lysis-filtration法...

900 感染症学雑誌第61巻第8号

Lysis-Filtration法による血液培養システムの研究について

横浜市立大学医学部病院中央検査部

神永陽一郎

横浜市立大学医学部病院第一内科

伊藤章

(昭和61年12月25日受付)

(昭和62年2月24日受理)

Key words: Lysis-Filtration Method, Blood culture, Hemodex

要旨

新しい血液培養システムであるLysis-Filtration法(Hemodex,テルモ製,以下L-F法)の有用性を

内科患者227例について検討した結果,以下の成績を得た.

1.菌陽性例は227例中39例(17.2%)で,方法別ではBCBシステム法(Columbia broth,ロシュ製,

以下BCB法)で28例(12.3%),LF法で34例(15.0%)と若干L-F法で良い成績が得られた.

2.培養後菌確認までに要した日数について比較したところ,培養後1～2日目では差が認められ

BCB法に比べLF法の方がより迅速に確認できた.

3.検出菌を比較するとBCB法では E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae, P. aeruginosa, Bacteroides

spp.などが,L-F法では S. pneumoniae, A. calcoaceticus var. anitratus, Flavobacterium spp., Candida

spp.などが若干ではあるが優位に分離された.

4.血液1ml当りの細菌数が10CFU/ml以下の場合には,L-F法での検出がBCB法に比べ優れてい

た.しかし,10CFU/ml以上の場合には両者間に差は認められなかった.

5.使用薬剤の有無とBCB法,LF法の成績を比較したところ,使用薬剤有とされた例ではLF法の

成績が優れ,無とされた例では両者間に差は認められなかった.

細菌検査室で扱う菌検索のための血液培養検査

はそれ程多いものではない.しかし,敗血症,菌

血症,心内膜炎の凝われる患者の診断,治療上最

も重要な検査である.これは血液が元来無菌的な

ものであることから,菌が検出されれば病原的意

義を有する場合が多く,しかも患者は重症例が多

いことによる.特に悪性腫瘍,血液疾患,骨髄腫

などの患者の末期感染症として敗血症は重要で主

要な死因の一つともなっており,原因菌を適確に

検査し,その成績を迅速に臨床側に報告すること

が要求される1)2).

血液からの菌検索法3)～6)としては,(1)混釈培養

法,(2)ヵルチャーボトル・チューブ法,(3)溶血炉

過法,(4)溶血遠心法,(5)Bactec法などがあるが,

(3)～(5)の方法については本邦では実用化には至ら

ず,ほとんど諸外国6)～16)でみられるのみである.我

国における最も一般的な血液培養法としては,採

取した血液を直接液体培地に入れて行うカル

チャーボトルおよびチューブによる方法の普及が

あり,比較的簡便で汚染の機会も厳密に行えばそ

れ程多いものではない.しかし,菌検出にやや日

数を要すること,発育確認には塗抹,サブカル

チャーなどが不可欠で若干手数を要することが知

られている.また,これらで使用される培地には

選択に苦慮する程多種類のものがあり,使用上の

問題,抗凝固剤の問題,培養条件および観察方法

などに関する多くの検討4)5)17)がなされ,さらには

別刷請求先:(〒232)=横浜市南区浦舟町3～46

横浜市立大学医学部病院中検

神永陽一郎

昭和62年8月20日 901

培養手技,使用法について基準化を計り,より確

実な検査法を普及させようとの動きもみられ

る18)19).かかる現状において,我々は〓過により血

液中の細菌を分離培養する新しいシステムである

Lysis-Filtration法(Hemodex,テルモ製,以下

L-F法)の有用性について検討したので報告する.

材料および方法

昭和59年12月より60年8月末日までの当院内科

の患者血液227検体について日常検査法としては

BCBシステム(Columbia broth,ロシュ製,以下

BCB法)を用い,L-F法については専用の培地

(Table 1)入り採血管に無菌的に所定量採取した

ものについて,それぞれ以下の通り行った.なお,

分離菌の同定は当院の常法に基づいて行った.

