UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Nastasja Manić

Uticaj tipa podloge na varijabilnost morfometrijskih

parametara larvi vrste Chironomus tentans Fabricius, 1805 u

testovima toksičnosti

Master rad

Niš, 2018.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Uticaj tipa podloge na varijabilnost morfometrijskih

parametara larvi vrste Chironomus tentans Fabricius, 1805 u

testovima toksičnosti

Master rad

Kandidat : Mentor :

Nastasja Manić Dr Đurađ Milošević

Br.indeksa: 164

Niš, 2018.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Master thesis

The influence of substrate type on

morphometric parameters of Chironomus

tentans Fabricius, 1805 in toxicity tests

Candidate Mentor

Nastasja Manić PhD Đurađ Milošević

Students Reg.No. 164

Niš, 2018

Zahvalnica

Srdačno se zahvaljujem svom mentoru dr Đurađu Miloševiću na pruženoj nesebičnoj

pomoći prilikom realizacije master rada.

Takođe, zahvaljujem se koleginici Zorani Lazarević kao i doktorantkinji Dimitriji Savić

Zdravković na pomoći i dobronamernim sugestijama pri izradi rada.

Hvala i dr Milici Stojković Piperac kao i doktorantu Aci Đurđević za pomoć tokom

ekperimentalne faze istraživanja.

Najveću zahvalnost dugujem svojim roditeljima na bezuslovnoj podršci tokom

studiranja.

Biografija

Nastasja Manić rođena je u Pirotu 14. aprila 1991. godine. Srednju školu, Gimnaziju u

Pirotu završila je 2010. godine.

Osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu upisuje 2010.

godine na Departmanu za biologiju i ekologiju. 2014. godine, završava osnovne akademske

studije i iste godine upisuje master akademske studije, smer Ekologija i zaštita prirode.

Sažetak

Larve hironomida vrste Chironomus tentans koriste se kao indikatori i test organizmi u

ekotoksikološkim studijama pri proceni kvaliteta životne sredine. Biološki testovi sprovode se

u kontrolisanim uslovima, te na taj način možemo precizno izmeriti varijacije određenih

parametara koje pratimo u kulturi test organizama.Cilj ovog istraživanja je testiranje prirodne

varijabilnosti standardnih subletalnih efekta bioloških testova i morfometrijskih parametara,

značajnih za postojeći OECD Protokol za tretiranje toksičnih supstanci u sedimentu.

Rezultati ovog istraživanja pokazali su da postoji statistički značajna razlika u

varijabilnosti dimenzija tela i širine glave, kao i mokre mase jedinki u odnosu na tip podloge

na kojoj su larve hironomida uzgajane. Testiran je i uticaj tipa podloge na stopu mortaliteta

larvi hironomida, gde se pokazalo da podloge sa primesama gline ispoljavaju povećanu stopu

mortaliteta kod larvi Chironomus tentans.

Različiti tipovi podloge pokazali su značajan uticaj na variranje morfoloških parametara

kod larvi koje su uzgajane na njima, dok su se larve Chironomus tentans pokazale kao izuzetno

pogodni indikatori i test organizmi za sprovođenje istraživanja o proceni kvaliteta životne

sredine.

Abstract

Chironomus tentans larvae are known to be great indicators and test organisms in

ecotoxicology studies for assessment environment quality status. Bio-esseys are implemented

through series of controlled conditions, this allows us to precisely measure variability of certain

parameters. In this research, we tested variability of morphometric parameters and standard

subletal effects for OECD Protocol due to environment quality assessment.

Results obtained from this research points out statistically significant variability of body

length and head width, so as significant differences of dry weight between larvae which were

cultivated on different substrate types. Also, substrate type effects on viability rate of

chironomids were tested. Results points to higher mortality rates of Chironomus tentans larvae

from substrate which had clay as component.

Different substrates have significant effects on variability of morphometric parameters

on larve which were cultivated. Chironomus tentans showed himself as great inidicator and test

organism for environment quality researches.

Sadržaj

1. UVOD .................................................................................................................................... 1

1.1 Zagađenje akvatičnih ekosistema .................................................................................... 2

1.2 Osnovni pojmovi biomonitoringa ................................................................................... 3

1.2.1 In situ biomonitoring ................................................................................................ 5

1.2.2 Ex Situ biomonitoring .............................................................................................. 6

1.2.3 Testovi ekotoksičnosti ............................................................................................. 7

1.3 Akvatični makroinvertebrati kao bioindikatori ............................................................... 8

1.3.1 Chironomidae kao bioindikatori u dosadašnjim istraživanjima ............................... 9

2. MATERIJALI I METODE .................................................................................................. 15

2.1 Lokalitet uzorkovanja i uzgajanje kulture Chironomus tentans ..................................... 15

2.2 Postavka eksperimenta .................................................................................................. 17

2.3 Merenje dimenzija morfoloških karakteristika............................................................... 19

2.4 Statističke metode .......................................................................................................... 20

3. REZULTATI I DISKUSIJA ................................................................................................ 20

4. ZAKLJUČAK ...................................................................................................................... 26

1

1. UVOD

Chironomidae predstavljaju familiju u okviru reda Diptera, njeni predstavnici

sastavljeni su od velikog broja vrsta, smatra se da postoji oko 10 000 različitih vrsta hironomida

(Armitage et al. 1995).

Životni ciklus hironomida, kao i kod ostalih insekata sa holometabolnim tipom razvića,

sastoji se od četiri faze: jaja, larve, pupe i adulta. Adulti ženke legu jaja na površinu vode,

nakon čega jaja potonu na dno i iz njih se izlegu larve nakon par dana do jedne nedelje. Larve

provode veći deo života zakopane u sedimentu gde žive, hrane se i razvijaju. Nakon završetka

larvene faze, sledi period pupacije, gde pupe, tj. lutke, aktivno plivaju ka površini vode. Adulti

se izležu iz lutki, ostavljajući egzoskelet lutki (exuviae) na površini vode (Kranzfelder et al.

2015).

Tokom dela razvića u stadijumu larve, ove vrste naseljavaju prirodne akvatične

ekosisteme ili one koji su nastali pod uticajem antropogenog faktora. Naseljavaju plitke i brze

vode poput potoka, ali isto tako mogu živeti i u dubokim i mutnim vodama, poput zaliva. Larve

hironomida pojavljuju se u stajaćim vodama u plitkoj obalskoj zoni poput jezera. Hironomide

pokazuju visok stepen tolerancije na promenljive uslove okoline, mogu se pokazati kao dobri

indikatori čistih voda koje imaju visoki stepen saturacije kiseonika. Isto tako mogu živeti u

zagađenim vodama sa niskim koncentracijama kiseonika.Prisutnost određenih vrsta

hironomida u pojedinim zagađenim akvatičnim ekosistemima u direktnoj je vezi sa tipom

zagađenja u toj sredini. Zahvaljujući veoma dobroj adaptivnoj prirodi, larve ovih vrsta mogu

se pronaći i u brakičnim vodama, na obalama gde se reke ulivaju u mora. Manji broj vrsta u

larvenoj fazi naseljava organsku materiju u fazi dekompozicije ili čak vlažno zemljište (Ali,

1991).

