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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICAMETABÓLICA

QFB

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M en EQ CLARA A. MUCIÑO HIDALGOM en EQ JOSÉ BENITO SÁMANO NÁJERA

2008

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

LICENCIATURA DE QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

QUINTO SEMESTRE

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ELABORADO POR;QFB CLARA ANGELICA MUCINO HIDALGO

Q.F.B JOSÉ BENITO SÁMANO NÁJERA

2008

PRESENTACIÓN

El manual de prácticas de Bioquímica Metabólica, se utiliza durante el quinto semestre de

la Licenciatura de Químico Farmacéutico Biólogo de la Facultad de Química de la

Universidad Autónoma del Estado de México y esta enfocado básicamente al estudio de

las propiedades y métodos de cuantificación de los lípidos, proteínas y ácidos nucleicos.

Las técnicas aquí utilizadas no son excluyentes de otras que pudieran ensayarse, las que

aquí se presentan fueron elegidas en base a su factibilidad técnica en recursos humanos

y económicos, así como en tiempo ajustándose a los objetivos que marca el programa de

la unidad académica.

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INTRODUCCIÓN GENERAL

La Bioquímica es una de las ciencias modernas que mayor auge ha alcanzado en los últimos tiempos, hace aproximadamente ocho décadas se separó de la química orgánica. La bioquímica es más una ciencia empírica que teórica. Cada organismo, en realidad cada macromolécula, tiene propiedades únicas. Un organismo vivo es la quintaesencia de un sistema sinérgico; esto es, el todo es más que la suma de sus partes. Sin embargo, como la complejidad de los fenómenos bioquímicos imposibilita el análisis de todo el sistema, la bioquímica ha intentado descubrir los secretos de la función celular estudiando sus partes aisladamente. Por lo tanto, por necesidad, la bioquímica ha sido siempre una ciencia deductiva.

A pesar de su diversidad, es posible hacer generalizaciones que parecen aplicables a todos los organismos como por ejemplo:

-Toda la información necesaria para que un organismo crezca y se reproduzca está contenida en su DNA. La información biológica se expresa en el complemento de proteínas de la célula y se trasmite mediante autorreplicación del DNA cuando la célula se divide.-El flujo de la información biológica es desde el DNA, el portador de la información genética, al RNA y, desde éste, a las proteínas.-Casi todas las reacciones químicas que ocurren dentro de la célula son realizadas por los catalizadores proteicos denominados enzimas. Recientemente se ha descubierto que ciertas reacciones bioquímicas pueden ser catalizadas por moléculas de RNA.

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-El ATP es la unidad cuántica de energía bioquímica. La degradación (catabolismo) de todos los alimentos se acoplada a la generación de ATP y la biosíntesis (anabolismo) de todos los componentes celulares está acoplada a la hidrólisis de ATP

Es inmenso el acervo de conocimientos acumulados en las últimas décadas, en relación con los mecanismos de gran cantidad de fenómenos biológicos. Definitivamente, se han logrado progresos increíbles en el conocimiento de una multitud de aspectos de los fenómenos biológicos. Pero asimismo, es necesario admitir que se sabe muy poco acerca de numerosos fenómenos biológicos. Respecto al metabolismo celular hay lagunas enormes que nos impiden analizar fenómenos aparentemente sencillos.

La vida se desarrolla en el microcosmos de la célula. El comprender las dimensiones de las biomoleculas y de la célula es importante para el estudio de la bioquímica. Una célula eucariótica típica tiene un diámetro de 25 micrómetros. Si ampliamos esta célula un millón de veces en cada una de las direcciones, tendríamos un escenario de 25 m de ancho. Una molécula de agua tiene un diámetro de unos 0.4 nm, el DNA tiene unos 2 nm de ancho, la hemoglobina, una proteína de los glóbulos rojos que transporta a el oxígeno, tiene un peso molecular de 64 000 uma y un diámetro de 6.4 nm aumentada un millón de veces tiene el tamaño de un guisante. Una célula esta limitada por una membrana plasmática. Aumentada un millón de veces, esta membrana tendría un centímetro de ancho.

Levantemos entonces el telón para entrar al fascinante mundo de la Bioquímica

Bienvenido a la Bioquímica

En el curso de Bioquímica Metabólica se estudian las biomoléculas de los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos.

Los lípidos constituyen más del 10 % del peso corporal de un individuo adulto normal y aporta aproximadamente el 40 % de las calorías de la alimentación diaria promedio. Los lípidos se consideran importantes porque son una fuente de energía, un manto térmico, ya que aísla al cuerpo contra la perdida de calor, forman parte de la estructura de las membranas biológicas, son una "almohada" protectora para muchos tejidos y órganos, forma parte de la estructura de caracteres sexuales secundarios.

Los lípidos lo constituyen todas aquellas sustancia insolubles en agua pero solubles en solventes no polares como el tetracloruro o cloroformo, dentro de los lípidos tenemos a los triacilgliceridos, los fosfolípidos, los esfingolipidos, las ceras, los terpenos, el colesterol, las sales biliares entre otras.

Además de fuente de energía (9 calorías por gramo), tal vez la función mas importante de los lípidos se relaciona con el hecho de que un buen número de ellos, son moléculas anfipáticas que en presencia de agua se asocian formando bicapas. Estas constituyen la base sobre la cual se organiza la complicada estructura de las membranas celulares.

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Por otro lado la información genética es inherente a una sustancia química intracelular, es un hecho descrito por primera vez en 1928 por Griffith, ahora es evidente que la información genética reside en la estructura del DNA, muchos de los experimentos realizados durante las últimas décadas así lo confirman.

Los ácidos nucleicos son moléculas polianiónicas de alto peso molecular compuestas por una secuencia específica de subunidades o monómeros llamados nucleótidos; la totalidad se le denomina polinucleótidos, los ácidos nucleicos se dividen en dos categorías el ácido desoxirribonucleicos o DNA y el ácido ribonucleico o RNA. El DNA se encuentra principalmente en el núcleo de la célula mientras que el 90 % del RNA se encuentra en el citoplasma, el 10 % restante se encuentra en el núcleo. El DNA contiene las bases púricas (adenina y guanina) y las pirimidinicas (citosina y timina), mientras que en el RNA en las pirimidinas existe en lugar de timina el uracilo.