Table 1 Composition of medium

(1) Tryptone (OXOID) 10g

(2) Soya Peptone (OXOID) 3g

(3) Meat Extract (OXOID) 3g

(4) Yeast Extract (OXOID) 5g

(5) Liver Digest (OXOID) 1g

(6) Dextrose 2.5g

(7) Dipotassium Phosphate 0.15g

(8) Sodium Chloride 4g

(9) Sodium Carborate 2g

(10) L-Cysteine Hydrochloride 0.45g

(11) Para-aminobenzoic acid 0.05g

(12) Hemin 0.005g

(13) Gelatin 12g

(14) Sodium Polyanetholesulfonate 1g(SPS, Roche)

(15) Saponin (MERCK) 8g

(1000ml) pH7.3•}0.2

1. BCB法

スライド取付は行なわず培養1日後に無菌的に

内容液を注射器で採取し,グラム染色と共に好気,

嫌気の両法でサブカルチャーを行うと同時にガム

半流動培地(日水)に接種し,平板は3日,ガム

半流動培地は1週間観察した.2日目以後につい

ては肉眼的観察と同時に,上記の方法で隔日的に

確認したが,L-F法で先に菌が認められたものは

随時グラム染色,サブカルチャーを行いチェック

した.

2. L-F法

検査手順をFig. 1に示した.先づ2ml培地入り

採血管に4m1の血液を無菌的に採取し,10回程度

転倒混和し十分溶血させた後,別の注射器で内容

液をとり吸水剤入りフィルター容器2つにそれぞ

れ3mlずつ注入し,吸引することなく1つはその

まま炭酸ガス培養で,1つは嫌気的(ガスパック

法,BBL)に培養し,最終的には1週間まで観察

した.なお培養後発現したコロニーをFig.2に示

した.

成績

1. BCB法とL-F法の比較

BCB法およびL-F法の培養結果の比較につい

てTable 2に示した.その結果227例中菌陽性例

は39例(17.2%)あった.このうちBCB法とL-F

法の好気,嫌気の両法で菌陽性を示したものは11

例(4.8%),BCB法とL的F法の好気のみ陽性が12

例(5.3%),BCB法のみ陽性5例(2.2%),L-F

法のみ陽性11例(4.8%)で,L-F法のみ陽性例の

Fig. 1 Test procedure

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

Blood collection Injection Aspiration Inoculation Incubation at 37•Ž Observation


Fig. 2 Enterobacter cloacae colonies growthed on

membrane filter (Hemodex Terumo)

うち好気,嫌気の両法陽性は3例(1.3%),好気

のみ陽性は8例(3.5%)であった.すなわち,菌

陽性率はBCB法12.3%, L-F法15.0%であった.

2. 菌確認までの日数について

培養後菌確認までに要した日数についてTable

3に示した.BCB法では依頼後1日目で確認され

たものが28例中15(53.6%),2日後4(14.3%),

3日後6(21.4%),4日後3(10.7%)あった.

LF法では好気例で1日後確認されたものが34例

中22(64.7%),2日後7(20.6%),3日後2

(519%),5日後1(2.9%),7日後2(5.9%)

で,嫌気例では1日後が14例中10(71.4%),2日

後3(21.4%),6日後1(7.1%)であった.

Table 2 Comparison of blood culture bottle

method and lysis-filtration culture method for

blood cultures

1) BCB: Blood culture bottle method (Columbia

broth, Roche)

2) Hemodex, Terumo

なお,5日以後認められたものはFlavobacter-

ium, spp., Candida spp.の2菌属のみであった.

3. 分離菌について

BCB法およびL-F法の成績について分離菌種

別に比較したものをTable 4に示した.培養陽性

39例より44菌株が検出され,BCB法では32菌株

(72.7%)が,L-F法では37菌株(84.1%)が分離

された.BCB法ではE.coli, K.pneumoniae,

E. cloacae, P. aeruginosa, Bacteroides spp. など

でそれぞれ1菌株ずつ多く,L-F法ではS.pnm-

moniae, A. calcoaceticus var. anitratus, Flavo-

bacterium spp., C. albicans A, C. tropicalis,

C.parapsilosisなどが1～4菌株の範囲で多く認

められた.

