chất mang vô cơ:

Thông dụng là vật liệu thủy tinh xốp, vật liệu oxit kim loại (nhôm

oxit, mangan oxit, magie oxit, titan oxit), diatomite (celit) và gốm.

Đặc điểm: cấu trúc lỗ xốp, kích thước các lỗ này có thể điều chỉnh được. Có

khả năng hấp thụ tốt các enzyme và tế bào.

1.7.3.2. Chất mang hữu cơ:

Polymer tổng hợp: gồm một số polymer như polystyren,

polyvinylalcol, polyacrylamid, polyvinylacetate, polyacrylic... dùng cố định

enzyme và tế bào bằng phương pháp nhốt trong lòng chất mang.

Cố định tế bào vi sinh vật

Trên bề mặt chất

Trong lòng chất mang

Không mang chất

mang

Liên kết

Hấp phụ

Nhốt trong cấu

trúc hệ sợi

Nhốt

trong cấu

trúc gel

Liên

kết

chéo

Màng

Membrance


39

Polymer sinh học: chất mang protein: gellatin, keratin, albumin. Cố

định tế bào bằng phương pháp nhốt trong cấu trúc gel.

Chất mang polysaccharid: cellulose, agarose, sephadex, và dẫn xuất.

Ngoài ra, còn có nhiều vật liệu khác như tinh bột, chitin, chitosan, alginate,

carrageenan.

1.7.4. Chỉ tiêu đánh giá hiệu quả cố định tế bào:

Khả năng sống của tế bào trong chất mang: lượng tế bào còn sống sót

và hoạt động sau một thời gian nhất định; khả năng chuyển hóa cơ chất và

thành phần dinh dưỡng đi vào; sản phẩm trao đổi chất đi ra. Độ bền cơ học của

chất mang: sức chịu đựng của chất mang ở pH, nhiệt độ, lực tác động của môi

trường và của lực khuấy, lực thổi của không khí đưa vào môi trường nuôi cấy

vi sinh vật. Khả năng bảo vệ vi sinh vật trong chất mang, tính đến yếu tố bất lợi

với điều kiện ngoại cảnh. Khả năng tái sử dụng nhiều lần, quá trình sản xuất liên

tục vi sinh vật không bị rửa trôi [3].

1.8. Công nghệ lên men L-lysine:

1.8.1. Các vi khuẩn lên men L-lysine:

Có nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp L-lysine. Tuy nhiên,với qui mô

sản xuất công nghiệp, các chủng đột biến được sử dụng phổ biến hơn vì chúng có

hoạt lực cao hơn so với chủng gốc ban đầu. Đặc điểm của các chủng này là chúng

cần lượng biotin cao hơn chủng gốc và chịu được nồng độ đường cao hơn 20%,

đặc biệt là cần một số acid amin cho tăng trưởng và sinh tổng hợp L-lysine. Một số

chủng được dùng để sản xuất L-lysine như: Corynebacterium glutamicum,

Brevibacterium flavum, Micrococcus glutamicum, Brevibacterium lactofermentum.

Trong đó, Corynebacterium glutamicum là chủng có ưu thế trong công

nghiệp hơn do điều kiện nuôi cấy phù hợp với quy mô lớn, L-lysine là sản phẩm

được Corynebacterium glutamicum tổng hợp và bài tiết ra ngoài, khả năng tổng

hợp lysine với mức độ cao, sống được trên môi trường có hàm lượng methionine

cao và threonine thấp. Chúng không có enzyme L-homoleucine dehydrogenase

nhưng chúng có giai đoạn cân bằng sinh khối và thời gian thu nhận sản phẩm

bậc hai dài. Đã thiết kế được các chủng Corynebacterium glutamicum đột biến để


40

sử dụng như các chủng siêu tổng hợp lysine (điều hòa được con đường sinh tổng

hợp lysine) [6].

1.8.2. Môi trường lên men:

Thành phần môi trường lên men là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới

quá trình lên men, thường là đối tượng cho những nghiên cứu tối ưu hóa và phát

triển công nghệ. Môi trường lên men phải thích hợp cho sự phát triển và sản xuất

của vi sinh vật. Môi trường được sử dụng lên men thu nhận L-lysine bao gồm: môi

trường xác định cần cho sự phát triển của vi sinh vật đòi hỏi những chất dinh

dưỡng và các chất bổ sung cần thiết hoặc môi trường chọn lọc không xác định

chứa chất hữu cơ tự nhiên như dịch thủy phân đậu nành, nước chiết ngô, cao

nấm men hoặc peptone.

Môi trường lên men phổ biến trong sản xuất L-lysine chứa nguồn carbon

và nitơ phong phú, những ion vô cơ và những nguyên tố vi lượng (Fe2+, Mn2+ ),

các aminoacid, vitamin (biotin, thiamine-HCl, Nicothin amide) và nhiều hợp chất

hữu cơ phức tạp. Sự tổng hợp thừa của gen chỉ đạt được khi tối ưu hóa các yếu

tố môi trường và kỹ thuật lên men dựa vào những thông số và bản chất gen

[30].

1.8.2.1. Nguồn Carbon:

Thể đột biến của Corynebacterium và các giống vi sinh vật cùng họ

có khả năng sản xuất các amino acid với chi phí thấp từ nguồn carbon rẻ tiền

bằng cách lên men trực tiếp. Nhiều loại carbohydrate được sử dụng riêng lẻ

hoặc kết hợp trong sản xuất L- lysine như glucose, fructose, sucrose, mật rỉ (

chứa cả glucose, fructose, sucrose, v.v…), maltose, tinh bột thủy phân,

cellulose thủy phân, acid hữu cơ (như acid acetic, acid propionic, acid benzoic,

acid fomic, acid malic, acid citric, acid fumaric), rượu ( như etanol,

propanol), glycerol, hydrocacbon, tinh dầu và chất béo (dầu từ hạt đậu nành,

hoa hướng dương, đậu phộng, dầu dừa) cũng như acid béo ( acid palmitic, acid

stearic, acid inoleic). Những chất này được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với

nhau [30].

Mật rỉ đường (từ mía, củ cải đường), tinh bột thủy phân (glucose) từ


41

ngô và khoai mì được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các aminoacid. Các

nguồn carbon đó được sử dụng khác nhau tùy thuộc vào vị trí địa lý , nơi có

các loài thực vật tương ứng. Chẳng hạn như tinh bột thủy phân từ ngô, syrup

ngô là nguồn carbon thường được sử dụng ở Mỹ, trong khi đó mật rỉ đường

được sử dụng ở Châu Âu và Nam Mỹ, xuất phát từ giá cả và nguồn có sẵn ở

các vùng này. Khoai mì chứa tinh bột gọi là tinh bột sắn được trồng nhiều ở

vùng nhiệt đới như Indonesia,Thái lan. Do đó, ở Nam Á, tinh bột sắn thủy

phân được sử dụng để sản xuất amino acid [22].

a.Mật rỉ:

Đây là nguồn nguyên liệu rẽ tiền, đồng thời là những thứ liệu của các

ngành công nghiệp sản xuất đường từ mía hay củ cải đường. Những đặc tính

quan trọng phù hợp với quá trình lên men của mật rỉ bao gồm: chứa hàm

lượng đường cao, ngoài đường saccharose ra còn chứa rất nhiều chất hữu

cơ, vô cơ, các vitamin và các chất kích thích sinh trưởng, trong đó có

vitamin H (Biotin).

Tuy nhiên, muốn sử dụng chúng cho quá trình lên men đòi hỏi phải

có các quá trình xử lý thích hợp vì:

Rỉ đường thường có màu nâu sẫm. Sau lên men, chúng sẽ bám vào

sinh khối vi sinh vật và bám vào sản phẩm. Việc tách màu ra khỏi sinh khối

và sản phẩm thường rất tốn kém và rất khó khăn. So sánh giữa hai loại mật

rỉ thì mật rỉ từ cây mía có màu sẫm hơn mật rỉ nhận từ sản xuất củ cải

đường. Do đó ở một số nước chỉ có mật rỉ từ mía, người ta phải trộn thêm

mật rỉ từ củ cải hoặc phải xử lý trước khi tiến hành quá trình lên men.

Thứ hai là hệ keo trong mật rỉ. Keo càng nhiều, khả năng hòa tan

của oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật càng kém. Do

đó công việc quan trọng nhất khi sử dụng mật rỉ là phải phá hệ keo này.

Người ta thường sử dụng acid sunfuric đậm đặc để xử lý với hàm

lượng khoảng 3,5 kg / một tấn mật rỉ bằng 1 trong 3 cách sau để nhằm mục

đích khử keo và màu nâu sẫm của mật rỉ:


42

Cách thứ nhất: Khi cho 3,5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta

khuấy đều ở nhiệt độ thường trong thời gian 24h, sau đó ly tâm thu dịch

trong.

Cách thứ hai: Khi cho 3,5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta đun

toàn bộ lên 85oC và khuấy đều liên tục trong 6h, sau đó ly tâm thu dịch

trong.

Cách thứ ba: Cho H2SO4 đến khi pH của mật rỉ đạt được giá trị là 4,

người ta đun nóng đến 120-125oC trong một phút để các chất vô cơ kết tủa,

sau đó ly tâm thu dịch trong [2].

Tuy nhiên, việc sử dụng mật rỉ có nhiều vấn đề: Việc vận chuyển

mật rỉ đường từ nhà máy đường đến nơi lên men tạo thêm chi phí. Chất

lượng mật rỉ cũng dễ bị thay đổi theo thời gian.

Do đó,xu hướng hiện nay đang chuyển từ việc sử dụng mật rỉ đường

sang nguồn carbon tinh khiết như là tinh bột thủy phân [21].

b. Tinh bột:

Khoai mì

Trong nhiều quá trình lên men, khoai mì được coi như là nguồn

nguyên liệu chứa tinh bột rất thuận lợi. Khoai mì chứa nhiều chất khoáng

như kali, natri, photpho ,magie, sắt. Các khoáng chất này rất cần cho vi sinh

vật phát triển và chuyển hóa các sản phẩm thứ cấp. Giá cả thường rẽ và dễ

trồng nên được sử dụng nhiều trong quá trình lên men.

Trong công nghệ lên men, người ta thường sử dụng bột khoai mì khô

vì khoai mì tươi thường khó bảo quản. Khoai mì phải trải qua quá trình

đường hóa và dịch hóa để chuyển tinh bột thành glucose để sử dụng cho quá

trình lên men, quá trình này được thực hiện bằng enzyme hay thủy phân hóa

học [2].

Ngô

Ngô là nguồn nguyên liệu rất thông dụng trong quá trình lên

men.Thành phần hóa học của ngô chứa nhiều glucid,protein, lipid.Ngô có


43

thể bảo quản lâu, dễ mua và rẻ tiền. Cũng như khoai mì, ngô cần phải qua

quá trình thủy phân trước khi sử dụng để lên men [2].

1.8.2.2. Nguồn Nitơ:

Nhiều nguồn nitơ khác nhau được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp trong

sản xuất L-lysine q u y m ô ph òn g th í n ghi ệm và t ro n g cô n g n gh i ệp ,

bao gồm những hợp chất vô vơ như: dung dịch ammonia ở dạng dung dịch

hoặc khí, muối ammonium. Nguồn nitơ tự nhiên từ các nguyên liệu hữu cơ như

dịch thủy phân đậu nành, dịch thủy phân protein (nitơ tổng khoảng 7%), dịch

thủy phân đậu nành, nước chiết bắp, dịch thủy phân casein, cao nấm men, dịch

chiết thịt, dịch chiết malt, urea, peptone, và các amino acid khác [30].

Trong đó, muối ammonium ( như ammonium sulfate) hoặc ammonia

nguyên chất được sử dụng phổ biến. Ammonium sulfate dễ dàng mua được vì

nó là phụ phẩm của nhiều ngành công nghiệp lớn như sản xuất caprolactam .

Ammonia sử dụng trong quá trình lên men ở dạng dung dịch nồng độ 25% hoặc

ở dạng khí. Nitrogen có thể bổ sung vào môi trường ban đầu bằng muối

ammonium hoặc bằng cách đều chỉnh pH bằng ammonia [22].

1.8.2.3. Các muối vô cơ, khoáng vi lượng,các chất kích thích sinh trưởng:

Bên cạnh nguồn carbon và nitơ, các thành phần cần thiết được thêm vào

môi trường lên men lúc đầu hoặc cho vào thành nhiều đợt trong suốt quá trình

lên men L-lysine, như muối vô cơ của các kim loại: Mg (Magie sunfat), Ca,

Na, K, Mn, và Zn hoặc một lượng rất rất nhỏ của các kim loại khác. Acid

H3PO4, KH2PO4, K2HPO4 và các muối natri tương ứng được sử dụng phổ

biến như là nguồn phospho cho sản xuất L-lysine. Những chất cần thiết cho

sự phát triển vi sinh vật như amino acid, vitamin (B1) và các tiền chất thích

hợp cũng được thêm vào môi trường lên men chỉ một lần hoặc từng đợt [30].

1.8.2.4. Khử trùng môi trường:

Môi trường được chuẩn bị bằng cách tiệt trùng theo mẻ hoặc liên tục.

Mặc dù việc tiệt trùng theo mẻ không hiệu quả, nhưng nó vẫn được áp dụng

phổ biến đối với các mẻ môi trường dưới 20m3 vì giảm được chi phí đầu tư.

Đối với những mẻ môi trường lớn, tiệt trùng liên tục có nhiều ưu điểm vì nhiệt

độ trong tiệt trùng theo mẻ gây biến tính một số thành phần trong môi trường.


44

Hơn nữa, nhiệt độ cao nhất trong giai đoạn đun nóng của chu trình tiệt trùng

theo mẻ thì không phù hợp. Nguồn carbon và nitơ thường được tiệt trùng riêng

biệt để tránh phản ứng Maillard [21].

1.8.3. Các phương pháp lên men:

1.8.3.1. Lên men batch và fed-batch:

Hầu hết các quá trình lên men amino acid trong công nghiệp đều sử dụng

quá trình lên men batch hoặc fed-batch.

Trong lên men batch, quá trình nuôi cấy bắt đầu khi môi trường (ngoại

trừ ammonia để điều chỉnh pH) được đưa vào fermentor cho đến khi lượng

đường trong môi trường sử dụng hết. Trong fed batch, một phần môi trường

được đưa vào fermentor và các chất dinh dưỡng được thêm vào gián đoạn hoặc

liên tục trong suốt quá trình nuôi cấy cho đến khi đạt được lượng sản phẩm tối

đa. Điểm cơ bản của fed batch là hàm lượng chất dinh dưỡng trong môi trường

nuôi cấy có thể kiểm soát được. Mặc dù lên men batch dễ dàng thực hiện và

không cần thêm thiết bị cho chất dinh dưỡng bổ sung, nhưng quá trình sản xuất

công nghiệp chủ yếu sử dụng fed-batch. Lý do chính là quá trình fed batch có

thể cho năng suất tốt hơn thông qua việc tăng sản lượng và giảm thời gian lên

men, đặc biệt khi nồng độ cao hay sự thay đổi nồng độ của một chất dinh dưỡng

nào đó ảnh hưởng đến sản lượng hay năng suất. Những ưu điểm của fed batch

bao gồm:

Trong hầu hết các quá trình sản xuất amino acid, hàm lượng đường rất

cao,thường là 20% hoặc nhiều hơn được sử dụng trong quá trình nuôi cấy để

đạt được sản lượng cao theo mẻ. Nồng độ đường cao trong môi trường đôi khi

làm ức chế sự phát triển của vi sinh vật hoặc giảm sản lượng sản phẩm, cùng

với đó là sự tạo thành các sản phẩm phụ như acetate và lactate. Bằng cách hạ

thấp nồng độ đường ban đầu thấp và bổ sung sau đó, tổng thời gian nuôi cấy,

đặc biệt là phage lag, có thể được rút ngắn và trong một số trường hợp sản

lượng có thể được tăng lên.

Trong một quá trình sử dụng chủng dị dưỡng, việc cung cấp quá mức

nhu cầu dinh dưỡng đôi khi dẫn đến làm giảm sản lượng do sự phát triển quá

mức của tế bào hoặc do sự điều hòa ngược bởi chất dinh dưỡng.Trong nhiều


45

quá trình, sản lượng có thể tăng cực đại bằng cách nuôi các chủng dị dưỡng

trong một lượng giới hạn của chất dinh dưỡng cần thiết thông qua việc bổ sung

theo một tỉ lệ được kiểm soát. Trong suốt pha sinh trưởng, nhu cầu oxy có thể

vượt quá lượng oxy trong fermentor. Trong trường hợp thiếu oxy trong môi

trường nuôi cấy, sản lượng sẽ giảm và kèm theo đó là các acid phụ phẩm. Bằng

cách sử dụng kĩ thuật fed batch, nồng độ các chất có thể được giữ ở mức thấp

nhất để ngăn chặn sự thiếu oxy .Trường hợp đó, glucose giới hạn trong fed-

batch được sử dụng phổ biến trong công nghiệp. Để tăng năng suất hơn nữa, lên

men fed-batch được mở rộng bằng cách lấy ra một phần canh trường tại một

hoặc nhiều thời điểm, sau đó bổ sung trở lại. Tuy nhiên, xét về khía cạnh kinh

tế, cả năng suất và sản lượng cần được suy xét khi quyết định sử dụng quá trình

này, bởi vì việc kéo dài thời gian nuôi cấy để thu được sản lượng tối đa thường

không có hiệu qủa kinh tế [22].