La secuencia de los nucleótidos en las cadenas de DNA y RNA permiten a las células sintetizar proteínas, que éstas tienen una diversidad de funciones como por ejemplo su activada enzimática, de defensa, hormonal entre otra de gran importancia para el desarrollo de las células.

Como podrás darte cuenta en esta pequeña introducción se puede apreciar la importancia que tiene el estudio de los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos.

ÍNDICE

1.- PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS LÍPIDOS

2.- SEPARACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

3.- HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS LÍPIDOS DE LA LECHE

4.- DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS TRANSAMINASAS

5.- DETERMINACIÓN DE UREA

6.- AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE RNA

7.- DETERMINACION DE FÓSFORO EN RNA

8.- EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE DNA DE ERITROCITOS DE POLLO.

9.- DETERMINACION DE FÓSFORO EN DNA

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PROPÓSITO GENERAL DEL CURSO

La Bioquímica en el programa académico de Químico Farmacéutico Biólogo, se

conceptualiza de manera general, la cual por su extensión en el contenido se ha dividido

en los cursos de Bioquímica Básica y Bioquímica Metabólica de aquí qué uno de sus

propósitos de ésta última, sea el de complementar el curso de Bioquímica Básica.

Específicamente en el curso de Bioquímica Metabólica se tiene como objetivo dotar al

alumno de las herramientas prácticas necesarias para que pueda explicarse o comprobar

según sea el caso, los fenómenos bioquímicos en que participan los lípidos, las proteínas

y los ácidos nucleicos, haciendo hincapié‚ en las desviaciones que sufren estos

fenómenos al verse afectados por agentes externos, que bien se pueden reflejar en

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alteraciones funcionales para que de esta manera el alumno los correlacione con

materias afines como Genética, Análisis Bioquímicos Clínicos, Inmunología, Hematología,

Virología, Microbiología, Bacteriología entre otras y que más tarde aplicará en su

desarrollo profesional.

REGLAMENTO PARA EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA METABÒLICA

1.-Para estar inscrito en el curso deber de presentar el recibo de inscripción que lo acredite como alumno del quinto semestre de la licenciatura de Químico Farmacéutico Biólogo.2.- Deber de tener derecho a cursar la unidad académica de Bioquímica Metabólica de QFB.3.-La asistencia es obligatoria, por que el alumno deber de adquirir y/o desarrollar las habilidades para el trabajo experimental.4.- El alumno que tenga menos del 80 % de asistencia tendrá una calificación de 2.9 en el laboratorio y no podrá ser tomada en cuenta para la calificación final.5.-Para entrar al laboratorio de Bioquímica Metabólica, el alumno deber de contar con el manual de prácticas del curso del laboratorio de Bioquímica Metabólica, ya que en él se encuentran todas las instrucciones que se desarrollaran durante el curso práctico.6.-Las prácticas y el pase de lista será a la hora indicada en los horarios, con una tolerancia de 5 minutos a la entrada, no habrá retardos.7.-Para el Trabajo de laboratorio es indispensable traer bata, un trozo de franela, un marcador indeleble y masking tape.8.-Los laboratorios son un lugar de trabajo por lo que cualquier indisciplina será sancionada de acuerdo al reglamento general de la Faculta de Química y de la UAEM.9.-Durante el desarrollo de las prácticas queda estrictamente prohibida la entrada de personas ajenas al grupo.10.- Queda estrictamente prohibido salir del laboratorio sin causa justificada.

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11.- Queda estrictamente prohibido sentarse en las mesas de trabajo.12.- Por razones de seguridad, queda estrictamente prohibido fumar o comer dentro del laboratorio.13.-El material y equipo que sea prestado por la institución para el desarrollo de las prácticas, que sea roto o descompuesto deberá ser repuesto o reparado inmediatamente, por el responsable directo o por el equipo de personas que estén efectuando la práctica.14.- El informe del laboratorio deberá de entregarse de acuerdo con las instrucciones del profesor de prácticas.15.- La evaluación de prácticas será tomando en cuenta los siguientes aspectos.

a).- Dos exámenes de laboratorio 50 % de la calificación.b).- Presentación de seminario 25 % de la calificación.c).- Participación en la discusión y desarrollo de la práctica 15 % de la calificación.d).- Reporte de la práctica 10 % de la calificación.

16.- La calificación del laboratorio corresponderá a un 20 % de la calificación final del curso de Bioquímica Metabólica para los QFB.17.- Los alumnos asistentes tendrán un visto bueno el cual lo obtendrán cuando se discuta y entreguen los resultados.18.- El alumno que no tenga visto bueno no acreditara su asistencia al laboratorio.19.- Antes de desechar los productos obtenidos deberán de ser tratados para evitar al máximo la contaminación.20.- Las personas que presenten el seminario tienen la obligación de indicar cual es el tratamiento final que deberá de darse a los productos generados durante la práctica.

21.- Además de las reglas del laboratorio de Bioquímica Metabólica para QFB se aplicarán las reglas generales de laboratorio de la Facultad de Química de la UAEM.

22.- Lo no previsto en este reglamento será sancionado por el Consejo Académico y de Gobierno de la Facultad de Química de la UAEM.

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MATERIAL REACTIVOS Y EQUIPO GENERAL.

MATERIAL1.- Potenciómetro2.- Agitador magnético3.- Soporte universal y pinzas para bureta4.- Bureta de 50 mL5.- Vasos de precipitado de 50,100, 200 y 500 mL.6.- Pipetas de 1, 5, 10 mL7.- Probetas de 50 y 100 mL8.- Piceta9.- Pañuelos desechables10.- Tubos de ensaye 11.- Baño María12.- Matraz Erlenmeyer de 100,200 y 500 mL13.- Aparato para filtración14.- Centrífuga15.- Agitadores de vidrio16.- Fotocolorímetro17.- Espectrofotómetro18.- Aspersores19.- Cajas petri20.- Embudos

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21.- Tubos de ensayo22.- Pipetas 23.- Espectrofotómetro 546 nm24.- Baño de agua25.- Cronometro26.- Vidrio de reloj27.- Licuadora 28.- Gasas 29.- Pipeta Pasteur 30.- Bulbos para pipeta Pasteur31.- Tubos de centrifuga32.- Baño de hielo33.- Mortero