4. L-F法陽性例のコロニー数とBCB法の成

績(Table 5)

Table 3 Days required for detection of organism

1) BCB: Blood culture bottle (Columbia broth. Roche;

2) Hemodex Terumo

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Table 4 Number of isolates from blood cultuer bottle method and Lysis-filtration

cultuer method

1) BCB: Blood culture bottle (Columbia broth, Roche)

2) L-F: Lysis-filtration culture method (Hemodex, Terumo)

Table 5 Relationship between number of colonies per lml blood in lysis-

filtration cultuer method and result of blood cultuer bottle method

1) L-F: Lysis-filtration culture method (Hemodex, Terumo)

2) BCB: Blood culture bottle (Columbia broth, Roche)

L-F法で菌陽性例は34あり,その内容を血液1

ml当りのコロニー数で分けると,1～5個であっ

たもの14例,6～10個4例,11～50個8例,51～100

個2例,101個以上6例であった.また,L-F法陽

性でBCB法でも菌陽性であったものは23例

(67.0%)であった.この成績をL-F法でのコロ

ニー数との関係でみると,1ml当り10個以下と少

ない場合にはBCB法では50.0%の陽性率を,

11～50個の場合は75.0%,51個以上の場合は100%

であった.

5. 使用薬剤の有無と培養成績

菌陽性例について検体採取時の使用薬剤の有無

とBCB法,LF法の成績を比較したものをTable

6に示した.菌陽性39例中採取前に使用薬剤有り

とされたのは30例(76.9%),無しであったものは

9例(23.1%)で,使用薬剤有りとされた例では

BCB法21例,LF法27例が陽性で後者での成績

が優れ,無しであった例では両者間に差は認めら


Table 6 Results of blood culture among two

different method and effects of preceding ther-

apy

1) BCB: Blood culture bottle method (Columbia

broth. Roche)

2) L-F: Lysis-filtration culture method (Hemodex,

Terumo)

れなかった.

6. 菌検出症例について

菌陽性例患者の年齢,性別,基礎疾患,培養回

数,検出菌名,使用薬剤の有無および転帰につい

て一覧表にした(Table 7).

期間中菌が検出されたのは15名の患者で,約半

数は白血病などの血液疾患を有し,しかも年齢的

には高齢者で1人当りの培養回数は1回から多い

ものでは11回におよんだ.

また,培養陽性例は39件で44菌株が分離され,

転帰は悪く半数以上が死亡例であった.

考察

新しい血液培養システムであるL-F法は,0.8%

のサポニンを含む培地入り採血管に無菌的に血液

を採取し,これを転倒混和して溶血させた後,メン

ブランフィルターを用いた吸水剤付き炉過器にあ

け,吸引することなく静置しそのまま培養するシ

ステムである.今回は当院内科の227例について,

一般的方法であるBCB法と,新しいシステムで

あるL-F法による成績を比較し,その有用性を検

討した.

その結果延べ数で39例(7.2%)の培養陽性例が

あり,検出率を比較するとBCB法12.3%,L-F法

15.0%と後者でわずかながら良い成績が得られ

た.また,血液培養では迅速性が特に望まれると

ころから,培養後菌確認までの日数について検討

したところ,培養後1日目,2日目では差が認め

られ,L-F法でやや早く菌確認ができた.これは

L-F法での菌確認は培養器上に発現するコロニー

をみるのみでよいのに反し,BCB法では肉眼的観

Table 7 Summary of clinical cases with positive culture

昭和62年8月20日 905

察と共にグラム染色,サブカルチャーなどを同時

に行わなけれは確認できない場合があるので,こ

れらの違いによるものと思われる.すなわち,L-F

法で1日後に菌確認ができたものが,BCB法では

同じ日には発見できず,数日後のグラム染色,サ

ブカルチャーで認められるなどの例があった.し

かも,同じ日に確認できてもL-F法ではコロニー

として認められるので,同定,感受性へのアプロー

チがその分早くできる利点がある.一方,手技を

簡便化した血液培養システムとしては,すでにボ

トルにスライドを取付けサブカルチャーをなくし

た方法,寒天平面付二相培地などがある.しかし,

これらはボトルを反転するタイミングにより早期

検出に至る場合と,従来法と変わらない場合があ

る.L-F法ではこれらの問題はないので迅速性,簡

便性という面から特に注目されよう.一方,検出菌をみるとブドウ糖非発酵性グラム

陰性桿菌,Candida spp.などの比較的好気性の強

いものはL-F法が優れ,腸内細菌,嫌気性菌では

BCB法で良い結果が得られた.また,血液採取前

に何らかの抗生剤が使用されていた例は約77%あ

り,その中ではBCB法に比べL-F法でわずかな

がら良い成績が得られた.しかし,薬剤投与時に

はL-F法では血液が培地で希釈される割合はボ

トル法に比べ少ないことから考えると,むしろ逆

の場合が考えられよう.従って,これらの結果に

ついては例数も少ないのでさらに基礎的な研究を

含めた検討が望まれる.