Vodeni ekosistemi u urbanoj i suburbanoj okolini su u sve većoj meri pod uticajem

čoveka.Trofički stupanj vodenih ekosistema zavisi od tipa i inteziteta prometa materije, kao i

od protoka energije i visine organske produkcije. Antropogeni uticaj dovodi do povećanja

stepena zagađenja, pri čemu se povećava eutrofičnostvodenih ekosistema.Usled različitih

tipova zagađenja, trofički odnosi, tačnije lanci ishrane mogi biti poremećeni što i te kako može

2

imati posledice na populacije različitih vrsta u biocenozi. Osnovni tipovi izvora zagađenja vode

mogu biti prirodni izvori (vulkanske erupcije, peščane oluje, produkti požara) ili antropogeni

izvori. Cross-media kontaminacija, predstavlja vid zagađenja u kome polutanti mogu dospeti

iz jednog medijuma u drugi (iz vazduha ili zemljišta u vodu). Takođe, izvori zagađenja mogu

se podeliti na dve grupe: tačkasta zagađenja i difuzna zagađenja (Simić i Simić, 2009).

Kao posledicazagađenja vodene sredine specijski diverzitet makrofaune u ovim

staništima se postepeno smanjuje, s druge strane, favorizuju se organizmi koji su tolerantni na

određeni stepen zagađenja, poput larvi pojednih vrsta hironomida, koje postaju glavna

komponenta zajednice makroinvertebrata u ovim staništima. Ipak, larve hironomida igraju

veoma važnu ulogu u lancima ishrane vodenih ekosistema.Njima se hrane mnoge insektivorne

vrste riba kao i pojedine vrste beskičmenjaka. Larve, takođe, održavaju vodeno stanište čistim

konzumirajući i reciklirajući organsku materiju (Ali, 1991).

Pošto su se hironomide pokazale kao organizmi sa jako širokom ekološkom valencom,

dalje u radu biće reči o zagađenosti akvatičnih ekosistema, kao potencijalnim staništima larvi

hironomida, kao i o uticaju tipa zagađenja na morfologiju ove vrste tokom razvića.

1.1 Zagađenje akvatičnih ekosistema

Slatkovodni ekosistemi predstavljaju najvažnije i najveće rezervoare slatke vode za

čovečanstvo, osim u vodosnabdevanju veliki je značaj ovih ekosistema u proizvodnji energije,

kao i izvora hrane i transportnih koridora. Međutim, čovekovim direktnim i indirektnim

uticajem menja se struktura i funkcija ovog tipa vodenih ekosistema. Izlivanjem industrijskih

i komunalnih otpadnih voda, u rekama se povećava koncentracija štetnih materija, koje dovode

u pitanje opstanak vrsta koje u tim vodama žive. (Lazarević et al. 2010).

Negativne posledice delovanja čoveka koji preko uticaja na prirodne faktore dovode do

konačnih promena u vodenim ekosistemima ogledaju se kroz urbanizaciju, industriju,

poljoprivredu i menjanje tokova reka, a konačni rezultati su destrukcija ekosistema, fizička

promena staništa, promene u hemiji vode i promene u sastavu vrsta (Li et al. 2010).

3

Komunalne otpadne vode, otpadne vode iz industrija i fabrika kao i drugi izvori koji

direktno ispuštaju zagađujuće materije u vodene ekosisteme predstavljeni su kao tačkasti izvori

zagađenja. Lako ih je uočiti i kontrolisati zakonodavno, njihov uticaj nije bezopasan i dalje je

u velikoj meri prisutan u vodenim ekosistemima (Simić i Simić, 2009).

Sa druge strane postoje i difuzni izvori zagađenja koji ne potiču iz jedne tačke, već su

prostorno široko rasprostranjeni. Preko zemljišta dospevaju do podzemnih voda ili do većih

tokova reka, jezera, močvara pri čemu ostavljaju veći stepen posledica u ovim ekosistemima.

Eksploatacija ruda, korišćenje pesticida i veštačkih đubriva glavni su izvori difuznog tipa

zagađenja ( Simić i Simić, 2009).

U zagađujuće materije se ubrajaju različita organska i neorganska jedinjenja,

sedimenti, joni teških metala, radioaktivne supstance ili topla voda, a prepoznavanje tipa

zagađivača je bitno za prevenciju i prečišćavanje voda kao i za konzervaciju životne zajednice

tog ekosistema (Simić i Simić, 2009).

Procenjuje se da u životnu sredinu dospeva oko 150.000 različitih supstanci

antropogenog porekla (Slobodnik, 2013). Glavni članovi grupe organskih zagađivača jesu

deterdženti, insekticidi, herbicidi, policiklična aromatična jedinjenja, polihlorovani bifenili,

perhlorati itd. Dok su među neorganskim jedinjenjima u najvećoj meri prisutni metali,

amonijak, fosfati, nitrati i nitriti (Wright i Welbourn, 2002). Međutim, sve ove suptance nije

moguće uključiti u opšti monitoring, prema tome formiraju se liste prioritizacije. Ovi

zagađivači označeni su kao hazardne suspstance prema Okvirnoj direktivi o vodama (Water

Framework Directive - Directive 2000/60/EC), među njima izdvajaju se pojedine koje

karakteriše visoka toksičnost, perzistentnost i visoka stopa bioakumulacije. Dozvoljene

koncentracije ovih supstanci u ekosistemima su određene zakonskim regulativama, a kao

osnova se koristi Direktiva o standardima u vodenim ekosistemima (EQS Directive,

2008/105/EC).

Teški metali poput žive, kadmijuma, olova i nikla kao i policiklična aromatična

jedinjenja, odlikuju se visokim stepenem genotoksičnosti (Johns i Luoma, 1990).

1.2 Osnovni pojmovi biomonitoringa

4

Praćenje efekta štetnosti ksenobiotika po životnu sredinu može se izvesti skupom

metoda koje se mogu objediniti terminom monitoring. Prema definiciji Programa za životnu

sredinu Ujedinjenih nacija (United Nations Environmental Program – UNEP) monitoring

predstavlja svako ponovljeno merenje, sa definisanom svrhom, jednog ili više hemijskih ili

bioloških parametaraprema unapred određenom rasporedu u prostoru i vremenu, koristeći

metode koje su uporedive i standardizovane. Dva osnovna tipa monitoringa koji omogućavaju

procenu rizika dejstva na organizme kao i procenu kvaliteta životne sredine su hemijski i

biološki monitoring (De Zwart, 1995).

Hemijskim monitoringom može se utvrditi prisutnost određenih kontaminanata i to

omogućava procenu izloženosti organizma ali ne govori o efektima koje imaju na biološke

sisteme (Lam, 2009). Metode biološkog monitoringa imaju prednosti u tom pogledu jer nam

ukazuju na posledice koje određeni polutanti mogu imati na organizme, tačnije povezuju

određena jedinjenja sa njihovim koncentracijama i toksičnošću u organizmu (De Zwart, 2005).

Van Gestel i Van Brummelen predložili su četiri različita nivoa biomonitoringa :

• Suborganizmalni nivo – pomoću biomarkera procenjuje se stanje organizma na

biohemijskom i fiziološkom nivou, te se time utvrđuju odstupanje od normalnog

funkcionisanja.

• Organizmalni nivo – korišćenjem bioanaliza prati se preživljavanje, rast i

reprodukcija jedinki.

• Populacioni nivo – korišćenjem bioindikatora prate se promene u genetičkoj

strukturi, starosnoj strukturi ili gustini populacije.

• Ekosistemski nivo – promene u sastavu i biodiverzitetu vrsta mogu ukazati na

zagađenje sredine.

Biomarker u najširem smislu predstavlja svako merenje koje reflektuje interakciju

između biološkog sistema i potencijalne opasnosti, koja može biti hemijskog, fizičkog ili

biološkog tipa (WHO, 1993). Njihova ključna funkcija je da obezbede rani upozoravajući

signal bioloških efekata u vidu odgovora koji se prvo dešava na fiziološkom ili molekularnom

nivou za kojim slede promene na višim nivoima biološke organizacije (Lam, 2009).