REACTIVOS1.- Solución cloroformo metanol 2:1 (v:v)2.- Solución de cloruro de potasio 0.1 M en agua destilada3.- Eluyente: solución de cloroformo-metanol-ácido acético-agua 65:25:8:4 (en volumen).4.- Reactivo de molibdato.5.- Reactivo de ninhidrina.6.- Reactivo de bismuto.7.- Aceite de ajonjolí.8.- Aceite de algodón.9.- Aceite de linaza.10.- Aceite de cartamo.11.- Aceite de recino.12.- Éter anhídro.13 - Cloroformo.14.- Cloruro de sodio.15.- Tetracloruro de carbono16.- Albúmina de huevo.17.- Extran 100.18.- Ninhidrina.19.- Piridina 250 ml20.- Ácido nítrico.21.- Ácido oléico.22.- Ácido esteárico.23.- Sales biliares.24.- Cobre metálico.25.- Bromo.26.- Fosfolípidos (lecitina) 27.- Colesterol.28.- Butanol.29.- Azul de metileno.30.- Lugol.31.- Pancreatina.32.- Etanol al 96 %.

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33.- Hidróxido de potasio.34.- Fenoftáleina.35.- Arabinosa.36.- Ácido Tricloro acético.37.- Reactivo de orto-toluidina.38.- Arsenomoblidato.39.- Sacarasa40.- Carbonato de sodio.41.- Suspensión de ureasa.42.- Solución patrón de urea.43.- Reactivo de fenol.44.- Solución de hipoclorito45.- Suero humano fresco.46.- Solución amortiguadora de sustrato.47.- Reactivo de coloración (dinitrofenilhidrazina)48.- Solución patrón de piruvato.49.- Hidróxido de sodio50.- Fenol.51.- Acetato de potasio.52.- Sol. Isotónica de NaCl.53.- Sol. de saponina.54.-Solución de SDS en EDTA.55.- Mezcla de Sevag.56.- Solución de NaCl 5 M.

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICOFACULTAD DE QUÍMICA

BIOQUÍMICA METABÓLICAQFB

PRÁCTICA # 1PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS LÍPIDOS

PROPÓSITO

Al término de la práctica el alumno tendrá la habilidad de identificar en el laboratorio las propiedades fisicoquímicas más comunes de los lípidos.

INTRODUCCIÓN

El término lípido se refiere a cualquier sustancia natural no polar que sea casi o totalmente insoluble en agua, pero soluble en solventes no polares como el cloroformo, el disulfuro de carbono, el éter y el alcohol caliente. Debido a su diversidad, tanto estructural como funcional, esta definición es necesariamente vaga y muy general, Sin embargo, una propiedad de los lípidos en su naturaleza no polar, que se debe, en la mayoría de los casos, a la presencia de uno o más residuos de ácidos grasos.

Los lípidos se han clasificado de acuerdo a su complejidad estructural como:

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1. LÍPIDOS SIMPLES.- Este grupo se incluyen a los esteres de ácidos grasos y el glicerol.

2. LÍPIDOS COMPUESTOS.- Son aquellos que contienen otras sustancias además de un alcohol y de ácido graso (carbohidratos, fosfato, compuestos nitrogenados).

3. LÍPIDOS DERIVADOS.- Aquí se incluyen cualquier material que concuerde con la definición general de un lípido, pero que no pueda clasificar en los dos grupos anteriores: ejemplo los esteroides, los carotenoides y las vitaminas insolubles en agua.

Para la caracterización y análisis de los lípidos se precisa de utilizar más de un método: índice de saponificación, grado de insatauración, contenido de fósforo, nitrógeno, etc.

Es común, en la actualidad, efectuar una hidrólisis ácida o alcalina e identificar posteriormente los productos de la hidrólisis. Esta identificación se ha facilitado por la introducción de técnicas como la cromatografía en papel, en columna o en fase de vapor.

MATERIAL Y REACTIVOS

1.- Tubos de ensaye 15.- Tetracloruro de carbono2.- Gradilla. 16.- Sol. de albúmina al 1 %3.- Baño de hielo. 17.- Sol. de Extran 100 a 1%4.- Bulbo de hule 18.- Sol. de tween 80 al 1 %5.- Pipetas de 1.5 y 10 mL. 19.- Ac. nítrico concentrado6.- Aceite de ajonjolí. 20.- Ac. oleico saturado en butanol7.- Aceite de algodón. 21.- Ácido esteárico saturado en butanol8.- Aceite de linaza. 22.- Sales biliares al 5 %9.- Aceite de cártamo. 23.- Cobre metálico10.- Aceite de ricino 24.- Bromo en tetracloruro de carbono al 5%11.- Éter anhidro 25.- Fosfolípidos (lecitina de huevo). 4% en butanol)12.- Cloroformo 26.- Colesterol (4% en butanol)13.- Carbonato de sodio al 1 % 27.- Butanol14.- Alcohol etílico 28.- Azul de metileno (solución al 0.025% en Butanol).

TÉCNICA

A.- SOLUBILIDADUno de los criterios para definir a los lípidos es su solubilidad en disolventes orgánicos no polares, por lo que es conveniente comprobarlo y analizar a que se debe esta propiedad común de los lípidos.

PROCEDIMIENTO:A 5 gotas de los aceites, adicionar 1 mL del solvente por probar y anotar sus observaciones en el cuadro* .

MUESTRA AGUA ALCOHOL FRÍO

ALCOHOL CALIENTE

ÉTER TETRACLORURO DE CARBONO

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CARTAMOAJONJOLÍLINAZARICINO(*) Anote sus conclusiones de acuerdo a lo que observó.

B.-EMULSIFICACIÓNEl objetivo de esta prueba es comprender esta propiedad en los lípidos y factores que la modifican.

PROCEDIMIENTO

En tubos de ensayo debidamente etiquetados, efectúe las siguientes pruebas, usando 5 gotas de aceite y 2 mL del emulsificante en cada caso, anotando sus observaciones en el cuadro siguiente:MUESTRA AGUA ALCOHOL ALBÚMINA

al 1%EXTRAN al 1%

Na2CO3 al 1%

SALES BILIARES al 5%

AJONJOLÍALGODÓNRICINOLINAZA(*) Puede utilizarse tween 80 al 1% y otros aceites que disponga el profesor:NOTA: Anote en el cuadro el tiempo que tarda en romperse la emulsión.

