marcadores de celiaquía por...

Marcadores de celiaquía por

quimioluminiscencia Ángel Esteban Rodríguez

Hospital General U. de Alicante

1

WORKSHOP WERFEN Actualización en Autoinmunidad: nuevas tecnologías en el laboratorio.

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Definición

2

La Enfermedad Celíaca es un proceso sistémico

mediado inmunológicamente y originado por la

intolerancia al gluten, en personas genéticamente

predispuestas.

Se caracteriza por la presencia de

manifestaciones clínicas variables

(digestivas o no), anticuerpos

específicos de la enfermedad,

haplotipos HLA-DQ2 o HLA-DQ8 y

enteropatía.


Multifactorial

3

Auto-anticuerpos

Linfocitos B

Respuesta inmune celular

y humoral

Inflamación

Linfocitos T

Gluten

Extrínseco

Factores desencadenante y predisponente

Genética

Intrínseco


Estudio de la EC

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• Anti-endomisio (EMA)

• Anti-transglutaminasa IgA o IgG (tTG)

• Anti-gliadina desamidada IgA o IgG (DGP)

Serología autoinmune

• Asociación con HLA-DQ2 o DQ8

Estudio genético

• Lesión de la mucosa intestinal: Hiperplasia de las criptas y atrofia de las vellosidades

• Linfocitos intraepiteliales

Biopsia


Ac. Anti-endomisio

5

• Dirigidos contra fibras de

reticulina que rodea al músculo

liso en esófago de mono

• Antígeno: transglutaminasa

tisular (tTG)

• Se detectan por IFI en la porción

distal del esófago de mono

• Patrón reticular en la muscularis

mucosae

• Isotipo IgA: sensibilidad ≈95% y

especificidad 100%

Problemas: • Interpretación subjetiva: experiencia • Tejidos de mono son escasos y caros

Fluorescencia en sustancia intercelular de las fibras musculares lisas


Ac. antitransglutaminasa

• Se encuentran en sangre (IgG e IgA)

• Alta sensibilidad y especificidad

(IgA)

• Diferente comportamiento frente

EMA (más S y menos E), epítopos

menores

• Generalmente: a mayor lesión

histológica, mayor sensibilidad

• Automatizables

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rh-tTG

(recombinante humana)

h-tTG

(nativa humana)

pg-tTG

(Cobaya)

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Ac. Anti-tTG:

antígenos para su determinación

Marcador serológico único en la práctica clínica: - Cribado de EC - Seguimiento de adherencia a

la dieta sin gluten (DSG)


Ac. Anti-péptidos desamidados de la gliadina (DGP)

• Ac. Antigliadina: desuso

• Antígeno: péptido (sintético)

desamidado de la gliadina

• S y E comparable a tTG (algo menor)

• DGP-IgG mejor que DGP-IgA

• DGP aparecen antes que tTG (?):

útiles en menores 2-3-años.

• DGP + tTG: aumento S

8


Grupos de riesgo

• Familiares

• Síndromes genéticos: Down, Turner, Williams

• Enfermedades autoinmunes: Sjogren, Tiroiditis,

Diabetes tipo I, HAI

• Déficit total de IgA (<5 mg/dL)

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Realizar anti-tTG, EMA y/o los anti-DGP del tipo IgG

Buena combinación: tTG IgA + DGP IgG


Métodos de determinación

• Inmunofluorescencia indirecta (IFI): EMA

• Inmunoensayos:

o ELISA (enzimático)

• Clásicos en microplaca

• Fluroinmunoensayo (FEIA)

o No enzimático: Quimioluminiscencia (CIA)

• Ensayo multiplex: MFI (multiplex flow immunoassay)

• Alta sensibilidad y especificidad

10


CIA

11


CIA: Ventajas (I) • Calibración/

control de calidad

por parámetro

• Curva de

calibración de

trabajo estable

por lote de

reactivo

12

Rango de medida tTG-IgA: 1,9 a 4965 CU

Punto de corte: 20 CU


CIA: Ventajas (II)

• Tiempo del ensayo: 30 min

• Acceso aleatorio (incluido

cualquier isotipo)

• Rango de medida amplio

• Preciso

• Mayor S y E para todas las

técnicas

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Chemiluminescence and ELISA-based serum assays for diagnosing and monitoring celiac

disease in children: A comparative study

• CIA Quanta-Flash tTG y DGP (IgA e IgG)

• ELISA Quanta-Lite tTG y DGP (IgA e IgG)

• Retrospectivo: 321 niños todos biopsia

• EC: 155 niños

• Objetivo: Estudio del rendimiento clínico y analítico

Aita A, Rossi E, Basso D, et al. Clinica Chimica Acta 421 (2013) 202–207 14


Imprecisión en el estudio

15

Sensibilidad y especificidad

Aita A, Rossi E, Basso D, et al. Clinica Chimica Acta 421 (2013) 202–207


Conclusiones del estudio

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• Deficiencia de IgA: Se puede usar DGP-IgG

• Elevada S y E: sobre todo tTG-IgA

• Rango analítico de medida muy amplio

Falsos Positivos y Negativos



• Falsos negativos:

oDéficit de IgA

oNo reconocimiento de epítopos de

htTG del ensayo

• Falsos positivos:

oCeliaquía latente

oBiopsia correcta?