5

Definisanje kvaliteta sredine ili procena ugroženosti može se utvrditi i analizom

strukture živih sistema polazeći od pojedinačnih organizama pa sve do kompleksnijih nivoa

poput ekosistema. U ovom slučaju pojedinačni organizmi koji svojim prisustvom, odsustvom

ili ponašanjem daju informacije o uslovima sredine u kojoj žive, nazivaju se bioindikatori

(Lam, 2009).

Idealni bioindikatorski organizmi bi trebalo da zadovolje sledeće kriterijume (Zhou et

al. 2008):

• da imaju mogućnost akumuliranja visokih koncentracija zagađivača, bez visoke stope

mortaliteta,

• da imaju sesilni način života, ili da su slabo pokretni, kako bi se dobijeni odgovor

mogao vezati za određeni lokalitet,

• da su široko rasprostranjeni, kako bi bili primenjivi na većem prostoru,

• da imaju životni vek dovoljno dug kako bi se dejstvo zagađivača moglo ispoljiti,

• da imaju visoku abundancu i/ili da su jedinke dovoljno velike da bi se mogla obezbediti

količina materijala (tkiva) u količinama potrebnim za analize,

• da je uzorkovanje jednostavno i

• da se mogu lako gajiti u laboratoriji.

U ekotoksikološkim igenotoksikološkim studijama, biomonitoring se

sprovodiprimenom dva različita pristupa: in situ i ex situ. U in situ studijama monitoring se vrši

direktno u životnoj sredini na određenom lokalitetu.. U ex situ studijama, proučavanje uticaja

određenih susptanci vrši se u laboratorijskim uslovima.

1.2.1 In situ biomonitoring

6

Generalno, organizmi koji se proučavaju u in situ studijama, najčešće nisu izloženi

jednom zagađivaču, već je to smeša različitih supstanci. Teško je utvrditi da li će u toj smeši

supstance imati aditivan, sinergistički ili čak antagonistički efekat jedna na drugu. Jedino što

preostaje jeste povezivanje biomarkera i izmerenih hemijskih parametara u vodi ili sedimentu

na lokalitetima, pomoću korelacija ili multiple regresije.

U monitoringu ovog tipa primenjuju se metode pasivnog i aktivnog biomonitoringa,

kako bi se procenilo stanje ekosistema. Pasivni monitoring podrazumeva proučavanje efekta

sredinskog stresa kod organizama koji naseljavaju određeni lokalitet. Aktivni monitoring

podrazumeva proučavanje efekta sredinskog stresa kod organizama koji su na određeni

vremenski period izloženi na nekom lokalitetu. Organizmi koje izlažemo uticaju, najčešće se

prikupljaju na lokalitetima za koje je utvrđeno da stresni faktori čije se dejstvo proučava nisu

prisutni, ili je njihovo dejstvo procenjeno kao zanemarljivo (referenctni lokaliteti), ili se oni

gaje u laboratoriji, u odsustvu stresa (De Kock i Kramer, 1994).

Aktivni biomonitoring je sve zastupljeniji u praćenju uticaja raznih polutanata, jer

poseduje brojne prednosti u odnosu na pasivni biomonitoring. Na primer, aktivnim

monitoringom se mogu izbeći problemi u smislu variranja odgovora zbog pola, veličine i

reproduktivnog statusa jedinki, kao i razlike u odgovoru usled dejstva drugih abiotičkih faktora

(Bauer et al. 1991).

1.2.2 ExSitu biomonitoring

U ex situstudijama,proučavanje uticaja određenih supstanci vrši se u laboratorijskim

uslovima. Prilikom korišćenja akvatičnih bioindikatora, obično se primenjuju statički, semi-

statički ili protočni sistemi. U statičkim test supstanca dodaje se na početku tretmana u

akvarijume sa vodom, i voda se ne menja do kraja eksperimenta, dok se u semi-statičkim

koriste manje stabilne supstance, zbog čega se voda periodično zamenjuje kako bi se

minimiziralo variranje koncentracije test supstance tokom eksperimenta. U protočnim test

sistemima, voda sa aktivnom supstancom se konstantno zamenjuje tokom čitavog tretmana

(Environmental Protection Agency, US, 1996).

7

1.2.3 Testovi ekotoksičnosti

Testovi ekotoksičnosti su biološki eksperimenti u kojima se testira stanje različitih

bioloških parametara kod određenih vrsta usled prisustva hemijskih supstanci u okolini.

Neophodni su u proceni rizika novih i postojećih hemikalija kao i za sprovođenje monitoringa

kako bi se pratio stepen zagađenosti okoline. Rezultati ekotoksikoloških testova moraju biti

verodostojni, prema tome istraživanja se vrše po standardizovanim načelima GLP (Good

Laboratory Practice)(OECD, 1998). Kao i po principima koji su razvijeni od strane OECD

(Organisation of Economics Cooperation and Development), CEN (Comite of Europe

Normalisation) i ISO (International Organization of Standardization).

Postoje dve vrste ekotoksikoloških testova: akutni testovi i prolongirani testovi. U

akutnim testovima ekotoksičnosti posmatrani su parametri poput mortaliteta ili imobilizacije

jedinki. Prolongirani testovi posmatraju promene parametara koje se odigravaju u određenom

vremenskom periodu, takve promene tiču se efekata toksikanata na stopu reprodukcije, stopu

rasta ili neki drugi fiziološki proces. Takođe, predmet istraživanja u akutnim testovima jesu

direktno organizmi (jedinke), dok su kod prolongiranih testova u centru istraživanja drugi nivoi

ekološke organizacije, poput populacije (Markert et al 2003).

Rezultatibiotestova moraju biti ponovljivi, prema tome uslovi testa moraju biti strogo

regulisani u smislu standardizacije i metoda procene. Međutim, usled biološke raznolikosti

posmatranih osobina test organizama nemoguće je gotovo precizno kontrolisati istraživanja, s

toga rezultati neće biti identični. Ipak, praćenjem varijabli i njihovim poređenjem sa

kontrolnom grupom (jedinke koje nisu tretirane polutantima), dobijaju se rezultati koji se mogu

uporediti sa podacima drugih istraživanja i na osnovu kojih možemo zaključiti o efektu

toksičnosti pojedinih supstanci(Ratte et al. 2003).

Od ukupne raznolikosti vrsta na planeti, veoma mali broj koriste se kao test organizmi u

ekotoksikološkim studijama. Osetljivost na promene u životnoj sredini, dostupnost vrsta kao i

brojnost jedinki, ekološki značaj, neke su od glavnih kriterijuma koje test organizmi moraju

ispunjavati kako bi mogli biti odabrani kao modeli u proceni rizika zagađenja životne okoline.

8

Zbog razlika u osetljivosti vrsta na različite toksikante, ne postoji idealni test organizam

za određeni tip hemikalije, jer svaki organizam u drugačijoj meri reaguje na određenu

koncetraciju pojedinih polutanata, čak iako se prate istovetni parametri. Ustanovljeno je da se

prema organizaciji trofičkih nivoa, u ekotoksikološkim testovima koriste organizmi koji su za

dati nivo najreprezentativniji (Ratte et al. 2003).