1.8.3.2. Lên men liên tục:

Trong lên men liên tục, môi trường mới chứa toàn bộ chất dinh dưỡng

được bổ sung vào fermentor với những tỉ lệ cụ thể và một lượng canh trường

tương ứng với một phần vi sinh vật được lấy ra liên tục từ fermentor để duy trì

thể tích dịch nuôi cấy không đổi. Quá trình này được thực hiện bởi phương

pháp chemostat với sự hạn chế về chất dinh dưỡng, chẳng hạn như môi trường

giới hạn phosphate và môi trường giới hạn glucose, hoặc bằng phương pháp

turbidostat trong đó tỉ lệ bổ sung và lấy ra được điều khiển sao cho sinh khối

trong môi trường nuôi cấy được duy trì ổn định. Khi nồng độ của các thành

phần riêng biệt trở nên không đổi, trạng thái đó được gọi là trạng thái bền vững

và tế bào phát triển dưới điều kiện ổn định. Trong lên men liên tục, quá trình

nuôi cấy được bắt đầu trong một mẻ hoặc theo kiểu fed batch và khi năng suất

trên một đơn vị thời gian trở nên tương đối cao, quá trình lên men được chuyển

từ nuôi cấy theo mẻ sang liên tục. Nuôi cấy liên tục theo lý thuyết có thể duy trì

mãi không kết thúc. Nhưng theo thực nghiệm, thời gian chỉ có thể là vài trăm

giờ là do các vấn đề sẽ được trình bày ở phần sau.

Quá trình lên men liên tục cho phép tăng đáng kể năng suất tổng cộng

cũng như công suất sản xuất mà không cần thêm nhiều fermentor, điều đó

không những giảm chi phí sản xuất mà còn giảm chi phí đầu tư. Đã có nhiều


46

nghiên cứu đáng kể về lên men liên tục.Tuy nhiên, hầu hết là để sản xuất sinh

khối hoặc sản xuất rượu và acid hữu cơ, chỉ có một vài nghiên cứu lên men

amino acid. Hirao et al. [16] nghiên cứu quá trình lên men liên tục L-Lysine

bằng C. glutamicum B-6, một chủng đột biến sản xuất L-lysine. Chủng này cho

thấy có thể sản xuất L-Lysine ổn định trong hơn 300 giờ với nồng độ và năng

suất L-lysine HCl tối đa lần lượt là 105 g/l và 5.6 g/l.h. Trong khi đó chủng B-

6 có khả năng sản xuất 100 g/l L-Lysine HCl trong 48 h bằng lên men fed-

batch, năng suất không vượt quá 2.1 g/ l.h. Điều đó có nghĩa là năng suất của

quá trình lên men liên tục gấp hơn 2.5 lần so với lên men fed-batch.

Mặc dù năng suất tăng rõ rệt khi so sánh lên men liên tục và lên men

batch hoặc fed batch ở quy mô phòng thí nghiệm, nhưng việc ứng dụng vào lên

men công nghiệp còn rất hạn chế vì một số lý do sau :

Quá trình lên men liên tục các amino acid đòi hỏi việc bổ sung liên tục

môi trường mới đã được khử trùng và cung cấp không khí tiệt trùng. Hai yếu tố

đó dễ bị tạp nhiễm vi sinh vật trong qui mô công nghiệp, gây khó khăn cho việc

duy trì sự tinh khiết của môi trường nuôi cấy trong một thời gian dài.

Vi sinh vật thường trải qua quá trình đột biến ngẫu nhiên, dẫn đến giảm

năng suất trong suốt quá trình nuôi cấy liên tục trong một thời gian dài, đặc biệt

trong môi trường giới hạn dinh dưỡng chemostat. Các chủng đột biến phát triển

nhanh hơn chủng bố mẹ trong cùng điều kiện nuôi cấy và do đó được ưu tiên

nuôi dưỡng, kết quả là năng suất giảm nhanh.

Trong một số quá trình lên men chia ra phase sinh trưởng và phase sản

xuất, nuôi cấy liên tục có thể không đạt được năng suất cao bằng batch hoặc

fed-batch bởi vì tế bào luôn được giữ ở pha sinh trưởng. Năng suất của nhiều

quá trình lên men tăng lên bằng cách kết hợp kĩ thuật cell-recycling trong lên

men fed-batch hoặc lên men liên tục [22].

1.8.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:

1.8.4.1. Oxy:

Lên men L-lysine là một quá trình lên men hiếu khí, đòi hỏi một lượng

lớn oxy. C. glutamicum có thể chịu được lượng oxy cung cấp hạn chế nhưng để

quá trình sản xuất L-lysine được thuận lợi thì cần tránh sự thiếu oxy bởi vì hoạt

động của vi sinh vật sẽ tăng cường chuyển hóa tạo ra các phụ phẩm, làm giảm


47

sự tinh khiết và hiệu suất chuyển đổi. Trong điều kiện thiếu oxy, pyruvate sẽ

chuyển hóa thành các sản phẩm phụ như acetate, lactate, and L-alanine [21].

Việc cung cấp oxy được thực hiện và kiểm soát bằng hai cách: sục khí

và khuấy đảo. Trong không khí, ngoài các thành phần của không khí còn chứa

rất nhiều VSV, do đó không khí cung cấp cho quá trình lên men đòi hỏi phải

được sạch sẽ về vi sinh vật và các tạp chất khác. Trường hợp lên men trong điều

kiện hiếu khí, cánh khuấy làm tăng khả năng hòa tan của oxy. Các khí sẽ ở lại

lâu hơn do dòng chuyển động của môi trường, và như vậy, khả năng hòa tan

của oxy từ bọt khí sẽ cao hơn.

Tùy theo qui mô lên men và giống vi sinh vật sử dụng mà tốc độ sục khí

và khuấy đảo sẽ khác nhau. Đối với chủng C. glutamicum, một số nghiên cứu

lên men L-lysine được tiến hành bằng cách lắc trong máy lắc (250-300v/ph)

hoặc bằng sục khí(0,5-1,5vvm) trong jar fermentor 30 lít [28].Thực hiện

lên men thí nghiệm trong bench scale fermentor 6.6 lít ở tốc độ thổi không

khí sạch là l ,2vvm và thay đổi tốc độ khuấy trong suốt quá trình lên men từ

600 rpm ở 0 h đến 900 rpm ở 19h [20].

1.8.4.2. pH:

pH là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình lên men.

Những hợp chất cơ bản như sodium hydroxide, potassium hydroxide,

ammonium hydroxide, calciumcarbonate, urea, ammonia và khí ammonia

hoặc những hợp chất acid vô cơ như acid sunfuric hoặc phosphoric và những

hợp chất acid hữu cơ được sử dụng trong các nghiên cứu để kiểm soát pH

trong lên men L-lysine ở dãy rộng pH từ 5-9 [30].

pH tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp lysine đối với chủng C.

glutamicum là từ 7,0– 7,6 [2]. Trong quá trình lên men, vi sinh vật lại tạo ra

những sản phẩm trao đổi chất có tính acid hay kiềm, khiến pH của môi trường

không còn thích hợp cho hoạt động sống của chúng. Vì vậy, việc chủ động điều

chỉnh pH của môi trường luôn ở giá trị thích hợp trong suốt quá trình lên men là

điều rất cần thiết.


48

1.8.4.3. Nhiệt độ:

Nhiệt độ tối ưu của Corynebacteria sản xuất các amino acid là từ 25 đến

37˚C [21]. C. glutamicum có nhiệt độ tối ưu là khoảng 30oC, nhiệt độ tối ưu cho

quá trình lên men lysine duy trì trong khoảng từ 28-30oC. Do đó việc sử dụng

C. glutamicum ở các nước nhiệt đới có ý nghĩa về kinh tế, bởi vì chi phí cho

việc giữ nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men không đáng kể [22],[2].

Quá trình lên men luôn có sự tỏa nhiệt rất mạnh nên nhiệt độ trong các thiết

bị lên men thường có xu hướng gia tăng vượt quá ngưỡng nhiệt độ thích hợp

đối với hoạt động sống của vi sinh vật đó. Vì vậy phải thường xuyên giám sát

và điều chỉnh nhiệt độ theo yêu cầu của quá trình lên men.

Muốn đạt được nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men, người ta trang

bị hệ thống làm nóng và làm nguội bằng nước chảy quanh nồi dưới dạng các

ống ruột gà .

1.8.4.4. Hiện tượng tạo bọt:

Trong lên men fed-batch, hiện tượng tạo bọt cũng là một điều quan trọng

cần nghiên cứu, đặc biệt trong quy mô công nghiệp, khi tốc độ khí trên bề mặt

tăng theo kích thiết bị. Kích thước fermentor không phải là tiêu chuẩn đánh giá

tốt cho qui mô của một qui trình công nghệ lên men. Thông thường, lượng canh

trường lên men trong bình phản ứng chịu ảnh hưởng bởi hiện tượng sủi bọt, do

đó trong sản xuất công nghiệp, độ chứa đầy từ 70 đến 85% thể tích. Hiện tượng

tạo bọt bị ảnh hưởng bởi tỉ trọng của canh trường lên men, cũng như phụ thuộc

vào chủng sản xuất, thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. Bên cạnh áp

lực thủy tĩnh lớn trong các thiết bị qui mô lớn do lượng CO2 rất lớn sinh ra

trong chất lỏng, sự sủi bọt cũng ảnh hưởng rất lớn trong suốt quá trình nuôi cấy

và trong suốt quá trình downstream sau này[21]. Hiện tượng tạo bọt xuất hiện

trong suốt quá trình lên men có thể được kiểm soát bằng chất chống tạo bọt

như acid béo, ester polyglycol, hoặc silicon và polypropylene [30].

1.8.5. Qui trình lên men:

Trong qui mô công nghiệp,quá trình lên men được thực hiện trong các

fermentor có sục khí và lắc hoặc airlift tank fermentor có kích thước từ 50.000 đến

50.0000l. Do nhu cầu amino acid càng tăng và cần phải giảm giá thành để cạnh tranh,


49

kích thước các fermentor ngày càng tăng. Hình 1.25 mô tả sơ đồ một quá trình lên men

amino acid điển hình. Giống nuôi cấy trong bình flask được chuyển sang thiết bị nhân

giống cấp 1 ( kích thước 1.000lít - 2.000lít ). Khi tế bào phát triển đến một tốc độ thích

hợp, giống cấp 1 sẽ được chuyển sang thiết bị nhân giống cấp 2 (kích thước 10.000lít-

20.000lít), sau đó sẽ cung cấp giống cho thiết bị lên men chính. Các bước nhân giống

trên rất quan trọng, để đảm bảo hiệu suất lên men cao nhất trong thời gian ngắn nhất,

cũng như việc tái sản xuất tốt hơn. Chất lượng và số lượng của giống thường ảnh

hưởng đến tốc độ sinh trưởng và năng suất trong quá trình lên men, và do đó, việc nuôi

cấy trong mỗi bước nhân giống cần phải chuẩn bị cẩn thận để đạt được trạng thái tối

ưu trong quá trình nhân giống. Các thông số ảnh hưởng đến sản lượng sản xuất trong

quá trình nuôi cấy trong fermentor bao gồm: sục khí,khuấy đảo, áp suất trong thiết bị,

tỉ lệ bổ sung đường, pH, và nhiệt độ. Trong số đó, bốn thông số đầu tiên đặc biệt chú ý

bởi vì điều kiện tối ưu của chúng có thể khác nhau đáng kể tùy thuộc vào loại

fermentor và quy mô hoạt động. Nâng cấp từ phòng thí nghiệm đến nhà máy sản xuất

chủ yếu dựa trên các thông số vật lý như oxy hòa tan, tốc độ sục khí, tốc độ khuấy,

thời gian, và năng suất ra. Tuy nhiên, sản lượng thu được trong quy mô công nghiệp

thường không giống như kết quả trong phòng thí nghiệm. Nguyên nhân chính là do sự

phức tạp của các fermentor. Sự phân phối đường bổ sung và oxy có thể ảnh hưởng đến

sinh lý tế bào gây nên hiện tượng stress không mong muốn như :sự đổi hướng tổng

hợp từ amino acid mong muốn sang những sản phẩm phụ không mong muốn như CO2,

các acid, và sinh khối. Do đó, việc nâng cấp quy mô thành công đòi hỏi sự am hiểu tốt

về động lực học chất lỏng trong các fermentor cũng như sự tương tác giữa điều kiện

nuôi cấy, điều kiện hóa học và vật lý trong môi trường nuôi cấy và sinh lý vi sinh vật.


50

Hình 1. 25 Mô hình sản xuất các amino acid [22].

Giống

Nhân giống cấp 1 Nhân giống

cấp 2

khí

Sản xuất


51

Hình 1. 26 Mô hình lên men thu L-lysine [21].

Khử trùng liên tục


carbon

(NH4)2SO4

Nước

Muối, khoáng, vitamin Hợp chất hữu cơ phức tạp

Chuẩn bị môi trường

(NH4)2SO4 đã khử trùng

Nguồn C đã khử trùng


Khí nén

Thu nhận và tinh sạch

NH3


52

1.8.5.1. Nhân giống:

Bởi vì C. glutamicum có phage lag dài nếu nuôi cấy ở lượng sinh khối

dưới 0.1 g/l, nên giống dùng cho quá trình lên men công nghiệp được nhân

giống qua nhiều cấp liên tiếp (hình 5.2). Các fermentor nhân giống ở các cấp

khác nhau thường bao gồm một fermentor từ 1 đến 5 m3 ở cấp thứ nhất và từ 10

đến 50 m3 ở cấp thứ hai. Nhiệt độ, pH, và O2 cung cấp được kiểm soát để tránh

sự ức chế và đảm bảo vi sinh vật sinh trưởng. Quá trình này được kiểm soát

thông qua việc xác định sinh khối và hàm lượng carbon. Trong sản xuất công

nghiệp, quá trình trên được kiểm soát thông qua việc theo dõi sự tỏa nhiệt và

hàm lượng oxy hấp thu. Trong giai đoạn nhân giống và khử trùng môi trường,

kĩ thuật khử trùng, sự trang bị máy móc dụng cụ,chất lượng mối hàn, thiết kế

đường ống dẫn, thiết kế bình phản ứng, vận hành và duy trì quá trình nuôi cấy

vô trùng là cực kì quan trọng. Bởi vì C. glutamicum thường được nuôi cấy ở

giữa pH 6 và pH 9, ở nhiệt độ ôn hoà, sự tạp nhiễm chẳng hạn như nhiễm

Bacillus.sp là mối đe dọa cho quá trình sản xuất, nếu chúng có mặt trong giống,

môi trường khử trùng chuẩn bị lên men, hoặc trong môi trường khử trùng dự

trữ. Bacillus.sp tạp nhiễm thường phát triển với tốc độ cao hơn C. glutamicum

và lấn áp chủng sản xuất, ảnh hưởng đến năng suất. Sự tạp nhiễm phage không

phải là vấn đề đáng lo lắng trong công nghiệp lên men L-lysine bởi vì C.

glutamicum thường tỏ ra ít nhạy cảm với phage hơn E. coli [21].

1.8.5.2. Nuôi cấy lên men:

Do sức ép về việc giảm giá thành sản phẩm,kích thước fermentor đã tăng

lên từ 50m 3 lên 750 m3 trong 2 thập niên qua. Hầu hết đều sử dụng các bình

khuấy trộn, bởi vì chúng có năng suất cao do tỉ lệ oxy chuyển hóa cao. Bên

cạnh đó, do có hiệu quả cung cấp oxy tốt hơn, các air lift reactor cũng được sử

dụng trong quy mô công nghiệp,tuy nhiên chúng bị hạn chế khi lượng oxy

chuyển hóa tổng cộng có thể đạt được. Khi mà ngày càng có nhiều chủng C.

glutamicum có khả năng sản xuất cao, chịu được stress cao, áp suất thẩm thấu

cao thì chính các hệ thống bình phản ứng hơn là do vi sinh vật là nguyên nhân

hạn chế năng suất lên men.

