manual practicas microbiologia predictiva
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FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA: Aplicaciones teóricas y
prácticas.
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Editor Enrique Cabeza Herrera
UNIVERSIDAD DE PAMPLONA PAMPLONA – COLOMBIA
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Título original: Fundamentos de Microbiología Predictiva: aplicaciones teóricas y
prácticas, 1ª edición.
Autor: Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D.
Editorial: Universidad de Pamplona.
Copyright © 2011 by Enrique Cabeza Herrera
All Righs Reserved Enrique Alfonso Cabeza Herrera
Campus Universitario, Km 1 vía a Bucaramanga,
Complejo Científico y Tecnológico Simón Bolívar, 2do
piso. Pamplona - Colombia
I.S.B.N.:
http://sites.google.com/site/enalcahe
IMPRESO EN COLOMBIA PRINTED IN COLOMBIA
Reservados todos los derechos. Este libro no podrá ser reproducido en forma alguna,
total o parcialmente por cualquier medio, sin el permiso expreso del autor.
FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA: Aplicaciones teóricas y prácticas
Queda prohibida su reproducción total o parcial por
cualquier medio sin el consentimiento expreso del autor
ENRIQUE ALFONSO CABEZA HERRERA Ph.D., D.E.A. Ciencia y Tecnología de alimentos
Especialista en Protección de Alimentos Microbiólogo
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA PAMPLONA – NORTE DE SANTANDER
COLOMBIA 2013
©
CONTENIDO
Pág.
Unidad 1. Introducción a la Microbiología Predictiva
Unidad 2. Matemáticas del crecimiento bacteriano.
Unidad 3.
Unidad 4.
Unidad 5.
Unidad 6.
Unidad 7.
Unidad 8.
Unidad 9.
Unidad 10.
ACTIVIDADES PRACTICAS
Pág.
Actividad 1.
Actividad 2.
Actividad 3.
Actividad 4.
Actividad 5.
Actividad 6.
Actividad 7.
Actividad 8.
Actividad 9.
Actividad 10.
Fundamentos de Microbiología Predictiva: aplicaciones teóricas y prácticas
Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D.
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UNIDAD 1. INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA
1.1. INTRODUCCIÓN
El modelamiento Predictivo es un campo promisorio de la microbiología, se trata de un área
multidisciplinar emergente de la microbiología de alimentos, que combina disciplinas como las
matemáticas, microbiología, ingeniería y la química para desarrollar y aplicar modelos
matemáticos para predecir las respuestas de los microorganismos a variables ambientales
específicas (McDonald y Sun, 1999). La Microbiología Predictiva (MP) se basa en la premisa de
que las respuestas de las poblaciones microbianas a los factores ambientales son
reproducibles, y que al considerar los ambientes en términos de dominios identificables es
posible, a partir de las observaciones del pasado, predecir las respuestas de los
microorganismos. La microbiología predictiva surge como una metodología alternativa a los
métodos convencionales microbiológicos para asegurar la calidad y seguridad de los alimentos.
La microbiología de alimentos ha utilizado herramientas y métodos de diagnóstico tradicionales
que resultan ser muy engorrosos en cuanto a tiempo y gasto económico, ya que solo después
de un tiempo relativamente largo se logran obtener resultados que indiquen la presencia, el tipo
y cantidad de microorganismos patógenos y alterantes en los alimentos, haciendo que los
resultados de laboratorio sean demorados. Posteriormente se ha recurrido a métodos “rápidos”
que generan resultados cuantitativos en 15 horas aproximadamente, mediante el empleo de
reacciones específicas de enzima-sustrato en medios de cultivo que generan cambios de color
(medios cromógenos) o fluorescencia (medios fluorogénicos).
Finalmente se está recurriendo a análisis cualitativos de la calidad de alimentos mediante el
empleo de técnicas moleculares, que permiten detectar en tiempo menores a 1 hora la
presencia o ausencia de un microorganismo, especialmente los patógenos, como ejemplo de
estos métodos tenemos la Reacción en Cadena de la Polimerasa “PCR” que permite detectar la
presencia de estos microorganismos mediante la amplificación de un fragmento de su material
genético, por otro lado tenemos las pruebas de aglutinación en partículas de látex, alginato u
otra forma de encapsular bien sea un anticuerpo o un antígeno que reacciona con una fracción
específica del microorganismo blanco, pudiendo detectarse la presencia o ausencia del mismo.
Los anteriores métodos han permitido obtener resultados relativamente cortos en el tiempo pero
un tanto costosos y con el inconveniente de que no se conoce el número exacto de
microorganismos presentes.
La necesidad de tomar decisiones oportunas con respecto a la calidad microbiológica de los
alimentos, ha hecho que se esté dando un impulso al desarrollo de herramientas bioinformáticas
que resultan ser mucho más ágiles y económicas. En este sentido, ha tomado una importancia
cada vez mayor la denominada “Microbiología Predictiva o Ecología Microbiana Cuantitativa.
Con el desarrollo de la microbiología predictiva se puede predecir cuál será el comportamiento
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microbiano partiendo como base de que: “las respuestas de los microorganismos a los factores
medioambientales son reproducibles”, por otra parte, el papel que juegan los microorganismos
en los alimentos es cada día más relevante, no solo desde el punto de vista sanitario, por su
impacto en la salud pública, sino también en el deterioro de los productos alimenticios que
generan pérdidas económicas. Así mismo, la Microbiología Predictiva a través de interfaces con
muchas otras disciplinas se ha convertido en un paradigma de la microbiología moderna de
alimentos. Proporciona una base científica para sustentar el concepto de HACCP y la
Evaluación Cuantitativa de Riesgos Microbiológicos.
Así mismo, el uso de modelos predictivos pueden permitir estimar de la vida útil de
alimentos, la seguridad microbiológica de los mismos, el aislamiento de puntos críticos y
optimización de las cadenas de producción y distribución, también pueden dar una idea de
cómo las variables medioambientales o condiciones químicas o físicas tales como la
temperatura, pH y actividad de agua afectan la supervivencia de bacterias patógenas y
alterantes.
1.2. HISTORIA DE LA MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA
El uso de los modelos matemáticos en microbiología de alimentos no es nuevo, ya que
Baird-Parker y Kilsby en 1987 informaron que los modelos de destrucción térmica de
microorganismos por calor fueron establecidos en la literatura y la industria (Ross y McMeekin,
1994). De hecho, el origen de la microbiología predictiva puede remontarse hacia los años 20’s,
cuando Esty y Meyer planearon en 1922 el modelo de la “Cocción botulínica”. Este modelo
define el proceso térmico suficiente para destruir 1012 esporas de C. botulinum tipo A. Quizá
debido al hecho de que el modelo tuvo aceptación entre los industriales y se convirtió en amplio
uso en la industria alimentaria, no se vio la verdadera potencialidad predictiva de este tipo de
modelos.
El desarrollo histórico de la microbiología predictiva puede dividirse en tres etapas definidas:
(1) orígenes, (2) estancamiento, y (3) evolución.
Figura 1.1. Etapas del desarrollo de la Microbiología Predictiva
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Fuente: Autor
1.2.1. Orígenes de la Microbiología Predictiva
Como habíamos comentado, los orígenes de la microbiología predictiva de alimentos
pueden remontarse hacia los años 20. Esty y Meyer plantearon en 1922 un modelo que
describe el tiempo mínimo de tratamiento térmico a 121°C que debe recibir todo alimento
enlatado y con pH igual o mayor a 4.5, para reducir 12 veces la presencia de esporas de
Clostridium botulinum tipo A, es decir, desde 1012 hasta 100. Este modelo fue denominado
“Cocción botulínica”, y debido a su amplio uso en la industria de alimentos pudo perderse su
carácter predictivo (XXXX, 19XX).
Scott en 1937 sentó las bases de los modelos cinéticos al afirmar que “el conocimiento de
las velocidades de crecimiento de ciertos microorganismos a diferentes temperaturas es
esencial para los estudios sobre el deterioro de la carne refrigerada. Con estos datos, debería
ser posible predecir la influencia relativa de la alteración sobre el deterioro ejercida por los
diferentes organismos en cada temperatura de almacenamiento”, además, “debería ser posible
predecir el potencial alcance de los cambios en las poblaciones que diversos organismos
pueden sufrir durante el período inicial de enfriamiento de las superficies de la carne en los
mataderos cuando la superficie es con frecuencia mantenida a temperaturas muy favorables
para la proliferación microbiana” (Ross y McMeekin, 1994).
Por otra parte, J. Monod (1949) sentó las bases del crecimiento bacteriano aplicado a la
industria de la fermentación (McMeekin y Ross, 2002). Monod planteó que “El crecimiento
bacteriano, a pesar de la inmensa complejidad de los fenómenos a los que se someten, en
general, obedece a unas leyes relativamente sencillas que permiten definir ciertas
características cuantitativas del ciclo de crecimiento, fundamentalmente las tres constantes de
crecimiento: el crecimiento total (G), la tasa de crecimiento exponencial (R) y la fase de latencia
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(L)”.
1.2.2. Estancamiento
Durante los años 60’s y 70’s la literatura sobre el tema permaneció silenciosa y el uso de
modelos cinéticos se aplicaron para resolver problemas de alteración de alimentos, mientras
que los modelos probabilísticos fueron empleados en los problemas de contaminación de
alimentos y ETAS: botulismo. En 1973, Olley y Ratkowsky proponen el modelo de “Curva de
Alteración Universal” dependiente de la temperatura en la alteración del pollo.
1.2.3. Evolución
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1.3. MODELAMIENTO MATEMÁTICO
Un modelo es un análogo de la realidad física, típicamente simple e idealizada. Los
modelos pueden ser físicos o matemáticos y son creados con el objetivo de obtener una idea de
la realidad de la forma más conveniente. Un modelo físico puede ser una miniatura, tal como
una versión preliminar de una pieza a escala de un equipo. Un modelo matemático es un
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análogo matemático de la realidad física, que describe las propiedades y características de un
sistema real en términos de variables y operaciones matemáticas.
El fenomenal crecimiento en el poder de la computación y la facilidad de uso de estas
herramientas han permitido que los modelos puedan ser más realistas y han experimentado un
rápido crecimiento en el uso de modelos en diseños y experimentación de productos, procesos
y equipos. Entre las muchas ventajas de los modelos tenemos (1) reducción en el número de
experimentos, así como del tiempo y gastos económicos; (2) proveen grandes ideas de los
procesos (en caso de un modelo basado en la física) que regularmente no pueden ser posibles
con la experimentación; (3) optimización de procesos; (4) capacidad predictiva, por ejemplo,
formas de interpretar escenarios “qué si”; y (5) proveen mejoramiento en la automatización de
procesos y capacidades de control (Datta y Sablani, 2006).
1.4. CLASIFICACIÓN DE LOS MODELOS PREDICTIVOS
Los modelos predictivos microbiológicos pueden ser clasificados desde diversas
dimensiones (Gershenfeld, 1999), sin embargo, un esquema de clasificación absoluta aún no ha
sido decidido (McDonald y Sun, 1999). El uso uniforme de terminología y clasificación de los
modelos en grupos que tienen funciones específicas pueden hacer de la microbiología
predictiva una disciplina más exacta y de más fácil uso (Baranyi y Roberts, 1992). Sin embargo,
solo el sistema de clasificación propuesto por Whiting y Buchanan (1993) puede agrupar la
mayoría de modelos en primarios, secundarios y terciarios (McDonald y Sun, 1999).
Bibliografía
Datta, A.K., Sablani, S.S. (2006). Chapter 1: Mathematical Modeling Techniques in Food and
Bioprocesses: An Overview. In: Handbook of Food and Bioprocess Modeling Techniques /
Editors, Shyam S. Sablani, Mohammad S. Rahman, Ashim K. Datta and Arun S. Mujumdar.
Taylor and Francis Group, LLC. CRC Press. Boca Raton, FL, USA. Pages 1 – 11.
Gershenfeld, N. (1999). The Nature of Mathematical Modeling. Cambridge: Cambridge
University Press.
Van Boekel, M.A.J.S., Tijskens, L.M.M. (2001). Kinetic Modelling. In: Food Process Modelling /
Editors L.M.M. Tijskens, M.L.A.T.M. Hertog and B.M. Nicolaϊ. Woodhead Publishing
Limited. CRC Press. Boca Raton, FL, USA. Pages 35 – 59.
Baranyi, J., Pin, C. (2001). Modelling Microbial Safety. In: Food Process Modelling / Editors
L.M.M. Tijskens, M.L.A.T.M. Hertog and B.M. Nicolaϊ. Woodhead Publishing Limited. CRC
Press. Boca Raton, FL, USA. Pages 383 – 401.
Baranyi, J., Roberts, T.A. (1992). A terminology for models in predictive microbiology – A reply to
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K.R. Davey. Food Microbiology, 9: 355.
Ross, T., McMeekin, T.A. (1994). Review Paper: Predictive Microbiology. International Journal of
Food Microbiology, 23: 241 – 264.
McDonald, K., Sun, D-W. (1999). Predictive food microbiology for the meat industry: a review.
International Journal of Food Microbiology, 52: 1 – 27.
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UNIDAD 2. MATEMÁTICAS DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
2.1. OBJETIVOS DE LA UNIDAD
Al finalizar la unidad el lector estará en capacidad de:
Comprender los fundamentos matemáticos del crecimiento y muerte bacteriana.
Construir gráficos tanto de crecimiento como muerte empleando hojas de cálculo de
cualquier programa ofimático (p.ej. Microsoft Office Excel, OpenOffice Cal, Star Office
Cal, IBM Cal, etc.).
Manejar las hojas de cálculo como herramienta para estimar el comportamiento de una
población bacteriana.
Estimar los diferentes parámetros cinéticos tanto de crecimiento como muerte
bacteriana.
2.2. CRECIMIENTO BACTERIANO
En este capítulo abordaremos el estudio matemático del crecimiento bacteriano desde una
perspectiva clásica, es decir, partiendo del principio que el crecimiento bacteriano obedece a un
crecimiento constante (crecimiento equilibrado). Los aspectos de fisiología del crecimiento serán
vistos en forma general y se profundizará en algunos de ellos en capítulos posteriores. Sin
embargo, si el lector desea estudiar a profundidad los aspectos fisiológicos, podemos sugerirle
revisar tratados o libros de microbiología como Brock Biology of Microorganisms de Madigan et
al. (2008) o Zinsser Microbiology de Joklik et al. (1997).
El crecimiento o desarrollo bacteriano puede definirse como el aumento ordenado de todos
los constituyentes químicos de la célula, tratándose de un proceso que implica la replicación de
todas las estructuras celulares, organoides y componentes protoplasmáticos a partir de los
nutrientes presentes en el medio circundante. Por otra parte, podemos definir el crecimiento
bacteriano como el aumento del número de células en el tiempo. Cuando una célula bacteriana
se coloca en un medio nutricionalmente completo, aumenta de tamaño y con el tiempo se divide
para formar dos células. A este proceso se le denomina fisión binaria (binario para expresar el
hecho de que de una célula surgen dos) adoptando una progresión geométrica de 2n, donde n
representa el número de generaciones o divisiones que han tenido lugar en el tiempo. De tal
forma, que si partimos de una célula, al cabo de la primera generación se formarán 2 células,
después de la segunda generación se formaran cuatro, posteriormente ocho y así
sucesivamente. El proceso anterior se muestra en la figura 2.1.
En el desarrollo de un cultivo bacteriano se produce un aumento tanto de la masa celular
como del número de microorganismos, pero no existe una relación constante entre los dos
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parámetros (Willet, 1997; Madigan et al., 2008), ya que cada especie puede variar su tamaño,
velocidad de crecimiento y densidad celular en función de las condiciones intrínsecas,
extrínsecas e implícitas del cultivo donde se encuentren. Por tanto, en estudios cuantitativos que
se ocupan del desarrollo celular es necesario diferenciar entre la concentración celular, es decir,
el número de células por unidad de volumen de cultivo, y la densidad bacteriana, que se define
como el protoplasma total por unidad de volumen (Willet, 1997). En apartados posteriores
realizaremos una mayor distinción entre estos dos aspectos, la forma de determinarlos y la
relación entre ellos.
Figura 2.1. Representación del crecimiento bacteriano por fisión binaria.
Fuente: Adaptado de Madigan et al., 2008.
Como ya se ha mencionado, el crecimiento se define como un aumento en el número de
células microbianas en una población, que también se puede medir como un aumento en la
masa microbiana. La tasa o velocidad de crecimiento es el cambio en la cantidad de células o
de masa por unidad de tiempo. Durante el ciclo de división celular, todos los componentes
estructurales de la célula se duplican. El intervalo para la formación de dos células a partir de
una se llama generación y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de
generación. El tiempo de generación es, así, el tiempo requerido para que se duplique el
número de células. Debido a esto, también al tiempo de generación se le llama tiempo de
duplicación.
2.3. CRECIMIENTO ASINCRÓNICO
El estudio del crecimiento bacteriano suele hacerse a nivel de laboratorio en cultivos
continuos (sistema abierto) o discontinuos (sistema cerrado). Según señala Willet (1997), por lo
general las bacterias se desarrollan en laboratorio en cultivos discontinuos, y por tanto las
condiciones se aproximan a las de un sistema cerrado. Cuando un medio adecuado se inocula
con bacterias y se toman nuestras pequeñas a intervalos regulares de tiempo, la representación
gráfica de los datos dará una curva de crecimiento característica (Figura 2.2).
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Figura 2.2. Representación gráfica de la curva de crecimiento bacteriano.
Fuente: Autor.
En la curva anterior se muestra las cuatro fases del desarrollo bacteriano que se producen
cuando se representa el número de células viables en función del tiempo en un cultivo
discontinuo y asincrónico. Nótese la presencia de tres interfases con variaciones de pendiente
que indican la transición de una a otra fase del desarrollo: transición 1 entre las fases de latencia
– exponencial, transición 2 entre las fases exponencial – estacionaria y la transición 3 entre las
fases estacionaria – declive. En cultivos sincrónicos las interfases tienden a desaparecer ya que
las células crecen de forma simétrica y por tanto la curva de crecimiento adopta una forma lineal
entre cada una de las cuatro fases de crecimiento.
2.4. CRECIMIENTO EQUILIBRADO
En muchos tipos de trabajos de investigación es conveniente emplear microorganismos que
estén creciendo en forma equilibrada o sincrónica. En la forma habitual de cultivo de bacterias la
división celular ocurre de manera aleatoria, y produce una mezcla de células que representan
todas las fases del ciclo de división. Los estudios con estos cultivos sólo dan valores promedio.
Sin embargo, se dispone de técnicas para sincronizar la división y para introducir a todas las
células en el cultivo para que se dividan de forma simultánea. El estudio de las matemáticas del
crecimiento bacteriano se abordará desde este enfoque y las ecuaciones así obtenidas podrán
emplearse para el estudio del crecimiento bacteriano en condiciones sincrónicas y asincrónicas.
De igual forma, el estudio matemático del crecimiento bacteriano puede abordarse de forma
individualizada en cada una de las fases del crecimiento (Curvas Lineales) o desde un enfoque
Transición 3
Transición 2
Transición 1
Fase de declive
Fase estacionaria
Fase de
latencia
Fase exponencial
Tiempo
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continuo donde el crecimiento ocurre como una serie de fases sucesivas (Curva Sigmoidal).
Ecuaciones de crecimiento equilibrado: Como es sabido el crecimiento bacteriano sigue
una relación exponencial de primer orden, esto es, que por cada célula que se divida se
originan dos nuevas (Figura 1). De esta forma se puede afirmar que el crecimiento
bacteriano se comporta de acuerdo a la siguiente relación:
𝑁 = 2𝑛 (Ecuación 1)
donde N es el número de células y n el número de duplicaciones que han tenido lugar.
Si asumimos que N = Nf en determinado tiempo Nf(t), entonces Nf(t) es dependiente del
número inicial de células (N0) y del número de divisiones que haya tenido lugar en ese
intervalo de tiempo n(t), de esta forma si reordenamos la ecuación 1, obtenemos la siguiente
expresión matemática que rige el crecimiento bacteriano en función del tiempo:
𝑁𝑓 = 𝑁0 × 2𝑛 (Ecuación 2)
Velocidad relativa de crecimiento y velocidad específica de crecimiento: Si x(t) es una
variable tiempo-dependiente que describe la variación de cierta sustancia, como biomasa o
concentración de la célula. La velocidad instantánea del proceso es la derivada de
x(t):dx(t)/dt. La velocidad específica, μ(t), se define como:
𝜇(𝑡) =𝑑𝑥
𝑑𝑡 Ecc. 3
Si x(t) denota la concentración celular entonces en un cultivo bacteriano la velocidad de
crecimiento es medida como el aumento absoluto en la concentración celular por unidad de
tiempo de la unidad, mientras que la velocidad de crecimiento específica es el incremento
en la concentración celular por unidad de tiempo por célula. Una simple ecuación muestra
que si x(t) es positivo entonces:
𝜇(𝑡) =𝑑(𝑙𝑛𝑥 𝑡 )
𝑑𝑡 Ecc. 4
Por consiguiente, la velocidad de crecimiento específica puede medirse como la inclinación
de la curva de crecimiento cuando el logaritmo natural (ln) de x(t) se traza contra el tiempo.