C.-INSATURACIÓN

Esta prueba nos permite comprender el grado de instauración de los ácidos grasos constituyentes de lípidos, basándose en la propiedad que tienen los dobles enlaces de adicionar halógenos, utilizando para ello una solución de bromo en tetracloruro al 5 %, observado la desaparición de la coloración café‚ por la adición de bromo al doble enlace, siendo la intensidad del color proporcional a la saturación del lípido o ácido graso, e inverso a la instauración.

PROCEDIMIENTO Esta prueba se efectúa en tubos de ensayo secos, utilizando 5 gotas de la muestra lipídica y siguiendo las indicaciones del cuadro siguiente:REACTIVO AJONJOLÍ LINAZA ACEITE

DE MAÍZACIDO OLEICO

ACIDO ESTEÁRICO

TESTIGO

Éter anhidro

Adicionar 5 mL , tapar y enfriar en hielo por 10 minutos

Reactivo de bromo al 5 %

Adicionar 0.5 mL a todos los tubos con sumo CUIDADO en la campana

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Desarrollo Dejar reposar una hora en baño de hieloGrado de instauración

De acuerdo con sus lecturas, indique si se trata de un lípido saturado, insaturado o poliinsaturado.

D.- ISOMERÍA CIS-TRANS.

La isómera cis-trans puede ser observada en el ácido oleico, ácido graso constituido por una cadena de 18 C con un doble enlace en el C-9, es líquido a temperatura ambiente (p.f. 13.4 oC) que al ser tratado con cobre y ácido nítrico concentrado se trasforma en su isómero trans, el ácido elaidico, que es sólido y de punto de fusión más elevado (p.f. 44-45 oC)

PROCEDIMIENTO

En un tubo de ensayo coloque 1 mL de ácido oleico, adicione 0.2 mL de ácido nítrico concentrado y un pequeño alambre de cobre en espiral.CUIDADO la reacción es violenta y con desprendimiento de gases. Efectúe esta prueba en la campana y enfríelo con agua fría.

Transcurrido 15 minutos, agregue 3 mL de agua destilada para diluir, pase la fase "oleosa" a otro tubo agréguele 2 mL de etanol y mezcle.

Consérvelo en baño de hielo hasta la aparición de cristales de ácido elaidico.

E.- PERMEABILIDAD DE UNA MONOCAPA LÍPIDICA

La membrana juega un papel muy importante en la integridad celular, por lo que es conveniente comprender su composición y como es afectada su permeabilidad al modificar sus constituyentes lípidicos.

PROCEDIMIENTO

Prepare una serie de 5 tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones del cuadro, colocando la solución de butanol-lípido-azul de metileno con mucho cuidado, dejando resbalar por las paredes del tubo logrando formar las 2 capas

PROCEDIMIENTO

REACTIVO TUBO1 2 3 4 TESTIG

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OAGUA DESTILADA (mL) 2 2 2 2 2ÁCIDO ESTÉARICO (mL) 2 0 0 0 0ÁCIDO OLEICO (mL) 0 2 0 0 0FOSFOLÍPIDO (mL) 0 0 2 0 0COLESTEROL (mL) 0 0 0 2 0AZUL DE METILENO-BUTANOL (mL) 2 2 2 2 2

DEJAR EN REPOSO A TEMPERATURA AMBIENTE

OBSERVACIONES

TIEMPO DE REPOSO (hrs)

TUBO1 2 3 4 TESTIGO

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CUESTIONARIO

1. ¿Cómo explica la diferencia en la solubilidad con el alcohol frío y caliente?2. Explique ¿porqué los aceites probados tuvieron diferentes solubilidades en los

diferentes disolventes?3. ¿Cómo se comportan los lípidos en presencia de un detergente, ante una proteína

y ante un electrolito?4. ¿De qué depende el grado de saturación o instauración de un lípido?5. ¿Qué es el índice de iodo para los lípidos?

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QFBBIOQUÍMICA METABÓLICA

PRÁCTICA No 2SEPARACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

PROPÓSITO

Al finalizar la práctica el alumno comprobará que la cromatografía es una técnica que se utiliza para la separación de fosfolípidos de la yema del huevo.

INTRODUCCIÓN

Los lípidos constituyen una de las biomoléculas que con frecuencia se encuentran combinados covalentemente o mediante enlaces débiles con miembros de otra clase de biomoléculas, constituyendo moléculas tales como: glicolípidos, los cuales contienen lípidos y glúcidos; lipoproteínas que contienen lípidos y proteínas. En estas biomoléculas las propiedades químicas y físicas características de sus componentes están fusionadas para cumplir funciones biológicas especializadas.

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La cromatografía es un proceso que conduce a la resolución de mezclas por separación de todos o algunos de sus componentes en zonas concentradas o en fases diferentes de aquellas de las que se encontraban originalmente, independientemente de la naturaleza de las fuerzas que provocan el paso de dichas sustancias de una fase a otra.

Los mecanismos que se llevan a cabo en la cromatografía son fundamentalmente:

a).- Partición entre solventes (fase móvil o eluyente y fase acuosa estacionaria) o cromatografía de reparto.b).- Interacciones superficiales físicas o cromatografía de adsorción.c)- Atracción electrostática de iones con carga opuesta sobre superficie polielectrolítica o cromatografía de intercambio iónico.

En la práctica, la mayoría de las veces se trata de una combinación de estos mecanismos.

En la cromatografía de capa fina la separación se logra fundamentalmente debido a la adsorción de cada sustancia sobre el gel de silica distribuido en una placa de vidrio que forma una capa delgada y uniforme o debido a una distribución entre el solvente móvil y el agua incluida en el gel de sílice.

Las sustancias adheridas están ligadas a la superficie del absorbente por fuerzas electrostáticas y puente de hidrógeno recordando que el contenido de agua es decisivo, ya que esta bloqueado los sitios activos de la superficie.