Để điều khiển quá trình lên men đạt được năng suất và hiệu suất chuyển

đổi lớn nhất và những biến động trong quá trình lên men là thấp nhất, đặc điểm


53

vi sinh vật, lựa chọn môi trường và điều kiện công nghệ cần được tính toán cẩn

thận. Một khía cạnh quan trọng khác khi kiểm soát hàm lượng carbon cung cấp,

trong điều kiện hiếu khí hoàn toàn, C. glutamicum sẽ phản ứng lại sự thừa

carbon cung cấp trong lên men L-lysine bằng cách tăng cường sự chuyển hóa

thành các sản phẩm phụ. Trong những trường hợp đó,nếu không điều chỉnh lại,

thì tùy theo đặc trưng của giống vi sinh vật , các chất trung gian của chu trình

acid citric có thể dễ dàng tích lũy ngoài tế bào khoảng10 g/ l hoặc cao hơn. Do

đó, tỉ lệ carbon cung cấp và các nguồn dinh dưỡng khác cần phải tính toán cẩn

thẩn, tỉ lệ tối ưu dựa trên đặc tính của giống và điều kiện công nghệ .Kiểm soát

các chất dinh dưỡng cung cấp cũng rất phức tạp, ước lượng trực tiếp dựa trên

con đường chuyển hóa. Trong quy mô công nghiệp, fed-batch, repeated fed-

batch, và lên men liên tục được ứng dụng. Đặc điểm của fed-batch là bổ sung

một lượng lớn nguồn carbon và nitơ khi mà nguồn carbon trong môi trường ban

đầu bị cạn kiệt. Nguồn carbon có thể được bổ sung vào ở dạng tinh khiết hoặc

ở dạng môi trường bổ sung bao gồm nhiều chất dinh dưỡng khác như các amino

acid và các khoáng chất. Trong cả hai trường hợp, hàm lượng carbon được duy

trì ở nồng độ thấp, để hạn chế tỉ lệ oxy hấp thu và để tránh sự chuyển hóa thành

các phụ phẩm. Phase bổ sung có thể được kéo dài bằng cách lấy ra một phần

canh trường khi mà bình phản ứng đầy và tiếp tục bổ sung sau đó. Sự khả thi

của phương pháp này là khả năng vi sinh vật tiếp tục chuyển hóa thành L-

lysine với hiệu suất chuyển đổi và năng suất cao. Một đặc điểm khác của fed-

batch là hàm lượng nhiều chất dinh dưỡng giảm trong suất quá trình nuôi cấy

nếu không bổ sung thêm môi trường. Đó là ưu điểm để sản xuất L-lysine, đặc

biệt nếu chủng sản xuất dị dưỡng các amino acid và có phase sinh trưởng và

phase sản xuất riêng biệt. Mặt khác, nó rút ngắn thời gian nuôi cấy ở mỗi mẻ.

Ưu điểm lớn nhất của fed-batch là thu được nồng độ sản phẩm cao. Đối với L-

lysine điều đó hoàn toàn đúng, bởi vì không có giới hạn cho sự hòa tan trong

quá trình lên men. Do đó, nồng độ sản phẩm cao có lợi cho quá trình thu nhận

và tinh sạch. Tuy nhiên, khi nồng độ sản phẩm tăng,áp suất thẩm thấu cũng như

khả năng tiết ra các chất của vi sinh vật ảnh hưởng toàn bộ hiệu suất của quá

trình. Sự tích tụ L-lysine bị tác động xấu của áp suất thẩm thấu cao, nó tác động

xấu lên sự sinh trưởng,sự chuyển hóa và năng suất. Để sự tạo thành L-lysine


54

hiệu quả trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao, glycine betaine tỏ ra có hiệu

quả và được biết tới trong nhiều năm qua. Kawahara et al. [19] mô tả một quá

trình chuyển hóa khoảng 55% với năng suất khả thi 2 g/l.h trong lên men batch

bắt đầu với nồng độ glucose 160 g/ l và cung cấp đủ betaine .

Yêu cầu duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong fed-batch ít nghiêm

ngặt hơn so với lên men liên tục trong fermentor. Bởi vì quá trình lên men

thường không bị ảnh hưởng với điều kiện sự tạp nhiễm không vượt quá 0.1%

giống sản xuất, quá trình lên men chịu được sự tạp nhiễm ở mức độ thấp trong

thiết bị lên men, điều đó cho phép một số sửa đổi các van, ống dẫn, do đó giảm

chi phí đầu tư. Theo công nghệ của Biolys®, một số phương pháp nghiêm ngặt

được áp dụng để giữ cho sự tạp nhiễm trong quá trình sản xuất ở mức thấp nhất

bằng chương trình thiết kế khá phức tạp và tự động để kiểm soát sự tạp nhiễm.

Nếu sự phát triển hướng về lượng chất khô và nồng độ L-lysine cao hơn

trong fed-batch bị hạn chế bởi những khía cạnh vừa nêu, thì năng suất của một

quá trình fed-batch có thể tăng lên bằng kĩ thuật repeated fed-batch [25]. Khi

đạt được độ chứa đầy tối đa, một thể tích thích hợp ( 10-20%) giữ lại trong

reactor xem như là giống cho chu kì tiếp theo. Phương pháp đó (còn gọi là bán

liên tục –semi continuos) chỉ khả thi đối với những giống có đủ sự ổn định.

Hirao et al. [16] phát triển một quá trình liên tục, giảm thời gian chết do

vệ sinh, chuẩn bị và tiệt trùng. Mặc dù có tiềm năng lớn để tăng năng suất và

giảm chi phí đầu tư, nhưng lên men liên tục ít được áp dụng trong công nghiệp

sản xuất. Yêu cầu thiết kế cao đối với bình phản ứng, hệ thống van, trang thiết

bị, bảo trì phức tạp và sự vận hành sản xuất cần phải giữ cho sự tạp nhiễm trong

sản xuất quy mô lớn dưới 5% (giới hạn cho phép: 102 VSV tạp nhiễm /ml canh

trường), đó là một điều kiện tiên quyết trong lên men liên tục. Khi các

bioreactor qui mô hơn 100m3, điều kiện vô trùng trong sản xuất là một thách

thức lớn. Do đường kính ống dẫn,áp suất thủy tĩnh, ứng suất cơ học tăng trong

các thiết bị đó, thật khó để tìm ra một giải pháp cơ khí có đủ khả năng thực hiện

sản xuất trong điều kiện vô trùng. Nếu những vấn đề đó không được nghiên cứu

đúng đắn, thì thời gian kết thúc của các mẻ và thời gian chết sẽ dài, làm giảm

công suất tổng cộng của nhà máy. Một hạn chế nữa của lên men liên tục là C.

glutamicum thường bị đột biến ngẫu nhiên, đặc biệt trong điều kiện cơ chất giới


55

hạn của quá trình hoạt động chemostat. Bởi vì các chủng đột biến thường

chuyển hóa nguồn carbon với sản lượng L-lysine thấp hơn và lượng sinh khối

cao hơn. Nên quá trình sản xuất liên tục L-lysine chỉ có thể thực hiện được ở

thời gian giới hạn. Thời gian nuôi cấy kéo dài, vi sinh vật sẽ bị ảnh hưởng bởi

những đột biến bất lợi [21]. De Hollander et al. [13] cho biết tỉ lệ phospho và

carbon từ 0.5 đến 4.0 mmol phospho/1 mol carbon thì có lợi cho quá trình sản

xuất liên tục L-lysine bằng vi khuẩn Coryne. So sánh với quá trình chỉ giới hạn

nguồn carbon, năng suất tăng khi giới hạn cả nguồn carbon và phosphate từ

3.18 g/ l.h lên 3.75 g/ l.h L-lysine-HCl. Một hạn chế nữa của nuôi cấy liên tục

là để tăng sự chuyển đổi chỉ có cách là tăng thời gian lưu. Do đó, năng suất

không cao. Hirao et al. [16] chứng minh rằng sự chuyển đổi là 38% với 105 g/ l

L-lysine đạt được sau 30 h, năng suất chỉ là 2.8 g/ l.h, so sánh với năng suất lớn

nhất là 5.6 g/ l.h trong 7 h với 40 g/ l L-lysine. Một so sánh giữa phương pháp

liên tục và repeated fed-batch được đưa ra bởi Nakamura et al. [25]. Khi thời

gian lưu là 20 h, sự chuyển đổi trong quá trình liên tục chỉ là 35% với năng suất

3.5 g/ l.h, so sánh với 41% năng suất 3.9 g/ l.h trong quá trình repeated fed-

batch với cùng một giống vi sinh vật .

1.8.6. Thu nhận và tinh sạch sản phẩm:

Thu nhận và tinh sạch sản phẩm là một công đoạn rất quan trọng, nó ảnh

hưởng lớn đến hiệu quả của quá trình lên men và chi phí sản xuất, cần phải nghiên

cứu để nâng cao hiệu suất thu nhận L-lysine. Trong nhiều năm qua, tinh thể L-

lysine HCl đã được sản xuất qua nhiều bước khác nhau như lên men, thu nhận,

tinh sạch, kết tinh và làm khô.

Dịch sau lên men có nồng độ chất khô khoảng 10-13%.Dịch sau khi lên men

rất dễ bị hư hỏng do quá trình tự phân của vi sinh vật, hoặc bị tạp nhiễm. Do đó cần

phải đem dịch lên men đi thu nhận và tinh sạch L-lysine ngay. Trong trường hợp

không thể tiến hành thu nhận và tinh sạch ngay thì cần tiến hành các biện pháp để

bảo quản bằng cách: dùng HCl acid hóa dung dịch lên men (đưa về pH=5), đồng

thời bổ sung methabisunfit natri với liều lượng 4% so với dịch lên men.

Để thu nhận được L-lysine tinh khiết ở dạng kết tinh người ta thực hiện các

bước sau:


56

Tiến hành lọc và ly tâm dịch lên men để loại bỏ sinh khối, cặn và các thành

phần không tan (muối carbonat, canxi phosphat,…).

Dịch sau ly tâm được cho hấp phụ ở cột nhựa trao đổi ion cationit. Sau đó

rửa cột cẩn thận đến khi nước không còn màu và tiến hành nhả hấp phụ bằng

dung dịch ammonia 0,5-5% .

Đun nóng dịch L-lysine thu được để đuổi ammoniac. Sau đó dùng dung

dịch HCl hạ pH của dung dịch tới 4,9-5.

Tiến hành cô trong nồi cô chân không để nồng độ lysine đạt được 30-50%.

L-lysine sẽ tác dụng với HCl (dùng khi hạ pH dung dịch) tạo thành

monochlohydrat lysine.

Làm lạnh toàn bộ tới nhiệt độ 10-12 oC, khi đó thấy xuất hiện những tinh

thể màu vàng nhạt (kết tinh lần một). Tiến hành ly tâm để thu nhận tinh thể. Dịch

sau ly tâm được cô đặc thêm và tận dụng như dịch lysine cô đặc, hay đem tái kết

tinh để thu nhận triệt để L-lysine có trong dịch lên men.

Tinh thể thu được sẽ đem đi sấy chân không .

Nếu muốn tinh thể sạch hơn, người ta hòa tan tinh thể trong cồn (3-4 lần thể

tích) rồi cho kết tinh và làm đi làm lại nhiều lần, các tinh thể sẽ tách khỏi tạp chất

và các chất màu, L-lysine thương phẩm có độ tinh khiết trên 97%

dihydromonohydrat lysine, độ ẩm không quá 0,5%; tro 0,3% được bảo quản trong

túi PE hay hộp carton. L-lysine tinh khiết được dùng trong thực phẩm và y học.

Trong một số trường hợp không cần L-lysine ở mức độ tinh khiết cao, chẳng

hạn như làm thức ăn gia súc, ta có thể tiến hành làm khô trực tiếp dịch lên men mà

không cần đến các bước tinh sạch đắt tiền .Qui trình được thực hiện như sau:

Dung dịch lên men được bơm vào nồi chân không, tiến hành cô cho đến khi

nồng độ chất khô trong dịch đạt tới 35-40 %.Ta thu được chế phẩm thô đầu tiên.Ta

có thể sử dụng chế phẩm này cho chăn nuôi gia súc.Tuy nhiên dạng chế phẩm này

chỉ có thể bảo quản trong khoảng 4 tháng.


57

Để bảo quản lâu hơn ta phải tạo ra sản phẩm có độ ẩm thấp.Bằng cách trộn

thêm một chất độn nào đó (bột xương, bột ngủ cốc) vào trong dịch đã cô đặc trên

sau đó đem sấy khô hoặc ép thành viên rồi sấy.

Một cách khác có thể được sử dụng là đưa dung dịch đã cô đặc đi sấy phun.

Độ ẩm của sản phẩm này khoảng 5-6% [2].

1.8.7. Phân tích chất lượng và số lượng L-lysine

Để định tính L-lysine ta có thể sử dụng phương pháp sắc kí giấy, đây là một

trong những phương pháp có độ nhạy cao trong việc định tính các amino acid.

Trong khi đó, để định lượng L-lysine , 2 phương pháp có thể sử dụng là

phương pháp quang phổ và phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan

58

CHƯƠNG 2: CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN

QUAN

2.1. Nghiên cứu về các đối tượng sản xuất lysine:

2.1.1 Sử dụng dịch cỏ như một gradient trong sản xuất lysine:

Để hạ giá thành cho sản phẩm lysine, người ta sử dụng dịch từ cỏ như một

gradient để sản xuất lysine. Sử dụng bốn môi trường lên men khác nhau là A, A1, B

và C với ba giống vi sinh vật là IFA 129 (Brevibacterium E 531), 133

(Corynebacterium glutamicum) và 134 (Brevibacterium lactofermentum) để sản

xuất lysine.

Cỏ được thu hoạch từ một khu vực được trộn với nước và xay nhuyễn tạo ra

thể đồng nhất gọi là dịch cỏ. Dịch cỏ này đem trộn với glucose, đối với môi trường

A là 30 g/l glucose và dịch men 20/l, môi trường B là 50 g/l glucose và dịch bắp 50

g/l. Còn môi trường C gồm dịch cỏ trộn với mật đường từ củ cải tía với lượng

carbonhydrate khoảng 100 g/l và dịch men 20 g/l, môi trường A1 sử dich dịch chiết

bắp 50g/l và glucose 30 g/l. Sau đó thêm vào tất cả các môi trường trên một số

chất: (NH4)2SO4 30 g/l, CaCO3 30 g/l, biotin 0,0003 g/l. Ba loại giống cho vào có

thể tích chiếm khoảng 10% so với fermenter khi chưa cho môi trường vào.

Lên men liên tục ở 30°C và duy trì mức pH ở 7,2-7,5. Sau khi khảo sát thấy

rằng chủng IFA 129 và 133 là hai chủng có tiềm năng sản xuất lysine với sản

lượng cao ở tất cả các môi trường nêu trên. Môi trường C có thành phần là phù hợp

cho sản xuất lysine nhất với nguồn dinh dưỡng và carbohydrate thích hợp.

Lượng lysine thu được sau 72 giờ lên men ở môi trường C đạt 32.65 g/l

(IFA 129) và 40.32 g/l (IFA 133), 14.21 g/l (IFA 134). Lượng lysine đạt thấp hơn

ở ba môi trường còn lại. Ngoài ra, dịch chiết bắp cũng được xem là nguồn dinh

dưỡng tốt cho sản xuất lysine, vì nó có chứa methionine và threonine.

2.1.2 Đặc điểm con đường tổng hợp sinh học lysine trong Obligate Methylotroph

Methylophilus methylotrophus:

Con đường tổng hợp lysine của vi khuẩn Gram âm obligate methylotroph

Methylophilus methylotrophus AS1 thì được kiểm tra thông qua đặc điểm của


59

enzyme aspartokinase (AK), aspartsemialdehyde dehydrogenase,

dihydrodipicolinate synthase (DDPS), dihydrodipicolinate reductase và

diaminopimelate decarboxylase. AK thì bị ức chế bởi L-threonine và bởi hỗn hợp

của L-threonine và L-lysine nhưng không bị ức chế bởi L-lysine riêng lẻ và hoạt

động của DDPS bị giảm một cách vừa phải bởi lysine. Ở thể đột biến sản xuất L-

lysine (G49) được cô lập như là chủng kháng S-(2-aminoethyl)-L-cysteine (lysine

analog), cả AK và DDPS thì một phần được kháng ức chế ngược. Gen ask và gen

dapA mã hóa enzyme AK và DDPS thì được cô lập từ chủng gốc AS1 và chủng

G49 xuất phát từ AS1. So sánh những trình tự thì thấy một sự đột biến điểm trong

mỗi gen này ở G49. Sự đột biến trong gen ask thay đổi aspartic acid trong một

vùng chủ chốt tham gia vào quy luật chung allosteric bằng AKs trong khi ở một sự

đột biến cũ là trong gen dapA thay đổi tyrosine 106, được giả định là tham gia vào

tổng hợp lysine bằng DDPS.

2.1.3. Các nghiên cứu về đối tượng sản xuất lysine là Corynebacterium

glutamicum:

2.1.3.1. So sánh tiềm năng sản xuất L-lysine giữa các chủng Corynebacterium

glutamicum khác nhau:[17]

Corynebacterium glutamicum là một sinh vật công nghiệp quan trọng

được sử dụng để sản xuất các axit amin khác nhau. Sản xuất một L-lysine bằng

cách đưa các đột biến lysC (T311I) vào lần lượt sáu chủng C. glutamicum đại

diện. So sánh các kết quả sản xuất L-lysine của các chủng đột biến có nguồn

gốc từ một chủng ban đầu ở điều kiện 30°C theo phương pháp truyền thống và

40°C trong công nghiệp. Qua đó tìm thấy rằng có sự khác biệt đáng kể trong

sản lượng và năng suất, đặc biệt là ở 40°C. Các kết quả này cho thấy sự đa dạng

giữa các chủng C. glutamicum trong lên men, cũng như tầm quan trọng của việc

chọn một chủng với hiệu suất tốt nhất trong công nghiệp.

Corynebacterium glutamicum và các vi sinh vật cùng loài với nó được

xếp vào loại vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic, đóng vai trò quan trọng trong

ngành công nghiệp vi sinh vật, sử dụng để sản xuất nhiều loại amino acid. Vi

khuẩn sản xuất acid L-glutamic gồm các chủng đa dạng, các chủng này cũng có

thể dùng để sản xuất các amino acid bằng phương pháp đột biến gen. Bảng sau


60

đưa ra các chủng hoang dại và ứng dụng sản xuất amino acid tương ứng của

chúng:

Bảng 2. 1 Các chủng vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic hoang dại theo báo cáo như là chủng

bố mẹ để sản xuất các amino acid và như là gen chủ cho nhân dòng [17].