Si el log10 es usado en lugar de ln, entonces la pendiente de log10 será moderada = 2,3
veces menor que la velocidad de crecimiento específico cuando empleamos el ln.
La velocidad de crecimiento específica (μ) puede calcularse a través de la ecuación 4.1.
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𝜇 = (𝑙𝑛𝑁𝑓− 𝑙𝑛𝑁0)
(𝑡𝑓− 𝑡0) Ecc. 4.1
La velocidad de crecimiento relativo (k) puede calcularse a través de la ecuación 4.2.
𝑘 = 2,303 (𝐿𝑜𝑔𝑁𝑓− 𝐿𝑜𝑔𝑁0)
(𝑡𝑓− 𝑡0) Ecc. 4.2
Tiempo de duplicación (Td) y tiempo de generación (Tg): En un momento fijo (tfix), el
valor de μ(t) será μ(tfix) = μfix. La relación para el tiempo de duplicación, Td = ln2/ μfix =
0.69/μfix, de tal forma que si μ(t) permaneciera constante, al tiempo tfix + Td, la concentración
celular sería el doble que cuando estaba a tfix. Es importante anotar que, en cultivos
asincrónicos, Td no es equivalente al tiempo medio de generación. De hecho, el tiempo
medio de generación puede estimarse por 1/ μfix en lugar de la relación 0.69/ μfix, si la
división celular puede aproximarse por un proceso aleatorio, como el proceso de Poisson.
El tiempo de generación puede calcularse a través de la siguiente ecuación:
𝑇𝑔 = 𝑡
𝑛 Ecc. 5
donde t es el diferencial de tiempo y n el número de generaciones.
El número de generaciones puede estimarse a través de la ecuación 6:
𝑛 = 3,3 (𝐿𝑜𝑔𝑁𝑓 − 𝐿𝑜𝑔𝑁0) Ecc.6
Si reemplazamos la Ecc. 6 en Ecc. 5, el tiempo de generación se puede calcular mediante
la ecuación 7:
𝑇𝑔 = 𝑡
3,3 𝐿𝑜𝑔𝑁𝑓−𝐿𝑜𝑔𝑁0 Ecc. 7
Curvas de crecimiento y muerte bacteriana: Como hemos comentado anteriormente, la
cinética de crecimiento bacteriana sigue una tendencia de primer orden, lo mismo puede
asumirse para la muerte bacteriana, esto es que al graficar el Log de la población en función
del tiempo se obtiene una línea que representa cómo evoluciona esta población. Esta línea
de crecimiento o muerte puede entonces ajustarse a nuevas líneas de tendencia que
comparan el crecimiento real frente a una función matemática definida: función lineal o
función exponencial por método gráfico o estimación lineal o estimación logarítmica por
medio de fórmulas Excel, de las cuales pueden obtenerse la ecuación que representa cada
una de estas funciones, su coeficiente de correlación R2 o los valores de las diferentes
constantes. En este caso puede asumirse que el crecimiento o muerte bacteriana sigue una
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tendencia lineal o exponencial dependiendo del valor de R2, cuando R2 se aproxima a 1 el
comportamiento bacteriano sigue esa tendencia. A manera de ejemplo, si en un estudio de
crecimiento se ajusta la gráfica de los datos a una función lineal con un R2 = 0,955 y a una
función exponencial con un R2 = 0,985, la tendencia de crecimiento de esa población se
comporta más como una función exponencial que una lineal.
En el caso de un comportamiento se dice que es lineal cuando la gráfica de la población final
a un tfix es una línea recta; y por consecuencia tiene la forma:
y = f(x)= mx + b
Donde m representa la pendiente de la recta y b la ordenada al origen (es el punto de
intersección de la recta al eje de las “y”. También es importante mencionar que este tipo de
funciones crecen a tasas constantes; y en ellas puede calcularse tanto el tiempo (t) como
una densidad de población (y) específica.
Si el crecimiento se ajusta a un comportamiento exponencial, puede obtenerse la población
final a un tfix o calcularse el tiempo a una densidad de población y a través de una ecuación
exponencial que adopta la forma:
y = f(x) = ax
y = f(x) = cebx
Donde la base a es una constante positiva, c y b son constantes y e es la base del logaritmo
neperiano.
Por otro lado, si los datos de crecimiento se asemejan a una función logarítmica, la
población final a un tfix o el tiempo a una densidad de población y puede calcularse por
medio de una ecuación que adopta la forma:
y = f(x) = logax
y = f(x) = blnmx
Donde la base a es una constante positiva, b es una constante equivalente a c y lnm es la
constante equivalente a eb. Es importante aclarar que las funciones logarítmicas son las
inversas a las exponenciales.
2.5. MODELAMIENTO DEL CRECIMIENTO
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El desarrollo de los diversos modelos de predicción empleados en microbiología descansa
sobre bases matemáticas preestablecidas con anterioridad, sin importar tanto si se trata de
modelos probabilísticos, cinéticos, mecanísticos, etc,. Como comentaba en la introducción de
este manual, los orígenes del modelamiento microbiano se sitúa sobre los años de 1922 cuando
Esty y Meyer desarrollan un modelo para estimar el tiempo necesario para reducir las esporas de
Clostridium botulinum tipo A de 1012 a 100 (Conocido como cocción botulínica). En 1949, J.L.
Monod desarrolló un modelo matemático para representar el crecimiento equilibrado de una
población bacteriana, posteriormente este modelo fue aplicado a la industria de la fermentación.
En años posteriores diversos investigadores empezaron a explicar en forma de expresiones
matemáticas la relación existente entre el número de bacterias finales en función del tiempo y
como varían estas con respecto a la aplicación de algún factor externo que influye sobre su
crecimiento/supervivencia.
Uno de los factores que más ha influido en el desarrollo de la microbiología predictiva ha
sido el empleo de las nuevas tecnologías informáticas, y en especial la aparición y desarrollo de
herramientas de cálculo como Excel de Microsoft Office®, Calc de OpenOffice.org (Software
Gratuito), Calc de StarOffice, etc. Estas nuevas opciones han facilitado por un lado comprometer
conceptualmente a todas aquellas personas poco familiarizadas con el Álgebra en la ayuda de
visualización de las ecuaciones y sus soluciones de nuevas maneras y no de la forma tradicional,
es decir haciendo énfasis en la repetición y las reglas del algoritmo. Con el empleo de estas
herramientas en concepto de Margaret Niess se logra que el foco del pensamiento del estudiante
se traslade del campo algorítmico al de la verdadera comprensión del concepto.
El modelamiento microbiano tampoco ha escapado a esta nuevas herramientas, antaño el
desarrollo de ecuaciones simples de predicción (modelos primarios) requería del conocimiento
profundo de las matemáticas y en especial del álgebra para poder llegar al fin absoluto del
trabajo: la obtención de un modelo matemático expresado como una ecuación que permita
predecir en futuras ocasiones el comportamiento de los microorganismos, sin embargo, con el
desarrollo de estas herramientas tecnológicas, esta labor se ha vuelto un tanto más simple. Esto
no quiere decir que se abandone del todo el método más clásico, ya que todos los modelos no
son iguales ni funcionan de la misma forma, esto depende del fin con el cual fue hecho, por
ejemplo: si es aplicable para todos o solo algún grupo microbiano de interés, las condiciones
particulares de prueba y validación con que fue hecho entre otros.
Los datos obteniendo gráficos, ecuaciones y tendencias del comportamiento microbiano. Así
mismo, se han desarrollado bases de datos y programas estadísticos gráficos y software
específicos de modelamiento, que con solo digitar algunos datos permiten observar y predecir el
comportamiento microbiano. Dentro de las bases de datos más conocidas está el ComBase
Predictor, y ejemplos de programas estadísticos gráficos son el Prisma, Staph Graphic Plus,
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Statistica, SPSS, Microfit, DMFit, mientras ejemplos de software específicos son: Pathogen
Modeling Program (PMP), Seafood Spoilage and Safety Predictor (SSSP).
ACTIVIDAD PRÁCTICA 1: CONSTRUCCIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO-MUERTE
BACTERIANA Y ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS EMPLEANDO LA HOJA DE
CÁLCULO MICROSOFT OFFICE Y OPEN OFFICE.
En la presente actividad se explica cómo desarrollar las gráficas de crecimiento bacteriano,
así como la estimación de diversos parámetros cinéticos por los métodos gráficos y
matemáticos, empleando como herramienta las hojas de cálculo de los programas Office 2007 ©
y Open Office 3.1 ©. Las gráficas de muerte serán vistas en una unidad posterior.
2.6. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS
Computador con paquete Microsoft Office 2003 o posterior o OpenOffice 3.1. Para esta
práctica emplearemos el software Office 2007 de Microsoft.
2.7. REACTIVOS
No se requieren.
2.8. PROCEDIMIENTO
Antes de abordar el procedimiento, debemos aclarar que en esta práctica se empleará un
ejemplo sencillo de crecimiento equilibrado con independencia de fases de la curva de
crecimiento, es decir, que los datos se manejaran teniendo en cuenta solo la fase de
crecimiento exponencial y no los datos de crecimiento de una curva completa, la cual se
abordará en una práctica posterior. También se presentarán dos procedimientos (método
gráfico y método de las funciones) en forma de ventanas.
Método gráfico
A través de ventanas que representa la hoja de cálculo Excel desarrollaremos un ejercicio
de construcción de curvas de crecimiento y estimación del mismo, con los supuestos datos
de crecimiento de S. aureus (100 UFC/g) mostrados en la Tabla 1, donde el
microorganismos mantenido durante 25 horas a 37ºC.
Tabla 1: Resultados supuestos del crecimiento de S. aureus en caldo BHI incubado a 37ºC
durante 25 horas.
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Tiempo (horas) Población (UFC/g) Tiempo (horas) Población (UFC/g)
0,0 100 13,0 61659500
1,1 105 14,1 141253754
2,2 230 15,1 251188643
3,3 1230 16,2 354813389
4,3 4266 17,3 426579519
5,4 15136 18,4 457088190
6,5 52481 19,5 478630092
7,6 186209 20,5 489778819
8,7 645654 21,6 489778819
9,7 2187762 23,4 489778819
10,8 7244360 25,2 489778819
11,9 22387211 ----- ---------
PASO 1: Los datos de crecimiento se representan en una hoja de Excel, a la densidad de
población (UFC/g) le calcularemos el log10 y Ln insertando en la casilla C2 la siguiente orden
=LOG10(B2) y en la casilla D2 =LN(B2), de esta forma calculamos los logaritmos para la
población al tiempo 0, continuamos con el mismo procedimiento para las demás casillas o
simplemente arrastraremos la fórmula. De igual forma procedemos a calcular la tasa de
crecimiento específica (µ) para el primer intervalo de tiempo en E2 =(D3-D2)/(A3-A2)
empleando la ecuación 3 y velocidad de crecimiento relativo k =(C3-C2)/(0,301*(A3-A2)) en
F2 o =(D3-D2)/(0,693*(A3-A2)) en G2 (Fig 2).
Figura 2. Cuadro de datos de crecimiento de S. aureus.
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PASO 2: Para proceder a graficar los datos de crecimiento, seleccionamos en la columna B
las filas correspondientes desde B2 hasta B24 (B2:B24) que corresponde a los datos de
crecimiento de S. aureus expresado en UFC/g (Fig. 3). Si seleccionamos (C2:C24)
obtendremos la gráfica del crecimiento de S. aureus expresado como log10UFC/g o
(D2:C24) para representar el crecimiento en lnUFC/g (Fig 4).
Figura 3. Representación del crecimiento de S. aureus en notación científica.
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Figura 4. Representación del crecimiento de S. aureus en notación logarítmica.
En los siguientes pasos calcularemos los diversos parámetros del crecimiento tales como:
velocidad media específica de crecimiento, duración de la fase de latencia y duración de la
fase exponencial. Así mismo, con los datos anteriores, calcularemos el tiempo medio de
generación.
PASO 3: De acuerdo con la figura anterior procedemos a graficar nuevamente los datos de
crecimiento exponencial, para tal fin seleccionaremos aquella porción del crecimiento en el
cual la población aumenta de forma lineal. Seleccionamos la pestaña “Insertar” y allí
escogemos la opción “Dispersión” y elegimos el gráfico con “líneas suavizadas y
marcadores”.
0
100000000
200000000
300000000
400000000
500000000
600000000
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0
Crecimiento de S. aureus (UFC/g)
0,000
5,000
10,000
15,000
20,000
25,000
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0
Crecimiento de S. aureus (Ln o Log10) UFC/g
Ln UFC/g
Log10 UFC/g
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Figura 5. Selección del tipo de gráfico de crecimiento de S. aureus.
Posteriormente, en la pestaña de Diseño escogemos la opción “Seleccionar datos”, según
muestra la Figura 6.
Figura 6. Selección del tipo de gráfico de crecimiento de S. aureus.
PASO 4: Inmediatamente hemos escogido la opción Seleccionar datos se despliega una
ventana como el que se muestra en la Figura 7a. En esta ventana deberemos seleccionar
“Agregar” y se despliega una nueva ventana donde escogeremos los valores tanto del eje X
(2) como del eje Y (3) a graficar, así como el nombre de la serie (1) (Figura 7b). Para tal fin
damos un click sobre las tablas que aparecen seleccionadas en la figura 7b.
Figura 7. a) Ventana principal Seleccionar origen de datos; b) Ventana secundaria
seleccionar datos.
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1) Nombre de la serie: escogemos el nombre que queremos para la curva, por ejemplo si
graficamos el logaritmo 10 de los datos de crecimiento, seleccionamos la casilla C1.
2) Valores de X: Para nuestro caso seleccionaremos los correspondientes al tiempo desde
A5 hasta A13.
3) Valores de Y: En nuestro ejemplo escogemos los correspondientes al crecimiento en
logaritmo 10, desde C5 hasta C13.
Una vez finalizada la opción de cargar datos para la curva damos click en “Aceptar” según
se muestra en la figura 8; posteriormente repetimos el procedimiento del PASO 4 para
cargar los datos de crecimiento en logaritmo natural (ln UFC/g).
Figura 8. Ventana Secundaria de datos diligenciada.
PASO 5: Al finalizar de cargar los datos de logaritmo natural obtendremos la gráfica con los
crecimientos lineales de la fase exponencial. Posteriormente nos ubicamos con el cursor
sobre la línea que representa el crecimiento y damos clic con el botón derecho del ratón, y
seleccionamos la opción “Agregar línea de tendencia…” según se muestra en la figura 9.
Figura 9. Ventana principal de “Agregar línea de tendencia….”.
1
2
3
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PASO 6: En la siguiente ventana (figura 10) escogemos la opción de “tendencia lineal” en la
ventana “tipo” y en la ventana “opciones” marcamos presentar ecuación en el gráfico y
presentar R cuadrado; posteriormente damos click en aceptar. Repetimos esta operación
para la otra línea de crecimiento, y así obtendremos la gráfica de la figura 11.
Figura 10. Ventana principal de “Formato de línea de tendencia”.
Figura 11. Curva de crecimiento exponencial de S. aureus con sus respectivas ecuaciones
y coeficientes de determinación.
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Al analizar la figura 11 podemos observar que los coeficientes de determinación o regresión
(R2) son próximos a 1 (0,999). Por lo tanto, las ecuaciones obtenidas serán las que
emplearemos para el cálculo de los parámetros cinéticos.
Método de las fórmulas en Excel
En algunos casos puede ser que no contemos con una hoja de cálculo Excel que permita
construir las gráficas y agregar las líneas de tendencia, tal como ocurre con algunos
paquetes ofimáticos como el IBM Lotus Symphony (el cual está basado en la tecnología de
OpenOffice.org), o el mismo Open Office en versiones inferiores a la 3.0. En estos softwares
se pueden agregar gráficos pero las ecuaciones de regresión no se pueden obtener tan
fáciles como en Excel o en OpenOffice Cal V 3.0 o mayor. En estos casos podemos usar
una función que traen las hojas de cálculo denominada Estimación Lineal.
Esta función calcula las estadísticas de una línea utilizando el método de "mínimos
cuadrados" para calcular la línea recta que mejor se ajuste a los datos y, a continuación,
devuelve una matriz que describe la línea. Debido a que esta función devuelve una matriz
de valores, debe ser especificada como una fórmula de matrices. La ecuación de la curva
es la ecuación de la recta: 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏 𝑜 𝑦 = 𝑚1𝑥1 + 𝑚2𝑥2 + ⋯ + 𝑏
(si hay varios rangos de valores X), donde el valor Y dependiente es función de los valores
X independientes. Los valores m son coeficientes que corresponden a cada valor X, y b es
un valor constante. Observe que Y, X y m pueden ser vectores. La matriz que devuelve
ESTIMACION.LINEAL es {mn,mn-1,...,m1,b}. ESTIMACION.LINEAL también puede
devolver estadísticas de regresión adicionales. Para mayor conocimiento de esta función
puede consultar la ayuda de Excel.
y = 1,1437x + 3,4217R² = 0,9997
y = 0,4967x + 1,486R² = 0,9997
0,000
2,000
4,000
6,000
8,000
10,000
12,000
14,000
16,000
18,000
0,0 5,0 10,0 15,0
Log x
UFC
/g
Tiempo (horas)
Crecimiento exponencial de S. aureus
Ln UFC/g
Log10 UFC/g
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Conocido y: es el conjunto de valores de y que se conocen en la relación y = mx+b.
Conocido x: es un conjunto opcional de valores x que se conocen en la relación y =
mx+b.
Constante: es un valor lógico que especifica si se ha de hacer que la constante b sea
igual a 0, si el argumento constante es VERDADERO o se omite, b se calcula
normalmente; pero si constante es FALSO, b se establece como igual a 0 y los valores
m se ajustan para encajar en y = mx.
Estadística: es un valor lógico que especifica si se deben devolver estadísticas de
regresión adicionales. Si estadística es VERDADERO, ESTIMACION.LINEAL devuelve
las estadísticas de regresión adicionales (Tabla 2), si estadística es FALSO o se omite,
ESTIMACION.LINEAL sólo devuelve los coeficientes m y la constante b.
Tabla 2. Estadísticas de regresión adicionales si estadística es VERDADERO.
Estadística Descripción
se1,se2,...,sen Los valores de error estándar para los coeficientes m1,m2,...,mn.
seb El valor de error estándar para la constante b (seb = #N/A cuando constante es
FALSO).
r2 El coeficiente de determinación. Compara los valores y calculados y reales, y los
rangos con valor de 0 a 1. Si es 1, hay una correlación perfecta en la muestra, es
decir, no hay diferencia entre el valor y calculado y el valor y real. En el otro extremo,
si el coeficiente de determinación es 0, la ecuación de regresión no es útil para
predecir un valor y.
sey El error estándar para el cálculo y.
F La estadística F o valor F observado. Utilice la estadística F para determinar si la
relación observada entre las variables dependientes e independientes se produce por
azar.
df Grados de libertad. Utilice los grados de libertad para encontrar valores F críticos en
una tabla estadística. Compare los valores que encuentre en la tabla con la
estadística F devuelta por ESTIMACION.LINEAL para determinar un nivel de
confianza para el modelo.
ssreg La suma de regresión de los cuadrados.
ssresid La suma residual de los cuadrados.
Para el método de las fórmulas emplearemos el mismo ejemplo del caso anterior.
PASO 1: En la ventana principal de la hoja de cálculo seleccionamos 5 casillas en blanco en
dos columnas seguidas, posteriormente en la pestaña “Fórmulas” seleccionaremos “Insertar
Función” como se muestra en la figura 12.
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Figura 12. Ventana principal de la hoja de cálculo Excel
PASO 2: En la ventana “Insertar Función” (Figura 13) seleccionamos en categoría “todas” y
buscamos la opción ESTIMACION.LINEAL, damos clic en aceptar. También podemos
seleccionar la función “ESTIMACIÓN.LOGARÍTMICA”, para aquellos casos donde el
crecimiento se ajusta a una función exponencial.
Figura 13. Ventana de selección de funciones.
PASO 3: Posteriormente complementamos la información que se despliega en la ventana de
Argumentos de función mostrada en la figura 14.
Figura 14. Ventana de argumentos de la función Estimación.Lineal.
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Los argumentos a escribir en esta ventana para completar la información son los siguientes
(figura 15).
En el cuadro Conocido_y escribimos D5:D13 que representa el logaritmo natural del
crecimiento de la población (mismos valores seleccionados en el paso 4 del método
gráfico).