1.- Equipo para cromatografía 2.- Tubos capilares3.- Centrífuga 4.- Embudo de filtración5.- Papel filtro 6.- Sol. cloroformo-metanol 2:1 (V:V)7.- Cloruro de potasio 0.1 M 8.- Reac. de bismuto9.-Eluyente: solución de cloroformo-metanol-ácido acético-agua 65:25:8:4 en volumen.10.-Reactivo de molibdato: pesar 68 g de molibdato de sodio y 0.4 de sulfato de hidracina, disolver en 100 mL de agua, añadir 100 mL de ácido sulfúrico concentrado. Enfriar y aforar a un litro con agua.11.- Reactivo de ninhidrina: disolver 0.5 g de ninhidrina en 100mL de n-butanol.

TÉCNICA

I.- PRIMERA PARTE: EXTRACTO DE LÍPIDOSa) Separar la yema del huevo y mezclarla con 25 mL de la solución de cloroformo-

metanol 2:1 para extraer fosfolípidos y lípidos neutros.b) Agitar aproximadamente 20 minutos.c) Filtrar, agitar el filtrado claro con 20 mL de la solución de cloruro de potasio 0.1M.d) Centrifugar a 2000 rpm, por 20 min.

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e) Separar la fase acuosa superior y usar la fase cloroformica inferior para la cromatografía.

II.- SEGUNDA PARTE: CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.a) Aplicar tres muestras del extracto de lípidos aproximadamente de 30 microlitros en

forma equidistante.b) Colocar el cromatógrama en la cámara saturada con el eluyente.c) Dejar desarrollar durante 90 min. o hasta que alcance una altura de 12-15 cm.d) Sacar la placa de la cámara y dejar secar.

III.- TERCERA PARTE: REVELADO DE CROMATOGRAMAS

a) Revelar cada placa cromatográfica con un revelador distinto con el fin de obtener las manchas características de cada tipo de fosfolípidos.

NOTA: El cromatograma revelado con el reactivo de ninhidrina requiere calentarse a 100 oC por 5 minutos.

CUESTIONARIO

1. Dibuja un esquema a escala de los cromatogramas.2. Calcula los rf de cada una de las manchas detectadas e identifica a que

compuestos corresponden.3. ¿Cuáles son los lípidos que se encuentran en la yema del huevo?4. Menciona 3 propiedades biológicas de los fosfolípidos.5. ¿Cuál es el fundamento de la técnica utilizada?

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QFBBIOQUÍMICA METABÓLICA

PRÁCTICA No 3HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LÍPIDOS DE LA LECHE

PROPÓSITO

Al término de la práctica el alumno habrá adquirido las habilidades en el laboratorio para determinar una hidrólisis enzimática de los lípidos de la leche.

INTRODUCCIÓN

Las lipasas y las estearasas catalizan la hidrólisis de los enlaces ester que se encuentran en un gran número de lípidos saponificables. La reacción que se llevan a cabo es la siguiente:

O O CH2-O-C-R CH2-OH R-C-O-CH LIPASA CH-OH + 3RCOO-

CH2-O-C-R CH2-OH

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O

Estas enzimas están ampliamente distribuidas en la naturaleza y son especialmente importantes en el intestino delgado donde tiene lugar la digestión y la absorción de grasas, debido a que los triacilgliceroles son insolubles en agua, y las enzimas digestivas son solubles en ella. La digestión de los triacilgliceroles transcurre en las interfaces lípido-agua: consecuentemente los agentes emulsificantes tales como las sales biliares producen a menudo una estimulación marcada de la hidrólisis enzimática de los lípidos.

En la leche homogenizada, los glóbulos de grasa se encuentran muy finamente divididos y este material sirve como un sustrato excelente para las lipasas.

MATERIAL Y EQUIPO

1. Siete matraces Erlenmeyer de 125 mL2. Dos buretas de 25 mL3. Una pinza para bureta4. Un soporte universal5. Termómetro6. Mechero7. Dos pipetas de 1mL, 5 mL y 10 mL.8. Seis pipetas volumétricas de 10 mL.9. Un litro de leche homogeneizada.10.Pancreatina al 1 % en agua11.Etanol al 95 %12.Hidróxido de potasio 0.05 N13.Sales biliares al 1%14.Fenolftaleína15.Baño de agua a 37 C0

TÉCNICA

1. Identificar los matraces del uno al cinco y uno con el 3'2. Medir cuidadosamente con una pipeta volumétrica, 5 mL de leche homogenizada

en cada uno de los seis matraces Erlenmeyer de 125 mL.3. Adicionar a cada matraz 1.5 mL de extracto neutro de pancreatina al 1 %4. Pipetear en el matraz 3', 1.0 mL de la solución de sales biliares al 1 %5. Colocar todos los matraces en un baño de agua a 37oC6. Después de 15 minutos, retirar del baño de agua el matraz identificado con el

numero 1 y adicionarle 12.5 mL de alcohol titulando enseguida con la solución de KOH 0.05 N usando fenolftaleína como indicador. Agitar el matraz durante la titilación, tan vigorosamente como sea posible ya que la proteína precipitada puede enmascarar los ácidos grasos libres.

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7. Titular tan rápido como sea posible debido a que la digestión por la enzima continúa durante la titulación.

8. Repetir el procedimiento anterior, sacando el matraz 2 a los 30 minutos, el 3 y 3' a los 45, el 4 a los 60 y el 5 a los 75 minutos.

9. Preparar un testigo de la siguiente manera. Añadir en un matraz de 125 mL, 5 mL de la leche homogenizada y 1.5 mL de la solución de pancreatina hervida previamente durante tres minutos. Agregar enseguida 12.5 mL de etanol, la fenolftaleína y titular inmediatamente con KOH 0.5 N restar este valor a los problemas.

CUESTIONARIO

1. Construir una gráfica usando tiempo de hidrólisis en las abscisas y los mL de KOH gastados en las ordenadas (restando el testigo).

2. Explicar el efecto de la adicción de sales biliares sobre la actividad enzimática suponiendo que la grasa de la leche es triestearina.

3. Calcular el número de miligramos de triestearina hidrolizada por la lipasa en una hora, basándose en la cantidad de ácido liberado durante ese intervalo.

4. Escribir las fórmulas de los siguientes compuestos: lecitina, isolecitina, un glicolípido y una cefalina.

5. Describir la composición de la leche.6. Que tipos de detergentes biológicos existen en el hombre.


BIOQUÍMICA METABÓLICAQUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

PRÁCTICA No 4DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS TRANSAMINASA

PROPÓSITOEl alumno desarrollará su capacidad para determinar la transaminasa glutámico piruvica en suero humano.