Chủng hoang dại Sử dụng

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Sản xuất L-lys, L-Trp, L-Phe

Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 Sản xuất L-Gln

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Sử dụng trong phòng thí nghiệm

để nhân dòng

Corynebacterium glutamicum KY 10025 Sản xuất L-Glu hay L-Val

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Sản xuất L-Lys hay L-Glu

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC

13032

Sản xuất L-Arg hay L-Pro

Abe et al. nghiên cứu vể đặc tính sinh lý và phân loại các vi khuẩn sản

xuất ra acid L-glutamic. Chúng được chỉ ra là vi khuẩn gram dương, không di

động, có hình dạng ellip, hình cầu hay là hình que ngắn, sinh trưởng trong môi

trường đòi hỏi có biotin. Tuy nhiên, có sự khác biệt nhỏ về sinh lý giữa các

chủng vi khuẩn này. Theo báo cáo, có 208 chủng vi khuẩn thuộc nhóm sản xuất

acid L-glutamic được phân thành mười hai dạng dựa vào đặc tính sinh lý. Một

trong số đó là sáu chủng liệt kê ở bảng 2.1, và trong số đó các chủng được xếp

vào dạng 1 là ATCC 13032, ATCC 13869, KY 10025 dựa vào việc sản xuất ra

acid từ vài nguồn carbon, hoạt động urease, việc làm giảm lượng nitrate giống

nhau giữa các chủng này. Chủng ATCC 13870 thuộc dạng 9 được chỉ ra là có

các đặc tính giống dạng 1 trử việc chúng thiếu sự làm giảm lượng nitrate. Hai

chủng khác là ATCC 31833, ATCC 14752 không có các đặc tính sinh lý như

hai dạng trên. Chủng ATCC 31833 được dùng làm gene chủ trong hệ thống

nhân dòng. Mặt khác, chủng ATCC 14752 vừa được phát hiện là có cấu trúc

lớp S-proteins.

Mặc dù các chủng C. glutamicum có sự khác biệt nho nhỏ trong phân

loại và đặc tính sinh lý, nhưng chúng có đặc tính giống nhau không chỉ ở khả


61

năng sản xuất các amino acid mà còn giống nhau ở các đặc tính quan trọng

trong sự hữu ích cho ngành công nghiệp như là khả năng tăng trưởng, tỉ lệ tiêu

thụ đường và chịu được sự khác nghiệt của môi trường. Từ những sự khác nhau

đó sẽ chọn ra được chủng phủ hợp nhất đưa vào fermenter sản xuất và thu

được kết quả cải thiện đáng kể.

Dựa vào những nghiên cứu ở phòng thí nghiệm, quyết định lấy bộ gene

của chủng hoang dại của C. glutamicum, ATCC 13032 làm gene giống để gây

đột biến có lợi cho sản xuất. Phương pháp này thật sự hữu ích cho việc tạo ra

các chủng phục vụ sản xuất công nghiệp và theo một cơ chế sàn xuất hợp lí.

Những nghiên cứu gần đây đã xác định cụ thể là sự đột biến lysC

(T311I), giảm bớt sự kìm hãm của aspartokinase là chìa khóa để gây đột biến

trong sản xuất L-lysine. Phương pháp gây độ biến lysC cho sáu chủng liệt kê ở

bảng 2.1 bẳng cách thay thế gene dựa vào phasmid hai lần tái tổ hợp

pClysC311 via. Mỗi chủng sẽ được nhân dòng lên mười lần mang thể đột biến

lysC rồi chọn ngẫu nhiên để đi kiểm tra sự sản xuất L-lysine. Tất cả các chủng

đột biến này đều tích lũy L-lysine, L-lysine tạo ra sẽ được mang đi đo bằng

phương pháp HPLC sau khi làm giảm nhạy với o-phthalaldehyde.

Vì không có sự khác biệt rõ về các sản phẩm L-Lysine được khảo sát

trong mười dòng của mỗi chủng nên các nhà khoa học đã chọn một trong mười

dòng của mỗi chủng đem nghiên cứu chi tiết. Kết quả được đưa ra ở bảng 2.2.

Bảng 2. 2 Kết quả thu được từ sáu chủng đột biến ở điều kiện lên men thu

L-lysine khác nhau.

Chủng Chủng

bố mẹ

30°C 40°C

Thời

gian

(h)

Sản lượng

L-Lysine

(g/l)

Năng

suất

(g/l/h)

Thời

gian

(h)

Sản lượng

L-Lysine

(g/l)

Năng

suất

(g/l/h)

AK-1 ATCC

13032 29 53 1.8 27 58 2.1

AK-14752 ATCC

14752 32 33 1.0 35 37 1.1


62

AK-31833 ATCC

31833 30 57 1.9 28 59 2.1

AK-10025 KY

10025 32 55 1.7 31 39 1.3

AK-13869 ATCC

13869 32 57 1.8 30 37 1.2

AK-13870 ATCC

13870 32 47 1.5 28 35 1.3

Dịch chiết thô của sáu chủng đột biến được chuẩn bị bằng cách dùng sóng siêu

âm phá vỡ tế bào, và hoạt động aspartokinase được đo bằng quy tắc so màu theo

phương pháp Folettie. Theo bài báo cáo, aspartokinase của tất cả các chủng đột biến

được khử nhạy thực sự đến việc làm cản trở bởi L-lysine có thêm vào L-threonine ở

các mức độ tương tự. Sản xuất LlLysine từ sáu chủng đột biến được tiến hành trong

fermentor dung tích 5 lít ở điều kiện 30°C theo truyền thống, và ở điều kiện tối ưu

khoảng dưới 40°C theo phương pháp làm giảm sự lạnh trong quá trình sản xuất công

nghiệp.

Đồ thị 2. 1 So sánh sản lượng L-lysine tạo bởi C. glutamicum từ sáu chủng đột biến trong

môi trường lên men theo phương pháp Fed-batch [17].

Thời gian (h)

Sinh

khố

i


63

Hình 2.1 chỉ ra kết quả thu được từ fermentor theo phương pháp lên men

Fed-Batch với LPG1 trung bình, ban đầu thêm 5% glucose, giai đoạn sau tăng

lên 25% glucose thêm vào.

Nhận xét rằng lượng L-lysine thu được là khá lớn từ sáu chủng đột biến

ở cả hai điều kiện nhiệt độ. Nhưng theo bảng 2.2 thì có sự khác biệt về năng

suất rõ rệt ở hai điều kiện nhiệt độ là 30°C và 40°C. Sản lượng L-lysine thu

được ở 40°C cao hơn ở 30°C từ các chủng AK-1, AK-31833, AK-14752.

Ngược lại, sản lượng L-lysine ở 40°C giảm so với 30°C từ các chủng AK-

10025, AK 13869, AK-13870. Kết quả chỉ ra rằng có 3 chủng không phù hợp

để lên men ở nhiệt độ cao. Trong ba chủng này, sản lượng L-lysine thu được ở

40°C cao hơn 30°C trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, nhưng sau đó

sản lượng giảm dần và ở giai đoạn cuối thì trở nên thấp hơn so với sản lượng

thu được ở 30°C, trong khi đó sự tăng trưởng và tiêu thụ đường được duy trì

trong suốt quá trình lên men. Từ đó, người ta cho rằng có một loại enzyme chịu

nhiệt không bền có liên quan đến sự sinh tổng hợp L-lysine trong ba chủng này.

Chúng ta không loại trừ các trường hợp khác có thể xảy ra, tuy nhiên, chắc chắn

rằng có một loại enzyme ở trung tâm trao đổi carbon bị phá hủy dần dần bởi

môi trường ở nhiệt độ 40°C. Chính điều này làm ảnh hưởng đến việc phân phối

carbon đến trung tâm trao đổi chất, do đó kết quả làm giảm tiền chất cung cấp

cho quá trình sinh tổng hợp L-lysine.

Thời gian lên men cũng là một yếu tố đáng chú ý, nó phản ánh mức tiêu

thụ đường. Thời gian lên men của chủng AK-14752 kéo dài đáng kể ở 40°C (35

giờ) so với ở 30°C (32 giờ), nhưng đối với 5 chủng còn lại thì thời gian ngắn

hơn ở 40°C so với 30°C.

Khi xem xét tất cả các yếu tố thấy rằng các chủng hoang dại có một vài

chủng phù hợp lên men ở nhiệt độ cao và tốc độ cao nhưng một vài chủng thì

không. Đối với sáu chủng gây đột biến nghiên cứu trong bài này, chủng AK-1

bắt nguồn từ C. glutamicum ATCC 13032 và AK-31833 bắt nguồn từ C.

glutamicum ATCC-31833 cho năng suất cao nhất (2.1 g/l/h) ở 40°C, cho thấy

tiềm năng của 2 chủng hoang dại ban đầu ATCC 13032 và ATCC 31833 phù

hợp để sản xuất L-lysine theo quy mô công nghiệp. Hơn nữa, chủng AK-31833

cũng cho năng suất cao nhất trong sáu chủng đột biến ở điều kiện lên men


64

30°C, chính điều này đã nới rộng khoảng nhiệt độ cho phép để lên men thu

nhận L-lysine. Phát hiện này có ý nghĩa trong việc cố gắng sản xuất L-lysine từ

chủng hoang dại ATCC 31833, mặc dù chủng này không được sử dụng trong

sản xuất công nghiệp trước đây.

Đây là sự chia sẻ một trong những lợi ích của việc ứng dụng kỹ thuật

gen di truyền cho các chủng C. glutamicum. Thêm vào đó là sự tìm thấy lần đầu

tiên về tiềm năng sản xuất các amino acid khác nhau giữa các chủng C.

glutamicum. Những phát hiện này thực sự quan trọng trong việc chọn bộ gen

giống, vì các chủng được xây dựng từ sự kế thừa từ giống ban đầu là chủng

hoang dại. Tóm lại, đây là một nghiên cứu ấn tượng để ứng dụng vào quá trình

sản xuất trong fermentor đạt năng suất cao từ sự lựa chọn một chủng hoang dại

phủ hợp nhất cho sản xuất theo quy mô công nghiệp.

2.1.3.2. Tạo dòng và xác định trình tự của gen meso-Diaminopimelate-

Dehydrogenase (ddh) của Corynebacterium glutamicum:[33]

Gen ddh của Corynebacterium glutamicum mã hóa meso-

Diaminopimelate (meso-DAP)-D-dehydrogenase (DDH) tham gia vào việc sinh

tổng hợp lysine đã được tạo dòng trong một DAP auxotroph (dapD4) của

Escherichia coli nhờ sự tương hợp của DAP auxotroph. Phân tích cho thấy một

trình tự 1,7-kb Xhol- Kpnl chứa cấu trúc gen ddh. Các hoạt động cụ thể của

DDH thì tăng gấp mười bốn lần khi C. glutamicum được chuyển vào một

plasmid tái tổ hợp chứa gen ddh tạo dòng. Hơn nữa, gen ddh đã được xác định

trình tự và một vài đặc tính của gen ddh đã được đưa ra thảo luận.

Bước cuối cùng của con đường tổng hợp lysine nhờ vi khuẩn là

decarboxyl meso-diaminopimelate (meso-DAP). Con đường tổng hợp DAP

trong E.coli đòi hỏi 4 bước từ L-a-amino-e-ketopimelate (L-AKP) đến meso-

DAP. Trong Bacillus sphaericus, một trong hai con đường được đề suất là

meso-DAP được tổng hợp trực tiếp từ L-AKP bằng phản ứng khử với NH3 và

NADPH, xúc tác bởi enzyme meso-DAP-D- dehydrogenase (DDH) và con

đường này được chứng minh là duy nhất và quan trọng. Nhóm nghiên cứu cho

rằng DDH thêm vào trong con đường tổng hợp DAP thì bao gồm con đường

tổng hợp sinh học lysine trong Corynebacterium glutamicum – một loài quan


65

trọng trong sản xuất lysine công nghiệp. Điều thú vị trong việc làm sáng tỏ con

đường tổng hợp này là làm tăng sản lượng lysine.

Trong bài báo này, nhóm nghiên cứu miêu tả cách tạo dòng và cách xác

định trình tự gen ddh của C. glutamicum.

Nguyên vật liệu và phương pháp

Hoá chất và enzyme:

Enzyme cắt giới hạn được mua từ Takara Shuzo, Boehringer Mannheim

Yamanouchi hoặc Toyobo.

T4 ligase, E. coli DNA polymerase I và một bộ kít trình tự Ml3 ở Takara

Shuzo.

[α – S]dATP (500 Ci/mmol) từ Amersham.

DAP (hỗn hợp của L,L-,D và meso-isomers).

Ampicillin (Ap) và spectinomycin (Spc) từ Sigma.

Giống, plasmid và môi trường: C. glutamicum KY755 (Leu-,

homoserine±, S- (2-aminoethyl)-cysteineR, a-amino-b-hydroxyvalerateR; một

thể đột biến sản xuất lysine thu nhận từ giống hoang dại ATCC 10132 và RRL-

5 (lysozymeS, r-) được sử dụng như nguồn cung cấp DNA và thể nhận. E. Coli

TM132 (F-, dapD4, hsdR2, Met+, RifR, Lac+) được thiết kế trong phòng thí

nghiệm sử dụng chủng AT982 (Hfr, thil, dapD4) và một thể WA802 kháng

rifampicin (Rif) (F-, metBl, Lac-, galK2, galT22, supE, hsdR2), chúng được sử

dụng như là cơ thể chủ cho việc tạo dòng JM103 và cho các vector phage M13.

E.coli được nuôi trong phòng thí nghiệm. DAP (50mg/ml), Ap (50mg/ml) và

Spc (100mg/ml) được thêm vào khi thích hợp. Nồng độ agar sử dụng là 20g/l.

Plasmids pBR322 và PUC 18 và vectors phage Ml3 mpl8 and MPl9 được mua

từ Takara Shuzo. A, plasmid C. glutamicum, pCGll mang gen kháng Spc.

Chuẩn bị những đoạn DNA và plasmid: DNA được tinh sạch từ tế bào

trần của C. glutamicum KYI0755 bằng phương pháp của Saito và Miura.

Plasmid được cô lập bằng cách trích ly trong môi trường kiềm. Những đoạn

giới hạn cho việc sử dụng trong tạo dòng M13 được cô lập bằng sắc kí lọc gel

agarose và eleatroelution trong màng thẩm thấu.


66

Sự dung hợp E.coli TM 132 và JM 103 bằng phương pháp sử dụng

CaCl2 của Cohen và cộng sự. C. glutamicum RRL-5 bằng phương pháp chuyển

đổi protoplast của Katsumata và cộng sự.

Tạo dòng gen ddh: DNA của C. glutamicum KYI0755 được cắt bởi các

enzyme cắt giới hạn EcoRI và enzyme ligase nối vào vị trí EcoRI PBR322. Hỗn

hợp nối này được chuyển vào E.coli TM132. Tế bào tổ hợp này được nuôi trong

phòng thí nghiệm chứa DAP ở 30°C trong 16 giờ, sau đó rửa và đặt vào môi

trường agar chứa Ap và nuôi ở 30oC trong vòng 1-2 ngày. Dòng tổ hợp thu

được (ApR, DAP+) sau đó khảo sát bằng phương pháp nhuộm màu để chọn ra

dòng dương tính với họat động DDH. Từ một trong số các dòng dương tính thu

được đó, một plasmid được thu nhận và thiết kế pCD1.

Xây dựng plasmid chèn gen ddh: plasmid chèn C. glutamicum-E. coli

mang gen ddh được thiết kế. Plasnid pCD1 chứa 1 phần PstI và nối vào trong

pCG11 tại vị trí PstI. Hỗn hợp nối được dùng để chuyển vào E.coli TM132.

Một trong những plasmid tổ hợp từ sự chuyển đổi SpcR, DAP+ và ApS được

thể hiện trong pCD2. Phân tích giới hạn pCD2 thấy rằng plasmid này gồm có

pCG11 và tất cả thành phần của pCD1 được nối với nhau ở phía trong gen b-

lactamase tạo thành từ pBR322.

Xác định trình tự DNA: DNA được xác định trình tự bằng phương pháp tạo

dòng của M13 của Messing và cộng sự và phương pháp dideoxy của Sanger và

cộng sự, khu vực giàu G-C được xác định trình tự với dITP trong vị trí của

dGTP.

Nhuộm hoạt tính của DDH: Nhuộm hoạt tính DDH sử dụng chiết tách thô của

E.coli và C. glutamicum được tiến hành sau khi điện di gel polyacryamide.

Phân tích và tinh sạch enzyme: DDH từ C. glutamicum KYI0755 được

tinh sạch bằng phương pháp của Misono và cộng sự. Hoạt tính của DDH được

xác định bằng phương pháp của Misono và Shimizu cùng cộng sự sử dụng chiết

tách thô. Protein được xác định bằng phương pháp của Lowry và cộng sự.

Phân tích trình tự amino acid: trình tự đuôi NH2 của DDh tinh sạch được

xác định bằng phương pháp sắc kí khí.