Prema tome, tradicionalno za procenu rizika zagađenja vodene sredine od strane pojedinih

polutanata, koriste se mnoge vrste algi, beskičmenjakai riba. Pojedine zelene alge poput

Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris iPseudokirchneriella subcapitata, koriste se kao

standardni test organizmi predstavljajući primarne producente. Dok se u ulozi primarnih

konzumenata kao test organizmi u ekotoksikološkim istraživanjima koriste Daphnidae, ali i

mnogi drugi predstavnici zglavkara, među kojima je i grupa hironomida, čije vrste se ne koristi

samo u svrhu procene stanja zagađenosti vodenih ekosistema određenim toksikantima, već se

rade i studije u kojima se proučava prirodna varijabilnost i prilagođenost larvi pojedinih vrsta

hironomida na smanjenu koncentraciju kiseonika u podlozi (Markert et al. 2003).

1.3 Akvatični makroinvertebrati kao bioindikatori

Akvatične makroinvertebrate su organizmi koji bar deo životnog ciklusa nasljevaju vodene

ekosisteme (Rosenbert i Resh, 1993). Da bi se svrstali u akvatične makroinvertebrate organizmi

moraju da ispunjavaju par kriterujema, odnosno da pored toga što žive u vodi, imaju i veličinu

tela veću od 500µm. Određeni predstavnici naseljavaju različite delove vodenih ekosistema,

tako pojedine vrste mogu živeti pri površini vode (neuston), drugi naseljavaju dno (bentos) ali

mogu živeti i među submerznom vegetacijom (epifiton).

U mnogobrojnim dosadašnjim studijama grupa akvatičnih makroinvertebrata pokazala se

kao dosta zahvalna za korišćenje u svrhu biomonitoringa (Paunović, 2007; Marković, 2014;).

Kod mnogih grupa ovih organizama poznat je njihov način života, životni ciklus, preferencije

za ishranu, stanište itd. Mnoge vrste su takođe slabo pokretne, žive sesilnim načinom života,

imaju široku rasprostranjenost i osetljive su na promene u životnoj sredini.

9

Pored mikrobioloških, fizičko-hemijskih i hemijskih parametara kvaliteta vode za procenu

ekološkog statusa ili potencijala, neophodno je da se koriste i biološki indeksi koji su

prilagođeni određenim grupama organizama, na primer grupi akvatičnih invertebrata.

1.3.1 Chironomidae kao bioindikatori u dosadašnjim istraživanjima

Larve familije Chironomida (Diptera) su izuzetno pogodne za biološka istraživanja sedimenata

slatkovodnih ekosistema iz više razloga:

• Većinu svog života larve provode u površinskim sedimentima, gde su izložene uticaju

toksikanata direktnim fizičkim kontaktom ili putem ingestije,

• Imaju kratak životni ciklus, pa je moguće u laboratoriji proizvesti deset ili više

generacija godišnje,

• Izuzetno su brojne u bentosu,

• Relativno su osetljive na polutante.

Kako bi se pratila funkcionalnost ekosistema, larve hironomida koriste se kao glavni

kandidati za procenu ekološkog statusa vodenih ekosistema. Monitoringom populacija ovih

organizama možemo steći bitna saznanja o kvalitetu vode, kao i o efektima prirodnih i

antropogenih delovanja. Stresori koji utiču na acidifikaciju, degradaciju staništa i organsko

zagađenje mogu se pratiti i kontrolisati uključivanjem hironomida u programe bioprocene

(Coffman, 1995). Larve hironomida mogu preživeti ekstremna variranja temperature, pH

vrednosti, koncentracije kiseonika i nivoa zagađenja. Jedinke iz familije hironomida

prepoznate su kao odlični indikatori u detekciji različitih opterećenja staništa i unapređivanju

metoda za procenu kvaliteta vode (Lenat, 1983).

Deformacije i fluktuiranje asimetričnosti morfološkiih karakteristika kod larvi hironomida

prepoznati su kao osetljivi indikatori biološkog stresa i često se koriste u studijama koje se bave

procenom negativnog uticaja čoveka na životnu sredinu. Najčešće korišćene

vrstesuChironomus riparius i Chironomus tentans, na kojima su u jednom takvom istraživanju

posmatrani efekti polutanata iz reke u kojoj je ova populacija živela. Različite koncentracije

10

olova i 4-nonilfenola pronađene su u jedinkama ove populacije, među kojima je uočena pojava

deformacije usnog aparata (Aramborou et al. 2012).

Kod kasnijih stupnjeva larvenog stadijuma hironomida takođe je moguće uočiti oštećenja

usnog aparata, posebno mentuma, kada su se javljala oštećenja zuba kao rezultat reakcije na

prisustvo polutanata u životnoj okolini (Slika 1). Ovo istraživanje sprovedeno je među 25

rodova Chironominae, Orthocladinae i Diamesinae u oblasti Nova Škotska u Severnoj Americi.

Stepen oštećenja kao i tip deformacije poslužili su kao indikatorske karakteristike pomoću

kojih je bilo moguće proceniti subletalnu dozu toksikanata u vidu koncentracije teških metala,

radioaktivnosti, organofosfata i organohlorida i drugih ksenobiotika (Bird, 1994).

Slika 1. Elektronska mikroskopija usnog aparata kod Polypedilum(levo-normalna građa, desno-

oštećenje zuba mentuma)

Prvi larveni stupanj kod Chironomus ripariuskoristi se kao najpogodniji za početak

ekotoksikoloških studija koje prate hroničnu toksičnost sedimenta, gde se prati njihov razvoj

do pojave adulta. U većini vodenih ekosistema koncentracija polutanata i dalje je ispod letalne

doze i može se odrediti tokom vremena pomoću ekotoksikoloških studija. Chironomus riparius

poznat je kao pouzdan indikator stresa usled zagađenja okoline, a otpornost larvi raste kako i

same larve napreduju ka višem stupnju (Watts i Pascoe, 1998).

Kako bi procenili stanje slatkovodnih ekosistema u pogledu prisustva toksikanata,

razvijeno je više različitih bioeseja koji se zasnivaju na kratkoročnim, akutnim, mikrobiološkim

odgovorima ili oni koji prate stanje životnog ciklusa organizama na duže vreme, kao što su

metode koje uključuju monitoring raznih vrsta beskičmenjaka, među kojima su poznate grupe

Amphipoda, Daphnida, pa i Chironomidae. U poslednje vreme, više pažnje se poklanja larvama

hironomida kao i njihovoj osetljivosti na promene životne sredine. Deformacije koje razvijaju

11

u odgovoru na prisustvo toksikanata, označene su kao jako pogodni biomarkeri za određivanje

toksičnosti sedimenta i prisutnost mikropolutanata(Hamilton i Saether, 1971).

U studiji u kojoj je proučavano dejstvo metala na razvoj larvi hironomida, različite

koncentracije teških metala u sedimentu, poput bakra i olova, pokazale su štetno dejstvo

izazivajući deformitete delova usnog aparata kod hironomida. Larve trećeg i četvrtog stupnja

pokazale su najveći stepen deformacija zuba mentuma. Inače, kao podloga na kojoj su larve

bile uzgajane u eksperimentalnim uslovima korišćena je dijatomejska zemlja, koja se nije

pokazala kao najbolji izbor zbog toga što je izazivala visok stepen mortaliteta larvi (>60%)

nezavisno od dejstva teških metala (Bisthoven i Ollevier, 1998).

Povećanje koncentracije organske materije koje dospevaju u vodene ekosisteme putem

otpadnih voda često mogu dovesti do promena strukture životne zajednice tog ekosistema.