En el cuadro Conocido_x escribimos A5:A13 que representa el tiempo durante el
cual crece la población (mismos valores del tiempo seleccionados en el paso 4 del
método gráfico).
En la casilla correspondiente a Constante y Estadística escribimos la palabra
VERDADERO.
Figura 15. Ventana de argumentos de la función Estimación.Lineal completa.
PASO 4: Una vez diligenciada esta información presionamos al tiempo las teclas: Ctrl + Shif
+ Alt + Aceptar de la ventana anterior. La tecla Shif corresponde a aquella que tiene la
flecha: . Al final obtendremos los datos mostrados en la siguiente figura:
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Figura 16. Resultados finales de la estimación lineal.
Estimación lineal
1,14372017 3,42169901
0,00746925 0,06030027
0,99970154 0,06239195
23446,9196 7
91,2731138 0,02724929
En la ilustración anterior los datos de estimación lineal corresponden en su orden a las
siguientes estadísticas de regresión correspondientes a la función lineal:
H2: Pendiente “m” (1,14372017)
H3: Error estándar para el coeficiente m (0,00746925)
H4: Coeficiente de determinación o regresión (0,99970154).
H5: Valor F observado (23446,9196).
H6: Suma de regresión de los cuadrados (91,2731138).
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I2: Constante b (3,42169901).
I3: Error estándar para la constante b (0,06030027).
I4: Error estándar para el cálculo Y (0,06239195).
I5: Grados de libertad (7).
I6: Suma residual de los cuadrados 0,02724929).
Con los datos obtenidos puede entonces construirse la ecuación lineal. Si 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏,
entonces al reemplazar los datos la ecuación queda conformada así:
𝑦 = 1,1437𝑥 + 3,4217
R2 = 0,9997
Como podemos ver, estos datos son los mismos obtenidos en la figura 11 (método gráfico).
Cálculo de los parámetros cinéticos
De acuerdo con Zwietering et al. (1992), a partir de los datos de crecimiento pueden estimarse
diversos parámetros cinéticos, entre ellos la duración de las fases de latencia (λ) y exponencial
(α), fin de la fase de crecimiento (ε), la velocidad específica de crecimiento (µ) y la máxima
velocidad específica de crecimiento (µmáx).
La forma más común de calcular la duración de la fase de latencia (λ) es la extrapolación de la
tangente en el punto de inflexión de la curva de crecimiento, hasta que corta con la recta
equivalente al nivel inicial de inoculación (Ymin). Después de esta fase de latencia se establece la
fase exponencial. El final de esta fase exponencial (ε) se puede definir como el momento en el
que la extrapolación de la tangente en el punto de inflexión corta con la recta de la máxima
densidad poblacional (Ymáx). La duración de la fase exponencial (α) surge entonces de restar el
tiempo final de la fase exponencial menos el tiempo de duración de la fase de latencia. La
velocidad específica de crecimiento (µ) corresponde con el valor de la pendiente en la gráfica del
Ln UFC/g vs tiempo, mientras que la máxima velocidad específica de crecimiento (µmáx)
corresponde a la máxima velocidad vista en todos los intervalos de tiempo.
De acuerdo con los datos del ejemplo que nos ocupa, identificamos los siguientes valores:
Ymin = 4,605 ln UFC/g
Ymáx = 20,009 ln UFC/g
Ecuación de la recta: y = 1,1437x + 3,4217
Duración de la fase de latencia:
λ = (y – 3,4217) / 1,1437
λ = (4,605 – 3,4217) / 1,1437
λ = 1,0346 horas.
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Final de la fase exponencial:
ε = (y – 3,4217) / 1,1437
ε = (20,009 – 3,4217) / 1,1437
ε = 14,5932 horas.
Duración de la fase exponencial:
α = 14,5932 – 1,0346
α = 13, 5586 oras.
Velocidad específica de crecimiento:
µ = m
µ = 1,1473 ln UFC/g*hora
Máxima Velocidad de crecimiento específico: este parámetro para nuestro ejemplo se obtiene de
la columna E (µ). En ella debemos escoger la casilla en la cual se observa la mayor velocidad y
que en nuestro caso corresponde a E4 (intervalo entre las 2,2 horas y 3,3 horas).
µmáx = 1,5243 ln UFC/g*hora que corresponde al intervalo =(D5-D4)/(A5-A4).
2.9. NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la anterior práctica se ha definido un nivel de Riesgo Bajo o nivel 1; es decir
que se requiere del uso de Bata de Laboratorio Manga Larga, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón
Largo.
2.10. BIBLIOGRAFÍA
Labuza, T. (2004). Predictive Microbiology Principles. Department of Food Science and
Nutrition. University of Minnesota. USA. Pp. 12.
Nies, M.L. (2006). Using Computer Spreadsheets to Solve Equations. Learning & Leading
with Technology, 3(23).
Monod, J. (1949). The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology 3: 371–
394.
Microsoft Office Excel 2007 de Microsoft Corporation Inc. Marca registrada.
Zwietering, M.H., Rombouts, F.M., van’t Riet, K. (1992). Comparison of definitions of the lag
phase and the exponential phase in bacterial growth. J. Appl. Bacteriol., 72: 139–145.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V., Clark, D.P., Brock, T. (2008). Chapter 6: Microbial Growth - Unit 1: Principles of Microbiology. In: Brock Biology of Microorganisms: International Edition. 20th ed. Prentice Hall Edit.
Willett, H.P. (1997). Capítulo 5 Fisiología del crecimiento bacteriano. En: Zinsser
Microbiología. 20ª edición. Joklik, W.K., Willett, H.P., Amos, B., Wilfert, C.M., Editores.
Editorial Médica Panamericana S.A. Buenos Aires, Argentina. Págs. 78 – 109.
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ACTIVIDAD 2
ESTANDARIZACIÓN DE UNA CURVA PATRON DE CRECIMIENTO BACTERIANO POR
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO (PATRÓN McFARLAND) Y RECUENTO EN PLACA.
2.11. OBJETIVOS
Los objetivos que se buscan con esta práctica son:
Diferenciar entre los distintos tipos de métodos de recuento bacteriano y discernir cual
de ellos emplear bajo diversas situaciones.
Comprender los fundamentos que rigen los diversos métodos instrumentales de
recuento microbiano.
Construir una curva patrón para la medida indirecta del crecimiento diversas bacterias
(E. coli, S. aureus, etc.) para futuras prácticas.
Ahorrar material de laboratorio, tiempo de trabajo, etc., en el desarrollo de las futuras
actividades relacionadas a la asignatura de Microbiología predictiva.
Obtener ecuaciones de primer orden para la predicción del crecimiento de estas
bacterias dependiente de la población inicial a temperatura constante.
2.12. MARCO TEÓRICO
El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde perspectivas
diferentes y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento
mediante diversas metodologías. Para algunos, el crecimiento es la capacidad que tienen las
células individuales para multiplicarse, esto es iniciar y completar una división celular. De
esta forma, se considera a los microorganismos como partículas discretas y el crecimiento
es entendido como un aumento en el número total de partículas bacterianas. Existen varias
formas de determinar el número total de microorganismos en una muestra: Determinación
del número de microorganismos, Determinación de la masa celular, y Determinación de la
actividad celular.
Independientemente de los métodos empleados para el conteo bacteriano estos se pueden
agrupar en dos modalidades claramente definidas, así pues tendríamos los métodos de
recuento directo o cuantitativos (como su nombre lo indica nos permite contar directamente
el número de células) y aquellos indirectos o cualitativos, que a través de la determinación
de diversos factores nos permite correlacionar la medida de los mismos con un número de
bacterias. En la práctica habitual del laboratorio, los ensayos se realizan siempre con
poblaciones bacterianas, a menudo tomando muestras en diversos momentos de su
crecimiento en un medio de cultivo. En el resto del manual nos vamos a referir al crecimiento
microbiano a escala de poblaciones. Comenzaremos con describir algunos métodos
habituales de medir ese crecimiento poblacional, algunos de los cuales serán reforzados por
el alumno en las siguientes prácticas de laboratorio.
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El crecimiento de una población o cultivo bacteriano se puede expresar en función de:
Aumento del número de células (microorganismos).
Aumento de masa del cultivo (masa celular).
Aumento de la actividad celular.
Estos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento
balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción
por unidad de tiempo). En cultivos cerrados (discontinuos o no equilibrados) estas
expresiones de crecimiento son coincidentes durante algún periodo pero transcurrido el
tiempo, dejan de ser equivalentes, por ejemplo la masa celular y la actividad celular.
La medida del crecimiento bacteriano puede medirse también mediante dos tipos de
métodos: directos (los cuales requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas) e
indirectos.
Ahora bien, hagamos una descripción de cada uno de ellos:
2.2.1 DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS: Estos métodos pueden
ser indirectos como el Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado, Método de las
diluciones múltiples o del Número Más Probable, Filtración por membrana e incubación de
ésta sobre medio de cultivo sólido, o métodos directos como Recuento microscópico directo
de los microorganismos, ya sea en frotis o en cámaras, Conteo al microscopio de
membranas, Conteo electrónico de partículas (tipo Coulter), Recuento proporcional de
Wright.
2.2.2 DETERMINACIÓN DE LA MASA CELULAR: El crecimiento de una población
bacteriana pueden determinarse por medio de métodos directos de conteo de la población:
medida del peso seco, medida del peso húmedo, medida del volumen, determinación del
contenido de N, etc., o bien por métodos indirectos como turbidimetría (escala de McFarland
y espectrofotometría) y Nefelometría.
2.2.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CELULAR: Este tipo de conteo nos permite
entre otros la determinación de una actividad enzimática, determinación de un metabolito,
medida del consumo de oxigeno, medida de ATP, calorimetría, medida de impedancia,
radiometría (de C02).
A los efectos de llevar a cabo cualquier técnica de recuento, hay que tener en cuenta el tipo
de muestra sobre la que se va a trabajar, por cuanto es posible que algunos de los métodos
no sean aplicables. Cuando es necesario llevar a cabo diluciones, la toma y preparación de
la muestra se realiza de la manera común. En las descripciones que siguen se denominará
homogeneizado a la muestra preparada para su análisis microbiológico.
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Los primeros incluyen normalmente el recuento en placa (mucho trabajo, costos, tiempo) o
conteo directo al microscopio (cámara de Neubauer), mientras los segundos cuantifican
indirectamente la población a través de diferentes métodos:
Métodos eléctricos: impedancia, conductancia.
Métodos turbidimétricos ópticos: Escala de McFarland.
Métodos turbidimétricos instrumentales: Absorbancia, Tramitancia.
Citometría de flujo
Otros.
2.2.4 MÉTODOS TURBIDIMÉTRICOS INSTRUMENTALES: La medición del crecimiento
por métodos turbidimétricos resulta ser más rápido y útil, para obtener una estimación del
número de células o biomasa. Una suspensión celular aparece turbia porque las células
dispersan la luz que atraviesa la suspensión. Cuantas más células haya más luz se dispersa
y más turbia aparece la suspensión. La turbidez puede medirse con un fotómetro o un
espectrofotómetro, aparatos que hacen pasar la luz a través de una suspensión celular y
detectan la cantidad de luz no dispersada. La mayor diferencia entre estos dos instrumentos
es que el fotómetro emplea un filtro simple (normalmente rojo, verde o azul) para generar
luz incidente de una amplitud de onda relativamente ancha, mientras que el
espectrofotómetro emplea un prisma o red de difracción para generar luz incidente de banda
estrecha. Sin embargo, ambos aparatos miden solamente luz no dispersada expresando los
resultados en unidades fotométricas (por ejemplo, Unidades Klett) o unidades de densidad
óptica (DO) para espectrofotómetro.
Para organismos unicelulares, las unidades fotométricas DO son proporcionales (dentro de
ciertos límites) a la masa celular y también al número de células. Por tanto las medidas de
turbidez pueden utilizarse como un sustituto para otros métodos de contaje. Sin embargo y
antes de utilizar la turbidez como método de contaje, hay que realizar una curva estándar
que relacione medidas directas (microscópicas o por recuento en placa) con las unidades
indirectas de turbidez (DO) (Francois et al., 2007). Tales curvas contienen datos para
número de células y masa celular, permitiendo la estimación de ambos parámetros a partir
de una sola medida de la turbidez.
A elevadas concentraciones de células, la luz dispersada de la unidad detectora puede ser
rescatada por otra (apareciendo a la fotocélula como si nunca se hubiese dispersado).
Cuando esto ocurre, la correspondencia uno a uno entre número de células y turbidez pierde
linealidad. Sin embargo, dentro de ciertos límites, las medidas de turbidez pueden ser
razonablemente precisas y además tienen la virtud de ser rápidas y fáciles de tomar.
Adicionalmente, las medidas de turbidez pueden tomarse sin distorsionar mucho las
muestras. Por estas razones, las medidas de turbidez se emplean ampliamente para seguir
el crecimiento de los cultivos microbianos; se puede medir repetidamente la misma muestra
y construir gráficos semilogarítmicos para calcular tiempos de generación. La población
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bacteriana puede determinarse midiendo la turbidez del cultivo a diferentes intervalos de
tiempo y confrontando estos resultados con medidas directas de la población a los mismos
intervalos de tiempo por ejemplo mediante recuento directo en placa.
El cambio de luz se registra en el espectrofotómetro como porcentaje de transmisión
(cantidad de luz transmitida) y absorbancia o densidad óptica (D.O.), valor derivado del
porcentaje de transmisión, correspondiente al log del cociente entre la intensidad de luz
incidente sobre la suspensión (Io) y la de la luz transmitida por la suspensión (I). A = log Io/I.
Cuando se inocula una pequeña población bacteriana en un medio de cultivo líquido
adecuado, generalmente el crecimiento no comienza inmediatamente, sino que hay un
período de latencia. Una vez que empieza el crecimiento, se observa un incremento
exponencial en la densidad celular, que corresponde a la fase exponencial de crecimiento.
Esta fase es la más significativa en el ciclo de crecimiento de los microorganismos y se
caracteriza porque los parámetros cinéticos del crecimiento (µ, k) se mantienen constantes.
A medida que el crecimiento avanza, la concentración de los nutrientes esenciales
disminuye, y se acumulan los productos finales del metabolismo, hasta que el crecimiento
llega a detenerse, de modo que el cultivo entra en fase estacionaria. Después las células
lentamente se mueren, lisándose en algunos casos, en una última fase de muerte celular
(Figura 2.1).
Figura 2.1. Representación gráfica de las fases de crecimiento bacteriano
(Tomado de Labuza, 1994).
Tomado de Schlessinger et al., 1994.
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2.13. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS
2 frascos Erlenmeyer con 99 mL de caldo BHI.
48 tubos de ensayo con 9 mL de agua peptona.
64 Pipetas estériles de 1 mL.
16 Pipetas estériles de 10 mL.
96 cajas de petri estériles con agar BHI.
12 tubos de ensayo estériles.
Incubadora de 35ºC +/- 2ºC
Espectrofotómetro calibrado a 600 nm.
Celdas plásticas para espectrofotometría.
2.14. REACTIVOS
Patrón de McFarland 5 (0,5 ml de BaCl2 al 1,175% + 9,5 ml de H2SO4 al 1%) (Ver anexo 2.1 y
2.2, preparación y control de calidad del estándar de McFarland).
2.15. PROCEDIMIENTO
2.5.1 Cultivos
Se usaran cultivo puros en fase exponencial de diversas bacterias (por ejemplo E. coli
ATCC25922 o S. aureus ATCC29213). Estos cultivos serán mantenidos a 37ºC durante 24 horas
en caldo Infusión-Cerebro-Corazón (Brain Heart Infusión - BHI) (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK)
para ser usadas en la estandarización de las curvas de crecimiento de estas bacterias, las
cuales se usarán como referencia para el desarrollo de las demás actividades prácticas de la
asignatura.
2.5.2 Preparación del inoculo, mantenimiento del cultivo y medida directa del crecimiento:
1. A partir de un cultivo bacteriano (en fase exponencial) preparar una suspensión inicial
(Patrón 1 – P1) de la cepa seleccionada y ajustarla a una turbidez correspondiente al
patrón McFarland 0,5, el cual equivale aproximadamente a 1,5x108 bacterias/ml
(ICONTEC, 2000). De este cultivo preparar una dilución 1:10 (Patrón 2 – P2) inoculando 1
ml de P1 en un tubo conteniendo 9 ml de caldo BHI (población final equivalente a 1,5x107
bacterias/ml).
2. A partir de P2 preparar cinco diluciones 1:10 para obtener los patrones P3, P4, P5, P6 y
P7 con unas poblaciones aproximadas a 1,5x106 bacterias/ml; 1,5x105 bacterias/ml;
1,5x104 bacterias/ml; 1,5x103 bacterias/ml y 1,5x102 bacterias/ml, respectivamente.
3. A partir de cada patrón preparar diluciones decimales (1:10) consecutivas en agua
peptona estéril de tal forma que la población teórica final sea de 1,5x102 bacterias/ml,
según el esquema anexo al final de la guía (ver anexo 2.3). De la última dilución sembrar
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en profundidad y por duplicado 0,1 ml para cada patrón. De la dilución anterior sembrar en
profundidad y por duplicado 1 ml de cada patrón. Adicionar 15 mL de agar BHI y
homogenizar las cajas, llevando a incubar la totalidad de las cajas a una temperatura de
35ºC ± 2ºC por 24 – 48 horas.
4. Al finalizar el tiempo de incubación, realizar los cálculos de la población así:
𝑁 = 𝑐
𝑛
De esta forma se calcula la población en ufc/mL equivalentes al patrón 1, la cual será
correlacionada con el valor inicial de la curva obtenida por espectrofotometría.
5. A partir de cada patrón (P1, P2, P3, P4, P5, P6 y P7) determine el valor de la absorbancia
a 600 nm, de esta forma obtendremos el equivalente en Ab para cada patrón, la cual será
correlacionada con el recuento en placa profunda para cada patrón.
6. Con ayuda de Excel obtener una gráfica de dispersión donde ubicaremos en el eje X el
valor de la absorbancia y en el eje Y el Log10 de la población. Posteriormente usando
regresión lineal, agregar la línea de tendencia que mejor ajuste tenga según el coeficiente
de regresión (R2) y obtener el valor de la ecuación.
7. Esta ecuación es la que usaremos para futuros cálculos de población. Solo basta con
preparar el inoculo inicial del microorganismo (en nuestro caso Escherichia coli
ATCC25922 y Staphylococcus aureus ATCC29213) medir la absorbancia y reemplazar
este valor en la X de ecuación. De esta forma obtendremos el valor aproximado de la
población en ufc/ml.
2.16. RESULTADOS
Construir la curva experimental de absorbancia vs LnN empleando los datos recogidos en la
siguiente tabla 2.1:
Tabla 2.1. Tabla de resultados de la actividad práctica 2.
Patrón
(dilución del
patrón)
Población teórica
(cel/ml)
Absorbancia
media (600 nm)
Media
Población
(ufc/ml)
Población real
(Ln ufc/ml)
1 (100) 1,5x108
2 (10-1) 1,5x107
3 (10-2) 1,5x106
4 (10-3) 1,5x105
5 (10-4) 1,5x104
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6 (10-5) 1,5x103
7 (10-6) 1,5x102
Ajustar la curva a la función más adecuada (lineal, exponencial o logarítmica). Calcular la
ecuación de predicción y corregir hasta obtener un R2 > 0,98. Trabajar con un mínimo de 4
valores de referencia. La ecuación así obtenida será la que se empleará para los cálculos de la
población final a diferentes intervalos de tiempo en las prácticas siguientes.
2.17. NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya
que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por
malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto,
todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá
usar los siguientes equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantalón Largo.
2.18. BIBLIOGRAFÍA
Schlessinger, D., Schaechter, M., Eisenstein, B.I. (1994). Biología de los agentes infecciosos,
capítulo 3. En: Microbiología. Mecanismos de las enfermedades infecciosas, enfoque
mediante la resolución de problemas. 2da edición. Editores: Schaechter, M., Medoff, G.,
Eisenstein, B.I., Guerra, H. Editorial Médica Panamericana, S.A. Buenos aires. Argentina.
Págs. 47 – 76.
http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/cholera/ch9.pdf.
Fernández, C.M., González, M., Illnait, M.T., Martínez, G. (1998). Determinación de la
concentración mínima inhibitoria de Anfotericina B en levaduras de interés médico. Rev
Cubana Med Trop., 50(1): 48-53.
Francois, A., Valero, A., Geeraerd, A.H., Van Impe, J.F., Debevere, J., García-Gimeno, R.M.,
Zurera, G., Devlieghere, F. (2007). Effect of preincubation temperature and pH on the
individual cell lag phase of Listeria monocytogenes, cultured at refrigeration temperatures.
Food Microbiol., 24: 32 – 43.
ICONTEC. Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación. (2000). NTC 2455.