67

Kết quả:

Tạo dòng và xác định vị trí của gen ddh: Một vài gen của C. glutamicum

biểu hiện trong E.coli. DDH xúc tác phản ứng của việc hình thành meso-DAP

từ AKP. Nếu gen ddh được biểu hiện trong E.coli thì sự thiếu hụt DAP sẽ được

thỏa mãn, ngược lại mục đích trên sẽ khó đạt được bởi sự đột biến trong dapC,

dapD, dapE hoặc gen DAP epimerase. Do đó, cần đáp ứng meso-DAP từ AKP

trong E.coli cho 4 gen đột biến. Vì vậy, gen ddh của C. glutamicum được tạo

dòng trong thể đột biến dapD4 của E.coli .

Nhuộm họat tính được tiến hành cho 20 thể biến nạp ApR và DAP+ , kết

quả là phát hiện ra hoạt tính của DDH trong 20 thể biến nạp trên. Từ một dòng

dương tính, một plasmid được cô lập và thiết kế pCD1. Plasmid pCD1 chứa cả

những kiểu hình ApR và DAP+ và trực tiếp tổng hợp DDH dựa trên

retransformation (biến nạp liên tiếp nhiều lần). Plasmid này dài xấp xỉ 12kb,

bao gồm vector và đoạn chèn EcoRI 8kb (2 đoạn EcoRI một đoạn 5.3kb và một

đoạn 2.7 kb).

Đoạn 8kb này được tạo dòng thứ cấp trong pUC18 để định vị gen mã

hóa cho DDH và các plasmid pEE1, pEP1, pKSP1, pXH1 và pXK1 được thu

nhận. Những nghiên cứu khuyết đoạn này và những kết quả của việc nhuộm

hoạt tính cho thấy rằng khu vực mã hóa cho DDH nằm giữa vị trí KpnI và

XhoI (»1.7kb).


68

Hình 2. 1 Cô lập gen ddh của C. glutamicum và cấu trúc của một plasmid

tổ hợp C. glutamicum - E.coli [33].

Xác định trình tự gen ddh

Dựa vào trọng lượng phân tử của DDH tinh sạch từ C. glutamicum

ATCC 10132 là 70,000Da và DDH bao gồm hai tiểu đơn vị đồng nhất, khu vực

mã hóa được ước lượng khoảng 1kb. Sự gián đoạn ở vị trí HindIII hoặc SphI

trong đoạn KpnI-XhoI dẫn đến sự mất hoạt tính DDH, cả hai vị trí ở trong gen

ddh. Từ vị trí SphI tới vị trí XhoI là 0.2kb, khu vực mã hóa được xác định là

1kb có thể nằm gần kề với vị trí XhoI. Từ đó trong trình tự, một vài khu vực ở

phía bên kia vị trí XhoI nên được thêm vào đoạn KpnI-XhoI để khảo sát cấu

trúc 3, và 5, khu vực không mã hóa.


69

Hình 2. 2 Nhuộm họat tính DDH sau polyacrylamide gel Electrophoresis [33].

Đoạn KpnI-XhoI từ pXK1 và một khu vực nhỏ từ pEP1 mở rộng về phía

bên kia vị trí XhoI được xác định trình tự và suy ra các trình tự nucleotide và

amino acid. Có một band có kích thước 1,125 nucleoide kéo dài từ vị trí 618

đến 1,742. Trong khung đọc mở này thì 5 codon ATG ở vị trí 618, 690, 699,

723, 783 ngược chiều từ vị trí HindIII (vị trí 840), chính sự gián đoạn này là kết

quả làm cho gen ddh không biểu hiện.

Để quyết định ATG nào là codon thật sự khởi đầu, DDH của C.

Glutamicum KYI0755 được tinh sạch và NH2-terminal amino acid được xác

định trình tự. Chín amino acid đầu tiên được xác định là Thr, Asn, He, Arg,

Val, Ala, He, Val và Gly trong thứ tự này. Sự tương quan này suy ra trình tự

của các amino acid chỉ khi sự dịch mã được bắt đầu ở vị rí 783. Do đó codon

bắt đầu cho khung đọc mở là ATG ở 783.


70

Hình 2. 3 Sơ đồ vật lý, phân tích và đánh dấu trình tự của DNA

C. glutamicum chứa gen ddh [33].

Khu vực mã hóa bao gồm 960 nucleotide tương ứng với 320 amino acid

của protein. Amino acid cuối cùng của DDH tinh sạch được tìm thấy là

threonine, amino acid methionine đầu tiên thì bị mất đi sau khi sự dịch mã bắt

đầu. Cho nên DDH được tính toán là 35,099 đơn vị.

Ngược chiều từ khu vực mã hóa là một trình tự Shine-Dalgarno (SD)

quan trọng GGAGG, trình tự này có giống promoter. Sau khu vực mã hóa là

một trình tự nhân tố kết thúc p độc lập.

Biểu hiện của gen ddh tạo dòng trong C. glutamicum: C. glutamicum

RRL-5 được tổ hợp với pCD2, plasmid C. glutamicum- E.coli mang gen ddh.

Hoạt tính đặc biệt của DDH được gia tăng khoảng mười bốn lần trong cơ thể tổ

hợp.


71

Bảng 2. 3 Hiệu quả của gen ddh trong C. Glutamicum [33].

Bảng 2. 4 Cách sử dụng codon của gen ddh [33].

Thảo luận

Bài báo này đã đưa ra việc tạo dòng và xác định trình tự gen ddh của C.

glutamicum trong E.coli. Plasmid chứa gen tạo dòng trực tiếp tổng hợp DDH

trong E.coli. Gen tạo dòng từ C. glutamicum, một homoserine

dehydrogenasehomoserine kinase (HD-HK) operon và gen prephenate

dehydrogenase (pheA) thì có chức năng trong E.coli và ngược lại gen từ E.coli

có thể biểu hiện trong C. glutamicum. Từ đó, các khu vực có trách nhiệm phiên

mã và dịch mã giống như mỗi cơ thể khác.


72

Trình tự DNA ngược từ khu vực mã hóa chứa một trình tự SD quan

trọng và trình tự giống promoter (được coi là trình tự -10; TAAGCT và -35:

TCATCA) cho E.coli như là operon HD-HK của C. glutamicum. Thành phần

G+C của DNA từ C. glutamicum là 35% và đó là đoạn base 1,829 được xác

định trình tự là 56% . Trong đoạn khu vực mã hóa (60%) thì giàu G+C hơn khu

vực không mã hóa 5, (52%). Bảng 2.4 chỉ ra rằng có một codon sai biệt, C

trong vị trí thứ 3 trong sự so sánh với 16, 19 và 10% cho A, G và T. Khi có một

sự sai biệt thì thu nhận được trong gen phe A nhưng không có trong operon

HD-HK của C. glutamicum.

Amino acid cuối cùng của DDH được tìm thấy là threonine chứ không

phải là methionine. Amino acid methionine thì bị mất đi sau khi sự dịch mã bắt

đầu. Mặc dù không có sự hoạt động nhưng aminopeptidase methionine có thể

hiện diện trong C. glutamicum như trong E. coli.

Trong bài thí nghiệm tạo dòng này, gen dapA của C. glutamicum không

được biểu hiện là do sự gián đoạn của khu vực thay thế cho biểu hiện gen bằng

EcoRI và đang có những cố gắng để tạo dòng gen dapA của C. glutamicum.

Lysine được cung cấp một cách rộng rãi trong quy mô công nghiệp bằng

lên men sử dụng những thể đột biến của vi khuẩn acid glutamic đại diện là C.

glutamicum. Trong con đường tổng hợp lysine ở C. glutamicum DDh cung cấp

meso-DAP để tổng hợp lysine. Một sự gia tăng 14 lần trong hoạt tính đặc biệt

của DDH được thu nhận sau khi giới thiệu gen tạo dòng trong một đối tượng

không phải đối tượng sản xuất.

2.1.3.4. Khuếch đại biểu hiện của Fructose 1,6-biphosphatase trong tế bào

Corynebacterium glutamicum thông qua con đường pentose phosphate và sản

xuất lysine từ các nguồn carbon khác nhau:[18]

Sự tác động quá mức của fructose 1,6 – biphosphatase (FBPase) trong

Corynebacterium glutamicum có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện sản

xuất lysine từ các nguồn đường khác nhau. Sự khuếch đại biểu hiện của FBPase

qua promoter của gen mã hóa yếu tố kéo dài TU (EFTU) làm tăng sản lượng

lysine trong sản xuất không tuân theo những qui tắc của lên men feedback từ

chủng C. glutamicum lysCfbr có 40% glucose và 30% fructose hay sucrose. Hơn

nữa, sự hình thành các sản phẩm glycerol và dihydroxyacrtone được giảm đáng


73

kể trong đột biến PEFTUfbp. Theo tiết lộ, sự trao đổi chất ở carbon thứ 13 của

glucose tác động quá mức của FBPase là lí do chuyển hướng trao đổi carbon từ

chu trình glycosis về phía chu trình pentose phosphate (PPP) và do đó dẫn đến

tăng cung cấp NADPH. Bình thường với một lượng glucose hấp thụ là 100%,

lượng tương đối vào PPP là 56% C. glutamicum lysCfbr PEFTU và 46% C.

glutamicum lysCfbr. Cơ chất cung cấp cho NADPH là 180% đối với chủng

PEFTUfbp và chỉ 146% cho chủng gốc ban đầu của chúng. Khuếch đại cùa

FBPase làm tăng sản lượng lysine thông qua việc tăng sự cung cấp NADPH. So

sánh nghiên cứu này với các chủng đột biến khác duy trì the sod promoter

upstream của gen biểu thị fbp rằng mức độ biểu hiện của FBPase liên quan đến

mức độ hiệu quả trao đổi chất. Sự biểu hiện quá mức của FBPase xem như hữu

ích cho sản xuất lysine trong công nghiệp từ tinh bột và mật mía từ C.

glutamicum. Việc chuyển hướng trao đổi chất vể phía PPP cũng thú vị để sản

xuất khác NADPH – yêu cầu các hợp chất cũn như sản phẩm trực tiếp bắt

nguồn từ PPP.

Vi sinh vật được sử dụng trong bài nghiên cứu này là các giống đột biến

từ chủng hoang dại C. glutamicum ACTT 13032.

Bảng 2. 5 Giống C. glutamicum dùng trong bài nghiên cứu này [18].

Chủng Sự thay đổi

Chủng Sự sửa đổi


74

Bảng 2. 6 Vị trí chuỗi primer đặc biệt được sử dụng phổ biến để thay thế trong G. glutamicum

bằng phương pháp PCR và chuỗi DNA tiếp theo sau [18].

Corynebacterium glutamicum sản xuất thành công lysine trong công

nghiệp hơn 40 năm, sản xuất hàng ngàn tấn lysine mỗi năm trên thị trường thế

giới. Chủng sản xuất cổ điển vẫn được sử dụng đến ngày nay, tuy nhiên hiện

nay sử dụng chủng đột biến từ chủng gốc ban đầu và nhờ đó làm giảm lượng

đường sử dụng, tăng sản lượng và chịu được điều kiện khắc nghiệt.

Để đạt được những mục tiêu như vậy, so sánh không ngừng chủng C.

glutamicum hoang dại và các chủng sản xuất gần đây là một chiến lược mạnh

mẽ. Bằng cách làm này, các đột biến được xem là chìa khóa phản ứng để giải

quyểt việc sinh tổng hợp trong sản xuất hay cung cấp trao đổi chất được xác

định và sau đó giới thiệu chủng hoang dại.

Trong bài nghiên cứu này, phân tích quá trình trao đổi chất đóng vai trò

quan trọng trong trung tâm trao đổi chất của C. glutamicum để sản xuất lysine.

Quá trình sinh tổng hợp lysine đòi hỏi nhiều NADPH. Phương pháp chính cho

sự hình thành NADPH trong C. glutamicum là con đường pentose phosphate

(PPP) với hai loại enzyme tạo ra NADPH là glucose 6-phosphate

dehydrogenase và 6-phosphpgluconate dehydrogenase.

Enzyme fructose 1,6 – biphosphate (FBPase) được xem là mục tiêu tiềm

năng để sản xuất lysine. Enzyme này là một phần của chu trình gluconeogenetic

và giúp C. glutamicum phát triển mà noncarbohydrate như là acetate, citrate,

Gen mục tiêu Đoạn mồi


75

glutamate. Trong suốt giai đoạn phát triển trên đường, không cần fructose 1,6 –

biphosphate và bị ức chế hay đàn áp bởi các cơ chế khác. C. glutamicum phát

triển trên đường glucose hay fructose mà hoàn toàn thiếu hoạt động của

fructose 1,6 – biphosphatase. Chính vì thiếu enzyme này đã làm giảm hiệu suất

sản xuất lysine mặc dù con đường PPP có tác dụng nâng cao sự hình thành sản

phẩm. Vi vậy, kết luận rằng enzyme fructose 1,6 – biphosphatase có ảnh hưởng

đến sản lượng là hiệu suất sản xuất lysine từ những nguồn carbon khác nhau.

Kết quả:

Hoạt động của fructose 1,6-biphosphatase trong tế bào ở những chủng C.

glutamicum khác nhau:

Fructose 1,6-biphosphatase biểu hiện hoạt tính trong tế bào của chủng

bố mẹ C. glutamicum lysCfbr là tương đối thấp.

Đồ thị 2. 2 Hoạt động invivo của fructose 1,6-biphosphatase trong

các chủng C. glutamicum khác nhau [18].

Ảnh hưởng của fructose 1,6-biphosphatase vào sự sản xuất lysine:

C. glutamicum lysCfbr có vi trò quan trọng trong việc sản xuất lysine trên

nhiều nguồn carbon khác nhau.


76

Bảng 2. 7 Sản lượng và những đặc trưng của sự sản xuất lysine của

C. glutamicum ACTT 13032 [18].

Đây là kết quả của quá trình lên men feedback – chịu được sự có mặt của

aspartikinase chứa trong chủng này, mà là lý do để sinh tổng hợp lysine. Sản

lượng lysine đạt khoảng C-mmol C-mol-1 (1C-mol = 1 mol C) từ nguồn cơ chất

là glucose hay sucrose, còn đối với fructose thì năng suất thấp hơn khoảng

20%.. Hơn nữa, việc ứng dụng fructose 1,6-biphosphatase trong C. glutamicum

lysCfbr PEFTUfbp làm tăng mạnh sản lượng lysine thu được trên cả ba nguồn

carbon. Sự gia tăng cao nhất là ở cơ chất glucose (40%), nhưng cải thiện đáng

kể là trên cơ chất sucrose (30%) và fructose (30%). Đối với chủng C.

glutamicum lysCfbr PSODfbp cũng cải thiện sản lượng lysine thu được, tuy nhiên

không tăng mạnh đối với cả ba nguồn carbon sử dụng.

Ảnh hưởng của fructose 1,6-biphosphatase lên sự phát triển:

Thêm vào sự gia tăng sản lượng lysine, chủng C. glutamicum lysCfbr

PEFTUfbp cũng như các chủng khác đều có ảnh hưởng đến sự phát triển. Trên cơ

chất glucose, tỉ lệ phát triển µ (0,31 h-1) của C. glutamicum lysCfbr PEFTUfbp thì

thấp hơn so với lysCfbr (µ = 0,39 h-1). Nhưng kết quả này không phải do cơ chất

khác nhau, bởi vì cả hai chủng đểu thu được giá trị tương tự là 4.9 mmol/g.h

cho C. glutamicum lysCfbr và 4.8 mmol/g.h cho C. glutamicum lysCfbr

PEFTUfbp. Kết luận là sự giảm ở đây là do sinh khối giảm. Mặc dù FBPase

không phụ thuộc vào nguồn cơ chất khác nhau nhưng khá là ảnh hưởng đến sự

phân phối nguồn carbon nội bào.

Chủng C.glutamicum Nguồn C


77

Sự thú vị là khào sát sự phát triển của tế bào trên nguồn đường fructose,

C. glutamicum lysCfbr PEFTUfbp phát triển nhanh (µ=0,35 h-1) hơn chủng bố mẹ

của chúng (µ = 0,27 h-1) và sản lượng sinh khối thu được cũng cao hơn. Kết quả

sử dụng nguồn fructose đạt hiệu quả cao hơn ở C. glutamicum lysCfbr PEFTUfbp

(qs = 4.7 mmol/g.h) trong khi ở C. glutamicum lysCfbr chỉ đạt qs = 4.4

mmol/g.h.

Ảnh hưởng sự biểu hiện của fructose 1,6-biphosphatase lên quá trình

hình thành sản phẩm:

Dựa vào nghiên cứu về enzyme FBPase thấy rằng chúng hoạt động mạnh

trong tế bào của C. glutamicum và đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện

sự sản xuất lysine.

Bảng 2. 8 Sinh khối và các chất chuyển hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr

và C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp từ 99% [1-13C] glucose [18].

Dựa vào bảng 2.8, lượng lysine từ 2 chủng đột biến thu được đều cao

nhưng ở chủn C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp là cao hơn hẳn so

với C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr.

Thông số


78

Bảng 2. 9 Nhu cầu đồng hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp

và C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr trên nguồn glucose [18].