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Falsos negativos y positivos



Seguimiento dieta sin gluten (DSG)

18

Biomarcadores

decrecen

significativamente

a los 12 meses:

tTG-IgA > cutoff

en 45% casos

DGP > cutoff en

14 % casos

1º disminuyen los ac. que reconocen péptidos

del gluten y después los autoanticuerpos anti-tTG

Relativamente

al momento

del

diagnóstico la

variación más

grande y

temprana es

para tTG-IgA



Analytical and Clinical Comparison of Two Fully

Automated Immunoassay Systems for the Diagnosis

of Celiac Disease

• Adultos: 74 pacientes con EC y biopsia; 138

controles.

• Técnicas: CIA Q-Flash vs FEIA (EliA, Thermo

Scientific). También EMA-IgA (corte 1/10)

• EMA IgA, S y E 100 % (sin déficit IgA)

Lakos G, Norman GL, Mahler M, Martis P, Bentow C, Santora D, Fasano A.

J Immunol Res. 2014;2014:371263. doi: 10.1155/2014/371263. Epub 2014 Mar 13.

19


20

Q-Flash tTG IgA: mayor S y E (si cutoff EliA baja la S y E se igualan) Q-Flash DPG: mayor S y E Mejor combinación: Q-Flash tTG IgA + DGP IgG (S 98,6 %)


LSN: Límite Superior de Normalidad 21

[tTG-IgA] >10 x LSN en EC:

Q-Flash IgA = 50%

FEIA IgA = 23 %

Aplicando el algoritmo diagnóstico ESPGHAN…

CIA FEIA


Fully-automated, chemiluminescence IgA and IgG anti-tissue transglutaminase (tTG) antibodies

serum assays for the screening of celiac disease.

• 727 pacientes consecutivos (mediana edad 27 a)

• No encuentran falsos negativos (S 100%)

• 3 falsos positivos (E 99,6 %)

• Útil en diagnóstico: excelente rendimiento analítico

• Útil en el seguimiento: amplio rango de medida

• Más S que EMA sin pérdida E

Daves M, Cemin R, Perkmann V, et al. J Immunol Methods. 2016 Feb;429:57-9. 22


Estudio tTG-IgA en rango 20-200 CU

• Período Enero 2015 – Junio 2016

• 20 niños (45% ♂) y 25 adultos (28% ♂)

• Parámetros estudiados:

o tTG-IgA y DPG-IgG por CIA (Q-Flash, BIO FLASH, WERFEN)

o EMA-IgA (IFI, esófago de mono, Euroimmun)

o HLA y Biopsia intestinal

• tTG entre 20 y 200 CU como primera

determinación (diagnóstico)

23


Resultados (I)

[tTG-IgA] (CU) [DGP-IgG] (CU)

Media Rango Media Rango*

Niños 82,0 23,7-183,1 25,0 3-93

Adultos 56,0 23,3-177,7 8,56 3-65

(*) Excluidos déficit de IgA 24


Resultados (II)

tTG-IgA (niños)

Rojo: EC

Amarillo: DQ8DQ7 25

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

tTG

-Ig

A (

CU

)

EMA

POS NEG 0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

tTG

-Ig

A (

CU

)

E. CELIACA

SI NO


Resultados (III)

DGP-IgG (niños)

Rojo: EC

Amarillo: Déficit IgA 26

0

20

40

60

80

100

120

140

DG

P-I

gG

(C

U)

E. CELIACA

SI NO

≈ 400

y = 0,4236x - 4,686 R² = 0,4599

0

50

100

150

200

0 50 100 150 200

DG

P-I

gG

(C

U)

tTG-IgA (CU

Correlación tTG-IgA vs DGP-IgG


Resultados (V) tTG-IgA (adultos)

Verde: EC

Rojo: Déficit de IgA y EC 27

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

tTG

-Ig

A (

CU

)

EMA

POS NEG

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

tTG

-Ig

A (

CU

)

CELIAQUIA

POS NEG


Controles externos UK-NEQAS

• Sample 152-1 was a serum sample from a patient with known

Coeliac disease.

28

• Sample 162-1 was a serum sample from a patient with known

Coeliac disease.


Conclusiones • Marcadores de E.

celíaca: o S y E muy elevadas

o Rango de medida muy

amplio (sobre todo tTG-

IgA), distinguiendo bien

entre positivo y negativo

o Útiles tanto para el

diagnóstico de E. celíaca,

como para el seguimiento

de la DSG.

o Reduce la necesidad de

biopsia para el diagnóstico

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• GENERALES: o Rápido (30 min. ensayo)

o Fácil manejo

o Acceso aleatorio de las

muestras

o Calibración por lote

(y controles) únicos para

cada analito

o Preciso

o Mantenimiento mínimo

o No existe la variabilidad

inter-observador

(comparado con IFI)


marcadores de celiaquía por...

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