manipulasi dna dan vektor
TRANSCRIPT
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 1/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 2/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 3/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 4/45
Gen insulin dari pankreas manusia yang denganManipulasi DNA dapat dimasukkan ke dalam selbakteri –seperti E. coli – atau tumbuhan –sepertisafflower – dan diekspresikan di dalamnya sehingga
saat ini kita dapat memperoleh insulin (obat diabetes)tanpa harus mengekstraknya langsung dari sapi ataubabi, cukup dengan menumbuhkan bakteri atautanaman hasil rekayasa genetika yang memiliki geninsulin dan memanen insulin
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 5/45
Bakteri dan archaea umumnya mereka memiliki ‘guntingberupa en!im yang dapat memotong"motong DNA secaraspesi#ik$
Enzim ini berguna sebagai bentuk pertahananbakteri terhadap DNA-DNA asing yang masuk kedalam sel bakteri.
DNA asing ini akan dipotong-potong agar tidakakan membahayakan bakteri lagi oleh enzim yang
disebut Restriction Endonuclease‘
DNA si bakteri sendiri sudah terlindungi denganmekanisme tertentu (metilasi) sehingga akanterhindar dari pemotongan.
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 6/45
%n!im restriksi hanya akan memotong
DNA pada tempat tertentu sa&a,yaitu &ika ia menemukan susunan palindrom, urutan basa yang &ika dibaca darikedua utas DNA akan tetap sama$
Setiap enzim restriksi hanyadapat memotong pada susunanpalindrom tertentu. Misalnyaenzim Eco! akan beker"apd
urutan GAATTC# enzim Sma! padaurutan CCCGGG# enzim Alu! padaurutan AGCT# dan seterusnya.
$%-&A'A'-%
* * * * * *
%-'A'A&-$%
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 7/45
Menggunakanenzimendonukleaserestriksi
Ujung “lengket”
(sticky ends)Ujung “tumpul”(blunt ends)
Penamaan enzim EcoRI
E = genus( Escherichia)co = species (coli)R = strainI = o! enzyme
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 8/45
Ujung “lengket” dan“tumpul”
("lunt # $ticky ends)
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 9/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 10/45
%n!im DNA ligase beker&a
dengan menyambungkanutas DNA yang memilikiu&ung '"*+ dengan u&ung"*- pada utas lain
.&ung overhang pada utas
sense akan berpasangandengan u&ung overhang utasantisense$
DNA +igase membentuk
ikatan phosphodiestersehingga kedua utas kinimen"adi satu denganikatan yang sangat kuat
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 11/45
Pembentukanikatan-H padaujung-ujung yangkomplemen (sticky
ends)
Ligase membentukikatan fosfodiester
untuk merekatkanbenang-benangDNA
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 12/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 13/45
Molekul DNA dalam keadaan ds, dapat dibelah men&adidua$ Gerga&i yang digunakan untuk membelah DNA a$l$ airpanas (/001) atau Na*- 0,+ M$
embelahan DNA penting di dalam 2 roses 13
roses hibridisasi DNA untuk mendeteksi keberadaansuatu gen di dalam genom
Makin banyak komposisi basa G dan 1 maka semakinbesar energi yang diperlukan untuk membelah molekulDNA, karena ¨ah ikatan hidrogen semakin banyak$
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 14/45
Diperlukan suatu waana (vehicle)
!kendaraan untuk memasukkan suatu
potongan DNA ke dalam sel agar DNA
tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di
dalam sel tersebut "ektor
#eda kendaraan dengan "ektor$ %en yang dipindakan (dari manusia&
ewan&tumbuan& organisme lain
#iotransport)
'istem biotransport dapat diikuti denganteknik biokimia dengan tingkat akurasi * +onto "ektor , DNA plasmid
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 15/45
%&' bukan kromosomterdapat di dalam bakteri
Mampu bereplikasi sendiri
"entuknya benang ganda(double strands DNA,dsDNA) sirkular
Ukuran * jt sp +,, jt %alton
$i!at !enotip - ta.anter.adap antibiotika ta.anlogam berat memiliki genlac-Z.
Plasmid buatan ( Artifcialplasmids) dapat dibuatdengan menamba.kanpotongan/potongan %&'
lain
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 16/45
Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu membawa
potongan DNA lain ke dalam sel bila memiliki,
eplikator (origin of replication)
Penanda (Marker ) yang muda diseleksi (misalnya
gen ketaanan teradap antibiotik) 'itus untuk mengklon (potongan DNA yang
memiliki urutan basa nukleotida yang menjadisasaran en.im restriksi tetapi tidak terletak di dalam
daera replikator atau penanda
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 17/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 18/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 19/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 20/45
Bila suatu bakteri mengandung DNA plasmid dan gen4ac"5 ber#ungsi baik, ditempatkan di dalam mediamengandung 6"Gal (Modi#ikasi galaktosa) dan 78G,maka sel bakteri membentuk koloni biru/
,asil ekspresi gen +a- adalah enzim /-galatosidase#
dapat memeah substrat 0-gal men"adi galaktosadan pre-hromophore $-bromo-1-hloro--hydro2yindole# yang selan"utnya dioksidasi men"adi$#$3-dibromo-1#13-dihloro-indigo yang ber4arnabiru.