Tóm lại, tăng sự biểu hiện của fructose 1,6-biphosphatase có vai trò quan

trọng trong cải thiện sự sản xuất lysine. Vì vậy, sự biến đổi gen hứa hẹn sẽ được

ứng dụng trong sản xuất theo quy mô công nghiệp dựa trên nguồn cơ chất là

tinh bột, mật mía, đường nguyên chất. Khảo sát giữa 2 giống đột biến là C.

glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp là cao hơn hẳn so với C. glutamicum

ATCC 13032 lysCfbr để làm rõ vai trò biểu iện của FBPase.

Hơn nữa, gen tham gia vào sự hình thành glycerol và dihydroxyacetone

trong C. glutamicum không được xác định. Nhưng hàm lượng glycerol và

dihydroxyacetone thì có liên quan đến sự hoạt động của FBPase trong tế bào.

Sự hình thành glycerol và dihydroxyacetone sẽ giảm khi tăng biểu hiện của

FBPase. Do đó, kết luận rằng sự tổng hợp các chất này là hiện tượng tràn ra

trong C. glutamicum bị giới hạn bởi enzyme FBPase.

2.2. Công nghệ lên men L-lysine:

2.2.1. Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid amin L-lysine :

Năm 2007, Nguyễn Thuỳ Châu và cs. đã tiến hành phân lập các chủng

Corynebacterium glutamicum có khả năng tổng hợp L-lysine cao từ các mẫu đất ở

Việt Nam, sau đó gây đột biến bằng nitrosoguanidine để thu được các thể đột biến

dị dưỡng với homoserin kí hiệu là CM24 có khả năng tổng hợp L-lysine cao nhất.

Đồng thời, nhóm nghiên cứu đã thực hiện khảo sát quá trình lên men thu nhận L-

Nhu cầu tiền chất [mmol (mol glucose)-1]


79

lysine bằng thể đột biến CM24 ở qui mô 50 lít, 150 lít. Từ đó đưa ra qui trình lên

men L-lysine theo mẻ với qui mô 1500lít, thu hồi và tạo chế phẩm L-lysine.

4 môi trường được nghiên cứu có nguồn Carbon thay đổi lần lượt là : 30g/l

glucose, 100g/l glucose, 130g/l mật rỉ đường , 80g/l mật rỉ đường. Trong đó môi

trường chứa 130 g/l mật rỉ đường cho sản lượng L-lysine cao nhất là 30g/l, và được

lựa chọn để lên men trong các thí nghiệm sau.

Bảng 2. 10 Khả năng lên men của chủng CM24 trên 4 loại môi trường [6].

Môi trường 30g/l glucose 100g/l glucose 130g/l mật rỉ

đường

80g/l mật rỉ

đường

Sản lượng L-

lysine (g/l) 22 25 30 18

Khi lên men ở quy mô 50 lít, thời gian tối ưu để lên men L-lysine là 72 h.

Từ đồ thị 2.2, sinh khối phát triển cực đại ở 24 giờ, pha cân bằng bắt đầu từ 24 giờ

đến 78 giờ. Hàm lượng L-lysine tăng mạnh từ 18 giờ đến 72 giờ. Hàm lượng L-

lysine đạt cao nhất là 30g/lít.

Đồ thị 2. 3 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và

sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít [6].

Khoảng nhiệt độ lên men khảo sát là từ 20 đến 35oC. Kết quả ở đồ thị 2.3

cho thấy đột biến thể CM24 khi lên men ở nhiệt độ 30oC cho sản lượng L-lysine


80

đạt cao nhất là 31g/l. Vì vậy có thể nói rằng nhiệt độ 30oC là thích hợp cho quá

trình lên men sinh tổng hợp L-lysine.

Đồ thị 2. 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít [6].

Khoảng pH khảo sát từ 6- 7.5, trong đó pH tối ưu cho quá trình sự sinh tổng

hợp lysine của đột biến thể CM24 là 7,0 cho sản lượng L-lysine cao nhất, đạt 31g/l

(bảng 2.6).

Bảng 2. 11 Ảnh hưởng của pH lên sản lượng L-lysine qui mô 50 lít [6].

pH môi trường 6.0 6.5 7.0 7.5

Sản lượng L-lysine

(g/l) 18 23 31 25.5

Hàm lượng Oxy hòa tan được thay đổi trong quá trình lên men tại những

thời gian điểm nhất định, để khảo sát ảnh hưởng của oxy lên hoạt động sinh tổng

hợp L-lysine. Kết quả ở bảng 2.7 cho thấy khi điều khiển độ oxy hoà tan trong suốt

quá trình lên men là 100% sản lượng L-lysine là 32,2 g/l tại thời điểm 72 giờ. Khi

độ oxy hòa tan thay đổi trong quá trình lên men, giảm từ 100% từ giờ thứ 12 đến

giờ 24 xuống còn 90% ở thời gian còn lại của quá trình lên men, sản lượng L-

lysine giảm xuống còn 28,2 g/l. Như vậy có thể nói rằng đột biến thể CM 24 là

chủng hiếu khí cao, cần oxy trong quá trình sinh tổng hợp L-lysine .


81

Bảng 2. 12 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít [6].

Thời gian lên

men (h)

Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2

Độ oxy hòa tan (%) Sản lượng L-

lysine (g/l)

Độ oxy hòa

tan (%)

Sản lượng

L-lysine

(g/l)

0 100 - 100 -

12 100 - 100 -

24 100 3.8 90 3.1

36 100 8.1 90 6.8

48 100 16 90 14

60 100 24.2 90 21.5

72 100 32.2 90 28.2

84 100 30 90 25.2

Dựa trên những kết quả thu được khi khảo sát quá trình lên men ở qui mô 50

lít, nhóm nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ lên men L-

lysine trên hệ thống lên men 150 lít. Dựa vào kết quả ở đồ thị 2.4 và bảng 2.8, ta

thấy động thái sinh tổng hợp L-lysine ở quy mô 150 lít không khác gì so với qui

mô 50 lít đã trình bày ở trên.

Đồ thị 2. 5 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và

sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít [6] .


82


Thời gian lên

men (h)


Độ oxy hòa tan

(%)

Sản lượng

L-lysine

(g/l)

Độ oxy hòa tan

(%)

Sản lượng

L-lysine

(g/l)

0 100 - 100 -

12 100 - 100 -

24 100 3.8 90 3.1

36 100 8.1 90 6.8

48 100 16 90 14

60 100 24.2 90 21.5

72 100 30.2 90 28.2

84 100 30.2 90 25.2

Tuy nhiên, khi nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ lên men L-lysine trên hệ

thống lên men 1500 lít, một vài thông số có sự thay đổi. Dựa vào đồ thị 2.5 và bảng

2.9, sản lượng L-lysine ở 72 giờ là 28,5g/l. Sản lượng này giảm hơn so với sản

lượng ở hệ thống 150l/mẻ. Có thể lý giải rằng hiệu quả khuấy của hệ thống

1500l/mẻ có kém hơn so với hệ thống 150l/mẻ đó dẫn đến kết quả trên .

Đồ thị 2. 6 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng

L-lysine ở qui mô 1500 lít [6].


83


Thời gian lên

men (h)


Độ oxy hòa tan

(%)

Sản lượng

L-lysine

(g/l)

Độ oxy hòa

tan (%)

Sản

lượng L-

lysine

(g/l)

0 100 - 100 -

12 100 - 100 -

24 100 3.8 90 3.1

36 100 8.1 90 6.8

48 100 16 90 14

60 100 24.2 90 21.5

72 100 28.5 90 25.5

84 100 28.5 90 25.5

Công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm L-lysine cũng được nghiên cứu. Dịch

sau khi lên men được li tâm trên hệ thống li tâm liên tục với vận tốc 16000v/phút

để loại bỏ tế bào vi khuẩn, thu dịch nổi. Tiến hành sắc ký trao đổi cation bằng nhựa

Dowex 50. Dịch chiết rút của quá trình sắc ký trao đổi ion được cô đặc bằng thiết

bị cô chân không RP2 của Anh quốc. Sau khi thu hồi bằng sắc ký trao đổi ion và cô

đặc bằng cô chân không được phối trộn với bột sắn tinh theo tỷ lệ L-lysine /bột sắn

là 7:3. Tiến hành sấy phụ hỗn hợp ở nhiệt độ 50-55oC thu được thành phẩm chứa

70% L-lysine.Kết quả được chỉ ra ở bảng 2.15

Bảng 2. 15 Hiệu suất thu hồi L-lysine [6].

Lượng L-lysine (g/1000 lít)

Trước thu hồi 30200

Thu hồi bằng sắc kí và cô chân không 27180

Hiệu suất thu hồi 90%


84

Từ các khảo sát trên , nhóm nghiên cứu đã đưa ra qui trình công nghệ lên

men L-lysine qui mô 1500 lít/mẻ như sau:

Chủng Corynebacterium glutamicum đột biến dị dưỡng homoserin giữ ở

ống thạch nghiêng ở 4oC trên môi trường L3 (Giống gốc giữ bằng phương pháp

đông khô và bảo quản trong tủ lạnh -200C). Nhân giống trong bình tam giác 500ml

có chứa 150ml môi trường L3 (thành phần gồm: mật rỉ đường 130 g/l, NH4Cl 20

g/l, Ure 5 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4.7H2O 0,4 g/l; FeSO4.7H2O 10mg;

MnSO4.4H2O 8mg; đậu tương thủy phân 10 g/l; thiamin 0,1mg; biotin 0,3mg; pH

= 7) tỷ lệ tiếp giống là 10%. Nuôi cấy lắc ở vận tốc 200v/phút trong 24h. Nhân

giống trên hệ thống lên men 150 lít /mẻ trong 24h trên môi trường L3 tỷ lệ tiếp

giống là 10%. Lên men L-lysine trên hệ thống lên men 1500 lít /mẻ trong 72h trên

môi trường L3, tỷ lệ tiếp giống là 10%. Ly tâm ở vận tốc 16.000v/phút, loại bỏ xác

tế bào, thu dịch nổi. Tiến hành sắc ký trao đổi cation bằng nhựa Dowex 50 có

nhóm acid và rửa giải bằng dung dịch amonium hydroxide. Dịch chiết rút chứa L-

lysine được cô đặc bằng cô chân không đến thể tích 1/10 sau đó được acid hóa

bằng HCl và kết tinh bằng hạ nhiệt độ, dịch L-lysine cô đặc được phối trộn với bột

sắn theo tỷ lệ 7:3. Tiến hành sấy khô hỗn hợp ở nhiệt độ 500C – 550C, thu được

thành phẩm dạng bột chứa 70% L-lysine, với hàm ẩm 12%.

Theo tính toán sơ bộ, giá thành sản xuất thử cho 30 kg L-lysine cho 1 mẻ

sản xuất ở hệ thống lên men chìm sục khí 1500 l/ mẻ như sau:

Tiền môi trường cho lên men: 50 000 đ/ kg

Tiền hóa chất cho thu hồi acid amin: 15 000 đ/ kg

Tiền năng lượng và khấu hao thiết bị : 27 000đ/kg

Tiền nhân công : 15 000 đ/ kg

Tổng : 107 000 đ/kg

Nghiên cứu trên tuy còn một số hạn chế khi mà hàm lượng L-lysine thu

được khá thấp 28.5 g/l. Nhưng đã bước đầu đưa ra được một qui trình công nghệ

hoàn thiện từ khâu nhân giống, lên men, và tạo ra chế phẩm cuối cùng, có thể

chuyển giao vào sản xuất.

Thực tế cho thấy mật rỉ đường ở nước ta hiện nay chủ yếu mới chỉ được sử

dụng để sản xuất cồn. Trong khi đó, có rất nhiều sản phẩm có thể sản xuất được từ

rỉ đường để đáp ứng nhu cầu cuộc sống , song vẫn chưa triển khai được. Đặc biệt


85

các acid amin như L- lysine, là những chất có thể sản xuất từ rỉ đường nhưng ta vẫn

phải nhập ngoại với số lượng vài trăm tấn/năm trị giá nhiều chục tỉ đồng. Vì vậy,

việc nghiên cứu công nghệ sản xuất các acid amin L-lysine là rất cần thiết để đa

dạng hoá các sản phẩm sau đường và phát triển chăn nuôi, dược phẩm.

2.2.2. Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự do và

chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine:

Năm 2009, Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Minh Tâm đã nghiên cứu ứng

dụng vi khuẩn Corynebacterium sp. cố định trong lên men thu nhận L-lysine. 3

loại chất mang khảo sát là Alginate, Bacterial Cellulose (BC) và phức Alginate –

Bacterial Cellulose (BC-A) tương ứng với 3 phương pháp cố định là: nhốt, bẫy-

hấp phụ, kết hợp nhốt và bẫy – hấp phụ. Điều kiện tối ưu thu nhận L-lysine là:

môi trường lên men chứa 8,35 % glucose ,điều kiện lên men: giống bổ sung

3%, pH 7.0, nhiệt độ 30oC, thời gian lên men 72 giờ. Quá trình lên men được thực

hiện trong fermentor với tốc độ khuấy đảo 300 vòng/phút, dO2 = 100%. Sử dụng

3 chế phẩm Corynebacterium sp (được cố định bằng 3 chất mang alginate, BC và

phức BC-A) để lên men thu nhận lysine nhằm so sánh hiệu quả của các chế phẩm

cố định đó. Tiêu chí đánh giá đánh giá để xác định số lần tái sử dụng là sản lượng

L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng các chế phẩm cố định trong cùng

một thời gian lên men là 72h. Một số kết quả thu được như sau:

Các chế phẩm vi khuẩn Corynebacterium sp cố định trên alginate dưới tác

động khuấy đảo trong lên men, đã bị trương và vỡ ra sau 5 lần tái sử dụng. Trong

môi trường lên men có một lượng Na+ và gốc phosphate là những tác nhân phá vỡ

cấu trúc hệ gel của alginate. Trong khi đó, màng BC giữ nguyên cấu trúc rất chắc

sau 10 lần theo dõi tái sử dụng (đồ thị 2.7).

Dựa vào các yêu cầu của chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào, ưu điểm

nổi bậc của chất mang BC thể hiện qua 4 điểm: tính chất cơ lý bền vững, dễ phù

hợp với hình dạng thiết bị lên men, giá thành thấp và số lần tái sử dụng cao.

Nhưng kiểu cố định tế bào bằng phương pháp bẫy-hấp phụ dẫn đến hiện tượng rửa

trôi tế bào sau mỗi lần tái sử dụng. Vì vậy, khi cố định tế bào bằng phương pháp

bẫy-hấp phụ trên BC chỉ có khả năng tái sử dụng khoảng 9 lần (đồ thị 2.6). Khi

kết hợp với nhốt tế bào bằng alginate trên phức BC-A đã khắc phục được hiện


86

tượng rửa trôi tế bào. Sau 10 lần tái sử dụng chế phẩm vi khuẩn cố định trên BC,

tỷ lệ rửa trôi lên đến 32%, tương ứng là sản lượng lysine giảm 40% so với đối

chứng. Đối với chất mang BC-A, sau 13 lần tái sử dụng tỷ lệ rửa trôi là 27%,

tương ứng sản lượng lysine giảm 25% so với đối chứng. Kết quả khảo sát tỷ lệ rửa

trôi tế bào thể hiện qua bảng 2.16.

Đánh giá hiệu quả cố định của chế phẩm Corynebacterium sp cố định trên

các chất mang thông qua sản lượng lysine trong quá trình lên men và xử lý số liệu,

cho kết quả như sau:

Đối với chất mang alginate: có thể tái sử dụng 3 lần cho hiệu quả lên men

không khác biệt so với đối chứng. Lần lên men tái sử dụng thứ 4, sản lượng lysine

giảm khoảng 24%. Lần tái sử dụng thứ 5, sản lượng giảm 32%. Dưới tác động

khuấy đảo trong quá trình lên men, chế phẩm Corynebacterium sp cố định trên

alginate bị trương và vỡ ra sau 5 lần tái sử dụng.

Đối với chất mang BC: có thể tái sử dụng 8 lần cho hiệu quả lên men

không khác biệt so với đối chứng. Lần lên men tái sử dụng thứ 9, sản lượng lysine

giảm khoảng 24%. Lần tái sử dụng thứ 10, sản lượng lysine giảm 40%. Chính sự

khác biệt của sản lượng lysine qua các lần lên men tái sử dụng, nên đối với chất

mang BC, số lần tái sử dụng được xác định là 8 lần.

Đối với phức chất mang BC-A: có thể tái sử dụng 12 lần cho hiệu quả lên

men không khác biệt so với đối chứng. Lần lên men tái sử dụng thứ 13, sản lượng

lysine giảm khoảng 25%. Lần tái sử dụng thứ 14, sản lượng lysine giảm 38%. Do

sự khác biệt của sản lượng lysine qua các lần lên men tái sử dụng nên đối với phức

chất mang BC-A, số lần tái sử dụng được xác định là 12 lần.

Chất mang BC và phức BC-A, sau số lần theo dõi tái sử dụng để lên men

vẫn giữ được nguyên trạng thái cấu trúc ban đầu. Đây cũng là một ưu điểm, thể

hiện qua tính chất vật lý của BC và củng là một yêu cầu quan trọng của chất mang

trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật. Với phức BC-A, các tế bào được nhốt bởi

gel alginate trong mạng lưới BC, giúp giảm tỷ lệ rửa trôi tế bào trong quá trình tái

sử dụng để lên men (bảng 2.15), vì vậy số lần tái sử dụng gia tăng (đồ thị 2.7).