Kombinacije različitih polutanata i komponenti organske materije u potocima Severne

Karoline podstiču pojavu hironomida kao dominantne vrste u toj zajednici. Na ovaj način larve

hironomida možemo smatrati odličnim indikatorskim vrstama, i daljom analizom zajednice

bentosa možemo utvrditi u kojoj meri je prisutnost organskog zagadjenja uticala na promenu

strukture zajednice. Sa druge strane, uticaj toksičnih jedinjenja (poput teških metala ili drugih

polutanata) najbolje je posmatrati kroz stepen deformacija koje izazivaju na posmatranoj vrsti

(Lenat, 1993).

Prema Warwick-u i Tisdale-u (1988), koncentracije jona teških metala, pesticida,

radioaktivnih komponenti i pojedinih kancerogena kod zajednice hironomida u larvenom

stadijumu izazvale su veliki broj poremećaja mandibule, premandibule, labralne lamele i

antena.

Deformiteti mentuma uzimaju se kao najčešći parametri koji se prate tokom

sprovođenja ekotoksikoloških studija. Pored toga se u standardnom testu toksičnosti prate i

tradicionalni subletalni efekti agenasa kao što su, rast, vreme razvića ili stopa izleganja adulta

. U oba slučaja, posmatrane karakteristike test organizama mogu pokazati određeni stepen

varijabilnosti u odnosu na specifičnosti postavljenog testa toksičnosti. Na primer, subletalni

efeketi kod model organizama mogu zavisiti od tipa supstrata čije fizičke osobine mogu uticati

na rast i razviće larvi, kao i na akutne promene koje se tiču deformiteta delova usnog aparata

larvi (Wentsel et al. 1978). U nekim istraživanjima naučnici su koristili supstrate bazirane na

12

organskoj materiji(treset) (Batac-Catalan i White, 1982), dok su pojedini koristili podloge na

mineralnoj bazi (kvarcni pesak;Giesy et al. 1988). Korišćenje supstrata na bazi mineral, kako

se pokazalo istraživanjima, dovodi do smanjenja oštećenja zuba mentuma kod larvi

hironomida, iako je kasnije dokazano da uzgajanje larvi hironomida na ovakvim podlogama

može dati nejasne ili lažno pozitivne rezultate (Warwick, 1988).

Efekat četiri različita supstrata na rast, razviće, preživljavanje i istrošenost zuba

mentuma kod larvi Chironomus tentans, ispitivani su u laboratoriji od strane Bird-a, 1995.

Podloge na kojima su larve hironomida bile uzgajane sastavljene su od celuloznog papira u

komadićima, grubog peska, šljunka i sitnog peska. Stepen deformiteta mentuma definisan je u

odnosu na tip podloge i to u jednu od tri kategorije: minimalna oštećenja, umerena i znatna

oštećenja mentuma. Iako su rezultati pokazali da je celulozna podloga najpogodnija za ugajanje

kultura hironomida, ovo istraživanje nije u potpunosti dalo statistički značajne podatke na

osnovu kojih bi mogli tvrditi da je stepen deformiteta mentuma direktno povezan sa tipom

podloge na kojoj su larve živele. Stepen prirodne varijabilnosti u okviru ove grupe je izrazito

veliki, ujedno su visoke i stope prirodnih i naslednih deformacija koje larve poseduju, pogotovo

je to bitno kada se radi sa kulturama starijih jedinki u istraživanjima koja se tiču odnosa

deformiteta i tipa podloge (Bird, 1995).

Prema tome, ukoliko se kao posmatrani parametar u testovima prati frekvencija

deformiteta, izbor supstrata ne mora biti kritičan, ukoliko podloga ne uzrokuje preveliko

oštećenje zuba mentuma do te mere da daje nejasne rezultate, koje je teško protumačiti ili pak

izaziva visoku stopu mortaliteta jedinki. Sa druge strane, ukoliko pratimo rast i razviće kao

ciljne parametre istraživanja, izbor podloge je od veće važnosti i treba što bolje uskladiti fizičke

odlike podloge na kojoj se kultura testira sa izvornim supstratom (Bird, 1995).

Dimenzije tela takođe mogu biti parametri koji se prate u testovima toksičnosti, a koji

su u zavisnosti od tipa ishrane larvi. Kvalitet hrane zavisi od prisustva organske materije,

mikro-detritusa i komponenti koje čine nutritijente za larve hironomida te utiču na njhov rast i

razviće. U istraživanjima u kojima je ispitivan nutritijent koji najviše doprinosi rastu i razviću

jedinki ustanovljeno je da ishrana na bazi TetraMin® hrane (komercijalna hrana za ribe), daje

jedinke sa najvećim dimenzijama tela, u odnosu na ishranu baziranu na algama i kvascima

(Habashy, 2005).

13

14

Ciljevi istraživanja

Cilj ovog istraživanja je testiranje prirodne varijabilnosti standardnih subletalnih

efektabioloških testova i morfometrijskih parametara, značajnih zapostojeći OECD Protokol

za tretiranje toksičnih supstanci u sedimentu. Za realizaciju ovog cilja testiran je uticaj tipa

podloge na stopu mortaliteta larvi hironomida. Pored toga, analizirana je i varijabilnost mokre

mase tela imorfometrijskih parametara: dužina tela i dužina i širina glave larvi hironomida,

gajenih na različitim tipovima podloge.

15

2. MATERIJALI I METODE

2.1 Lokalitet uzorkovanja i uzgajanje kulture Chironomus tentans

Larve hironomida sakupljene su na svom prirodnom staništu u starom koritu reke

Nišave (slika 2). Nakon prikupljanja larvi i identifikacije, uzgajanje je nastavljeno u laboratoriji

pod kontrolisanim uslovima, regulisana je temperatura kao i svetlosni režim i aeracija.Larve su

čuvane u laboratoriji do eklozije pupe u adulte. Posle polaganja jaja, prva generacija potomaka

izolovana je u posebne akvarijume, dalje su se mogli pratiti svi stadijumi razvića životnog

ciklusa hironomida, od stadijuma jaja, preko larvi do pojave novih adulta. Na ovaj način

stvorena je čista kultura Chironomus tentans koja je bila korišćena za dalje eskperimente.

Slika 2. Lokalitet sa koga su prikupljene larve hironomida, staro korito reke Nišave. (Izvor: Google

earth)

Populacija hironomida uzgajana je u akvarijumima koji su napravljeni od stakla, na

vrhu akvarijuma nalazila se rojilica koja je bila spojena sa delom akvarijuma preko otvora.

Rojilica je sastavljena od drvenih okvira i prekrivena je najlonskom mrežicom, kako bi se

sprečilo bekstvo adulta.

16

Slika 3.Izgled akvarijuma za uzgajanje larvi C. tentans (Autor: D. Savić)

Zapremina akvarijuma iznosi 80 litara i voda koja se u njima nalazi po sastavu je 50%

česmenska voda i 50% destilovana voda. Problem snabdevanja kiseonikom rešen je uz pomoć

akvarijumskih vazdušnih pumpi (Slika 3). U kontrolisanim laboratorijskim uslovima takođe je

bila regulisana i temperatura vode koja je održavana na 21 ± 0,5 ºC. Takođe, uspostavljen je i

svetlosni režim od 16 sati dnevnog i 8 sati noćnog režima, što imitira fotoperiod u prirodnim

uslovima. Svaki od ovih faktora ima jako bitnu ulogu u pravilnom razviću larvi, ukoliko se

neki od parametara promeni, izleganje adulta može biti odloženo na određeni period.