INTRODUCCION

En el metabolismo de los aminoácidos se incluyen reacciones de transaminación, en las que hay una transferencia de un grupo amino de un alfa-aminoácido a un alfa-cetoácido con la formación de un nuevo alfa-aminoácido y cetoácido, las enzimas que catalizan esta reacción se llaman transaminasas o llamadas también aminotransferasas, las cuales utilizan como coenzima al fosfato de pirodoxal derivado de la vitamina B-6

alfa-aminoácido-1 + cetoácido-2__________alfa-aminoácido-2 + cetoácido-1 transaminasa

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En la reacción de transaminacion el fosfato de pirodoxal actúa como un portador intermediario del grupo amino transferido.Dentro de las transaminasas más estudiantes tenemos a la transaminasa glutámico piruvica y a la transaminasa glutámico oxalacética TGP y TGO respectivamente su cuantificación es utilizada para conocer el funcionamiento hepático, junto con otras enzimas.

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MATERIAL Y EQUIPO

1. Solución amortiguadora de sustrato.- (amortiguador de fosfatos 100 mmol/L a pH 7.4 alanina 200 mmol/l alfa-cetoglutarato 2 mmol/l)

2. Reactivo de coloración.- (2,4 dinitrofenilhidrazina 1.5 mmol/l)3. Patrón.- (piruvato sódico 2 mmol/l)4. Hidróxido de sodio.- 0.4 n5. Tubos de ensayo6. Pipetas 7. Espectrofotómetro 546 nm8. Baño de agua9. Cronómetro

TÉCNICA

Prepara la siguiente tabla

REACTIVOS PROBLEMA (ml) BLANCO (mL)

Solución amortiguadora 0.5 0.5Colocar 5 min. en baño de agua a 37 oC

Suero (reciente, no hemolizado)

0.1 0.0

Mezcla, incubar 30 min. a 37 oCReactivo de coloración 0.5 0.5Agua 0.0 0.1

Mezclar y reposar 20 min. a temperatura ambiente

Hidróxido de sodio 0.4 N 5.0 5.0Mezclar y reposar 15 min. a temperatura ambienteLeer a 546 nm

CÁLCULOTome la siguiente tabla como referencia.

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D.O. mU/mL D.O. mU/mL0.02 3 0.30 460.04 5 0.32 500.06 8 0.34 530.08 10 0.36 570.10 13 0.38 610.12 16 0.40 650.14 19 0.42 690.16 22 0.44 740.18 26 0.46 790.20 29 0.48 840.22 32 0.50 900.24 36 0.52 980.26 390.28 43

CUESTIONARIO

1.- Escriba la reacción de la transaminasa TGP2.- ¿Cuáles son los valores de referencia de la TGP?3.- ¿Cuál es el fundamento de la reacción?4.- ¿Dónde se encuentran la TGP en el organismo humano?5.- ¿Qué significado tiene una elevación en la concentración de la TGP?


BIOQUÍMICA METABÓLICAQUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

PRÁCTICA No 5DETERMINACIÓN DE UREA

PROPÓSITOAl término de la práctica el alumno tendrá la capacidad para cuantificar urea en muestras biológicas humanas como la orina o la sangre.

INTRODUCIÓN

Cuando los aminoácidos de la dieta exceden los requerimientos para la síntesis proteica y otra vía anabólicas, el exceso es catabolizado para producir ATP o es convertido a substratos para la síntesis de ácidos grasos.

Es importante tomar encuentra que sólo los esqueletos de carbono de los aminoácidos y no los grupos amino pueden ser usados en el proceso antes mencionado.

La eliminación del nitrógeno de los aminoácidos es una parte importante en el catabolismo de los aminoácidos, es tóxico para el cerebro en forma de amonio, por lo que

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el organismo humano lo debe de eliminar en forma de urea, compuesto no tóxico soluble en agua cuya única función en el metabolismo es la excreción de nitrógeno.

La urea puede determinarse en el hombre en muestras como: la sangre o la orina, por diferentes métodos los más usados son los métodos enzimáticos.

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1. Suspensión de ureasa.-Ureasa 3.5 Ku/L.2. Solución patrón de urea.-Urea 40 mg/dL=6.66mmol/l3. Reactivo de fenol.- 150 mmol/L nitroprusiato de sodio 0.47mmol/ L4. Solución de hipoclorito.- hipoclorito de sodio 13mmol/L; NaOH 130mmol/L.5. Tubos de ensayo6. Espectrofotómetro7. Suero humano fresco (PROBLEMA)

TÉCNICA

Prepare la siguiente serie de tubos:

REACTIVO TUBOPROBLEMA PATRÓN BLANCO

UREASA (mL) 0.2 0.2 0.2UREA (mL) 0.0 0.02 0.0PROBLEMA (mL) 0.02 0.0 0.0

Mezclar y dejar en reposo por 30 min. a temperatura ambiente

FENOL (mL) 5.0 5.0 5.0HIPOCLORITO DE SODIO (mL)

5.0 5.0 5.0

Mezclar y dejar reposar por 30 min. a temperatura ambiente Medir en el espectrofotómetro a 620 nm

DETRMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN

C = D.O. X 6.66/D.O P.

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C = concentración en mmol/LD.O.= Densidad óptica del problemaD.O.P.= Densidad óptica del patrón

CUESTIONARIO

1. Determine la concentración de urea en el problema.2. ¿Cuáles son los valores de referencia de urea en suero en el humano?3. ¿Qué papel juega el fenol en la determinación de la urea?4. Escriba la reacción que cataliza la ureasa.5. Proponga otro método de cuantificación de la urea.6. Escriba el ciclo de la urea.


BIOQUÍMICA METABÓLICAPRÁCTICA No. 6

AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE RNA

PROPÓSITOAl finalizar la práctica el alumno habrá desarrollado la habilidad para extraer y purificar RNA de hígado de rata.

INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleicos, debido a su interrelación con otras moléculas, resultan bastante difíciles de separar, por ejemplo, de las proteínas y polisacáridos por métodos suaves y los tratamientos drásticos alteran profundamente su estructura y característica, por lo que a menudo se encuentra un considerable grado de impurezas en las preparaciones no analíticas. El RNA no tiene la estructura altamente regular que posee el DNA, ni presenta la relación constante entre las bases que son características del DNA. También es más difícil estudiarlo debido a que se presenta en varias formas diferentes en una misma célula. La mayor variabilidad en la estructura del RNA se debe, en parte, a la naturaleza misma de los nucleótidos que lo constituyen. Los nucleótidos de ribosa tienen dos grupos hidroxilos en el azúcar en estado libre, mientras que los nucleótidos de desoxirribosa

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presentan solo uno. Otro factor que contribuye a la variabilidad en la estructura del RNA es la mayor frecuencia de bases poco comunes tales como metil-citosina y metil-guanina.Los métodos de aislamiento, dependen del tipo o condiciones en que se requiere el RNA, los más usados son:

Extracción con ácido tricloroacetico-cloruro de sodio.- Consiste en la precipitación con ácido tricloroacetico de moléculas cargadas, lavando con acetona, para eliminar lípidos y la extracción final del RNA con NaCl al 10% y posteriormente precipitar con alcohol. El RNA así obtenido está algo degradado y contiene algo de DNA.

Extracción con fenol.- Consiste en la extracción con soluciones fenolicas concentradas, desnaturalizando proteínas, rompimiento de la emulsión fenol-agua por centrifugación, conteniendo en la fase inferior (fenolica) el DNA y en la superior (acuosa) RNA y carbohidratos con proteínas desnaturalizadas en ambas fases. Eliminación por centrifugación de proteínas y precipitando con alcohol el RNA. El producto esta contaminado con polisacáridos, principalmente glucógeno, pero libre de DNA.


1. Vidrio de reloj2. Licuadora3. Gasa4. Pipeta Pasteur 5. Bulbos para pipeta Pasteur6. Tubos de centrífuga7. Baño de hielo8. Fenol al 90%(v/v)9. Etanol absoluto10.Éter11.Mortero

TÉCNICA

1. Sacrificar una rata sometida a ayuno de 12 horas.2. Extraer el hígado y colocarlo en un vaso previamente sumergido en hielo y pesarlo

rápidamente; homogenizarlo en la licuadora durante 1 minuto con 25 mL de agua destilada (4 mL/g de hígado de rata) a 15o C.

3. Rápidamente filtrar en gasa doblada en cuatro, agitar vigorosamente al filtrado con 25 ml de fenol al 90% en baño de agua a temperatura ambiente por 20 minutos CUIDADO EL FENOL PRODUCE QUEMADURAS.

4. Enfriar la suspensión por 5 minutos en baño de hielo.5. Centrifugar a 3000 r.p.m. durante 15 minutos de preferencia a 5oC.6. Colocar la fracción acuosa superior y capa intermedia y centrifugar a 3000 r.p.m.

de preferencia a 5 oC. Durante 15 minutos7. Decantar y medir el volumen de sobrenadante obtenido. Añadir 1 ml de acetato de

potasio al 20 % pH 5.0 por cada 10 mL de sobrenadante.

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8. Enfriar en baño de hielo, el sobrenadante, y precipitar el RNA añadiendo 2 volúmenes de alcohol absoluto frío.

9. Centrifugar a 2000 r.p.m. durante 5 minutos.10.Suspender el precipitado en aproximadamente 5 mL de etanol-agua (3:1) a

temperatura ambiente y centrifugar a 2000 r.p.m. durante 5 minutos.11.Repetir el paso número 10 con alcohol absoluto y después con éter.12.Secar al aire y pesar.

CUESTIONARIO

1. Calcular el rendimiento de la técnica.2. Explicar ¿cuál es la función de los siguientes reactivos en la práctica: fenol, alcohol

absoluto y éter?3. Explique ¿qué desventajas tendría el utilizar ratas que no hubieran tenido ningún

ayuno?4. ¿De qué otras fuentes seria posible obtener RNA y que modificaciones haría en la

técnica de identificación y aislamiento?.


BIOQUÍMICA METABÓLICAQ.F.B

PRÁCTICA No 7DETERMINACIÓN DE FÓSFORO EN RNA

PROPÓSITO

Al finalizar la práctica el alumno habrá cuantificado el fósforo presente en la muestra obtenida de hígado de rata.

INTRODUCCION

El DNA y RNA se caracterizan ambos por la posesión de un elevado número de grupos fosfato, que pueden ser liberados por hidrólisis y determinados mediante la interacción con el azul de molibdeno. Esta es una aproximación a la determinación de los niveles de los ácidos nucleicos que sólo se puede emplear en disoluciones purificadas, otras pruebas más específicas son la de difenilalanina y del orcinol, utilizables para la desoxirribosa y sus derivados y la ribosa y sus derivados, respectivamente. Aquí se utilizan reacciones de sus componentes para la determinación cuantitativa de los ácidos

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nucleicos, con posibilidades, además, de diferenciarlos con facilidad ya que el DNA y derivados no reaccionan con el orcinol y el RNA y sus derivados no reaccionan con la difenilalanina.

La heterogeneidad del RNA total recogido de hígado de rata, se puede poner de manifiesto por su resolución mediante una columna, situación en la que se obtienen números picos distintos dependiendo de su pesos moleculares y que bajo condiciones muy controladas de extracción podrían servir para aislamiento parcialmente purificado de algunas clases de RNA de bajo peso molecular.

Existen algunas pruebas coloreadas específicas de las purinas, nucleósidos y nucleótidos que sirven fundamentalmente para reconocer a la ribosa y a la desoxirribosa en muy pequeñas cantidades o en desarrollo cromatográfico, así también se puede identificar elementos presentes, como por ejemplo el fósforo, la mayoría de los métodos para el análisis del fósforo se basan en la ruptura del ortofosfato, dando lugar a una forma insoluble que puede determinarse después por métodos gravimétricos, nefelométricos o polarográficos.


1.-Termómetro 1.-Ácido sulfúrico 2.5M2.-10 tubos de ensayo 2.-Ácido. sulfúrico 0.25M3.-3 pipetas de 1.5 y 10 mL 3.-Cloruro de sodio 0.15M4.-3 matraces de digestión 4.-Molibdato de amonio al 5%5.-2 matraces aforados de 10 mL 5.-Ácido amino-naftol-sulfónico6.-Digestor 6.-Sulfito de sodio.7.-Baño María a 37 C 7.-Bisulfito de sodio.8.-Fotocolorímetro 8.-Sol. tipo de fósforo (30 mg/ mL)

9.-Sol de RNA obtenido de hígado de rata.