Desinfectantes. Limpiadores líquidos. Desinfectantes para uso doméstico. Tercera
actualización. 25-10-2000.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. (2001). Crecimiento microbiano, Capítulo 5. En: Brock
Biología de los Microorganismos. 8ª edición revisada. Editorial Prentice Hall Iberia, Madrid,
España. ISBN: 84-89660-36-0. 4ª reimpresión. Págs. 155 – 157.
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Willett, H.P. (1997). Fisiología del Crecimiento Bacteriano, Capítulo 5. En: Zinsser, Microbiología.
20ª edición. Editores: Joklik, W.K., Willett, H.P., Amos, D.B., Wilfert, C.M. Editorial Médica
Panamericana, S.A. Buenos Aires. Argentina. Págs. 78 – 109.
ANEXOS
ANEXO 2.1. Escala de McFarland
Fundamento: El patrón o la escala de McFarland consiste en una serie de tubos
herméticamente cerrados, previamente calibrados y con una densidad óptica diferente originada
por la aparición de un precipitado de sulfato de bario (SO4Ba) resultante de la reacción entre el
cloruro de bario (Cl2Ba) al 1,175% (0,048 M) y el ácido sulfúrico (H2SO4) al 1% (0,36N). Esta
turbidez puede interpretarse ópticamente o por métodos espectrofotométricos y cada una de
ellas se corresponde a una concentración conocida de bacterias/ml. Para cada cepa bacteriana
hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de
bacterias (cel/ml) que genera una turbidez similar.
Inconveniente: Es un método poco preciso, que solo se emplea cuando no hace falta exactitud,
ha sido desplazado por los métodos espectrofotométricos.
Conservación: El estándar de McFarland puede ser almacenado hasta por 6 meses en la
oscuridad y a temperatura ambiente entre 22º a 25ºC. Sin embargo, se recomienda almacenarse
a ser posibles en refrigeración.
Cuidados: Descartar después de 6 meses o antes si su volumen es menor. Antes de cada uso,
debe agitarse muy bien usando un shaker, hasta que el precipitado blanco de sulfato de bario se
haya disuelto en todo el medio. Para asegurar la densidad del estándar de McFarland así
preparado puede ser chequeado usando un espectrofotómetro con una celda de cuarzo de 1-cm;
para el estándar 0,5 de McFarland, la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm puede
estar entre 0,08 a 0,1. Alternativamente, el aseguramiento del estándar de McFarland puede ser
verificado por ajuste de una suspensión de una cepa control (por ejemplo, E. coli ATCC 25922) a
la misma turbidez, preparando diluciones seriadas 1:10, y realizando el respectivo recuento en
placa. La suspensión así ajustada puede tener un conteo de 1,5x108 ufc/ml.
Para levaduras el estándar 0,5 de McFarland es equivalente a una suspensión de 106 ufc/ml
(Andreu et al., 1998).
Preparación: Se adicionan cantidades crecientes (o decrecientes según corresponda) de
BaCl2*2H2O al 1,175% (p/v) en H2SO4 al 1% (v/v) de acuerdo a la siguiente tabla (Tabla 2.2.)
para obtener la equivalencia deseada:
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Tabla 2.2. Preparación del estándar de McFarland.
Escala de
McFarland BaCl2*2H2O (0.048M) H2SO4 (0.36N) ml final [ ] celular
1 0,1 9,9 10,0 3 x 108
2 0,2 9,8 10,0 6 x 108
3 0,3 9,7 10,0 9 x 108
4 0,4 9,6 10,0 12 x 108
5 0,5 9,5 10,0 15 x 108
6 0,6 9,4 10,0 18 x 108
7 0,7 9,3 10,0 21 x 108
8 0,8 9,2 10,0 24 x 108
9 0,9 9,1 10,0 27 x 108
10 1,0 9,0 10,0 30 x 108
Fuente: ICONTEC, 2000.
Los estándares de turbidez se preparan en tubos similares a los que se emplearan para preparar
la suspensión del inoculo. Después, el tubo debe ser bien tapado usando una tapa rosca con
teflón, Parafilm, o algún otro medio que evite la evaporación del mismo. Esta escala de 3x108 a
3x109 bacterias por ml es de gran utilidad en cuanto que, en la mayoría de los experimentos, los
conteos quedarán dentro de estos límites, excepto en los casos de muy bajo crecimiento.
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ANEXO 2.2. Procedimiento para la preparación y control de calidad del estándar 0,5 de
McFarland (Equivalente a 1,5x108 bact/ml)
Fuente: Fernández et al., 1998.
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ANEXO 2.3. Esquema de trabajo curva de calibración de población por método
turbidimétrico y recuento en placa.
LECTURA TURBIDIMÉTRICA RECUENTO EN PLACA
P7
PT = 102
PT =101
PT =102
Cultivo madre de E. coli / o S. aureus
fluorescens
PT =101
PT =102
PT =101
PT =102
PT =101
PT =102
PT =101
PT =102
PT =101
PT =102
P1
PT = 108
P2
PT = 107
P3
PT = 106
P4
PT = 105
P5
PT = 104
P6
PT = 103 1 ml
1 ml
0,1 ml
1 ml 1 ml 1 ml
0,1 ml
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
0,1 ml
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
0,1 ml
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
0,1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
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ACTIVIDAD 3
INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO
3.1 OBJETIVO
Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:
Comprender el efecto que la temperatura ejerce sobre la cinética de crecimiento
bacteriano.
Evidenciar la relación existente entre la temperatura de incubación y la velocidad de
crecimiento bacteriano.
Conocer el mecanismo básico de acción de la temperatura en el crecimiento y
metabolismo a nivel de bacterias.
3.2 MARCO TEÓRICO
Así como los humanos estamos adaptados a vivir y trabajar en diversas condiciones de
temperatura, los microorganismos no escapan a esta regla. Por ejemplo cuando una
persona está acostumbrada a vivir y trabajar en un clima frío, el hecho de desplazarse y
realizar sus labores en clima cálido causa una afectación sobre su estado anímico y nivel de
actividad, reduciendo el rendimiento que cabría esperarse de la misma que cuando se
encuentra en su entorno natural. De esta forma podríamos decir que la temperatura afecta
nuestras actividades, lo mismo ocurre con los microorganismos. Probablemente dentro de
los factores físicos que influyen en el crecimiento, la temperatura es el principal factor que
afecta la viabilidad y el desarrollo microbiano, es decir, determina la velocidad de
crecimiento bacteriano (Adair et al., 1989; McDonald y Sun, 1999; Olson y Nottingham,
2000). Para entender mejor el efecto de este y otros factores medioambientales
(extrínsecos e intrínsecos) diversos modelos matemáticos han sido desarrollados, con el
objeto de predecir el comportamiento de las poblaciones bacterianas cuando crecen en
condiciones controladas de laboratorio y muchos de ellos han logrado ser validados en
condiciones de producción, transporte y almacenamiento de alimentos, esto es posible
incluso tomando en cuenta variaciones en factores de crecimiento extrínsecos como la
temperatura y en otros intrínsecos como la concentración de sal, actividad de agua, entre
otros (Wijtzes et al., 1995; Zwitering et al., 1990).
Las bacterias suelen presentar diferentes exigencias en relación a la temperatura de
crecimiento. Entre la máxima temperatura, por encima de la cual esta no puede crecer y una
temperatura mínima, por debajo de la cual un cultivo no se desarrolla, se ubican los límites
en los que pueda haber crecimiento. Al rango de temperaturas sobre la cual pueden crecer
los microorganismos se le conoce como temperatura cardinal, así esta temperatura esta
constituida por una temperatura mínima, una máxima y una óptima, situándose esta última
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2.
por lo general en valores muy cercanos o próximos a la máxima que a la mínima
temperatura de crecimiento. Las mejores condiciones de crecimiento de un organismo tienen
lugar dentro de unos límites bastante reducidos que es lo que se conoce como temperatura
óptima de crecimiento. La temperatura óptima para el crecimiento de una especie microbiana
determinada, está relacionada con la temperatura del hábitat normal del organismo. La
influencia de la temperatura sobre el crecimiento, es realmente, una medida de la influencia
de la temperatura sobre la actividad enzimática de la célula.
3.2.1 Comportamiento de los microorganismos respecto a la temperatura. El efecto de la
temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cada reacción química individual,
de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un
incremento de ésta resulta en una mayor velocidad de reacción. Esto se traduce en un
aumento de µmáx con la temperatura (ver Fig. 2). Por otra parte, aumentos posteriores de
temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo que el valor de µmáx
decrece rápidamente.
Como se ha mencionado, cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento
adecuada. Si consideramos la variación de la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al
tiempo de generación, g) en función de la temperatura de cultivo (y suponiendo que el resto
de condiciones ambientales se mantienen constantes), podemos distinguir tres puntos
característicos llamados temperaturas cardinales: una temperatura mínima por debajo de la
cual no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la
velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura
óptima a la que la velocidad es máxima (o sea, g mínimo). Por encima de esta temperatura
Fuente: Wijtzes y col., 1995
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óptima, se encuentra la máxima de crecimiento donde la velocidad de crecimiento decae
bruscamente y finalmente se produce la muerte celular. El margen entre la temperatura
mínima y la máxima se suele llamar margen de crecimiento o temperatura cardinal, y en
muchas bacterias suele comprender unos 40 grados. Hay varios tipos de microorganismos
en función de sus temperaturas de crecimiento mínima, máxima y óptima (ver tabla 1).
Tabla 1. Temperaturas cardinales para los microorganismos procarióticos.
Grupo Temperatura (ºC)
mínima óptima máxima
Mesófilo 5 a 15 30 a 45 35 a 47
Psicrófilo – 5 a 5 12 a 15 15 a 20
Psicrótrofoa – 5 a 5 25 a 30 30 a 35
Termófilob 40 a 45 55 a 75 60 a 90
Termótrofoc 15 a 20 45 a 55 65 a 75
Fuente: ICMSF, 2000.
aLos microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas.
Por tanto, se les puede considerar como psicrófilos facultativos. Esto es importante desde el
punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces
de crecer en condiciones de refrigeración (4 – 8ºC) y de producir infecciones en los
consumidores del alimento (30 – 35ºC). bDe acuerdo con Enrique Iañez las bacterias denominadas termófilas pueden presentan
mínimos a 25oC, óptimos a 50 – 75oC y máximos entre 80 y 105oC. Dentro de esta categoría
se suele distinguir las termófilas extremas (=hipertermófilas), que pueden llegar a presentar
óptimos cercanos a los 100oC, y que taxonómicamente pertenecen al dominio de las
Archaea. Las termófilas estrictas (o estenotermófilas), con óptimos por encima de los 80ºC
son de hecho incapaces de crecer a menos de 37oC, como las citadas arqueas (ej.,
Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium). La arquea Pyrolobus fumarii, habitante de los
humeros termales submarinos tiene su óptimo nada menos que a 105ºC y puede llegar a
aguantar 113ºC, y parece detiene su metabolismo (por "frío") a la "agradable" temperatura
de 90ºC. Las termófilas facultativas (o euritermófilas) pueden crecer a menos de 37oC, como
p. ej. Thermus aquaticus. cDe acuerdo con Mescle y Zucca (1994), los termótrofos son mesófilos capaces de crecer a
temperaturas relativamente elevadas, como ocurre con algunas bacterias lácticas
(Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus) o enterococos de origen fecal (E.
faecalis).
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Por encima de la temperatura mínima la tasa de crecimiento va aumentando
proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura óptima, esto se debe al incremento
generalizado de la velocidad de las reacciones metabólicas catalizadas por enzimas se van
aproximando a su óptimo. En dicha temperatura óptima las enzimas y reacciones se dan a
su máxima tasa posible. Se denomina coeficiente de temperatura a la relación entre el
incremento de la velocidad de reacción y el de temperatura. En términos generales, la
velocidad de las reacciones bioquímicas suele aumentar entre 1,5 y 2,5 veces al aumentar
10ºC la temperatura a la que tienen lugar.
A partir de la temperatura óptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce un
descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura máxima. Dicha
temperatura refleja:
Desnaturalización e inactivación de proteínas enzimáticas esenciales,
Colapsamiento de la membrana citoplasmática,
Lisis térmica de la bacteria.
Lo anterior conduce inevitablemente a la muerte celular.
Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular es lento y
las células paran de crecer; aunque suelen morir en algunos casos, no siempre es así. Sin
embargo, cuando la temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular
rápidamente y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja
posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por frío. Para concluir,
veamos las principales adaptaciones bioquímicas a bajas y altas temperaturas seguidas por
las bacterias en general.
1.1.1. Principales adaptaciones bioquímicas a medios fríos (exhibidas por los
psicrótrofos):
- Enzimas más resistentes al frío,
- Sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas,
- Los fosfolípidos de la membrana celular aumentan la proporción de ácidos insaturados
(y en algunas bacterias, poliinsaturados), ello supone que la membrana sigue en su
estado semifluido evitándose su congelación.
1.1.2. Principales adaptaciones bioquímicas a altas temperaturas (en células
vegetativas bacterianas)
- Enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy hidrófobo,
- Ribosomas termorresistentes,
- Membranas ricas en ácidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofóbicos más
fuertes,
- En Arqueas hipertermófilas los lípidos son muy especiales: en vez de basarse en ésteres
de ácidos grasos con el glicerol, se trata de éteres de hidrocarburos unidos al glicerol (el
enlace éter es más resistente). Algunas, además, en vez de la típica bicapa lípídica,
exhiben una monocapa bioquímica de C40-bifitanil-tetraéteres (resultado de unirse
"cola con cola" dos C20-fitanil-diéteres), que condicionan una extrema resistencia a
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agentes ambientales.
1.1.3. Modelamiento del efecto de la temperatura sobre el crecimiento.
Las aproximaciones modernas de la Microbiología Predictiva de Alimentos han tratado de
entender y establecer un vínculo entre el crecimiento de microorganismos y los factores que
regulan el crecimiento tales como la temperatura, pH, actividad de agua, potencial redox,
etc. La gran mayoría de los modelos secundarios son modelos de tipo cinético (Labuza y
Fu, 1993; McDonald y Sun, 1999), tales como el modelo de Arrhenius, modelo modificado
de Arrhenius, modelo de Schoolfield, modelo de la raíz cuadrada de Ratkowsky y algunos
modelos polinómicos, de los cuales el más comúnmente usado ha sido el modelo de
Arrhenius. Los modelos cinéticos para la determinación de la vida útil en alimentos son
generalmente basados en la ocurrencia de fenómenos y estos no han sido desarrollados
para un alimento en particular. Sin embargo, los parámetros experimentales y ambientales
de un modelo pueden aplicarse para un producto en especial. De estos, la temperatura es
normalmente considerada como el factor más importante en las reacciones de deterioro de
los alimentos, especialmente, para la alteración microbiana donde la velocidad de
crecimiento específico y la fase de latencia son altamente dependientes de la temperatura
(Giannuzzi y col., 1998).
Diversos modelos predictivos han sido usados a través del tiempo para evaluar la relación
entre la temperatura y la velocidad de crecimiento bacteriano (Adair et al., 1989). La
ecuación original del modelo lineal de Arrhenius se ha aplicado tanto al crecimiento
microbiano como a las reacciones químicas, es decir, este modelo está basado en
consideraciones termodinámicas empíricas (McDonald y Sun, 1999), pero se reconoce
ampliamente que la relación entre el logaritmo de los parámetros de la curva de crecimiento
y el inverso de la temperatura absoluta es no-lineal o por lo menos lineal sólo por encima de
una fracción del rango de temperatura (Adair et al, 1989).
.
1.1.3.1. Modelo de la Raíz Cuadrada
El modelo de la raíz cuadrada es probablemente la ecuación más estudiada y el modelo
más ampliamente usado para analizar el efecto de la temperatura sobre la velocidad
específica de crecimiento (Giannuzzi et al., 1998). Ratkowsky et al., (1983) propusieron la
siguiente relación:
𝜇 = 𝑏 × 𝑇 − 𝑇0
Donde µ es la velocidad específica de crecimiento, b es un coeficiente de regresión [(log
(ufc/cm2) días-1)1/2⁰C-1], T es la temperatura de incubación absoluta (K)y T0 es una
temperatura conceptual sin significancia metabólica para psicrófilos, psicrótrofos y
mesófilos, es decir, la menor temperatura en la cual la velocidad de crecimiento es cero o la
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fase de latencia es infinita (Ratkowsky et al., 1983; Adair et al., 1989; Giannuzzi et al.,
1998).
La ecuación anterior fue modificada como sigue (Giannuzzi et al., 1998):
𝜇 = 𝑏 × + 𝑞 × 𝑇
Donde T es la temperatura de incubación (⁰C), q es la pendiente de la línea de regresión
[(log (ufc/cm2) días-1)1/2⁰C-1] y p [(log (ufc/cm2) días-1)1/2] es el intercepto a 0ºC.
1.1.3.2. Modelo de Arrhenius
La ecuación de Arrhenius fue derivada empíricamente basada en consideraciones
termodinámicas (Labuza y Riboh, 1982), y describe la velocidad con que una reacción
cambia cuando se emplean diferentes temperaturas conocidas (Ross y McMeekin, 1994).
La forma más simple de esta ecuación es:
k = A 𝑒−𝐸𝑎𝑅𝑇
o
ln 𝑘 = ln 𝐴 − 𝐸𝑎
𝑅𝑇
Donde, k es la velocidad de reacción; A (ufc/ml*tiempo) es un factor pre-exponencial – que
corresponde al intercepto de “y” en una gráfica de Lnk vs 1/T–, R es la constante universal
de los gases (8,314 KJ/KgºK o 1,987 cal/ºKmol), T es la temperatura absoluta (ºK), y Ea
(KJ/Kg) es denominada como la energía de activación de la reacción límite de velocidad-
crecimiento (Ross y McMeekin, 1994). Si en la ecuación anterior los valores de k son
calculados a diferentes temperaturas y si el lnk es graficado contra 1/T, puede obtenerse
una línea recta en la cual la pendiente (m) es igual –Ea/R (Labuza y Riboh, 1982; Labuza y
col., 1992; McDonald y Sun, 1999). Así el modelo de Arrhenius puede catalogarse en la
clasificación de Whiting y Buchanan (1993) como un modelo de tipo secundario.
Cuando el modelo de Arrhenius es empleado para evaluar el efecto de la temperatura sobre
el crecimiento microbiano, entonces k se transforma en la velocidad de crecimiento
específico (Ross y McMeekin, 1994; Giannuzzi y col., 1998), y la ecuación de Arrhenius
puede escribirse como:
μ = A 𝑒−𝐸𝜇
𝑅𝑇
Sin embargo, el crecimiento bacteriano es complejo y las extrapolaciones de las gráficas
pueden no mostrar linealidad, por lo tanto, la ecuación anterior no puede encajar muy bien
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por debajo de los datos óptimos o por encima de las temperaturas mínimas para el
crecimiento. Entonces, las gráficas obtenidas solo sirven para predecir el crecimiento
microbiano en un limitado rango de temperatura (Labuza y Fu, 1993; McDonald y Sun,
1999). Así la ecuación que ha sido utilizada mayoritariamente para describir el efecto de la
temperatura sobre el crecimiento microbiano es el modelo de la raíz cuadrara propuesto por
Ratkowsky y col., en 1982 (Adair y col., 1989; Willocx y col., 1993; Neumeyer y col., 1997;
Giannuzzi y col., 1998).
MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS
Cultivo madre de E. coli o S. aureus en fase exponencial (mantenido en caldo BHI) y
ajustado a un McFarland 0,5.
Pipetas de 10 ml y 1 ml estériles.
Espectrofotómetro.
Celdas para espectrofotometría.
Incubadoras a distintas temperaturas (25ºC, 30ºC, 35ºC, 40ºC y 45ºC.
Frascos erlenmeyer con 99 ml de caldo BHI.
20 mL de caldo BHI estéril (Solución Blanco).
REACTIVOS
No aplica
PROCEDIMIENTO
A partir del cultivo madre inocular 1 ml en un frasco erlenmeyer conteniendo 99 ml de
caldo BHI.
De esta suspensión determine la absorbancia a 600 nm y confronte con la curva patrón
de Ab vs. LnN obtenida en la práctica 1, y prediga la población inicial. Esta población
será la equivalente a la población inicial a tiempo 0.
Colocar a incubar la suspensión a diferentes temperaturas durante una hora. Pasado
este tiempo en condiciones asépticas tome un inóculo y determine la absorbancia.
Posteriormente cada media hora haga lecturas espectrofotométricas hasta obtener por lo
menos 8 datos de incrementos en este valor. Confrontar estos resultados con la curva
patrón y calcular la población a los diferentes intervalos de tiempo.