Poznato je da larve hironomida provode svoj život zarivene u podlozi određenog

vodenog staništa, prema tome u akvarijumima za uzgoj kulture Chironomus tentansbilo je

potrebno obezbediti supstrat na kome će larve živeti (Slika 4). Celulozni papir najpouzdaniji je

materijal za dobijanje susptrata koji se koristi za uzgoj kulture hironomida u laboratorijskim

uslovima. Metoda pripreme sastoji se od ispiranja celuloznog papira acetonom (radi uklanjanja

nečistoća), zatim od ispiranja destilovanom vodom (kako bi se uklonio miris acetona), na kraju

kuvanjem papira (1h na 100ºC) u destilovanoj vodi, dobija se gotov supstrat, nakon što

iscedimo višak vode.

17

Slika 4. Izgled standardne celulozne (levo) i tegle sa čvrstom podlogom

(desno)(Autor: D. Savić)

Larve su hranjene svakodnevno TetraMin® mešavinom riblje hrane (Sastav hrane:

biljni sastojci, riba i riblji proizvodi, belančevine, ţitarice, alge, ulja, masti, školjke, minerali,

šećeri, rakovi, kvasac, lecitin). Hrana je pripremana usitnjavanjem i rastvaranjem 1g mešavine

riblje hrane u 10ml destilovane vode.

2.2 Postavka eksperimenta

Eksperiment je započet sakupljanjem položenih jaja u petrijeve posude, na ovaj način

bila je tačno poznata starost i poreklo jedinki (Slika 5). U petrijevim posudama nalazila se voda

iz akvarijuma, jaja su uzgajana do stadijuma larvi, kada je započeta sledeća faza eksperimenta,

odnosno prebacivanje larvi hironomida u tegle sa specifičnim supstratima.

Slika 5. Izgled sveže položenih paketa jaja (levo) i paketi jaja pokupljeni u Petrijeve

posude (desno) (Autor: D. Savić)

18

U eksperimentu je rađeno sa 5 različitih vrsta sedimenata, takođe istraživanje je

sprovedeno po OECDprotokolu(Organisation of Economic Cooperation and Development),

tačnije OECD testa broj 218, dizajniranog za procenu uticaja dugotrajnog izlaganja

hemikalijama, korišćenjem larvi hironomida koje žive u sedimentu kao model

organizama(OECD, 2016).

Sedimenti koji su korišćeni u eksperimentu su :

1. Standardna podloga – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj vodi, 186,66g kaolinske

gline i 700g kvarcnog peska;

2. Standardna podloga sa medicinskom glinom – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj

vodi, 186,66g medicinske gline i 700g kvarcnog peska;

3. Standardna podloga bez peska – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj vodi i 186,66g

kaolinske gline;

4. Standardana podloga bez gline – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj vodi i 700g

kvarcnog peska;

5. Standardna podloga bez treseta – 186,66g kaolinske gline i 700g kvarcnog peska.

Za postavku različitih tretmana korišćene su staklene posude, zapremine 600ml, u koje

je stavljen sediment debljine sloja 2cm. Na to je dodata mešavina česmenske vode (koja je

prethodno dehlorisana; pH 6.52±0.4; tvrdoća7.3 °dH; provodljivost 325 μS/cm3) i destilovane

vode u razmeri 1:1. Eskperiment sa svakim tipom supstrata rađen je u triplikatu. Na sediment

stavljano je po 20 jedinki, larvi prvog stupnja hironomida, temperatura je održavana na 21 ±

1ºC pomoću vodenog kupatila, aeracija pomoću vazdušnih pumpi za akvarijum, fotoperiod sa

16-8 dnevno-noćnim režimom. Hrana je dodavana svakodnevno u tegle, u vidu razblaženja

(0,15g TetraMin® i 9ml dH2O), po 0,5ml u svaku teglu. Eksperiment je nastavljen do trenutka

kada su sve larve dostigle poslednji stupanj larvenog stadijuma (11 dana), nakon čega su larve

hironomida iz svake tegle prikupljene i dalje čuvane u 70% etanolu (Slika 6).

19

Slika 6. Odrasle jedinke C. tentans i izgled adulta mužjaka (Autor: D.Savić)

2.3 Merenje dimenzija morfoloških karakteria

U toku daljeg sprovođenja eksperimenta merene su morfometrijske karakteristike larvi

hironomida kako bi se utvrdio uticaj delovanja različitih tipova sedimenata na određene

morfološke parametre. Izmerena je ukupna dužina tela larvi, dužina i širina glavene kapsule,

kao i mokra masa jedinki. Prvo su bila izvršena merenja celokupne dužine tela larvi, dok su

dimenzije glavene kapsule izmerene kasnije. Analiza karaktera izvršena je pomoću mikroskopa

(Nikonov stereoskopski mikroskop SMZ 745T, sa C-W 10xB/22 Nikon objektivom i 1x okularnim

uvećanjem),koji je digitalnim putem povezan sa računarom, što je omogućilo preciznije

merenje pojedinih morfometrijskih parametara. Larvehironomida su fotografisane

mikrokamerom dok su dimenzije dužine tela larvi, dužine i širine glave izmerene pomoću

softvera (MorphoJ). Merenje mokre mase larvi hironomida izvršeno je u laboratoriji pomoću

analitičke vage, koja meri sa preciznošću težine u 1mg.

20

2.4 Statističke metode

Nakon što je analizirana normalnost merenih parametara, razlike u težini larvi, dužini

tela i dužini i širina glave larvi hironomida, na različitim podlogama, testirane su

neparametrijskom analizom varijansi (Kruskal-Wallis-ov test). Za pojedinančna poređenja

tretmana korišćen je Mann-Whitney test (Karadžić i Marinković, 2009). Univarijantni

statistički testovi su primenjeni pomoću statističkog paketa SPSS 15.0.

3.REZULTATI I DISKUSIJA

Eksperiment je okončan nakon 11 dana, a sa svakog tipa podloge izolovan je određeni

broj larvi četvrtog stupnja (Tabela 1). Stopa mortaliteta manja od 30% dostignuta je na

standardnoj podlozi bez gline što je u skladu sa protokolom. Iako Kruskal-Wallis-ov test nije

potvrdio statistički značajne razlike (p>0.05) u stopi preživljavanja između različitih tipova

podloge, tretmani sa podlogom bez gline su pokazali najmanji mortalitet (Tabela 1). Može se

zaključiti da glina koja se nalazi u pojedinim podlogama, ispoljava toksično dejstvo na jedinke

vrste Chironomus tentans i zbog toga povećava nivo mortaliteta u svim tipovima podloge gde

je prisutna.

Tip podloge Standardna

podloga bez

treseta

Standardna

podloga bez

peska

Standardna

podloga sa

medicinskom

glinom

Standardna

podloga bez

gline

Standardna

podloga

Broj

tretmana

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Broj

preživelih

larvi po

tretmanu

12

13

13

9

13

11

13

15

9

17

20

14

13

14

7

Ukupno

preživelih

larvi

38

33

37

51

34

Tabela 1. Broj preživelih larvi po tretmanima (tipu podloge)

21

Mokra masa tela larvi hironomida je značajno varirala (Kruskal-Wallis-ov test;

p<0.0001) između različitih tipova podloge (Grafik 1). Mann-Whitney test je pokazao da

hironomide gajene na standardnoj podlozi (4) i podlozi bez peska (5) imaju značajno veću masu

od jedinki gajenih na ostalim podlogama (1-pesak+treset, 2-medicinska glina+treset, 3-

glina+pesak; slika2).