L-F法の特徴の1つには,血中細菌数の大まか

な把握がある.しかしながらこれらの研究は諸外

国には多いが6)～12),本邦では少なくわずかに荒

井20)の報告があるのみである.今回,我々が検討し

たL-F法は諸家の方法6)～12)20)とは手技が若干異

なることから一概に比較はできない.方法は異な

るが荒井20)はウサギの人工菌血症例でconven-

tionalな方法と比較し,フィルター法は血液1ml

当りの細菌数が1個(1CFU/ml)以下の10wer

levelの場合に検出率が高かったが,実際例では両

者に差が認められないとした.Gill12)も同様なこ

とを指摘している.L-F法では採取した血液中に

1個の菌があれは,理論的にはフィルター上に補

集されるはずであり,そこに発育支持性の高い培

地があれは容易にコロニーとして認められよう.

著者らは血中細菌数の問題については厳密に行っ

たものではないが,得られた成績は諸家と同様

lower levelでの検出が若干優れていた.また,血

液1ml中の細菌数は数個から数えきれない程多い

場合などさまざまであった.多数認められた例に

ついては,血液採取後速やかにフィルターへ接種

できないなど時間的なものが原因であったと思わ

れる.従って,より的確な数を把握するためには,

血液採取後できるだけ速やかにフィルターへ接種

することが必要である.それから,操作過程での

contaminationが懸念されたが,炭酸ガス培養器

中のエアゾル汚染とみなされるもの以外は,特に

なかったように思われた.

現在の方法は,血液採取時に採血管をよく振ら

ないと凝固しやすい,一部の菌種ではコロニーが

小さく複数菌検出時には鑑別が困難,幹燥しやす

い,嫌気培養時減圧式チエンバーが使用できない

などの問題がある.しかし,採血量も少なく,カ

ルチャーボトルの様なconventionalな方法と比

較しても検出率は劣らず,簡便性に富み,より短

期間に発育確認ができ,かつ血中細菌数の大まか

な把握が可能であるなど利点も多い.以上の如く,

本システムにはいくつかの問題点はあるが,注目

される培養システムと思われる.今後,基礎的な

研究を含めた若干の改良が期待される.

稿を終えるに望み,サンプルを提供して下さったテルモ

株式会社に深謝の意を表します.なお,本論文の要旨は第

59回東日本感染症学会で発表した.

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Evaluation of Lysis-Filtration Method as a Blood Culture System

Yoichiro KAMINAGAClinical Laboratories of Yokohama City University

Akira ITOThe First Department of Internal Medicine, School of Medicine, Yokoyama City University

The newly introduced Terumo Lysis-Filtration method (L-F method) as a blood culture systemwas applied to 227 patients at the Department of Internal medicine. The usefulness of the method wasevaluated as follows:

1) Thirty-nine (17.2%) of 227 cases were found positive by the test for the bacterial presence.Positive results were obtained in 28 cases (12.3%) with the culture bottle method (Rosch) and 34 cases(15.0%) with the L-F method. Thus, slightly better detection rates were obtained with the L-F method.

2) Bacterial growth was quicker after one or two days in incubation with L-F method than withthe culture bottle method.

3) Forty-four strains from the 39 patients were isolated. E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosaand Bacteroides were isolated a little, more frequently by the culture bottle method and S. pneumoniae,A. calcoaceticus var. anitratus, Flavobacterium spp. and Candida spp. were isolated a little morefrequently by the L-F method.

4) Bacterial counts per 1 ml blood in positive case by the L-F method, in cases of less than 10counts per 1 ml blood, positive cases by the culture bottle method were decreased to half.

5) In cases under a drug therapy, the L-F method revealed a higher detection rate than that of theculture bottle method. However, no difference was noted in cases without any drug treatment.

lysis-filtration法...

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