Realizar la gráfica de crecimiento a cada temperatura, para tal fin, tome los datos de
lectura obtenidos por los otros grupos. Una vez construida la gráfica y con los valores
obtenidos determine en cada una de ellas la duración de la fase de latencia, la velocidad
de crecimiento específico y el tiempo de duplicación. Discuta además el comportamiento
del crecimiento a cada una de las diferentes temperaturas.
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Tiempo (min) 0 60 90 120 150 180 210 240 270 300
Ab (600 nm)
LnN células/ml
NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya
que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por
malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto,
todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá
usar los siguientes equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantalón Largo.
BIBLIOGRAFÍA
Adair, C., Kilsby, D.C., Whittall, P.T. (1989). Comparison of the Schoolfield (non-linear
Arrhenius) model and the Square Root model for predicting bacterial growth in foods. Food
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abril de 2007.
Iañez, E. (2007). Curso de Microbiología On Line. Capítulo: Factores físicos que afectan el
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ACTIVIDAD 4
INFLUENCIA DEL PH Y ACIDEZ SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO
OBJETIVO
Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:
Comprender el efecto que el pH tiene sobre la viabilidad y crecimiento bacteriano.
Conocer el mecanismo básico de acción del pH sobre el medio, sobre la membrana
celular y sobre las reacciones metabólicas de las bacterias.
MARCO TEÓRICO
En estado natural, la mayoría de los alimentos (carnes, pescados y productos vegetales) son
ligeramente ácidos. La mayor parte de las frutas son bastantes ácidas y solo algunos
alimentos, como la clara de huevo por ejemplo, son alcalinos. Para preservar los alimentos,
durante miles de años se ha venido aumentando su acidez, bien sea de manera natural, por
fermentación, o artificial, por adición de ácidos débiles, con lo que se consigue inhibir la
proliferación microbiana. De este modo, la acidez puede ser un factor básico en la
preservación, como en el caso de algunos alimentos fermentados tales como el yogur, la col
fermentada o los pepinillos en vinagre, o tener un papel auxiliar, cuyo efecto se combina con
el de otros factores tales como conservantes químicos, calor o actividad de agua (aw).
El pH es el logaritmo de la inversa de la concentración de iones hidrógeno de una disolución.
Proporciona una indicación de la actividad de estos iones sobre los componentes del medio.
Influye sobre las reacciones químicas y bioquímicas y, en consecuencia, sobre los
microorganismos.
Comportamiento de los microorganismos respecto del pH: Como sabemos, las bacterias
pueden desarrollarse a pHs entre 4,5 y 9 con un óptimo de crecimiento entre 6,5 y 7,5. Esto
quiere decir que a valores de pHs comprendidos entre estos rangos la velocidad de
crecimiento es mayor y, por tanto la duración de la fase de latencia es menor que cuando las
bacterias crecen a valores de pHs inferiores o superiores a los óptimos. Naturalmente existen
excepciones, es decir, como las bacterias acéticas y las bacterias lácticas, que soportan pHs
inferiores a 3,5. Para las primeras el pH óptimo se sitúa en torno a 5,4 – 6,3, mientras que
para las segundas oscila entre 5,5 (incluso menor) y 6 (ICMSF, 2000). En nuestro caso
particular y según describe Mescle y Zucca (1994), los límites de pH para el crecimiento de E.
coli y S. aureus son:
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Microorganismo pH mínimo pH óptimo pH máximo
E. coli 4.3 6.0 – 8.0 9.0
S. aureus 4.2 6.8 – 7.5 9.3 – 9.8*
* ICMSF, 2000.
Como hemos mencionado, muchos microorganismos pueden crecer dentro de un apmplio
rango de pH, cabría suponer pues, que estas células tienen la capacidad o disponen de
métodos eficaces para estabilizar su pH interno. Sin embargo, se ha comprobado que el pH
interior puede sufrir o verse considerablemente afectado por el pH del medio exterior. Esta
cuestión se ha estudiado a través del seguimiento paso a paso, a través de la membrana
celular, de un ácido débil, la 5,5-dimetil-2,4-oxaxolidindiona (DMO). En el rango de pH entre 5
y 7, el pH interno de E. coli resultó ser más alcalino que el del medio exterior y por encima de
pH 7, más ácido (ICMSF, 2000).
Mecanismo de acción del pH sobre el crecimiento de los microorganismos: La acción
del pH sobre el crecimiento de los microorganismos se puede situar a tres niveles: el medio,
la permeabilidad de la membrana y la actividad metabólica. La disponibilidad de ciertos
nutrientes en el medio de cultivo sufre modificaciones en función del equilibrio iónico. Como
ocurre con los iones metálicos, a pHs ácidos los iones magnesio forman complejos
insolubles, a pHs básicos lo hacen los iones de zinc, calcio y los férricos. Bajo estas formas,
estos iones, que son indispensables como cofactores de enzimas, son difícilmente utilizables.
La permeabilidad de la membrana se ve igualmente afectada por las variaciones en la
concentración de iones H+ y OH-. En medio ácido las permeasas catiónicas se saturan de
iones hidrógeno, lo que limita o anula el transporte de cationes indispensables. En medio
alcalino, son los iones hidroxilo los que saturan la membrana, impidiendo la transferencia de
aniones. Las reacciones enzimáticas poseen un óptimo de actividad por encima o por debajo
del cual la cinética sufre cambios. Toda variación del pH citoplásmico entraña una
disminución de la actividad enzimática y, por tanto, del crecimiento del microorganismo. No
todos los enzimas tienen el mismo comportamiento en función del pH, las hidrolasas
extracelulares son menos sensibles en general que los enzimas citoplásmicos.
En la práctica se pueden emplear dos tipos de conservadores ácidos en alimentos que actúan
sobre los tres niveles antes mencionados:
- Ácidos fuertes (fosfórico o el clorhídrico). Su efecto consiste en bajar considerablemente
el pH, proporcionando una concentración externa de protones muy elevada, que
determina la acidificación del medio interno celular. Tales condiciones son normalmente
inaceptables en alimentos pero permisibles en bebidas carbónicas.
- Ácidos débiles lipofílicos (láctico, cítrico, acético, fórmico). Provocan la entrada de
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protones a través de la membrana celular, acidificando el interior de la célula e
inhibiendo el transporte de nutrientes. Algunos ácidos se disocian dando lugar a aniones
(lactato o citrato) que la célula es capaz de transportar y cuya presencia por tanto no
inhibe el metabolismo energético. En su defecto, el ácido acético o el fórmico, son
eficaces conservadores debido a que no solo son buenos conductores de protones, sino
que además pueden dar lugar a concentraciones intracelulares de sus aniones que
ejercen acción inhibitoria.
También existen algunos iones que potencian la acción de los ácidos, tal es el caso del sulfito
o el nitrito (las sales minerales de ácidos débiles), que resultan altamente inhibitorios a pH
bajos.
MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS
Cultivo madre de E. coli y S. aureus en fase logarítmica (mantenido en caldo BHI).
Pipetas de 10 ml y 1 ml estériles.
Espectrofotómetro.
Celdas para espectrofotometría.
Incubadora a 35ºC +/- 2ºC
Frascos erlenmeyer con 99 ml de caldo BHI ajustado a pHs 5,0; 6,0 y 7,0.
REACTIVOS
No aplica
PROCEDIMIENTO
A partir del cultivo madre inocular 1 ml en un frasco erlenmeyer conteniendo 99 ml de
caldo BHI ajustado a diferentes concentraciones de pH.
De esta suspensión determine la absorbancia a 600 nm y confronte con la curva patrón de
Ab vs. LnN obtenida en la práctica anterior (Fig 1 y Fig 2), y prediga la población inicial.
Esta población será la equivalente a la población inicial a tiempo 0.
Colocar a incubar la suspensión a 35ºC +/- 2ºC y cada hora determine la absorbancia
durante dos horas. A partir de las 2 horas reduzca el tiempo de medida a 30 minutos
hasta obtener por lo menos 8 datos de incrementos en la absorbancia. Confrontar estos
resultados con la curva patrón y calcular la población a los diferentes intervalos de
tiempo.
Realizar la gráfica de crecimiento a cada valor de pH y calcular en cada una de ellas la
duración de la fase de latencia, la velocidad de crecimiento específico y el tiempo de
duplicación.
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Tiempo (min) 0 60 120 150 180 210 240 270
Ab (600 nm)
NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya
que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por
malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto,
todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá
usar los siguientes equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantalón Largo.
BIBLIOGRAFÍA
Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los
alimentos, incidencia del pH. En: Microbiología alimentaria, volumen 1. Aspectos
microbiológicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza,
España. Pps. 7-50.
ICMSF. (2000). pH y Acidez, Capítulo 5. En: Ecología microbiana de los alimentos 1.
Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos.
Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. Pps. 97-117.
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ACTIVIDAD 5
EFECTO DE DIVERSOS DEPRESORES DE LA ACTIVIDAD DE AGUA (AW)
[CONCENTRACIÓN DE NaCl, GLUCOSA Y SACAROSA] SOBRE EL CRECIMIENTO
BACTERIANO
OBJETIVO
Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:
Comprender el efecto que la actividad de agua (aw) y la concentración de solutos
depresores de aw tienen sobre la viabilidad y crecimiento bacteriano.
Evidenciar la relación existente entre la concentración de sal, glucosa y sacarosa vs la
actividad de agua de un medio.
Conocer el mecanismo básico de acción de la actividad de agua y solutos depresores de
la misma sobre el metabolismo bacteriano.
MARCO TEÓRICO
Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma disponible, para que
puedan crecer y llevar a cabo sus actividades metabólicas. La mejor forma de medir la
disponibilidad de agua es mediante la actividad de agua (aw). La deshidratación es un
método de conservación de los alimentos basado en la reducción de la aw, lo que se
consigue eliminando el agua de los productos. Durante el curado y/o salazonado, así como
en el almíbar y otros alimentos azucarados, son los solutos los que, al ser añadidos,
descienden la aw. un pequeño descenso de la aw es a menudo suficiente para evitar la
alteración de los alimentos siempre que esta reducción sea potenciada por otros agentes tal
como ocurre con los nitritos en muchas carnes curadas y con los componentes del humo en
los alimentos ahumados, salazonados y desecados. De esta forma la aw puede tener un
papel principal en la conservación de alimentos o en su defecto tener un papel auxiliar, cuyo
efecto se combina con el de otros factores tales como conservantes químicos, calor, acidez,
etc.
La actividad de agua (aw) es definida como la relación de la presión parcial del vapor de
agua en el producto (p) y la del agua pura (po) a la misma temperatura (Christian, 1980;
Mathlouthi, 2001).
𝑎𝑤 = 𝑃
𝑃0
A medida que una solución se concentra, la presión de vapor disminuye y la aw va
descendiendo a partir de un valor máximo de 1 para el agua pura (en ausencia de capilares
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o fuerzas de adsorción). La aw está relacionada con el punto de congelación y con el de
ebullición así como con la humedad relativa en equilibrio (HRE) y la presión osmótica.
Relación entre la Actividad de Agua, la Humedad Relativa en equilibrio y la Presión
Osmótica: Según Christian (1980) los primeros estudios sobre el efecto de la humedad en el
crecimiento microbiano se describieron en términos de HRE o presión osmótica. La relación
entre la aw y la humedad relativa viene dada por la fórmula:
𝐻𝑅𝐸 % = 𝑎𝑤 × 100
En este caso la HRE al igual que la aw, es la relación entre la presión de vapor de la solución
y la del agua pura pero expresada en porcentaje. Esta ecuación podría ser válida para
sistemas en los cuales teóricamente se alcance el equilibrio, sin embargo, en la praxis
resulta complejo que la aw y la HRE alcancen el equilibrio, aún incluso en aquellos alimentos
que podríamos considerar cerrados como los enlatados, la aw no alcanza el equilibrio con la
humedad relativa). La HRE se refiere estrictamente a la atmósfera en equilibrio con una
solución o alimento y constituye una expresión menos apropiada que la aw como forma de
medir el agua disponible. La presión osmótica está relacionada con la aw a través de la
siguiente ecuación:
𝑃. 𝑂𝑠 =−𝑅𝑇 𝑙𝑛𝑎𝑤
𝑉
Donde R es la constante de los gases, T la temperatura absoluta (ºK), lnaw el logaritmo
natural de la aw y V el volumen molar parcial del agua. El uso de la presión osmótica
presupone la presencia de una membrana con unas características de permeabilidad
adecuadas.
Relación entre la Actividad de Agua y la concentración de depresores de la misma: La
aw de un alimento puede reducirse aumentando la concentración de solutos en la fase
acuosa de los alimentos bien mediante la extracción del agua (secado, deshidratación, etc.)
o mediante la adición de solutos (NaCl, azúcar, glicerina, etc.). Algunas moléculas del agua
se orientan en torno a las moléculas del soluto y otras quedan absorbidas por los
componentes insolubles de los alimentos. En ambos casos, el agua queda en forma ligada
que es una forma menos reactiva (no disponible). La relación entre la aw y la concentración
de solutos viene dada por la ley de Raoult y puede expresarse de la siguiente forma:
𝑃
𝑃0=
𝑛2
𝑛1 + 𝑛2
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Es decir, la relación entre la presión de vapor de la solución y la del solvente puro es igual a
la fracción molar del solvente, donde p y po son las presiones de vapor de la solución y del
solvente, respectivamente y n1 y n2 el número de moles del soluto y del solvente,
respectivamente. En la figura 1 se presenta la relación de tres solutos depresores de la
actividad de agua (Sacarosa, Glucosa y NaCl) frente a la aw.
Figura 1. Relación entre la concentración de sacarosa, glucosa y cloruro sódico (g/L) vs
actividad de agua en medio acuoso a 25ºC.
Fuente: adaptada de los valores de Christian, 1980.
A partir de la figura anterior podemos inferir que la relación entre la concentración tanto de
sacarosa, glucosa y NaCl y la actividad de agua es inversamente proporcional, tomando una
relación de tipo lineal. En este sentido, el cloruro de sodio actúa como un fuerte represor de
la actividad de agua y en menor medida la glucosa y sacarosa. Con los datos anteriores se
puede predecir la aw de una solución acuosa sencilla de composición conocida, sin embargo,
la relación entre la composición de un alimento y su aw es mucho más compleja. Para
conocer estas relaciones, lo habitual es determinar los valores de la aw de un alimento con
diferentes concentraciones de solutos, los que se representan gráficamente con el fin de
obtener la curva de correlación entre el % soluto vs aw. A partir de los datos mostrados en la
figura 1, se obtienen las siguientes ecuaciones que pueden ser usadas para preparar medios
sencillos con diferentes valores de aw para el estudio de las relaciones de agua desde un
punto de vista microbiológico, la bondad de las gráficas (coeficiente de determinación –R2)
es de 0,996 para la sacarosa y NaCl y 0,993 para la glucosa:
- Sacarosa: 𝑎𝑤 = −0,00007 × 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎𝑔
𝐿𝑡 + 1,00412
0,74
0,78
0,82
0,86
0,90
0,94
0,98
1,02
0 500 1000 1500 2000
a w
Concentración (g/Lt)
Sacarosa
Glucosa
Sal
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- Glucosa: 𝑎𝑤 = −0,00010 × 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎𝑔
𝐿𝑡 + 0,99808
- NaCl: 𝑎𝑤 = −0,00067 × 𝑁𝑎𝐶𝑙𝑔
𝐿𝑡 + 1,00551
Relación entre la Actividad de Agua y la Temperatura: La relación entre la concentración
de los solutos y la actividad de agua es dependiente de la temperatura, dado que esta influye
sobre la presión de vapor de agua de las soluciones pero el efecto es pequeño con la
mayoría de los solutos salvo que las soluciones sean saturadas. En tales casos, las
cantidades de algunas sustancias de la solución, y por tanto la aw, pueden variar
marcadamente con la temperatura.
Figura 2. Relación entre la actividad de agua y el porcentaje de NaCl en solución acuosa: a
25ºC y b 30ºC.
En la figura 2 (a y b) puede verse la relación entre la actividad de agua y el % de NaCl a dos
temperaturas (25 y 30ºC). A manera de ejemplo y para ilustrar la relación entre la
temperatura y actividad de agua podemos calcular la aw para una concentración del 10% de
NaCl a 25ºC y 30ºC, en este caso los valores obtenidos a partir de las ecuaciones equivalen
a una aw = 0,930 a 25ºC, mientras a 30ºC esta misma concentración equivale a una aw =
0,935. En términos generales aunque la variación es poca (0,005 unidades) podría resultar
letal en algún momento si existe una combinación de diversos factores que afecten el
crecimiento (temperatura, pH, aw, atmósfera gaseosa, presencia e antimicrobianos, etc.).
A temperaturas inferiores a las del punto de congelación de una solución o alimento, la
presión de vapor del agua líquida disminuye al descender la temperatura y por tanto,
disminuye también la aw. La aw de una solución o alimento congelados es función de la
temperatura presentando un valor de 0,953 a -5ºC; de 0,907 a -10ºC; de 0,864 a -15ºC y de
0,823 a -20ºC (Christian, 1980). Si representamos los datos anteriores en forma gráfica
(Figura 3), podemos apreciar el concepto descrito anteriormente, es decir, con el descenso
Concentración de NaCl para diversos valores de
Aw a 25ºCy = -0,0064x + 1,0043
R2 = 0,9975
0,840
0,860
0,880
0,900
0,920
0,940
0,960
0,980
1,000
1,020
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
NaCl (% p/p)
Aw
Concentración de NaCl para diversos valores de
Aw a 30ºC y = -0,0067x + 1,0015
R2 = 0,996
0,910
0,920
0,930
0,940
0,950
0,960
0,970
0,980
0,990
1,000
1,010
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00
NaCl (% p/p)
Aw
y = – 0,0064x + 1,0043 R2 = 0,9975
Y = - 0,0067x + 1,0015 R2 = 0,996
a b
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de la temperatura por debajo el punto de congelación de un alimento (generalmente situado
en torno a los -1,5ºC a -2,5ºC) disminuye la actividad de agua en forma proporcional así:
𝑎𝑤 = 0,0087 × 𝑇℃ + 0,995 (𝑅2 = 0,999)
Figura 3. Relación entre la temperatura de congelación de un alimento y la actividad de
agua del mismo.
Comportamiento de los microorganismos respecto a la aw
Como sabemos, la mayoría de los microorganismos, incluyendo las bacterias patógenas,
crecen más rápidamente a niveles de aw de 0,995 – 0,980 (la aw de la mayoría de los medios
de cultivo empleados en laboratorio es de 0,999 – 0,990) (ICMSF, 2000). A valores de aw
inferiores a estos, la velocidad de crecimiento y la población estacionaria o la masa celular
final disminuye y la fase de latencia aumenta (Figuras 5, 6 y 7 -Anexos). A una aw
suficientemente baja, la cual es difícil de definir con precisión, la fase de latencia se hace
infinita, es decir, el crecimiento cesa. Por ejemplo, la tasa de crecimiento de S. aureus
desciende en un 10% de su máximo cuando la aw baja a 0,90 (Mescle y Zucca, 1994). A una
aw suficientemente baja, la cual es difícil de definir con precisión, la fase de latencia se hace
infinita, es decir, el crecimiento cesa (ICMSF, 2000).
El crecimiento de la mayoría de las bacterias y hongos ocurre a aw superiores a 0,90. Sin
embargo, entre los microorganismos que tienen una importancia en la conservación de los
alimentos existen muchos que pueden multiplicarse a valores de aw muchos más bajos.
Dichos microorganismos se denominan de forma variada: halófilos, xerófilos y osmófilos. Al
igual que el crecimiento, la aw del medio también afecta a la supervivencia de los
microorganismos. La letalidad se reduce, a temperatura ambiente y bajo refrigeración
(ICMSF, 2000), al descender la aw o al aumentar la concentración de solutos. Esta
protección que proporciona una aw baja puede disminuirse bajo condiciones de acidez
0,80
0,84
0,88
0,92
0,96
-20 -15 -10 -5 0
a w
Temperatura de congelación (°C)
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(ICMSF, 2000). Específicamente hablando de microbiología de alimentos, la supervivencia
de microorganismos es más importante en el contexto del tratamiento térmico. La
supervivencia a altas temperaturas es generalmente menor a altos valores de aw.
Entre las bacterias gram-negativas de mayor importancia están las Pseudomonas spp y las
Enterobacteriaceae, las que habitualmente proliferan sólo a aw superiores a 0,96 y 0,93,
respectivamente. Por otro lado las bacterias gram-positivas no formadoras de esporas son
mucho más tolerantes a las aw reducidas que las gram-negativas. Dentro de este grupo el
patógeno más tolerante es S. aureus el cual puede desarrollarse a aw de 0,86 y 0,83
dependiendo del sustrato. Sin embargo, a aw inferiores de 0,93 no se ha observado la
producción de toxina (ICMSF, 2000). Dentro de los gram-positivos formadores de esporas el
límite normal de aw es de 0,90 – 0,91. A aw de 0,97 – 0,93 no germinan ni crecen las cepas
de B. cereus productoras de ETAs. Por otro lado C. botulinum deja de producir toxina a unos
valores de aw cercanos a los de crecimiento. Estos valores dependen del tipo así: 0,95 para
el tipo A, 0,94 para el B y 0,97 para el E. C. perfringens presenta una aw de crecimiento
próximo a 0,95 (ICMSF, 2000).