Grafik 1.Srednja vrednost mokre mase larvi hironomida na različitim tipovima podloge (1-

pesak+treset, 2-medicinska glina+treset, 3-glina+pesak, 4-standardna podloga i 5-

glina+treset); Grupe koje ne dele isto slovo su statistički značajne, Mann-Whitney test

p<0.05)

Morfometrijski parametri dužina tela (Grafik 2) i širina glave (Grafik 3) su pokazali

sličan obrazac varijabilnosti na različitim podlogama kao i mokra masa (Kruskal-Wallis-ov

test; dužina tela p<0.010 i širina glave p<0.008).

a

b

a

a

b

22

Grafik 2.Srednja vrednost dužine tela larvi hironomida na različitim tipovima podloge (1-

pesak+treset, 2-medicinska glina+treset, 3-glina+pesak, 4-standardna podloga i 5*-

glina+treset); Grupe koje ne dele isto slovo su statistički značajne, Mann-Whitney test

p<0.05)

Dužina tela larvi značajno se razlikuje kod jedinki koje su uzgajane na podlozi 1 u

odnosu na larve sa podloge 5, statistički značajna razlika u vrednosti parametra dužine tela

hironomida postoji i između jedinki uzgajanih na podlozi 2 naspram jedinki sa podloge 5.

Mann-Whitney test pokazao je i da postoji značajna razlika u dimenziji tela larvi između

jedinki sa podloge 3 u odnosu na hironomide sa podloge 4 i 5, koje imaju veće dimenzije tela

u odnosu na larve sa ostalih tipova podloge.

b b

a

a

a

23

Grafik 3.Srednja vrednost širine glave larvi hironomida na različitim tipovima podloge (1-

pesak+treset, 2-medicinska glina+treset, 3-glina+pesak, 4-standardna podloga i 5-

glina+treset);Grupe koje ne dele isto slovo su statistički značajne , Mann-Whitney test p<0.05

Statistička obrada podataka pokazala je da postoje značajne razlike između dimenzija

širine glave kod jedinki uzgajanim na različitim tipovima podloge. Larve sa podloge 1

pokazuju značajne razlike u srednjoj vrednosti parametra širine glave u odnosu na jedinke sa

podloga 2, 3 i 5, čije su dimenzije širine glave veće. Mann-Whitney test takođe pokazuje da

postoji značajna razlika između širine glave kod jedinki sa podloge 4 u odnosu na larve sa

podloga 2 i 3. Kao i da je podloga 5 dala jedinke koje imaju značajno veće dimenzije širine

glave u odnosu na larve sa podloge 4.

а b b a b

24

Grafik 4. Srednja vrednost dužine glave larvi hironomida na različitim tipovima podloge (1-

pesak+treset, 2-medicinska glina+treset, 3-glina+pesak, 4-standardna podloga i 5-

glina+treset)

Konačno, dužina glave jedinki hironomida nije značajno varirala (Kruskal-Wallis-ov

test; p<0.099) između različitih tipova podloga (Grafik 4).

U sličnim istraživanjima proučavan je efekat različitih tipova podloga na biomasu i

stopu preživljavanja larvi hironomida (Bird, 1995). Iako je postojala mala razlika u

vrednostima ovih parametara, vrednosti su bile od dovoljne značajnosti i ukazivale su na

povoljnost podloge bazirane na celuloznom sastavu. Larve koje su uzgajane na ovom tipu

supstrata pokazale su veću stopu preživljavanja kao i veće srednje vrednosti u dimenzijama

tela od drugih. Podloge bazirane na komponentama šljunka i grubog peska u ovim

istraživanjima pokazale su da jedinke hironomida imaju manje dimenzije tela u odnosu na larve

sa celulozne podloge (Bird, 1995). U poređenju sa rezultatima našeg istraživanja rezultati se

25

razlikuju u odnosu na jedinke sa standardne podloge (4) i podloge glina+treset (5), koje su

pokazale značajno veće dimenzije dužine tela u odnosu na larve sa drugih tipova podloge koje

su sadržale veći procenat peska. Podloga 5 predstavlja supstrat koji ne sadrži primese peska

kao sastavnu komponentu. U nasem istraživanju celulozna podloga korišćena je u inicijalnoj

fazi eksperimenta za potrebe stvaranja čiste kulture hironomida, jer se pokazala kao supstrat sa

najpovoljnijim uslovima za uzgoj kulture C. tentans.

Manje dimenzije tela kao i stope preživljavanja u pojedinim istraživanjima u kojima su

se larve hironomida uzgajale na podlogama baziranim na pesku kao glavnoj komponenti

dokazala su da je ovakav tip podloge siromašniji supstrat za hironomide. Zbog određene

granulacije moguće je da hranljive supstance propadaju između čestica peska, što otežava

ishranu larvi i manifestuje se sporijom stopom rasta larvi (Bird, 1995).

Što se tiče dimenzija širine glave po rezultatima ovog eksperimenta može se zaključiti

da postoji statistički značajan stepen varijabilnosti ovog parametra kod larvi hironomida u

odnosu na tip podloge na kom su uzgajane. Pojedina istraživanja pokazala su slične rezultate,

sa osvrtom na stepen deformacija koje određeni tip podloge može izazvati na mentumu

larvi(Janssens de Bisthoven et al. 1992).Podloge sa peskom u većoj meri izazivaju deformitete,

ali poznato je i da populacije hironomida zbog inbridinga poseduju određeni urođeni stepen

deformiteta. Kako je dokazano, oštećenja mentuma i ostali tipovi urođenih deformiteta ne utiču

na dimenzije larvi tačnije na njihov rast i razviće (Bird, 1995).

Eksperimenti u kojima je određivana mokra masa jedinki pokazala su da je veličina tela

larvi u vezi sa mokrom masom larvi(Dermott i Paterson, 1974). Larve koje su imale veće

telesne dimenzije pokazale su se kao praktičnije za rad pri sprovođenju metode za određivanje

mokre maseU našem istraživanju rezultati su pokazali da su najveće vrednosti mokre mase

larvi zabeleženi na podlogama 4 (standardna podloga) i 5 (glina+treset) (Grafik 1). Na grafiku

2 se jasno vidi da je dužina tela najveća kod larvi koje su takođe uzgajane na istim tipovima

podloge (4 i 5).

26

4. ZAKLJUČAK

Prisutnost određenih kontaminanata u životnoj okolini može se utvrditi sprovođenjem

hemijskog monitoringa ili različitih tipova bioeseja u laboratorijskim uslovima. Na ovaj način

biološkim monitoringom možemo proučiti uticaj koji određeni toksikanti ili druge komponente

sredine imaju na organizme.

Chironomus tentanspredstavlja idealni test organizam, koji se može koristiti kao

indikatorski organizam pomoću koga možemo proceniti kvalitet uslova vodenih ekosistema.

Zbog životnog ciklusa i građe organizma ovom vrstom lako se može manipulisati u

laboratorijskim uslovima. Rezultati ovog istraživanja pokazali su da postoji statistički značajna

razlika u varijabilnosti dimenzija tela i širine glave, kao i mokre mase jedinki u odnosu na tip

podloge na kojoj su uzgajane. Podloge sa primesama gline treba izbegavati u bioesejima jer

izazivaju smrtnost larvi u većoj meri. Ostali tipovi podloge iz eksperimenta mogu se koristiti u

bioesejima, sa posebnim osvrtom na standardni tip podloge i podloge sa glinom i tresetom koje

su pokazale najviši stepen značajnih promena varijabilnosti morfometrijskih osobina kod larvi

Chironomus tentans.

Osetljivost larvi hironomida na uslove sredine je velika i potencijal ove grupe

organizama treba dalje iskoristiti u sprovođenju ekotoksikoloških testova i biomonitoringu

kako bi se procenio i zaštitio kvalitet vodenih ekosistema kao životne sredine.