87

Alginate BC BC-A

Đồ thị 2. 7 Sản lượng L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng các chế phẩm

vi khuẩn cố định. [8]

Bảng 2. 16 Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%) [8].

Chất

mang

Lần tái sử dụng

2 4 6 8 10 12 13

Alginate 8 35 x x x x x

BC 12 15 19 25 32 x x

BC-A 9 12 17 19 22 23 27

(x): không có khả năng tái sử dụng.

Chất mang BC có nhiều ưu thế hơn các chất mang truyền thống alginate

trong kỹ thuật cố định tế bào vi khuẩn Corynebacterium sp. BC hoàn toàn phù hợp

với các yêu cầu của chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi khuẩn. Phức chất

mang BC-A phát huy được những ưu thế của chất mang Bacterial cellulose và

Alginate. Hiệu quả sử dụng chế phẩm Corynebacterium sp cố định trên phức chất

mang BC-A trong lên men thu nhận lysine khá cao: có thể tái sử dụng chế phẩm

12 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men và sản lượng lysine so với đối

chứng sản lượng lysine trung bình là 30g/l.


88

2.2.3. Nghiên cứu quá trình lên men thu nhận L-lysine ở các chế độ lên men

khác nhau:

Nakamura et al [25] đã nghiên cứu quá trình lên men thu nhận L-lysine bằng

Brevibacterium lactofermentumATCC 21800, Brevibacterium flavum ATCC

21475 và Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 21491 ở các chế độ lên men

khác nhau: lên men batch, lên men fed batch chỉ bổ sung glucose, fed batch bổ

sung glucose và các thành phần khác, repeat fed batch, lên men liên tục. Môi

trường lên men ban đầu chứa 80g/l mật rỉ đường, hàm lượng glucose trong môi

trường bổ sung là 40g/l, Dịch đậu nành thủy phân 100mg/l, Thiamine HCL 0,1

mg/l, biotin 0,3 mg/l. Trong quá trình lên men fed batch, 100ml môi trường bổ

sung được thêm vào sao cho nồng độ đường trong canh trường nuôi cấy duy trì ở

các mức dưới 5g/l và từ 5-15 g/l, quá trình lên men kết thúc vào thời điểm hàm

lượng đường trong canh trường nuôi cấy được sử dụng hết. Trong repeat fed batch,

sau khi 100 ml môi trường bổ sung được thêm vào, 100ml canh trường được rút ra

từ fermentor tại thời điểm đường trong canh trường nuôi cấy cạn kiệt, tiếp tục bổ

sung thêm môi trường bổ sung, quá trình nuôi cấy được tiếp tục. Trong trường hợp

này, nồng độ đường trong canh trường nuôi cấy cũng được giữ ở mức 5 g/l hoặc

thấp hơn. Sau khi 100 ml môi trường bổ sung được thêm vào, quá trình nuôi cấy

kết thúc tại thời điểm đường trong canh trường nuôi cấy cạn kiệt. Canh trường

trong fermentor và canh trường lấy ra trước đó được trộn với nhau và đem đi định

lượng L-lysine. Trong lên men liên tục, môi trường bổ sung cho quá trình nuôi cấy

liên tục được bổ sung sau 25h kể từ khi quá trình lên men bắt đầu, môi trường bổ

sung sử dụng là môi trường trường lên men ban đầu đem đi pha loãng 4 lần,

khoảng 1 lít môi trường được đưa vào với độ pha loãng 0.05/h để thực hiện quá

trình nuôi cấy liên tục, khi đạt được trạng thái ổn định, đem đi định lượng hàm

lượng L-lysine trong môi trường nuôi cấy. Tất cả các quá trình nuôi cấy được thực

hiện với tỉ lệ giống bổ sung là 5%, ở pH=7, nhiệt độ 31,5oC, tốc độ sục khí là ½

vvm, tốc độ khuấy 700 rpm. Trong đó, các kết quả ở thí nghiệm trước là tiến đề các

thí nghiệm sau.

Ở thí nghiệm 1, so sánh các chế độ lên men: lên men batch, lên men fed

batch chỉ bổ sung glucose, fed batch bổ sung glucose và các thành phần khác,


89

giống sử dụng là Brevibacterium lactofermentum ATCC 21800. Kết quả thu được

như sau:

Bảng 2. 17 Sản lượng L-lysine thu được bằng các phương pháp lên men khác nhau.[25]

Phương pháp lên men Năng suất L-lysine (g/l.h) Sản lượng L-lysine

(%)

Lên men batch 2,2 32

Fed batch chỉ bổ sung

glucose 2,3 33

Fed batch bổ sung glucose

và các thành phần khác 2,8 35

Ở thí nghiệm 2, tiến hành lên men fed batch, nồng độ đường trong canh

trường nuôi cấy duy trì ở các mức dưới 5g/l và từ 5-15 g/l. Giống sử dụng là

Brevibacterium flavum ATCC 21475. Kết quả thu được như sau:

Bảng 2. 18 Ảnh hưởng của hàm lượng đường giới hạn lên năng suất và sản lượng L-lysine

[25].

Hàm lượng

đường

Năng suất L-lysine

(g/l.h)

Sản lượng L-lysine

(%)

Thấp hơn 5 g/l 2,9 34

Từ 5-15 g/l 2,5 32

Ở thí nghiệm 3, khảo sát quá trình lên men repeat fed batch, sử dụng giống

Brevibacterium flavum ATCC 21475, kết quả thu được: năng suất đạt được là 3,8

g/l.h, sản lượng là 42 %.

Ở thí nghiệm 4, khảo sát quá trình lên men repeat fed batch và liên tục, sử

dụng giống Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 21491.


90

Bảng 2. 19 Năng suất và sản lượng L-lysine trong lên men repeat fed batch và liên tục [25].

Phương pháp lên

men Năng suất L-lysine (g/l.h) Sản lượng L-lysine (%)

Repeat fed batch 3,9 41

Liên tục 3,5 35

Các kết quả trên cho thấy:

So với quá trình lên men batch, quá trình lên men fed batch ở mức 5g/l hoặc

ít hơn được năng suất và sản lượng cao hơn hẳn. Nguyên nhân là do nồng độ

đường cao trong môi trường đôi khi làm ức chế sự phát triển của vi sinh vật hoặc

giảm sản lượng sản phẩm, cùng với đó là sự tạo thành các sản phẩm phụ như

acetate và lactate. Bằng cách hạ thấp nồng độ đường ban đầu thấp và bổ sung sau

đó, tổng thời gian nuôi cấy, đặc biệt là phage lag, có thể được rút ngắn và sản

lượng có thể được tăng lên [22].

Bên cạnh đó, quá trình lên men liên tục cũng thu được năng suất cao, và giá

thành có thể giảm trong sản xuất công nghiệp.

So với quá trình fed batch và lên men liên tục, quá trình repeat fed batch thu

được năng suất và sản lượng cao hơn hẳn. Nguyên nhân có thể là do trong fed

batch, nồng độ sản phẩm tăng làm tăng áp suất thẩm thấu, tác động xấu lên sự sinh

trưởng, sự chuyển hóa và năng suất thu L-lysine. Bằng kĩ thuật repeat fed batch có

thể khắc phục được hiện tượng trên bằng cách rút ra một lượng canh trường nhất

định, do đó năng suất và sản lượng được cải thiện [25].

2.2.4. Nghiên cứu quá trình lên men liên tục L-lysine:

Năm 1989, Toshihiko Hirao và cs đã khảo sát quá trình nuôi cấy liên tục

bằng chủng Corynebacterium gutamicum đột biến. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành

khảo sát quá trình lên men liên tục một cấp bằng chủng B-6, được tạo ra từ

Corynebacterium gutamicum ATCC13032 bằng cách lựa chọn các chủng kháng S-

(2-aminoethyl)-L-cysteine, rifampicin, streptomycin và 6-azauracil sau khi gây đột

biến bằng N-nitro-N'-nitro-N-nitrosoguanidine. Môi trường lên men ban đầu chứa

3% mật rỉ đường. Môi trường bổ sung có hàm lượng mật rỉ đường thay đổi từ 12%

đến 18%. Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong fermentor 5lít chứa 1.3 lít môi

trường ban đầu. Khi lượng đường ban đầu đã được tiêu thụ, môi trường bổ sung


91

được cung cấp với một tỉ lệ nhất định. Sau khi thể tích canh trường nuôi cấy là

2.51ít, quá trình nuôi cấy liên tục được bắt đầu bằng cách bổ sung liên tục môi

trường bổ sung và đồng thời lấy ra canh trường chứa tế bào và sản phẩm. Thể tích

làm việc được duy trì ở mức 2.5 1ít. Quá trình nuôi cấy được thực hiện ở tốc độ

khuấy 600 rpm, thổi khí 3 1ít/ phút ở 32°C. pH 7 được chỉnh tự động bằng NH4OH

10 N. Các kết quả thu được như sau:

Đồ thị 2.8 thể hiện thời gian nuôi cấy liên tục chủng B-6 và ảnh hưởng của

tỉ lệ bổ sung đến năng suất (g/1.h) ở nồng độ đường bổ sung là 20%. Mặc dù nuôi

cấy liên tục có thể trên 500h, nhưng không thực hiện quá 400 h để tránh hiện tượng

giống bị đột biến gây ảnh hưởng đến năng suất. Với việc tăng tỉ lệ bổ sung vượt

hơn 90 ml/h, nồng độ L-lysine giảm. Mặc khác, năng suất tăng dần dần và sinh

khối không thay đổi rõ ràng.

Đồ thị 2. 8 Thời gian nuôi cấy liên tục [16]

Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng đến các thông số trạng thái ổn định được

khảo sát ở nhiều nồng độ đường bổ sung khác nhau được thể hiện ở đồ thị 2.8. Với

việc tăng tỉ lệ pha loãng, năng suất tăng và thể hiện một giá trị lớn nhất ở mỗi nồng

độ đường bổ sung. Tuy nhiên, hiệu suất của L-lysine tính trên mỗi khối lượng

đường (%), Yp/s, giảm dần ở các tỉ lệ pha loãng cao hơn. Sinh khối giảm mạnh ở tỉ

Thời gian nuôi cấy (h) Thời gian nuôi cấy (h)

Sinh

khố

i

Năn

g su

ất (g

/l.h)

Tỉ lệ bổ sung sung

Tỉ lệ bổ sung sung

Đườ

ng só

t (%

)


92

lệ pha loãng cao nhất. Nồng độ L-lysine lớn nhất đạt được là105 g/l với Yp/s là

38.5%, đạt được ở nồng độ đường bổ sung là 28%. Năng suất và sinh khối lớn nhất

tính trên mỗi khối lượng đường (%), Yx/s, lần lượt là 5.6 g/1.h và 14.7%, ở nồng

độ đường bổ sung là 12%.

Đồ thị 2. 9 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng lên các thông số trạng thái ổn định [16].

Nồng độ đường bổ sung: , 12%; , 20%; ,28%

Yx/s= hiệu suất của sinh khối tính trên khối lượng đường

Yp/s=hiệu suất thu sản phẩm tính trên khối lượng đường

Quá trình nuôi cấy được thực hiện ở tốc độ khuấy 600 rpm,

sục khí 3lít/phút

Trong đồ thị 2.9, các thông số trạng thái ổn định được vẽ dựa vào tỉ lệ pha

loãng. Tuy nhiên, nó khó để phân tích tỉ lệ - các yếu tố giới hạn ảnh hưởng đến

năng suất trong trường hợp các nồng độ đường khác nhau. Do đó, năng suất được

vẽ lại dựa theo tỉ lệ đường bổ sung, song song với các thông số trạng thái ổn định

Năn

g su

ất (g

/l.h)

Tỉ lệ pha loãng (h -1)


93

khác, bao gồm ORP và lượng L-lactic acid (lactate) tích tụ, nó có thể là một dấu

hiệu của lượng oxy cung cấp. Kết quả thể hiện ở đồ thị 2.10. Điểm lớn nhất của

năng suất trùng khớp với điểm mà lactate bắt đầu tích tụ ở mỗi nồng độ đường bổ

sung. Bởi vì sự tích tụ đường cụ thể không phát hiện ở mỗi điểm, ngoại trừ điểm ở

tỉ lệ đường bổ sung cao nhất, điều đó có vẻ như tỉ lệ đường bổ sung bằng với tỉ lệ

đường tiêu thụ và do đó sự tích tụ lactate chủ yếu là do thiếu oxy. ORP tới hạn thay

đổi nằm trong khoảng từ -100 mV ở nồng độ đường bổ sung là 28% đến -140 mV

ở 12%. Những kết quả đó cho thấy sự thiếu oxy đã ảnh hưởng đến năng suất ở các

tỉ lệ bổ sung đường cao.

Đồ thị 2. 10 Ảnh hưởng của tỉ lệ đường bổ sung lên năng suất,

thế oxy hóa ban đầu, lactate sinh ra [16].

Nồng độ đường bổ sung: , 12%; , 20%; ,28%

ORP = thế oxy hóa ban đầu

Bên cạnh đó, ảnh hưởng của lượng oxy cung cấp giới hạn lên các thông số

khác nhau cũng được nghiên cứu. Oxy cung cấp được thay đổi bởi các tốc độ

khuấy từ 450 rpm đến 700 rpm ở nồng độ đường bổ sung 25% và thổi khí 3

lít/phút. Trong đồ thị 2.10, năng suất lớn nhất tăng với việc tăng tốc độ khuấy. Mặc

Năn

g su

ất (g

/l.h)

Tỉ lệ đường bổ sung (g/l/h)


94

khác, cả nồng độ L-lysine và Yp/s giảm với việc tăng tỉ lệ pha loãng, ở những tốc

độ khuấy thấp hơn, cả 2 đều giảm ở với tỉ lệ pha loãng thấp.

Đồ thị 2. 11 Ảnh hưởng của khuấy đảo lên các thông số trạng thái ổn định [16].

Tốc độ khuấy: ∆, 450 rpm, 500 rpm; , 600 rpm; , 700 rpm.

Nhằm xác định yếu tố giới hạn quá trình sản xuất L-lysine bằng phương

pháp liên tục là do oxy cung cấp hay không, không khí giàu oxy được sử dụng

trong quá trình sục khí. Việc sử dụng không khí chứa 29% oxy được so sánh với

không khí chứa 21% oxy (không khí tự nhiên) ở nồng độ đường bổ sung là 25% và

tốc độ khuấy là 500 rpm. Kết quả thể hiện ở đồ thị 2.11. Việc sử dụng không khí

giàu oxy, ORP cho thấy giá trị cao hơn ở mỗi tỉ lệ pha loãng và năng suất cải thiện

rõ rệt. Điều đó cũng cho thấy việc cung cấp đủ oxy là cần thiết để duy trì năng suất

cao.

Năn

g su

ất (g

/l.h)



95

.

Đồ thị 2. 12 Ảnh hưởng của khí giàu oxy lên các thông số trạng thái ổn định [16].

Hàm lượng oxy trong không khí : , 29%; , 21%

Nghiên cứu này cho thấy, chúng ta có thể thực hiện quá trình nuôi cấy liên

tục một cấp ổn định và thành công. Nghiên cứu này cũng thu được năng suất và

nồng độ L-lysine cao hơn, lần lượt là 5.6 g/l.h và 105 g/l. Chủng B-6 tích tụ 100

g/1 L-lysine-HCI sau 48 h bằng nuôi cấy fed-batch. Tuy nhiên, năng suất của nuôi

cấy fed-batch không vượt quá 2.1 g/1.h (dữ liệu không thể hiện). Điều đó có nghĩa

là năng suất của nuôi cấy liên tục cao hơn gấp 2.5 lần so với nuôi cấy fed-batch.

Nuôi cấy liên tục mô tả trong nghiên cứu này cũng tạo điều kiện phân tích các yếu

tố ảnh hưởng đến quá trình lên men liên tục L-lysine. Trong nuôi cấy liên tục, một

vấn đề quan trọng chính là sự không ổn định của giống. Trong nghiên cứu này, sự

không ổn định của giống B-6 có thể đã không xảy ra trong quá trình lên men L-

Năn

g su

ất (g

/l.h)



96

lysine trong 400 h. Điều đó cho thấy sự ổn định của giống chủ yếu phụ thuộc vào

đặc tính vốn có của nó. Một lý do cho sự ổn định của giống B-6 là sự sản xuất L-

lysine hầu như giải phóng ra hoàn toàn từ sự điều hòa trao đổi chất bởi L-lysine (dữ

liệu không thể hiện). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy nuôi cấy liên tục không

chỉ là một quá trình hiệu quả cho phân tích ở trạng thái ổn định trong phòng thí

nghiệm, mà còn là một quá trình thực tiễn trong các nhà máy bởi năng suất cao và

sự đơn giản của quá trình nuôi cấy [16].