Mecanismo de acción de la actividad de agua (aw) sobre el crecimiento/supervivencia
de los microorganismos
Cuando una bacteria es expuesta a un incremento en la presión osmótica del ambiente
(adición de un soluto como la NaCl, el cual disminuye la actividad del agua) trae consigo un
fenómeno de plasmólisis de la célula (Sperber, 1983). Esto disminuye o paraliza el
crecimiento de los microorganismos, a causa de la inhibición de las actividades enzimáticas.
Algunas bacterias responden a este hecho mediante la acumulación de biomoléculas en el
interior celular para prevenir la deshidratación o mantener la presión intracelular (Pocard et
al., 1994; Mazomba y Mabinya, 2010).
Estas biomoléculas usualmente no interfieren con las funciones macromoleculares, y son
denominadas como “solutos compatibles”, debido a que funcionan, a grandes
concentraciones intracelulares, como protectores de la actividad enzimática en vez de actuar
como inhibidores. En síntesis general, los microorganismos responden frente a aw reducidas
acumulando potasio, aminoácidos y polialcoholes.
Algunas moléculas como la glicina betaina, prolina, prolina betaina, trehalosa, colina,
dimetilglicina, dimetilsulfoniopropionato, ectoina, glucosilglicerol y carnitina, han sido
reportadas por Kempf y Bremer (1998) y Prescott et al., (1999) como osmoprotectores en
Escherichia coli, y juegan un papel importante en la ecología bacteriana, especialmente en
ambientes adversos. Estos componentes pueden ser acumulados bien sea directamente
desde el medio exterior o ser sintetizados a partir de compuestos presentes en este medio
(Mazomba y Mabinya, 2010).
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Sperber (1983) y Mezcle y Zucca (1994) describen el mecanismo general de adaptación al
descenso de la aw seguido por aquellas bacterias que son capaces de crecer cuando la aw es
reducida, este mecanismo supone dos fases:
A. Con una aw igual o mayor a 0,995 el desarrollo microbiano tiene lugar en óptimas
condiciones. La aw intracelular de las células es significativamente menor que el del
medio exterior, de tal forma que las células son capaces de mantener la turgencia.
Cuando la aw del medio externo es reducido (shock osmótico: por ejemplo el aw pasa de
0,995 a 0,950), se observa en primer lugar un fenómeno de plasmólisis con una pérdida
rápida de agua. Durante este lapso la célula es incapaz de crecer. Paso seguido, se
evidencia una acumulación citoplasmática de iones potasio (K+) e iones Glutamato. La
acumulación de solutos en el citoplasma permite la recuperación de la turgencia.
B. Cuando se presenta una reducción de la aw menor a 0,950, nuevamente hay pérdida de
agua y el crecimiento se detiene. El descenso de la concentración de agua intracelular
incrementa efectivamente la concentración interna de iones potasio desde la
concentración inicial. El incremento en estos iones, activan la enzima Glutamato
deshidrogenasa, la cual reduce la α-cetoglutarato a Glutamato, que se acumula en el
citoplasma, provocando un nuevo ingreso de agua al interior, tras lo cual se reactiva el
crecimiento aunque a velocidades menores. En general, la mayoría de las bacterias más
comunes han mostrado una acumulación de aminoácidos intracelulares cuando se
enfrentan a stress osmótico (Sperber, 1983). Aquellos que generalmente acumulan
Glutamato por lo general son incapaces de crecer a aw menor a 0.95. El Glutamato,
puede afectar negativamente al pH celular (acidificándolo), por lo que se requiere de la
presencia de cationes (usualmente ión potasio) para contrapesarla. Cuando la
concentración de iones Glutamato es suficiente para reducir la aw intracelular a 0,950, la
concentración de iones potasio se eleva tanto que resulta ser tóxico para algunas de las
funciones celulares y el crecimiento cesa. Algunas especies de bacterias que son
capaces de producir Glutamato son: Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus,
Escherichia coli, Salmonella oranienburg, Clostridium sporogenes, Lactobacillus
plantarum, Serratia marcescens y Klebsiella aerogenes.
Algunos microorganismos pueden adaptarse a un descenso más pronunciado de la aw
bien sea descarboxilando el Glutamato hasta ácido α-aminobutírico (GABA) o bien
reduciendo el Glutamato hasta Prolina, compuestos que se acumulan en el citoplasma
bacterianoLos anteriores aminoácidos son compuestos sin carga, por lo que no se
requiere de la presencia de cationes de contrapeso; por consiguiente, las células que
son capaces de aumentar estos aminoácidos pueden crecer a valores más bajos de aw
que aquéllos que aumentan sólo en Glutamato (Sperber, 1983). Según señala Mescle y
Zucca (1994), estos microorganismos pueden crecer incluso a aw de 0,930 – 0,900 o aún
a valores de aw de 0,860.
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Figura 4. Adaptación intracelular a la reducción de actividad de agua (o = iones potasio;
o = iones Glutamato, □ = ácido α-aminobutírico –GABA– o Prolina)
Microorganismos como Micrococcus lysodeikticus, Sarcina lutea, Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Bacillus cereus Streptococcus faecalis, Klebsiella aerogenes, Serratia
marcescens, Bacillus megaterium, Lactobacillus plantarum, Clostridium sporogenes, Salmonella
oranienburg y Eschericia coli pueden producir un incremento en Prolina, mientras que
Escherichia coli, Clostridium sporogenes y Streptococcus faecalis pueden producir GABA.
Hajmeer et al. (2006), evaluaron el efecto del cloruro de sodio sobre E. coli O157:H7 y S. aureus,
encontrando que E. coli O157:H7 fue menos tolerante a la NaCl que S. aureus en
concentraciones de 5% y 10%. Estos resultados están de acuerdo con los datos teóricos
reportados por Jay (1992) o Stein (2000), dónde los niveles de tolerancia a la sal para E. coli
O157:H7 se sitúa en un 8% cuando está creciendo en los medios de cultivo, mientras que
algunas cepas de S. aureus son capaces de tolerar hasta un 20%. La osmotolerancia de S.
aureus al NaCl se debe a su habilidad de mantener la integralidad estructural de la membrana
exterior. Así mismo, S. aureus puede crecer en ambientes osmóticos altos debido a la
acumulación de productos osmoprotectores tales como la prolina y glicinbetaina en las células
bajo estres osmótico (Neidhardt et al., 1990).
Jablonski y Bohach (1999) observaron que diferentes compuestos aumentan en S. aureus tales
como L-prolina, el betaine del proline, el choline, taurino, y sobre todo betaine de glicina que
refuerza el crecimiento del staphylococcal bajo la tensión osmótica
aw mayor a 0.995 Reducción de aw (0.950) aw menor a 0.950
Ácido α-aminobutírico Incremento de (K+)
α-cetoGlutarato Glutamato Prolina
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Tabla 1. Valores mínimos de actividad de agua para el crecimiento y/o germinación de ciertos patógenos
alimentarios.
Organismo Mínimo
NaCl Glucosa Glicerol
Campylobacter spp. 0.980 --- ---
Clostridium botulinum tipo E (Crecimiento) *0.970 --- *0.940
Clostridium botulinum tipo E (Germinación) *0.930 --- *0.890
Shigella spp. 0.970 --- ---
Yersinia enterocolitica 0.970 --- ---
Vibrio vulnificus 0.960 --- ---
Escherichia coli Enterohemorrágica 0.950 --- ---
Salmonella spp. 0.940 --- ---
Vibrio parahaemolyticus *0.948 *0.984 *0.937
Bacillus cereus (Crecimiento) *0.950 --- *0.930
Bacillus cereus (Germinación) *0.950 --- *<0.85
Clostridium botulinum tipos A y B (Crecimiento) *0.960 --- *0.930
Clostridium botulinum tipos A y B (Germinación) *0.930 --- *0.890
Clostridium perfringens (Crecimiento) *0.970 *0.960 *0.950
Listeria monocytogenes 0.920 --- ---
Staphylococcus aureus (Crecimiento) 0.830 *0.860
--- ---
Staphylococcus aureus (Producción de toxina) 0.880 --- ---
Pseudomonas fluorescens *0.957 --- 0.94*
Fuente: ICMSF, 1996. *Sperber, 1983.
Modelamiento del efecto de la aw sobre el crecimiento
Diversos autores han estudiado el efecto de la aw sobre el crecimiento de varios
microorganismos y estabilidad de los alimentos (Sperber, 1983; Neumeyer et al., 1997a y 1997b;
Carrillo et al., 2007; Grau et al., 2007; Mathlouthi, 2010; Mazomba y Mabinya, 2010). Muchos de
los trabajos solo se tratan de simples curvas de crecimiento a diversos valores de aw, de la cual
se determina la velocidad de crecimiento. Sin embargo, otros autores como McMeekin et al.
(1987) y el mismo Neumeyer et al. (1997) describen un modelo de regresión no lineal tipo
Bĕlehrádek que permite estimar los valores de la velocidad de crecimiento (µ) como una función
dependiente de la actividad de agua. Este modelo es:
𝑟 = 𝑏 × 𝑎𝑤 − 𝑎𝑤𝑚𝑖𝑛
Donde
b = la pendiente de la línea de regresión
aw = actividad de agua
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awmin = aw mínima teórica para crecimiento al cual la velocidad de crecimiento es
predicha como cero.
MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS
Cultivo madre de E. coli, S. aureus u otra bacteria en fase logarítmica (mantenido en
caldo BHI y ajustado a un patrón McFarland 0,5).
Micropipetas de 5-10 ml y 100-1000 µl.
Espectrofotómetro.
Celdas para espectrofotometría.
Incubadora a 35ºC +/- 2ºC
Frascos erlenmeyer con 50 ml de caldo BHI ajustado a concentraciones de NaCl,
Glucosa y Sacarosa: 0,5%; 2%; 4%; 6% y 8%.
REACTIVOS
No aplica
PROCEDIMIENTO
Debido a la concentración de solutos variable y el nivel de color para cada depresor,
medir la absorbancia inicial a 600 nm para cada medio de cultivo (Absorbancia blanco -
Abb).
A partir del cultivo madre inocular 2ml en un frasco erlenmeyer conteniendo 50 ml de
caldo BHI ajustado a las diferentes concentraciones de los depresores de aw.
De esta suspensión determine la absorbancia a 600 nm (Abt0) y reste la Abb para
corregir el valor de la absorbancia.
El resultado de esta Abt0 corregida se confronta con la curva patrón de Ab vs. Ln ufc/ml
obtenida en la práctica 1, para predecir la población inicial. Esta población será la
equivalente al tiempo 0.
Colocar a incubar la suspensión a 35ºC +/- 2ºC y cada hora determine la absorbancia
(Abt1 – Abtn) hasta obtener por lo menos 8 datos de incrementos en este valor. Corregir
los valores de absorbancia y confrontar estos resultados con la curva patrón para
calcular la población a los diferentes intervalos de tiempo.
Realizar la gráfica de crecimiento para cada concentración del depresor y calcular en
cada una de ellas la duración de la fase de latencia, la velocidad de crecimiento
específico y el tiempo de duplicación. Discuta además el comportamiento del crecimiento
a cada una de las diferentes concentraciones de NaCl, Glucosa y Sacarosa.
Tabla 2. Resultados para cada concentración de soluto depresor.
Tiempo (min) 0 60 120 150 180 210 240 270
Ab (600 nm)
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Ln N (ufc/ml)
NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya
que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por
malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto,
todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá
usar los siguientes equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantalón Largo.
BIBLIOGRAFÍA
Carrillo, M.L., Zavala, D., Alvarado, B. (2007). Modelado del efecto de la temperatura,
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ACTIVIDAD 6
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA MUERTE BACTERIANA
6.1 OBJETIVO
Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:
Comprender el efecto integrado temperatura-tiempo sobre la supervivencia microbiana.
Aplicar modelos primarios y secundarios de destrucción térmica para predecir el número
de supervivientes.
Evaluar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de muerte.
6.2 MARCO TEÓRICO
La mayor parte de las bacterias patógenas tienen una tolerancia limitada a las variaciones
extremas en su medio ambiente físico y escasa capacidad para sobrevivir fuera del organismo
vivo. Otras, en cambio, producen esporas que son muy resistentes a las condiciones físicas
deletéreas del medio ambiente y que dotan al microorganismo de un valor incrementado de
supervivencia.
En el vocabulario común se emplea la palabra esterilización como un absoluto que implica la
inactivación total de todas las formas de vida microbiana en términos de la capacidad del
microorganismo para reproducirse. El sufijo cida se agrega cuando se hace alusión a una acción
letal, en tanto que stasis se añade cuando simplemente se trata de inhibir el desarrollo o la
multiplicación del microorganismo.
Teóricamente se ha descrito que la destrucción de una población bacteriana sigue un orden
matemático progresivo, que obedece a un descenso exponencial. Rahn (1929, 1930) atribuyó a
Madsen y Nyman (1907) y Chick (1908) como los primeros en observar la naturaleza
aparentemente exponencial de las curvas de supervivencia, aunque los primeros autores
aportaron pocos datos para poyar su conclusión con respecto a la muerte térmica. Couvert et al.
(2005) también atribuye el modelo cinético de muerte de primer orden a Madsen y Nyman, el
cual fue corroborado por diversos estudios realizados por Chick (1908 y 1910); Esty y Meyer
(1922) y Esty y Williams (1924) con células vegetativas. Estos estudios se basaron en el efecto
de la temperatura sobre las células, pero con el tiempo se fue extendiendo para evaluar el efecto
de diversos factores medioambientales sobre la supervivencia microbiana, por ejemplo, el efecto
del tipo y concentración de antimicrobianos, efecto del pH (tipo y concentración de acidulantes),
efecto de la depresión de la actividad de agua, etc.
6.2.1. Índice de letalidad de los microorganismos: la información referida a la cinética de la
destrucción de una población bacteriana es esencial para comprender las bases de la
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esterilización por agentes letales. Para los microorganismos el único criterio válido de muerte es
la pérdida irreversible de la capacidad de reproducirse. Esto en general está determinado por
técnicas de siembra en placas que cuantifican, por medio de recuento de colonias, el número de
sobrevivientes.
Cuando se expone una población bacteriana a un agente letal, con el tiempo tiene lugar una
reducción progresiva en el número de microorganismos sobrevivientes. La cinética de la
destrucción de una población microbiana suele ser de primer orden y en la mayoría de los casos
de tipo exponencial: el número de sobrevivientes disminuye en función del tiempo y puede
representarse por medio de la ecuación 6.1 que se describe a continuación:
𝑁𝑓 = 𝑁0 × 𝑒−𝑘𝑡 Ecuación 6.1
Si el logaritmo natural del número de supervivientes se representa como una función del tiempo
de exposición se obtiene una línea recta (figura 6.1) cuya pendiente negativa define la velocidad
de destrucción. Sin embargo, el índice germicida solo nos dice que fracción de la población
inicial sobrevive a un periodo determinado de exposición al agente antimicrobiano. Para
determinar el número real de sobrevivientes es necesario conocer el tamaño inicial de la
población. Esta relación se expresa de forma matemática por la ecuación 6.2:
𝑘 =1
𝑡∗ 𝑙𝑛
𝑁0
𝑁𝑓 Ecuación 6.2
Donde k es la velocidad de muerte, N0 el número inicial de microorganismos y Nf el número final
que queda luego de un tiempo t de exposición.
Figura 6.1. Gráfica de la velocidad de muerte bacteriana (Curva de supervivientes).
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Como puede apreciarse en la figura 6.1, la pendiente negativa de la curva obtenida refleja la tasa
de destrucción de la población a ese factor específico; pero dicha tasa es independiente del
número inicial de bacterias y se ve influenciada por un sinnúmero de factores. Esto es común
para todas las bacterias, pero cada una de ellas difiere en su velocidad de destrucción, la cual se
halla reflejada en la pendiente de la gráfica. Esta velocidad será la que determine el grado de
resistencia del microorganismo, por lo tanto ésta será diferente para cada especie bacteriana;
constituyéndose en una importante herramienta para la medida de la resistencia bacteriana. En
el ejemplo mostrado en la figura 6.1, la velocidad de muerte de la población es: 0.08296 log
células/min.
6.2.2 Modelo del valor D
El tiempo necesario para la esterilización es inversamente proporcional a la temperatura de
exposición. Esta relación se puede expresar por el término de tiempo de muerte térmica o valor
D de inactivación térmica (McDonald y Sun, 1999; Joklik et al., 1997; Brennan et al., 1990), que
se refiere al tiempo mínimo necesario para destruir el 90% de una suspensión de
microorganismos a una temperatura predeterminada en un medio ambiente especificado
(Rahman et al., 2004), lo cual equivale a reducir la población en una unidad logarítmica. Por
tanto, el modelo del valor D puede catalogarse como un modelo primario (McDonald y Sun,
1999).
Este valor D, como veremos más adelante es equivalente al valor del inverso de la pendiente de
la curva TDT). La definición de lo que conocemos como tiempo de reducción decimal – DRT
(Modelo del valor D) fue presentado por Katzin et al., en 1943, pero fueron Ball y Olson en 1957
quienes simbolizaron este tiempo como “Valor D”. Debido a los elevados coeficientes de
temperatura implicados en la esterilización por calor, un cambio mínimo en la temperatura altera
y = -0,08296x + 13,82022R² = 0,99999
8,5
9,5
10,5
11,5
12,5
13,5
14,5
0 20 40 60 80
Log
célu
las
Tiempo (min)
No. Supervivientes
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de manera significativa el tiempo de muerte térmica. De acuerdo con la ley de acción de masas,
el tiempo de esterilización se relaciona de forma directa con el número de microorganismos en la
suspensión.
El modelo del valor D puede representarse por la siguiente expresión matemática (Ecuación 6.3):
𝐷 = ∆𝑡
𝐿𝑜𝑔10 𝑁0− 𝐿𝑜𝑔 10𝑁𝑓 Ecuación 6.3
Donde Δt corresponde al lapso de tiempo que ha transcurrido para que la población inicial
(Log10N0) se reduzca hasta una población final (Log10Nf).
Si representamos los datos de supervivientes en coordenadas logarítmicas (Log10 población) en
el eje de las ordenadas y el tiempo en las abscisas, obtendremos una línea recta, tal como se
muestra en la figura 6.2.
Figura 6.2. Representación logarítmica de una población microbiana frente al tiempo.
La pendiente de la línea recta está directamente relacionada con el “tiempo de reducción
decimal” (Singh y Heldman, 1997) o valor D; por tanto, este valor D es equivalente al valor
inverso de la pendiente de la curva TDT (ecuación 6.4).
𝐷 = −1
𝑚 Ecuación 6.4
En el ejemplo mostrado en la figura 6.2, el valor D puede calcularse reemplazando la pendiente
en la ecuación 6.4, obteniendo un valor de 27.75 minutos (D = -1/-0.03603).
y = -0,03603x + 6,00205R² = 0,99999
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
6,50
0 20 40 60 80
Log 1
0cé
lula
s
Tiempo (min)
Log10 Supervivientes
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Debido a que cada ensayo para evaluar o determinar un valor D, se hace a una temperatura
constante; ésta temperatura debe indicarse como un subíndice en la letra, así por ejemplo, el
valor D215ºF, indica el tiempo de reducción decimal de una población a una temperatura
correspondiente a 215ºF.
Existe una relación inversa entre la velocidad de muerte y el tiempo de reducción decimal (D), la
cual es mostrada en la ecuación 6.5.
𝑘 = 2.303
𝐷 Ecuación 6.5
A partir de los resultados obtenidos de la figura 6.2 podemos calcular la velocidad de muerte,
reemplazando el valor D en la ecuación 6.5. Así obtenemos una velocidad de 0.08297/min, la
cual es idéntica al valor de la pendiente obtenida en la figura 6.1.
6.2.3 Modelo del valor Z
La constante de resistencia térmica o valor Z, es un factor que describe la resistencia térmica de
una población. Se define como el aumento de temperatura necesario para causar una
disminución del 90% en el tiempo de reducción decimal D (Rahman et al., 2004). Si
representamos los valores D obtenidos a diferentes temperaturas en coordenadas logarítmicas,
el valor Z representa el aumento de temperatura necesario para cambiar un orden logarítmico el
valor de D, tal como se muestra en la figura 6.3.
Figura 6.3. Representación logarítmica del tiempo de reducción decimal frente a la temperatura.