TÉCNICA

A).-DIGESTIÓN

1. Etiquete dos matraces de digestión uno como "testigo" y otro como problema.2. En el matraz "testigo" coloque los siguientes reactivos: 1 ml de ácido sulfúrico 2.5M y

0.2 ml de NaCl 0.15M; en el matraz "problema" coloque 1 ml de ácido sulfúrico 2.5M y 0.2 ml de solución de RNA de hígado de rata.

3. Digerir las muestras durante 10 minutos, contando el tiempo al iniciarse el desprendimiento de vapores blancos (hacerlo en campana y digestor).

4. Terminada la digestión, enfriar los matraces y pasar su contenido cuantitativamente a un matraz aforado de 10 mL, haciendo lavados repetidos al matraz de digestión con alicuotas de 1 mL de agua destilada, pero sin llegar al volumen de aforo (aproximadamente 3 ml menos).

5. Adicionar a cada matraz, testigo y problema 0.4 mL de molibdato de amonio y 0.4 mL de solución reductora.

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6. Aforar los matraces con agua destilada y calentar a 37oC en baño María, durante 50 minutos

7. Leer en el fotocolorímetro con filtro rojo a 660 nm ajustando el aparato con el blanco de la curva patrón.

B).-CURVA TIPO Preparar en 7 tubos de ensayo debidamente etiquetados la siguiente tabla:

Tubo Solución tipo de fósforo mL

Acido sulfúrico 0.25 M, mL

Molibdato de amonio al 5 %, Ml

Solución reductora, mL

Blanco 0.0 9.2 0.4 0.41 0.1 9.1 0.4 0.42 0.2 9.0 0.4 0.43 0.4 8.8 0.4 0.44 0.8 8.4 0.4 0.45 1.2 8.0 0.4 0.46 1.5 7.7 0.4 0.4

Incubar la serie de 7 tubos a 370C en baño María durante 50 minutos enfriar y leer en el fotocolorímetro con filtro rojo (660 nm)

CUESTIONARIO

1. Calcular el porcentaje de fósforo en el problema. Restar al problema el dato del testigo.

2. Graficar la curva tipo de fósforo (lectura contra concentración de fósforo).3. Mencione algunas pruebas específicas para algunos de los compuestos que

contienen ácidos nucleicos.4. En caso del que el RNA estuviera contaminado con carbohidratos ¿cuál sería su

influencia en los resultados?

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BIOQUÍMICA METABÓLICAQFB

PRÁCTICA No 8EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE DNA DE ERITROCITOS DE POLLO

PROPÓSITO

Desarrollar las habilidades de la extracción y purificación de DNA en eritrocitos de pollo.

INTRODUCCIÓN

El DNA o ácido desoxirribonucleico es llamada también la molécula de la vida, esta formada por nucleótidos del tipo desoxirribonucleico, que contienen las bases nitrogenadas de adenina, guanina, citosina y timina. En el seno del DNA, la secuencia de nucleótidos conserva, en este alfabeto de 4 letras, la información para la síntesis de una proteína, constituye el gen de esta. De hecho, ningún gen es traducido directamente en

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proteína. Antes debe ser copiado (transcrito) en RNA mensajero, que es específico y complementario del gen.

Este RNA es traducido después en proteína gracias a un diccionario bilingüe, -el “código genético"- a un grupo de tres nucleótidos en el RNA y por consiguiente en el gen, correspondiendo a un aminoácido determinado.

El aislamiento del DNA original e intacto es un problema muy complejo y sólo puede resolverse en algunos casos excepcionales. Las principales etapas del aislamiento de los ácidos nucleicos son:

1. Destrucción de la membrana celular por choque osmótico.2. Precipitación de las proteínas.3. Extracción del DNA.

MATERIAL Y EQUIPO

1.- Centrífuga clínica.2.- Tubos para centrífuga.3.- Dos pipetas de 1 ml.4.- Baño de hielo5.- Sol. isotónica de NaCl al 0.85%.6.- Sol. de saponina (60 mg/ml de saponina en amortiguador de fosfato 0.11 M pH 7.2)7.- Solución de SDS 1.25% en EDTA 0.1M8.- Mezcla de Sevag (cloroformo-alcohol isoamilico 24:1)9.- Solución de NaCl 5 M.10.- Etanol absoluto.11.- Pipetas Pasteur y bulbos.

TÉCNICA

1. Extraer 15 mL de sangre de pollo adulto directamente de corazón con una jeringa previamente humedecida con heparina.

2. Diluir la sangre, dos veces su volumen con solución isotónica.3. Centrifugar 5 minutos a 2500 r.p.m. y decantar el sobrenadante.4. Lavar el paquete de eritrocitos con 3 mL solución isotónica.5. Agregar al paquete celular 5 veces su volumen de solución isotónica y añadir una

décima de la solución de saponina.6. Poner en hielo y agitar durante 30 minutos.7. Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 20 minutos y decantar el sobrenadante.8. Lavar el paquete de núcleos (sedimento) con 3 mL de la solución isotónica.9. Por cada 0.5 mL de núcleos agregar 5 mL de SDS. Agitar para romper los núcleos.10.Agregar NaCl 5 M hasta obtener una concentración final de NaCl 1M.11.Agregar 25 mL de Sevag y agitar vigorosamente durante 10 minutos.12.Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 30 minutos.

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13.Tomar la fase acuosa (sin tomar las proteínas) y repetir la adición de la solución de NaCl 5 M y la solución de Sevag. Centrifugar y tomar la fase acuosa. Repetir este paso si todavía quedan proteínas.

14.Colocar en un vaso 6 volúmenes de etanol enfriado previamente y resbalar por las paredes la fase acuosa. Se formara un precipitado que se saca con un agitador de vidrio con movimientos circulares.

15.Redisolver el DNA en 5 ml de agua y determinar la absorción a 260 y 280 nm.

CUESTIONARIO

1. Explique ¿qué sucede en cada uno de los pasos de esta técnica?2. De acuerdo a las lecturas a 260 y 280 nm diga usted si el DNA obtenido es puro.3. Explique ¿cómo se puede cuantificar el DNA?

BIBLIOGRAFíA

Básica

N° Nombre Clasificación

1

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