2.2.5. Nghiên cứu tổng hợp lysine bằng tế bào cố định:

Năm 1989, Moncef Nari và cs đã nghiên cứu về sự sản xuất lysine bởi

chủng C.glutamicum cố định. Giống Corynebacterium sp được thử nghiệm sản

xuất Lysine bằng nuôi cấy theo mẻ với tế bào tự do và cố định với lượng vi sinh

vật ban đầu 5x107 tế bào /ml, trong môi trường chứa 200 g/lít glucose. Một số kết

quả thu được như sau:

Khi giống nuôi cấy cấy ở dạng tự do, sự tích tụ lysine đạt được lần lượt là

42 và 46 g/lít L-lysine sau 72 và 96h. Trái lại, khi giống được nuôi cấy ở dạng cố

định tạo ra được 60g/lít L-lysine sau 120h nuôi cấy. Hiệu suất sản xuất lysine, khi

glucose thêm vào môi trường được tiêu thụ hoàn toàn, lần lượt là 23 và 30% khi

nuôi cấy ở dạng tự do và cố định. Kết quả trên cho thấy quá trình cố định đã cải

thiện quá trình sản xuất lysine. Số lượng tế bào trong gel tương ứng với số tế bào tự

do. Nguyên nhân cho sự sinh trưởng chậm của Corynebacterium sp trong gel

alginate là sự hạn chế oxy.

Đối với các tế bào cố định, môi trường nuôi cấy cần bổ sung sung CaC12 để

đảm bảo sự ổn định cơ học của các hạt gel. CaC12 có thể ảnh hưởng đến sự phát

triển. Các kết quả thể hiện trong bảng 2.15, cho thấy rằng giống đã tích tụ 45 g/lít

lysine khi không có CaC12, trong môi trường chứa 140 g/lít glucose, nhưng sự tích

tụ giảm nhẹ bởi việc thêm vào CaC12. Trong hầu hết các trường hợp, sinh khối

cuối cùng trong môi trường là giống nhau. Như vậy nồng độ CaC12 nằm trong

khoảng từ 50 đến 200 mM có thể được bổ sung vào chế độ cố định mà không ảnh

hưởng đến năng suất và sự phát triển của các tế bào cố định.


97

Bảng 2. 20 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 lên sinh khối và nồng độ L-lysine [24].

CaCl2

(mM)

Glucose

tiêu thụ

Sinh khối (108)

t=72h

L-lysine

HCl(g/l)

Hiệu suất

(%)

0

62.5

125

187.5

250

133

134

135

135

132

99

93

95

97

60

45

43

43

43

41

33.83

32.08

31.85

31.85

31.06

Lượng vi sinh vật ban đầu cũng ảnh hưởng đến năng suất tạo L-lysine. Các

lần nuôi cấy được thực hiện với nhiều nồng độ khác nhau từ 107 đến 20.107 tế

bào/ml trong môi trường chứa 200 g/1 glucose. Các kết quả thể hiện ở đồ thị 2.12

cho thấy, sau 72h nuôi cấy, sự tổng hợp L-lysine tăng theo lượng vi sinh vật cho

vào ban đầu. Sau 120h, khi glucose thêm vào môi trường được tiêu thụ hoàn toàn,

sự tổng hợp L-lysine duy trì không đổi khi tăng lượng tế bào. Hiệu suất sản xuất L-

lysine (khoảng 33%) là giống nhau khi lượng tế bào sống từ 2,5 đến 20x107 tế bào

bào/ml (Bảng 2.20 ).

Bảng 2. 21 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu và thời gian lên men lên sự tổng hợp

L-lysine bằng các tế bào C. glutamicum cố định [24].

Mật độ tế

bào x

107/ml

Glucose

tiêu thụ

(g/l)

L-

lysine

(g/l)

Hiệu

suất

(%)

Glucose

tiêu thụ

(g/l)

L-

lysine

(g/l)

Hiệu

suất

(%)

Glucose

tiêu thụ

(g/l)

L-

lysine

(g/l)

Hiệu

suất

(%)

72h 96h 120h

1

2.5

5

20

111

115

148

147

17

25

32.5

35

15.3

21.75

21.95

23.8

138

167

183

190

33

43

49.5

49.5

23.3

25.75

27

26

187

200

200

200

38

58.5

60

59.5

20.3

29.25

30

29.75


98

Đồ thị 2. 13 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu lên sự tổng hợp L-lysine bằng các tế bào

C.Glutamicum cố định [24].

Các kết quả thể hiện trong bảng 2.16 và đồ thị 2.12 cho thấy rằng sự tổng

hợp L-lysine và hiệu suất tăng khi tăng thời gian nuôi cấy. Chẳng hạn như, với mật

độ ban đầu là 2,5x107 tế bào/ml, khoảng 25 g/lít L-lysine được tạo ra (hiệu suất

21,73%). Sau 96h đạt tới 43 g/lít, và sau 120h là 58,5 g/lít L-lysine ( hiệu suất

29,25% ) khi glucose thêm vào môi trường được tiêu thụ hoàn toàn.Với các tế bào

tự do, glucose được tiêu thụ hoàn toàn sau 96h, trong khi các tế bào bòa cố định là

120h. Hai điều lý giải cho việc tăng thời gian nuôi cấy có thể là: bởi vì sự khuếch

tán hạn chế của oxy và các chất dinh dưỡng vào bên trong các hạt gel [29]; và

gradient của tốc độ phát triển (gradient số lượng tế bào sống cố định) gây ra những

hạn chế về khuếch tán. Thật sự, việc cung cấp đầy đủ oxy để thỏa mãn nhu cầu oxy

của các tế bào là cần thiết để quá trình sản xuất L-lysine [14].

Sau khi kéo dài thời gian nuôi cấy hạt gel mất sự bền cơ học và do đó hình

dạng và đường kính các hạt gel bị biến đổi. Sự ổn định của các hạt gel có thể được

cải thiện bằng cách tăng nồng độ gel và ion canxi [12]. Nồng độ ion canxi được

duy trì ở 100 mM, sự tăng nồng độ alginate làm giảm hàm lượng L-lysine và sự

thất thoát tế bào. Những kết quả này có thể được giải thích là những nồng độ gel

thấp sẽ làm giảm tối thiểu sự giới hạn trong vận chuyển vật chất và tối đa cho sự

tạo thành sinh khối. Tốc độ tiêu thụ oxy của các vi sinh vật cố định giảm khi tăng

nồng độ gel alginate [14].


99

Những kết quả đạt được ở đây cho thấy L-lysine có thể sản xuất hiệu quả

bằng các tế bào Corynebacterium sp cố định. Bằng cách so sánh với những kết quả

đạt được với tế bào tự do cho thấy có sự cải thiện nhỏ về sự tạo thành L-lysine

bằng các tế bào cố định. Những ưu điểm đạt được khi sử dụng phương pháp cố

định tế bào là: sử dụng lượng tế bào ban đầu nhỏ (so sánh với các tế bào tự do);

giảm sự tạp nhiễm. Tế bào cố định phát triển gần bề mặt các hạt gel, nơi chúng tạo

các khuẩn lạc [14,31]. Bởi vì tính chất cơ học của các hạt gel, nó cho phép một

lượng giới hạn sự phân chia tế bào trong các lỗ trống [26], các tế bào

Corynebacterium có thể được bảo vệ một phần khỏi sự cạnh tranh với các tế bào

tạp nhiễm khi sự rửa trôi tế bào do các tế bào được bẫy không quá thừa. Hơn nữa,

phương pháp này cho thấy để tăng tính ổn định plasmid một cách đáng kể cho

khoảng thời gian nuôi cấy dài hơn [26, 27], và hiện tượng đó như là những sự biến

động hoặc sự thay đổi di truyền, nó xảy ra sau quá trình nuôi cấy kéo dài của vi

khuẩn trong nuôi cấy liên tục sử dụng tế bào tự do có thể tránh được thông việc cố

định tế bào. Tuy nhiên, bởi vì sự giới hạn truyền khối, việc cung cấp oxy cũng như

các chất dinh dưỡng cho các tế bào hiếu khí cố định (như là Brevibacterium

flavum) và với các tế bào bào hiếu khí không bắt buộc (Corynebacterium

glutamicum) thường trở thành một hạn chế trong việc sử dụng hiệu suất quả các tế

bào này. Để giải quyết vấn đề này, cần thiết để xác định ảnh hưởng của kích thước

hạt và sự cung cấp oxy lên tốc độ phản ứng. Việc làm các hạt nhỏ hơn, sẽ làm giảm

đến mức thấp nhất các hạn chế truyền khối [24].

Chương 3:Kết luận

100

CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN

Trên thế giới, với tốc độ tăng trưởng trên thị trường đã được dự báo rằng nhu

cầu sử dụng L-lysine sẽ tiếp tục tăng, do đó sự cạnh tranh ngày càng mạnh mẽ để chia

sẽ thị trường. Sự phát triển các giống sản xuất công nghiệp, bao gồm kĩ thuật quá trình

chuyển hóa, kĩ thuật gen sẽ tiếp tục là chìa khóa để phát triển cạnh tranh, trong đó kĩ

thuật về đột biến gen sẽ phát triển từ các đột biến ngẫu nhiên sang các đột biến xác

định. Hiện nay, các nghiên cứu về cải thiện giống đã đạt được những kết quả như

mong muốn, tạo ra được giống siêu sản xuất L-lysine. Bên cạnh đó các nghiên cứu

theo hướng phát triển và tối ưu hóa qui trình công nghệ vẫn được tiếp tục thực hiện do

sự tác động chặt chẽ giữa việc cải thiện giống và kĩ thuật nuôi cấy trong việc nâng cao

quy mô sản xuất.

Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có cơ sở sản xuất L-lysine mà vẫn phải nhập L-

lysine từ nước ngòai dưới dạng thuốc uống hoặc các dạng tồn tại của lysine. Đây có

thể nói là một sự bỏ phí rất tiếc và sự kém phát triển của Việt Nam trên con đường ứng

dụng thành tựu khoa học vào sản xuất. Ta có thể mua giống đã cải tạo để ứng dụng lên

men thu nhận lysine hoặc có thể tự xây dựng giống Corynebacterium glutamicum siêu

tổng hợp lysine từ chủng hoang dại hay cải tạo giống khác trên cơ sở kiến thức đã

được công bố và được tìm hiểu rất sâu sắc.

Bên cạnh những nghiên cứu nâng cao hiệu quả thu nhận lysine cần tập trung

nghiên cứu và hoàn thiện quy trình sản xuất L-lysine, để triển khai xây dựng các nhà

máy sản xuất L-lysine với chất lượng cao, giá thành hạ.

Mặc dù đã có nhiều cố gắng trong việc thực hiện Đề tài này nhưng do thời gian

có hạn và sự hiểu biết còn hạn chế nên nội dung Đồ án còn một số thiếu sót. Với ý

nghĩa khoa học và kinh tế của Đề tài hy vọng rằng Đề tài này sẽ được tiếp tục tìm hiểu

và phân tích sâu hơn trong Luận Văn Tốt Nghiệp.

101

Tài liệu tham khảo

Tài liệu trong nước

1. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005). Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục.

2. Nguyễn Đức Lượng (2006). Công nghệ vi sinh, Tập 2-Vi sinh vật học công

nghiệp. Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP.Hồ Chí Minh.

3. Nguyễn Đức Lượng và cs.( 2006). Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2,

NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.

4. Nguyễn Đức Lượng (2007). Công nghệ gen. Nhà xuất bản Đại học quốc gia

TP. Hồ Chí Minh.

5. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên (1998). Giáo trình sinh hóa hiện

đại. Nhà xuất bản giáo dục.

6. Nguyễn Thùy Châu, Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản

xuất chế phẩm acid amin và enzyme từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp và hải

sản ở quy mô bán công nghiệp, Đề tài KHCN cấp nhà nước, Hà nội, (2006):

154 -165.

7. Nguyễn Thuý Hương (2008), Một số ứng dụng của cellulose vi khuẩn

trong lĩnh vực thực phẩm, Tạp chí sinh học, 30 (1): 62 -69.

8. Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Minh Tâm (2009), “Ứng dụng vi khuẩn

Corynebacterium sp. cố định trong lên men thu nhận L-lysine”, Tạp chí khoa

học và công nghệ các trường đại học kỹ thuật, Số 70, trang 96 -100.

9. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006). Công nghệ

chuyển gen (Động vật và Thực vật). Nhà xuất bản Huế.

Tài liệu nước ngoài

10. A.A.de Graaf, L.Eggeling, H.Sahm (2001). Metabolic Engineering for

Llysine Production by Corynebacterium glutamicum. Biotechnology, vol.73,

10-29

11. Akashi, K., Shibai, H. and Hirose, Y. (1979), Agric. Biol. Chem., 43, 2087-

2092.

12. Cheetham, P.S.J., Blunt, K.W. and Bucke, C. (1979), Biotechnoi. Bioeng.,

21, 2155-2168.

102

13. De Hollander JJ, Eswilder R, and Noordover JAC. (1998) Amino Acid

Fermentation Process. U.S. Patent No. 5,763,230 .

14. Eikmeier H., Westmeier F. and Rehm H.J. (1984), Appl. Microbiol.

Biotechnol., 19, 53-57.

15. Gordon F. Bickertaff, (1997). Immobilization of enzymes and cells,

Humana Press Inc, New Jersey.

16. Hirao T, Nakano T, Azuma T, Sugimoto M, and Nakanishi T. (1989) L-

lysine production in continuous culture of an L-lysine hyperproducing mutant

of Corynebacterium glutamicum. Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:269–273.

17. Junko Ohnishi and Masato Ikeda (2006). Comparisons of Potential for L-

Lysine Production among Different Corynebacterium glutamicum strains.

Biosci.Biotechnol. Biochem.,70 (4), 1017-1020.

18. Judith Becker, Corinna Klopprogge, Oskar Zelder, Elmar Heimzle and

Christoph Wittmann (2005). Amplified Expression of Fructose 1,6-

Biophosphatase in Corynebacterium Glutamicum Increase In Vivo Flux

through the Pentose phosphate Pathway and Lysine Production on Different

Carbon Sources. American Society for Microbiology. 71:8587-8596.

19. Kawahara Y, Yoshihara Y, Ikeda S, Yoshii H, and Hirose Y. (1990)

Stimulatory effect of glycine betaine on L-lysine fermentation. Appl. Microbiol.

Biotechnol. 34:87–90.

20. Liaw, H.J., Eddington, J., Yang, Y., Dancey, R., Swisher, S., Mao,W.:

(2006). US20066984512.

21. Lothar Eggeling and Michael Bott (2005). Handbook of Corynebacterium

glutamicum, CRC Press, the United States of America.

22. Masato Ikeda (2003) ,amino acid production process . Advances in

Biochemical Engineering, Biotechnology,Vol. 79.

23. Mikiro Hayashi, et al (2006). Transcription anlysis Reveals Global

Expression Changes in an Industrial L-lysine Producer of Corynebacterium

glutamicum. Biosci. Biotechnol. Biochem.,70 (2), 546-550.

24. Moncef nasri, Abdelhafidh dhouib, Fathi zorguani, Habib kriaa,Radouan

ellouz.( 1989) Production of lysine by using immobilized living

Corynebacterium sp cells . Biotechnology Letters . 11: 865-870.

103

25. Nakamura T, Nakayama T, Koyama Y, Shimazaki K, Miwa H, Tsuruta M,

TamuraY, and Tosaka O. (2000) Process for production of lysine by

fermentation. U.S. Patent No. 6,025,169.

26. Nasri, M., Sayadi, S., Barbotin, J.N. and Thomas, D. (1987b). J

Biotechnol. 6, 147-157.

27. Nasri, M., Sayadi, S., Barbotin, J.N., Dhulster, P. and Thomas, D.

(1987a). Appl. Environ. Microbiol. 53,740-744.

28. Oh, J. W., Kim, S.J., Cho, Y.J., Park, N. H., Lee, J.H.: US5268293(1993).

29. Rodovich, J.M. (1985). Biotech. Advs. 3, 1-12 .

30. Savas Anastassiadis (2007). L-Lysine Fermentation. Biotechnology, 1, 11-

24.

31. Shinmyo, A., Kimura, H. and Okada, H. (1982). Eur. J. Appl. Microbiol.

Biotechnol., 14, 7-12.

32. Shuichi Ishino, et al (1984). Involvement of meso-a,e- Diaminopimelate D-

Dehydrogenase in Lysine Biosynthesis in Corynebacterium glutamicum. Agric.

Biol. Chem, 48 (10), 2557-2560.

33. Shuichi Ishino, et al (1988). Cloningand Sequencing of the meso-

Diaminopimelate-D-dehydrogenase (ddh) Gene of Corynebacterium

glutamicum. Agric. Biol. Chem, 52 (11), 2903-2909.

34. Walter Pfefferle, et al (2003). Biotechnological Manufacture of Lysine.

Biotechnology, Vol. 79, 60-112.

35. Yoshiya Gunji, et al (2004). Characterization of the L-lysine Biosynthetic

Pathway in the Obligate Methylotroph Methylophilus methylotrophus. Biosci.

Biotechnol. Biochem., 68 (7), 1449-1460.

36. Yoshiya Gunji, et al (2006). Characterization of a Unique Murant lysE

Genne, Originating from Corynebacterium glutamicum, Encoding a Product

That Induces L-lysine Production in Methylophilus methylotrophus. Biosci.

Biotechnol. Biochem.,70 (12), 2927-2934.

Địa chỉ trang web

37. www.anabol.com.

38. www.baigiang.bachkim.vn.

104

39. www.lakewoodconferences.com.

40. www.wellbasics.com.

41. www.wikipatents.com/US-Patent-4123329

lysine -...

Documents