En base a la definición anterior, z puede expresarse mediante la siguiente ecuación (6.6):
y = -0,09177x + 10,97885R² = 0,99969
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
100 105 110 115 120
Log 1
0D
(m
in)
Temperatura (⁰C)
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𝑍 = 𝑇2−𝑇1
𝐿𝑜𝑔 𝐷𝑇1− 𝐿𝑜𝑔 𝐷𝑇2 Ecuación 6.6
Donde T2 y T1 corresponde a la Temperatura más alta y más baja, respectivamente, mientras
que el LogDT2 y LogDT1 corresponde a los valores D para T1 y T2, respectivamente.
Al igual que el modelo del Valor D, el valor Z puede obtenerse a partir de la gráfica logarítmica
del tiempo de reducción decimal frente a la temperatura (figura 6.3). Como puede verse en esta
gráfica, se obtiene una línea recta y por medio del inverso de la pendiente puede hallarse el valor
Z (ecuación 6.7).
𝑍 = −1
𝑚 Ecuación 6.7
Como hemos visto, el modelo del valor Z evalúa el efecto de la temperatura sobre la resistencia
térmica microbiana, por tanto, desde la clasificación propuesta por Whiting y Buchanan (1993), el
modelo del valor Z puede catalogarse como un modelo secundario (McDonald y Sun, 1999).
6.2.4 Modelo de Arrhenius
La ecuación de Arrhenius es una expresión matemática que se utiliza para demostrar la
dependencia de la constante de velocidad (k) de una reacción con la temperatura a la que se
lleva a cabo esa reacción, de acuerdo con la expresión 6.8, esta expresión fue inicialmente
propuesta por Svante Arrhenius en 1889. Salvo contadas excepciones, la velocidad de una
reacción aumenta, a menudo con el aumento de la temperatura (Man, 2004).
𝑘 = 𝐴 × 𝑒 −
𝐸𝑎𝑅𝑇
Ecuación 6.8
Donde k es la velocidad de reacción o constante cinética, A es un factor pre-exponencial o factor
de frecuencia, Ea es la energía de activación de la reacción (KJ/mol), R la constante universal de
los gases (8,3143 J·K-1·mol-1 o 0,001987 Kcal·K-1·mol-1) y T la temperatura absoluta (K). Esta
ecuación es considerada como una primera aproximación adecuada para el estudio del efecto de
la temperatura sobre la cinética de reacción.
En la ecuación 6.8 puede verse que a temperatura constante cuanto mayor es la Ea, más
pequeña será la constante de velocidad y por lo tanto más lenta será la velocidad de reacción.
Por el contrario, velocidades de reacción rápida tendrán una Ea pequeña. Esta ecuación también
ha sido utilizada para evaluar el efecto o dependencia de la velocidad específica de crecimiento
o muerte (µ) de una población a una temperatura específica. Por tanto, es posible sustituir en la
expresión 6.8 la constante de velocidad (k) por la velocidad específica µ (ecuación 6.9).
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𝜇 = 𝐴 × 𝑒 −
𝐸𝑎𝑅𝑇
Ecuación 6.9
De la anterior expresión puede concluirse que, cuanto menor sea la temperatura de crecimiento
(T), mayor energía (Ea) requiere el microorganismo para su desarrollo y por tanto, su velocidad
de crecimiento será menor (µ). Un caso similar lo veremos cuando la temperatura sobrepasa la
máxima de crecimiento, a medida que aumenta la temperatura de exposición, menor energía se
requiere para causar un daño letal en la célula y por tanto la velocidad de muerte aumenta.
Para que la expresión 6.9 pueda ser usada como un modelo de regresión lineal entre las
variables µ y T-1, esta ecuación puede ser reescrita como se muestra en la expresión 6.10a y
6.10b:
ln 𝜇 = 𝑙𝑛 𝐴 −𝐸𝑎
𝑅𝑇 Ecuación 6.10a
log10 𝜇 = 𝑙𝑜𝑔10 𝐴 −𝐸𝑎
2.303×𝑅𝑇 Ecuación 6.10b
En teoría, si representamos lnµ con el recíproco de la temperatura absoluta se debería obtener
una línea recta, siendo su inclinación la energía de activación dividida por la constante universal
de los gases (Ea/R). Las gráficas de k con 1/T se llaman gráficas de Arrhenius. Muchas
reacciones cumplen con el modelo de Arrhenius, es decir sus gráficas son una línea recta. Por
tanto, estudiando la reacción y midiendo k a dos o tres temperaturas diferentes, se puede
extrapolar lo que pasará a una temperatura inferior y predecir la velocidad a esa temperatura
(Man, 2004).
De igual forma que el modelo del valor Z, el modelo de Arrhenius puede clasificarse como un
modelo secundario en la clasificación propuesta por Whiting y Buchanan (1993) (McDonald y
Sun, 1999), ya que evalúa la dependencia de la velocidad de reacción en función de la
temperatura.
6.2.5 Relación entre el modelo de Arrhenius y el modelo del Valor Z
Sin embargo, la representación que se utiliza con mayor frecuencia entre los industriales es una
representación del valor D basado en el modelo de Arrhenius, el cual se trata de un modelo
usado inicialmente en cinética química para describir la influencia de la temperatura en la
constante de velocidad de reacción enzimática (Singh y Heldman, 1997); sin embargo, este
modelo se ha empleado en aquellos casos donde se quiera evaluar la influencia de la
temperatura sobre la velocidad de reacción, en este caso se relaciona el logaritmo neperiano de
D en función de la inversa de la temperatura absoluta (en grados Kelvin –K–). En esta gráfica la
exactitud es tan buena o mejor que la de la ecuación del valor z descrita anteriormente, con la
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ventaja de que en la recta de Arrhenius uno puede hacer ligeras extrapolaciones y en la de la
ecuación del valor z el hacerlo resultaría en una imprudencia (Cerf et al., 1988). La pendiente en
la recta de Arrhenius es igual a Ea/R; Ea es la energía de activación (expresada en J/mol) y R la
constante de los gases ideales (8,314 J/molºK). Existe una relación sencilla entre Ea y z:
𝑧 = 19,15 ×𝑇𝐴
2
𝐸𝑎 (5.9)
La ecuación anterior puede utilizarse usando un valor de T que corresponda a la temperatura
absoluta media experimental.
6.2.6 Mecanismo de la lesión térmica: la inactivación de las bacterias por calor no puede ser
definida en términos bioquímicos simples. Aunque el efecto letal del calor húmedo por encima de
una temperatura determinada en general se atribuye a la desnaturalización y coagulación de las
proteínas, el patrón del daño térmico es bastante complejo y la coagulación sin duda enmascara
otros cambios más sutiles inducidos en la célula antes de que se evidencie la coagulación. La
producción de rupturas en una hebra de DNA puede ser el primer episodio letal. La pérdida de
viabilidad de las células expuestas a una temperatura suave se puede correlacionar con la
introducción de estas rupturas. El daño al DNA parece ser de naturaleza enzimática y es una
consecuencia de la inactivación de las nucleasas. La capacidad de la célula para reparar este
daño y para recuperar la viabilidad depende del estado fisiológico del microorganismo y de su
conformación genética.
El calor también ocasiona una pérdida de la integridad funcional de la membrana y la filtración de
pequeñas moléculas y de material absorbente a 260 nm. Este material es de origen ribosómico y
aparentemente proviene de la degradación de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el
tratamiento térmico. Parece existir una correlación entre la degradación del RNA ribosómico y la
pérdida de viabilidad de las células expuestas a temperaturas elevadas. El mecanismo por el
cual los microorganismos resultan destruidos por el calor seco es diferente al del calor húmedo.
Los efectos letales del calor seco, o la desecación en general, habitualmente se atribuyen a la
desnaturalización proteica, al daño por oxidación y a los efectos tóxicos de elevadas
concentraciones de electrolitos. En ausencia de agua el número de grupos polares sobre las
cadenas peptídicas disminuye y se requiere más energía para abrir las moléculas; de ahí el
aumento aparente de la estabilidad del microorganismo.
6.3 MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS
30 tubos con 9 ml de agua peptonada estéril 0.1%.
2 fiolas con 99 mL de caldo BHI
1120 mL de agar BHI fundido y mantenido a una temperatura de 55ºC.
Cepas de bacterias mantenidas a 35ºC en caldo BHI (en fase exponencial).
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56 cajas de petri estériles.
40 pipetas estériles de 1 mL.
2 pipetas de 5 mL estéril.
2 Baños serológicos ajustados a diferentes temperaturas.
Patrón de McFarland No 0,5.
6.4 REACTIVOS
No requiere.
6.5 PROCEDIMIENTO (Se seguirá la metodología propuesta por Byrne et al., 2006).
A partir de la cepa mantenida en caldo BHI se prepara una solución patrón 0,5 de
McFarland.
A partir del patrón se toma una alicuota de 11 ml que se suspende y homogeniza en 99 ml
de solución diluyente para disminuir 10 veces la concentración y preparar una suspensión
de una población teórica aproximada de 1,5x107 bact/mL.
Se pasa 1 mL exacto de la suspensión, previamente homogenizada, a cada uno de los 6
tubos con 9 ml de agua peptona estéril. De ésta manera reducimos 10 veces la anterior
población, es decir que supuestamente cada tubo tendrá una concentración de 1,5x106
bact/mL. Cada tubo se rotula con 9, 18, 27, 36, 45 y 54 minutos.
Se toma el tubo rotulado para 9 minutos, y se le realiza un recuento inicial para verificar la
concentración de las suspensiones. El recuento se hace de la dilución 103, por duplicado en
agar BHI.
En un baño serológico, mantenido a una temperatura constante, indicada por el profesor
para cada microorganismo, se introducen los 6 tubos, manteniendo la temperatura
constante. Transcurridos los primeros 9 minutos, se toma el respectivo tubo, con la debida
asepsia, y se le realiza el correspondiente recuento de la siguiente manera: se lleva hasta la
dilución 10-1, tomándose 1 y 0,1 mL para inocular en las placas de Petri estériles, cubriendo
con agar BHI fundido.
El procedimiento anterior se repite para cada tubo cuando se cumpla el tiempo respectivo de
exposición a la temperatura indicada.
Se incuban las placas durante 24 – 48 horas a 37ºC, según el microorganismo a ensayar. Se
hace la lectura correspondiente y se construye la gráfica para especificar el valor D del
mismo.
6.6 NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya
que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por
malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto,
todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá
usar los siguientes equipamientos:
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Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantalón Largo.
6.7 BIBLIOGRAFÍA
Brennan, J.G., Butters, J.R., Cowell, N.D. (1990). Heat processing 2. In: Food Engineering
Operations, Elsevier, UK. Pages 297 – 302.
Byrne, B., Dunne, G., Bolton, D.J. (2006). Thermal inactivation of Bacillus cereus and
Clostridium perfringens vegetative cells and spores in pork luncheon roll. Food Microbiol.,
23: 803 – 808.
McDonald, K., Sun, D-W. (1999). Predictive food microbiology for the meat industry: a
review. Int. J. Food Microbiol., 52: 1 – 27.
Whiting, R.C., Buchanan, R.L. (1993). A classification of models for predictive
microbiology. Food Microbiol., 10: 175 – 177.
Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los
alimentos, la temperatura. En: Microbiología alimentaria, volumen 1. Aspectos
microbiológicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza,
España. Págs. 7 – 50.
Man, D. (2004). El Modelo de Arrhenius: Apéndice A. En: Caducidad de los Alimentos.
Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. Págs. 91 – 92.
ICMSF. (2000). Temperatura, Capítulo 1. En: Ecología microbiana de los alimentos 1.
Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial
Acribia, S.A. Zaragoza, España. Págs. 1 – 38.
Singh, R.P., Heldman, D.R. (1997). Capítulo 5: Procesado térmico. En: Introducción a la
Ingeniería de los alimentos. 1ª edición. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. Págs.245
– 265.
Rahman, M.S., Guizani, N., Al-Ruzeiki, M.H. (2004). D- and Z-values of microflora in tuna
mince during moist- and dry-heating. Lebensm.-Wiss. U.-Technol., 37: 93 – 98.
Katzin, L.I., Sandholzer, L.A., Strong, M.E. (1943). Application of the decimal reduction
time principle to a study of the resistance of coliform bacteria to pasteurization. J bacterial.,
45(3): 265 – 272.
Brailsford Robertson, T. (1914). On the conditions under which discontinuous events may
be employed as a measure of continuous processes, with especial reference to the killing
of bacteria by disinfectants. Journal of Hygiene, 14: 143 – 148.
Couvert, O., Gaillard, S., Savy, N., Mafart, P., Leguérinel, I. (2005). Survival curves of
heated bacterial spores: effect of environmental factors on Weibull parameters. Int. J Food
Microbiol., 101: 73 – 81.
Rahn, O. (1929). The size of bacteria as the cause of the logarithmic order of death. J.
Gen. Physiol., 13: 179 – 205.
Rahn, O. (1930). The non-logarithmic order of death of some bacteria. J. Gen. Physiol., 13:
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Madsen, T., Nyman, M. (1907). Zur theorie der desinfection. I. Z. Hyg., 57: 388 – 404.
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Chick, H. (1910). The process of disinfection by chemical agencies and hot wáter. J. Hyg.,
10: 237 – 286.
6.8. ANEXOS
Tabla 6.1. Relación de temperatura y tiempo para determinación del valor D y z en cultivos
asporógenos.
Temperatura
(ºC) Tiempo (minutos)
50 0 10 20 30 40
55 0 8 ½ 17 25 ½ 34
60 0 7 14 21 28
65 0 6 12 18 24
70 0 5 10 15 20
75 0 4 8 12 16
80 0 3 6 9 12
85 0 2 ½ 5 7 ½ 10
Tabla 6.2. Tiempos mínimos requeridos para la esterilización por calor húmedo y calor seco a
diferentes temperaturas.
Temperatura
(ºC)
Calor húmedo Calor seco
Tiempo (min) Presión (lb) Tiempo (min)
121 15 15 -
126 10 20 -
134 3 30 -
140 - - 180
150 - - 150
160 - - 120
170 - - 60
Fuente: Joklik et al., 1997.
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Figura 6.4. Diagrama de flujo del proceso
54 ml
TRATAMIENTO TÉRMICO
DILUCIONES Y SIEMBRA
10-1
10-2
10-3
10-4
6 ml
1 ml
10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 5 ml
Cepa
S. aureus Cultivo de
trabajo
1 ml
1 ml 1 ml
1 ml
1 ml 1 ml
1 ml 1 ml
1 ml 1 ml
1 ml 1 ml
1 ml
Control
Temperatura
T0 T1 T2 T3 T4 CºT
1 ml 1 ml
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Ejemplo de la determinación del valor z empleando el modelo tradicional y el modelo basado en
la cinética de Arrhenius.
Tabla 6.3. Valores D de S. senftenberg 774W y S. typhimurium en chocolate lacteado.
Temperatura (ºC)
Valores D (min)* Valor D medio (min)
S. senftenberg 774W
S. typhimurium S. senftenberg
774W S. typhimurium
70
360 720
440 ± 69,3 816 ± 203,7 480 678
480 1050
80
144 222
116 ± 24,9 222 ± 0,0 96 222
108 222
90
36 78
36 ± 6,0 75 ± 4,24 30 72
42 ---
* Datos de Olson y Nottingham (1980).
Figura 6.4. Representación del Log10D vs. T para S. senftenberg 774W y S. typhimurium
obtenidos en chocolate lacteado.
y = -0,0544x + 6,4367R² = 0,9986
y = -0,0518x + 6,5242R² = 0,9973
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
60 70 80 90 100
Log 1
0D
Temperatura (°C)
S. senftenberg 774W
S. typhimurium
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Figura 6.5. Representación del LnD vs. 1/TA para S. senftenberg 774W y S. typhimurium
obtenidos en chocolate lacteado.
Como puede verse en las figuras anteriores, cuando se grafica el Log10D vs T, se obtienen
líneas rectas con una bondad de ajuste de 0,9986 y 0,9973 para S. senftenberg 774W y S.
typhimurium, respectivamente; mientras que si usamos el modelo modificado de Arrhenius, los
coeficientes de correlación son mejores con valores de 0,9995 y 0,9987, respectivamente. Los
valores de z obtenidos por los dos modelos son similares tal y como puede verse en la tabla
siguiente, sin embargo, ya hemos visto que la bondad de ajuste de la gráfica es mayor para el
modelo modificado de Arrhenius.
Tabla 6.4. Valores z para S. senftenberg 774W y S. typhimurium en chocolate lacteado
Modelo de z Valores z (°C)
S. senftenberg 774W S. typhimurium
Modelo tradicional 18,382 19,305
Modelo de Arrhenius 18,266 19,152
y = 15589x - 39,378R² = 0,9995
y = 14868x - 36,668R² = 0,99873,00000
4,00000
5,00000
6,00000
7,00000
0,002700 0,002800 0,002900 0,003000
Ln D
1/Temperatura (°K)
S. senftenberg 774W
S. typhimurium
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ACTIVIDAD 7
EFECTO CONJUGADO DE LA TEMPERATURA, ACTIVIDAD DE AGUA (% NaCl), pH Y
COMPOSICIÓN DEL MEDIO SOBRE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO FÚNGICA
OBJETIVOS
Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:
Diseñar diversas metodologías para cuantificar el crecimiento miceliar fúngico
Desarrollar protocolos para cuantificar la cinética conidial
Evaluar el/los efecto(s) individual o conjugado de diversos factores sobre el crecimiento
de hongos.
MARCO TEORICO
Todos los organismos tienen un potencial de incrementar su masa por división celular,
alargamiento celular, o ambos. De esta forma, el incremento de la masa se constituye en
una medida de su crecimiento. Muchos micólogos y científicos tienen un número diverso de
razones prácticas para estudiar lo concerniente al crecimiento fúngico. Primero, los hongos
son extremadamente importantes en los hábitats naturales donde ellos crecen como
saprófitos o simbióticos. Las actividades saprofíticas y el crecimiento fúngico están envueltas
en los ciclos nutritivos dentro del suelo, mientras que en la vida simbiótica hacen parte de
otros organismos. El conocimiento de cómo los hongos crecen y de los factores que afectan
su crecimiento es importante para entender la ecología fúngica. Segundo, el crecimiento de
los hongos también puede ser controlado. Muchos hongos causan alteraciones o pérdidas
grandes de alimentos y materiales de importancia para los humanos. El crecimiento
parasítico a expensas de su hospedador puede resultar en una enfermedad o muerte de su
hospedador. Naturalmente, los fitopatólogos, veterinarios, y demás profesionales
relacionados son conscientes de controlar el crecimiento de estos hongos, mientras que por
otras razones individuales existe una necesidad directa de permitir su crecimiento.
Si bien se han desarrollado una multitud de trabajos evaluando el papel de los hongos
(mohos y levaduras) como agentes deteriorantes, estos se han enfocado principalmente al
efecto de diversas tecnologías de conservación (química, física, biológica) sobre la
supervivencia de los mismos en alimentos, materiales de construcción, etc., o a describir
simplemente una curva normal de supervivencia cuando son expuestos a diversos factores
medioambientales de forma individual; pero son relativamente pocas las publicaciones sobre
investigaciones hechas a partir del modelamiento predictivo del efecto conjunto de la
temperatura, aw y pH en el crecimiento/supervivencia de mohos.
Lo anterior puede explicarse debido al hecho de que la medida del crecimiento fúngico no es
fácil de cuantificar, ya que a diferencia de las bacterias y levaduras, los hongos no crecen
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como células individuales, sino como filamentos hifales que no pueden ser cuantificados por
las habituales técnicas de enumeración. Además, las hifas fúngicas pueden penetrar en los
sustratos sólidos haciendo difícil su extracción. Así mismo, la capacidad de los hongos para
producir esporas, resulta en un gran aumento en el número de células viables (ufc/ gr o ml)
que a menudo tienen poca relación con la biomasa (Pitt, 1984; Taniwaki et al., 2006).
Tradicionalmente el crecimiento y caracterización ecofisiológica de los hongos
contaminantes de alimentos ha sido determinado usando un alto nivel de inóculo en forma
de suspensión de esporas o discos circulares cortados de los márgenes de un cultivo fúngico
(Samapundo et al., 2007).
Crecimiento de los hongos
Es importante tener en cuenta que en el crecimiento en los mohos se da de forma micelial, sólo
el borde de la colonia (las puntas de las hifas) crece. La parte central de una colonia micelial está
formada por células viejas mientras que el borde de la colonia está formado por células jóvenes.