Bila gen 4ac"5 rusak maka bakteri membentuk koloni putihDengan melihat perubahan si#at yang ter&adi pada 9arna
koloni Dapat memonitor berhasil tidaknya plasmid
memba9a DNA asing
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 21/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 22/45
Plasmid yang %imiliki ole. Escherichia coli
Berasal dari plasmid
Potongan DNA tamb
Potongan DNA tamb
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 23/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 24/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 25/45
Khimera berasal dari mitologi 0unanimak.luk dengan tubu. gabungan daribagian/bagian mak.luk binatang lain
$etela. pemotongan plasmidmenggunakan suatu enzim restriksipotongan %&' asing yang memiliki ujungpemotongan yang sama dapat disisipkan
$etela. ujung/ujung plasmid danpotongan %&' asing disambung akan
di.asilkan 1plasmid rekombinan1 Plasmid rekombinan dapat bereplikasi
dalam sel inang yang sesuai
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 26/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 27/45
"ila diinginkan untukmenginsersikan potongan %&'asing dengan orientasi tertentu
%ilakukan dengan memotong %&' 2ektor maupun %&' sumber gen yang dike.endaki menggunakandua enzim restriksi yang berbeda
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 28/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 29/45
* 3ektor berupa plasmid
+ 3ektor berupa bakterio!aga
4 5osmid
6 "'5s ("acterial 'rti7cial
5.romosome) # 0'5 (0east 'rti7cial 5.romosome)
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 30/45
* Memiliki origin o! replication dari
inang yang dituju se.ingga
memungkinkan replikasi secara
independen ter.adap genom inang
+ Memiliki penanda selekti!-Memuda.kan seleksi sel pemba8a
plasmid tersisipi %&' asing
keta.anan ter.adap antibiotik ganda penapisan biru/puti.
4 Memiliki banyak situs pengkloningan
(multiple cloning sites M5$)
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 31/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 32/45
Plasmid
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 33/45
Keunggulan: 9ecil muda. pengerjaannya
$trategi seleksi muda.
"erguna untuk mengklon potongan%&' ukuran kecil (: *,kbp)
Kelemahan: 9urang berman!aat untuk mengklon
potongan %&' ukuran besar (;*,kbp)
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 34/45
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 35/45
Lengan kiri- Protein penyusun
kepala # ekor
Lengan kanan-
$intesis %&' Pengendalian
<isis inang
Daerah ang
dihilangkan: integrasi # eksisi
Pengendalian
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 36/45
3ektor berupa bakterio!aga( !ectors)
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 37/45
Keunggulan: "erman!aat untuk mengklon
potongan %&' ukuran besar (*, / +4
kbp) $eleksi berdasar ukuran
Kelemahan:
<ebi. sulit pengerjaannya
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 38/45
Keunggulan: "erman!aat untuk mengklon
potongan %&' berukuran sangatbesar (4+ / 6 kbp)
$eleksi berdasar ukuran Pengerjaan seperti plasmid
Kelemahan: >idak terlalu muda. untuk
mengerjakan plasmid dengan ukuransangat besar (? @, kbp)
Aabungan si!at 2ektor plasmid dan
si!at berguna dari situs cos(di.ilangkan pada 2ektor )
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 39/45
3ektor5osmid
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 40/45
B'P
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 41/45
Replikasi dimediasi ori$ dan oriC
par ' and par "mengendalikanagar .anya terdapatsatu 2ektor dalam
sel Menggunakan
penanda keta.ananter.adap
9.loram!enikolR
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 42/45
%apat disisipi gen asing +,, / +,,,kbp dan dimasukkan ke dalam yeast
telomere telomerecentromere
URA3 ARS HIS3
replicationorigin
markers
largeinserts
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 43/45
Keunggulan: %apat digunakan untuk mengklon potongan
%&' dengan ukuran sangat besar (*,, / +,,,kbp)
Penting digunakan dalam proyek penetapanurutan basa nukleotida total genom
Kelemahan: >idak muda. mengerjakan molekul %&'dengan ukuran sangat besar
"A#s - "acterial 'rti7cial5.romosomes
$A#s - 0east 'rti7cial
5.romosomes
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 44/45
3ektor yang dapat digunakan untuk dua macam
inang (memiliki origin o! replication dari masing/masing inang)
7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor
http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 45/45
Ukuran %&' yangdisisipkan Ukuran 2ektor $itus enzim
restriksi yang
tersedia Dumla. salinan
(copy number) C7siensi kloning
9emampuan untukmenapis %&'sisipan
Rencana penelitianselanjutnya