Las células jóvenes se encuentran en trofofase (fase de alimentación y crecimiento), mientras
que las células viejas se encuentran en idiofase (fase de diferenciación). Cuando observamos
una colonia micelial (por ejemplo una colonia de moho sobre una naranja), el crecimiento de la
colonia se produce sólo por el borde de la parte mohosa y en la parte central de la colonia se
produce la diferenciación que dará lugar a la formación de las esporas y a la aparición del color
verdoso característico. Las células jóvenes desarrollan la mayoría de la actividad metabólica del
hongo, liberando enzimas al medio y absorbiendo los nutrientes. La zona central, por otra parte,
tiene células en las que se acumulan las substancias de reserva que pueden ser necesarias para
que el micelio colonice nuevas zonas pobres en nutrientes (por ejemplo, cuando el moho de una
fruta comienza a extenderse por la fuente de plástico en la que se encuentra) o cuando el hongo
se diferencia (por ejemplo, cuando produce esporas o cuerpos fructíferos) (Aristegui, B., 2002).
Por otra parte, para la medición del crecimiento fúngico se han desarrollado varios métodos, a
pesar que solo hasta hace algunos años se ha comenzado a comprender bien sus principios y
aplicaciones. El método más frecuentemente usado ha sido el del recuento de células viables o
unidades formadoras de colonias (ufc/ g o ml), una técnica derivada del recuento de bacterias en
alimentos. Sin embargo, este método sufre graves inconvenientes, ya que el conteo de esporas
suele reflejar solo números en lugar de la biomasa (Pitt, 1984); cuando el crecimiento de los
hongos consiste fundamentalmente en el crecimiento de hifas, es decir, en jóvenes individuos en
el interior de las colonias, por tanto, el recuento de este tipo dará unos resultados bajos al inicio,
pero cuando se produce la esporulación, el conteo a menudo aumenta rápidamente sin que se
observe un aumento de la biomasa. En consecuencia, se considera que el recuento de células
viables es un pobre indicador del grado de crecimiento de los hongos y parece que se
correlacionan mal con otras medidas tales como ergosterol (Taniwaki et al., 2006).
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Un segundo método comúnmente utilizado es la medición del diámetro de la colonia. Cuando se
mide el tiempo durante varios intervalos, el diámetro de la colonia puede traducirse en tasas de
crecimiento, que son con frecuencia muy lineal a lo largo de grandes períodos de tiempo
(Taniwaki et al., 2006) y han sido ampliamente utilizados en estudios de actividad de agua. Sin
embargo, el diámetro de la colonia como una medida de la biomasa de los hongos no tiene en
cuenta la densidad de la colonia.
Factores que afectan el crecimiento de los hongos
El desarrollo de los hongos, se afecta profundamente por el medio ambiente. Las variaciones en
el ambiente externo no solo influye en el grado de crecimiento sino que en la mayoría de los
casos pueden dar lugar a diferencias en el tipo del mismo, por esta razón se describe a
continuación algunos de estos factores:
Necesidades nutricionales: Los hongos son considerados generalmente como
quimioheterótrofos estrictos. Son incapaces de fotosintetizar y por consiguiente necesitan
substratos ricos en energía para alcanzar sus requerimientos de energía y biomasa. Los
hongos producen una amplia variedad de enzimas extracelulares, principalmente oxidasas e
hidrolasas y pueden utilizar la mayor parte de los sustratos orgánicos que existen
naturalmente, incluyendo la celulosa, la quitina, el almidón, azucares, hemicelulosas y
lignina. Normalmente los carbohidratos son las principales fuentes de carbono accesibles a
los hongos; son metabolizados para proporcionar energía y también actúan como
precursores para síntesis del material celular. Otras fuentes de carbono utilizadas incluyen
alcoholes, hidrocarburos, glicerol y almidón. Los hongos utilizan nitrógeno,
fundamentalmente en la forma de amonio, aunque casi todos pueden utilizar nitrato.los
hongos generalmente crecen en el laboratorio sobre medio definido que contiene azucares,
como glucosa y sacarosa, o sobre polímeros como celulosa. Actualmente los investigadores
utilizan también medios complejos no definidos sobre los que crecen los hongos, incluyendo
el medio Agar Papa dextrosa y medios basados en vegetales. Otros nutrientes minerales
requeridos y de gran importancia para un máximo rendimiento de los hongos incluyen
fosforo, azufre, potasio y magnesio (Wainwright, M. 1995).
Respiración: Todos los hongos necesitan de oxigeno para su crecimiento, pero pueden
crecer en ambientes bajos en tenciones de oxígeno, por ejemplo cuando crecen sumergidos
en medio liquido pueden llegar a producir estructuras atípicas, a veces semejantes a
levaduras, otras veces viscosas pero de igual manera el crecimiento es lento y depende del
oxigeno disuelto en el liquido. Las esporas de muchos hongos filamentosos germinan
cuando se sumergen en un medio líquido, pero crecen con excesiva lentitud hasta que
algunas hifas alcanzan la superficie, desarrollándose después rápidamente y de forma típica
hasta cubrir la superficie. Uno de los efectos más comunes cuando se limita la aireación es
la supresión del color normal, tanto del micelio como de los conidios. Si bien los hongos no
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pueden aprovechar el CO2 para la fotosíntesis y normalmente libera el gas, se ha
demostrado que por lo menos algunos reabsorben parte del CO2 producido en la respiración
y lo utilizan para formar compuestos de 4 o más átomos de carbono. Actualmente se sabe
muy poco sobre el mecanismo de la respiración en los hongos filamentosos (Smith, G.,
1963)
Influencia de la luz: No es posible generalizar en cuanto a la influencia de la luz sobre el
desarrollo de los hongos, pues existen muchas especies comunes que parecen
desarrollarse lo mismo en la luz que en la oscuridad, otras se afectan de diversas maneras
por la acción de aquella. Como por ejemplo muchas Mucoráceas parecen ser
completamente indiferentes a la acción de la iluminación moderada; en cambio, algunas
cepas de Rhizopus nigricans crecen especialmente mejor en la luz difusa que en la
oscuridad. Algunos hongos son fototrópicos, es decir crecen en presencia de la luz,
dirigiendo sus órganos reproductores hacia esta. En muchos mohos el efecto de la luz
consiste en estimular la producción de esporas u órganos reproductores, por lo que las
breves exposiciones a la luz solar constituyen un método útil para inducir la esporulación en
cultivos que habían llegado estériles. Otro efecto de la luz moderada es la producción de
pigmentos miceliales (Smith, G., 1963)
Influencia de la temperatura: Los hongos muestran grandes diferencias en su reacción a
los cambios de temperatura y en su resistencia al calor y frio. Se ha visto que cada especie
se desarrolla mejor a una cierta temperatura, denominada temperatura optima. En general
las especies de Penicillium son más comunes en países templados y su temperatura óptima
se encuentra entre 20°C y 25°C, por otro lado, las especies del género Aspergillus se
desarrollan mejor alrededor de los 30°C siendo comunes en regiones cálidas. Se trata de
una generalización muy amplia y con muchas excepciones, pero con frecuencia valiosa en
trabajos industriales, donde el 90% de los hongos aislados crecen a temperaturas alrededor
de 25 – 30°C.
Influencia de la aw: El agua es el solvente en donde ocurren las reacciones químicas y
enzimáticas de la célula y es indispensable para el desarrollo de los microorganismos.
Variaciones en la actividad de agua puede afectar la tasa de crecimiento, la composición
celular y la actividad metabólica del hongo debido a que si no disponen de suficiente
cantidad de agua libre en el medio necesitaran realizar más trabajo para obtenerla y
disminuirá el rendimiento del crecimiento. Cuando un microorganismo se encuentra en un
substrato con una actividad de agua menor que la que necesita, su crecimiento se detiene.
Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino
que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo.
En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prácticamente
ilimitada. La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de
agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mínimos de actividad para
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diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los siguientes: bacterias aw
>0.90, levaduras aw >0.85, hongos filamentosos aw >0.80. Como puede verse, los hongos
filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor
(más secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razón se
puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o
almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias.
Influencia del pH: Un cambio drástico en el pH produce una drástica reducción de la
supervivencia de los microorganismos. La mayoría de los microorganismos crecen a pH
entre 5 y 8, en general los mohos y las levaduras son capaces de crecer a pH más bajos
que las bacterias. Puesto que la acidificación del interior celular conduce a la pérdida del
transporte de nutrientes, los microorganismos no pueden generar más energía de
mantenimiento y, a una velocidad variable según las especies, se produce la muerte celular.
(Pereira, G., et al 2007)
MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS
Cepas de hongos filamentosos obtenidas de la colección de cultivos microbianos del Cepario
de la Universidad de Pamplona. Las cepas son mantenidas en Agar Patata Dextrosa
(PDA) e incubadas a 27 ± 0,5ºC por un máximo de 5-7 días hasta obtener un crecimiento
miceliar y formación abundante de conidias.
Calibrador Vernier o Nonio ± 0,1 mm.
Incubadoras a 25ºC, 30ºC y 35ºC.
2 tubos con 10 ml de agua destilada estéril + Tween 80.
Perforadora de agar de mm de diámetro.
Micropipeta de 100 – 1000 µl.
Micropipeta de 1- 20 µl.
Cajas de Petri de 4 divisiones de 100 x 20 mm o en su defecto cajas de petri corrientes de
100 x 20 mm.
REACTIVOS Y MEDIOS
27 cajas de petri con 20 ml de Agar PDA
27 cajas de petri con 20 ml Agar Sabouraud
27 cajas de petri con 20 ml de Agar Malta
27 cajas de petri con 20 ml de Agar OGY
27 cajas de petri con 20 ml de Agar Rosa de Bengala
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PROCEDIMIENTO
Para el desarrollo de esta práctica se empleara un diseño factorial 4X3X3X3X2 para evaluar
el efecto del medio de cultivo (4), temperatura (3), actividad de agua (3), pH (3) y por
duplicado (2) sobre el crecimiento radial.
La actividad de agua de los cuatro medios de cultivo se modificarán empleando como soluto
depresor el cloruro de sodio (NaCl) en concentraciones de 0,5%, 5% y 10% en cada medio
de cultivo, para obtener una actividad de agua teórica* de 0,995; 0,971 y 0,938,
respectivamente. Las cajas inoculadas serán incubadas a 25ºC, 30ºC y 35ºC.
Para la siembra de los diversos mohos se empleará la técnica de punción central descrita
por Samson et al., 1999 y Graϋ et al., 2007:
Tomar una caja de petri estéril y trazar por la parte inferior de la base dos líneas
perpendiculares que pasen por el centro de tal forma que dividan la caja en 4
cuadrantes.
Inocular la cepa en el centro de la caja con ayuda de un asa de punción.
Incubar de forma invertida las cajas a cada una de las temperaturas, y hacer lectura del
crecimiento radial en cada cuadrante con ayuda de un calibrador Vernier cada día,
durante 15 días o hasta que el crecimiento alcance el borde de la caja.
Obtener el valor medio de crecimiento fúngico (expresado en mm) para cada tiempo
(expresado en horas):
𝑟 = 𝑟4
1
𝑛𝑟
Donde 𝑟 es el radio medio, 𝑟41 es la sumatoria del valor de los radios medidos y
𝑛𝑟 es el número de radios contados.
1
2
3
4
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Tabla 7.1. Crecimiento radial fúngico expresado en mm, para una temperatura de 25ºC y
0% NaCl en agar PDA.
Tiempo
(horas) radio 1 radio 2 radio 3 radio 4 radio medio
Desviación
estándar
0
48
96
144
192
240
288
336
360
Repetir el cuadro anterior para cada temperatura, medio, porcentaje de NaCl y pH.
Graficar los datos para calcular la velocidad radial de crecimiento fúngico (mm/horas),
según la figura mostrada de ejemplo.
Graficar las velocidades radiales de crecimiento fúngico como una función de cada
combinación empleando gráficos de respuesta superficial (Excel, SPSS, Statistica, etc.)
Tomada de Graü et al., 2007.
NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya
que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por
malas prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto,
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todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá
usar los siguientes equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantalón Largo.
BIBLIOGRAFÍA
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ACTIVIDAD 8 y 9
CONOCIMIENTO Y MANEJO DE LA BASE DE DATOS COMBASE, PATHOGEN MODELING
PROGRAM (PMP), SEAFOOD SPOILAGE AND SAFETY PREDICTOR (SSSP), MICROFIT
OBJETIVO
Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:
Conocer los diversos software de modelamiento microbiano como instrumento
fundamental de la simulación bacteriana.
Aplicar las distintas bases de datos como una herramienta práctica para el estudio del
comportamiento de una población bacteriana.
Utilizar los software específicos para cada caso particular.
Utilizar el software DMFit y MicroFit para la estimación de diversos parámetros cinéticos
(crecimiento/muerte) en el estudio de poblaciones bacterianas.
MARCO TEÓRICO
El desarrollo de los diversos modelos de predicción empleados en microbiología descansa
sobre unas bases matemáticas preestablecidas con anterioridad. Los diferentes softwares de
modelamiento han empezado a popularizarse a partir de los años 90.
En el presente documento se describe en forma general el aplicativo ComBase y sus
componentes principales: ComBase Predictor, Perfringens Predictor y el DMFit web edition.
MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS (por estudiante)
Ordenador con conexión a internet (fundamental para el normal desarrollo de la práctica)
REACTIVOS
No aplica
PROCEDIMIENTO
Esta práctica se desarrollará en tres sesiones. A través de una serie de ventanas y ejemplos
prácticos se explicará paso a paso la metodología a seguir para el manejo de cada software.
NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo bajo, ya que no se
manejaran. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el
desarrollo de la misma deberá usar los siguientes equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo.
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ANEXOS
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I. NORMAS DE SEGURIDAD
La bioseguridad comprende el conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud
del personal frente a riesgos por agentes, biológicos, químicos y/o físicos en las áreas de
trabajo del laboratorio, así corro medidas de seguridad aplicables a los edificios e instalaciones
donde se realicen las actividades. Su objetivo es crear un ambiente de trabajo SEGURO Y
ORDENADO que permita alcanzar la productividad óptima.
Reglas básicas de seguridad:
Usar ropa adecuada (bata manga larga abotonada y limpia, zapatos cerrados y limpios, uso
de cofia y tapabocas).
No permitir el acceso a las áreas de trabajo sin la debida precaución. Respetar las áreas de
acceso restringido; no ingresar inmediatamente a cuartos de siembra previamente
esterilizados con radiación ultravioleta.
Al iniciar y finalizar las prácticas, lavarse las manos con agua y jabón
Flamee el asa antes y después de usarla.
El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica
es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales para
este propósito son la lejía y el alcohol (etanol 96º), o una solución de hipoclorito a 15 - 20
ppm.
Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los
desplazamientos innecesarios con el asa bacteriológica cargada con algún microorganismo
por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones, aerosoles
o producir accidentes.
Durante las prácticas está prohibido comer, beber, fumar o mascar chicle.
Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz,
ojos, y otras partes del cuerpo (por ejemplo heridas) que podrían constituirse en puertas de
entrada de microorganismos oportunistas, ya que los dedos y las uñas se contaminan
fácilmente, llevando microorganismos y otras sustancias nocivas; por tanto es
recomendable el uso de guantes de látex, en especial cuando se manipulen
microorganismos patógenos o aquellos considerados oportunistas.
No portar maquillaje o aplicarse cosméticos en el laboratorio.
En caso de no contar con micropipetas, debe emplearse pipeteadores para la transferencia
de volúmenes y colocar algodón, está prohibido pipetear soluciones con la boca (reactivos,
sueros y soluciones en general).
Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la
práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
Para deshacernos del material contaminado utilizaremos los recipientes adecuados
(generalmente de color rojo o bolsas de este mismo color), los cuales deben estar
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debidamente marcados con el logo de residuos biológicos. Estos recipientes serán
esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada por el fregadero o a la basura
común.
Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
El suministro de gas para los mecheros Bunsen requiere las precauciones propias de estas
instalaciones. Los escapes de gas son muy peligrosos, por lo que hay que cerrar todas las
llaves de paso de gas al finalizar la práctica, evitar la presencia de sustancias inflamables y
revisar periódicamente las conducciones.
En las prácticas en que se trabaje con luz ultravioleta debe tenerse en cuenta que la
exposición a este tipo de radiación es peligrosa, ya que tiene poder mutagénico. Por tanto,
nunca se debe mirar directamente el foco emisor. Hay que protegerse los ojos y cualquier
zona de la piel expuesta a la radiación (gafas, guantes, máscaras, etc.).
En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se
comunicará inmediatamente al instructor.
Trabaje solamente en su puesto.
Marque cuidadosamente todos los cultivos y las preparaciones que de ellas se hacen.
Incube en el lugar asignado por el instructor.
Al terminar cada sesión de trabajo, limpie la superficie de la mesa. Descarte el material que
no necesita ya sea usando los recipientes respectivos o entregándolos al instructor, al
monitor o auxiliar de laboratorio.
Nunca retire los cultivos de microorganismos del lugar de trabajo sin previa autorización del
instructor.
Los cultivos microbianos empleados para las prácticas solo se deben abrir durante el
momento de ser usados.
Trabaje con el cabello recogido, evite usar joyas (anillos, pulseras y cadenas largas por
fuera de la blusa).
Esterilizar todo el material de desecho. Deben establecerse reglas para la eliminación de
desechos sólidos, incluyendo agujas hipodérmicas, que deben colocarse en envases
sellados etiquetados como "material peligroso". Los medios de cultivo o muestras de suero
que se sospecha que contienen un agente Infeccioso, o virus de la hepatitis, deben
autoclavarse antes de su eliminación final.
Si se trabaja con material que no es desechable, tener las debidas precauciones.
Etiquetar todos los frascos con fecha, nombre de la preparación, concentración y personal
que elaboró. Cada tubo de cultivo, placa de medio y reactivo debe tener una etiqueta que
indique claramente el contenido y las fechas de preparación y vencimiento. Los tubos,
medios y reactivos "codificados por ser peligrosos" deben estar etiquetados de forma tal
que incluso personal ajeno al laboratorio pueda interpretar el signo.
Almacenar las sustancias volátiles en envases adecuados, ventilados y fríos.
Disponer de neutralizantes para usar en caso de accidente y extinguidores
Deben utilizarse guantes adecuados cuando se manipulan instrumentos calientes, así
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como protectores faciales u oculares cuando se manipulan o mezclan sustancias cáusticas.
Todas las sustancias corrosivas o cáusticas deben designarse con una etiqueta de color
brillante y guardarse en gabinetes cerrados cerca del piso. Las soluciones corrosivas que
se vierten en las piletas deben enjuagarse con abundante agua, antes de la eliminación
real y después de ella.
Todo el equipo eléctrico debe estar apropiadamente conectado a tierra y debe tomarse la
preocupación de no sobrecargar los circuitos. No manipular con las manos húmedas o sin
conocer adecuadamente su funcionamiento.
En el laboratorio esta estrictamente prohibido el uso extensiones eléctricas y artefactos
domésticos, como cafeteras o calentadores eléctricos.
El personal de laboratorio debe informar al supervisor sobre cualquier choque eléctrico con
el uso del aparato. Nunca debe intentarse la reparación mientras el dispositivo está
conectado con el circuito eléctrico.
Los tanques de gases comprimidos deben asegurarse bien a la pared y el nombre de su
contenido debe estar claramente indicado en la etiqueta.
Recomendaciones antes y durante la práctica:
Llegue siempre al laboratorio con un conocimiento completo de la práctica que va a
realizar.
Llegue a tiempo para la práctica, evite interrupciones.
Atienda las explicaciones del profesor y pregunte lo que no entienda.
Marque todos sus cultivos y especímenes del estudio siguiendo las indicaciones del
instructor. Dicha marcación debe contener por lo menos:
Grupo de trabajo, Fecha, Nombre del microorganismo, Datos relativos a la práctica
como temperatura y tiempo de incubación, medio de cultivo, número de lista y otros
que considere pertinente, Semestre y nombre de la asignatura.
Para estos rótulos usar marcador de vidrio, rótulos adhesivos o escriba en cinta de
enmascarar, que usted debe llevar al laboratorio.
No olvide llevar siempre el kit de trabajo elemental: porta y cubreobjetos, lanilla o toalla,
jabón, marcador, cinta de enmascarar, cortapapel, asas de siembra reta, redonda, de
Driglasky y todo lo demás que considere necesario.
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II. NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo en general de este curso se han definido en cada una de las prácticas el nivel
de riesgo, sin embargo de forma genérica para las actividades descritas en este manual se ha
definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos
considerados oportunistas y que en algún momento por malas prácticas de laboratorio pueden
conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente
que oriente e intervenga en el desarrollo de este curso deberá usar los siguientes elementos
protectores:
Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantalón Largo
Nota 1: el docente será el responsable de velar por el cumplimiento de los elementos descritos
anteriormente.
Nota 2: cada estudiante deberá portar un kit de trabajo conteniendo mínimo los siguientes
elementos:
Pipeteador, tijeras, cinta de enmascarar, marcador para vidrio, jabón líquido, en polvo o
en barra antibacterial, toalla absorbente, porta y cubre objetos, guantes desechables de
látex, gasa, algodón, asas de platino redonda, recta y de Driglasky (hockey),
encendedor o fósforos, alcohol antiséptico.