Literatura

Ali, A., 1991: Perspectives on management of pestiferous Chironomidae (Diptera), an

emerging global problem. Journal of the American Mosquito Control Association 7:

260-281.

Ali, A., R. D. Baggs, J. P. Stewart.,1982 : Susceptibility of some Florida chironomids

andmosquitoesto various formulations of Bacillus thuringiensisserovar. israelensis. J.

Econ. Entomol. 74:672-67

Ali, A. and M. S. Mulla., 1978 : Chironomid population changes in an intermittent water

spreading system.Mosq. News 38: 386-392.

Ali, A. and M. S. Mulla., 1976 : Substrate type as afactor influencing spatial distribution of

chironomid midges in an urban flood control channel system. Environ. Entomol. 5:631-

636.

Arambourou H, Beisel J-N, Branchu P, Debat V., 2012: Patterns of Fluctuating Asymmetry

and Shape Variation in Chironomus riparius (Diptera,Chironomidae) Exposed to

Nonylphenol or Lead. Plos one. Vol. 7. pp. 11.

Armitage, P. D., Cranston, P. S., Pinder, L. C. V., 1995 : The Chironomidae: biology and

ecology of non-biting midges. London: Chapman & Hall.

Batac-Catalan, Z., White, S., 1982: Creating and Maintaining Cultures of Chironomus

tentans(Diptera: Chironomidae).Entomology News. Vol.93. pp. 54–58.

Bauer, G., Hochwald, S., Silkenat, W., 1991: Spatial distribution of freshwater mussels: the

role of host fish and metabolic rate. Freshwater Biology. Vol. 26. pp. 377–386.

Bird, G. A., 1995: Deformities in Cultured Chironomus tentans larvae and the influence of

substrate on growth, survival and mentum wear. Environmental Science Branch.

Bird, G. A., 1994: Use of chironomids deformities to asses environmental degradation in the

Yamaska river, Quebac. Environmental Monitoring and Assesment. Vol. 30. pp. 163-

175.

Bisthoven L., Ollevier, F, 1998: Experimental Induction of Morphological Deformities in

Chironomus riparius Larvae by Chronic Exposure to Copper and Lead. Environmental

contamination and toxicology. Vol. 35. pp. 249-256.

Coffman, W. P., 1995: The chironomidae: biology and ecology of non-biting midges. Chapman

and Hall, London, pp 436–447

Dermott, R.M., Paterson, C.G., 1974:Determining dry weight and percentage dry matter of

chironomid larvae. Canadian Journal of Zoology.Vol. 52. pp. 1243-1250.

De Kock, W.C., Kramer, K.J.M., 1994: Active Biomonitoring (ABM) by translocation of

Bivalves mollusks. Biomonitoring of Coastal Waters and Estuaries. CRC Press. Boca

Raton, FL, US. pp. 51-84.

De Zwart, D., 1995: Monitoring water quality in the future. Biomonitoring. National Institute

for Public Healt and Environmental Protection. Bilthoven. The Netherlands, Vol.3. pp.

1-81.

Environmental Protection Agency, US, 1996: Ecological Effects Test Guidelines OPPT

850.1000 Special Considerations for Conducting Aquatic Laboratory Studies, 712–C–

96–113.

Edwards, R. W., H. Egan, M. A. Learner., P. J.Maris., 1964 : The control of chironomid larvae

in ponds, using TDE(DDD). Journal of Applied Ecology.Vol 1. pp. 97-11.

Giesy, J. P.,Graney, R. L.,Newsted, J. L., Rosiu, C. J.,Benda, A., Kreis, R. G., Horvath, F. J.,

1988: Comparison of Three Sediment Bioassay Methods Using Detroit River

Sediments. Environmental Toxicology Chemistry. Vol. 7. pp. 483–498.

Habashy, M. M., 2005: Culture of Chironomid larvae (Insecta-Diptera-Chironomidae) unde

different feeding systems. Egyptian Journal of Aquatic research. Vol. 31. pp. 403-418.

Hamilton, A.L., O.A. Sæther, 1971: The occurrence of characteristic deformities in the

chironomid larvae of several Canadian lakes. Canadian Entomologist . Vol.103.

pp.363–368.

Janssens de Bisthoven, L. G., Timmermans, K. R., Ollevier, F., 1992 : The Concentration

ofCadmium, Lead, Copper and Zinc in Chironomus thummi Larvae (Diptera,

Chironomidae)with Deformed Versus Normal Mentum.Hydrobiology. Vol.239.

pp.141–149.

Janković, M. J., 1982: Chironomid larvae as bioindicators of the organic pollution. Academie

Serbe des Sciences et des Arts.

Johns, C., Luoma, C.N., 1990: Arsenic in benthic bivalves of San Francisco Bay and the

Sacramento/San Joaquin River delta. Science Total Environment. Vol. 97/98. pp. 673-

684.

Karadžić, B., Marinković, S., 2009: Kvantitativna ekologija. Institut za biološka istraživanja

“Siniša Stanković”. Beograd.

Kranzfelder P., Anderson A., Egan A., Ferrignton L. C., 2015: Use of Chironomidae (Diptera)

Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies.

Journal of visualized experiments.

Lam, P.K.S., 2009: Use of biomarkers in environmental monitoring. Ocean Coast. Manage.

Vol. 52. pp. 348-354.

Lazarević, M., Milovanović, D., Simonović, P., Simić, V., Simić, S., Cakić, P., Paunović, M.

2010 : The Danube in Serbia. Institut za biološka istraživanja ”Siniša Stanković”,

Beograd. p.p. 15-30.

Lenat, D. R., 1993: Using mentum deformities of Chironomus larvae to evaluate the effects of

toxicity and organic loading in streams. The North American Benthological Society.

Vol. 12. pp. 265-269.

Lenat, D. R.,1983: Chironomid taxa richness: natural variationand use in pollution assessment.

Freshwater Invertebrate Biology. Vol. 2. pp. 192–198.

Li, L., Zheng, B., Liu, L., 2010 : Biomonitoring and bioindicators used for river ecosystems:

definitions, approaches and trends. Procedia Environment Science. Vol 2. pp. 1510-

1524.

Markert B.A., Breure A.M., Zechmeister H.G., 2003: Bioindicators and Biomonitors. Elsevier

Science Ltd. Kidlington, Oxford. pp. 240.

Marković, V., 2014: Morfološka varijabilnost i distribucija roda Theodoxus Montfort, 1819

(Neritomorpha, Gastropoda) u centralnom delu Balkanskog poluostrva i na južnom

obodu Panonske nizije. Doktorska disertacija, Biološki fakultet, Univerzitet u Begradu.

Milošević, Đ., 2013: Larve familije Chironomidae (Diptera, Insecta) sliva Južne Morave i

njihova primena u proceni ekološkog statusa tekućih vodenih ekosistema. Doktorska

disertacija. PMF univerziteta u Kragujevcu.

Moriya, K. 1977. Seasonal prevalence of Chironomus yoshimatsui. Jap. J. Sanit. Zool. 28:63.

OECD, 2016: Test No. 218: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Sediment.

(http://dx.doi.org/10.1787/9789264070264-en ).

Paunović, M., 2007: Struktura zajednica makroinvertebrata kao indikator tipova tekućih voda

Srbije. Doktorska disertacija, Biološki fakultet, Univerzitet u Begradu.

Ratte, H. T., Hammers-Wirtz, M., Cleuvers, M., 2003: Ecotoxicity testing. In Trace Metals

and other Contaminants in the Environment. Elsevier. Vol. 6, pp. 221-256

Rosenberg, D.M., Resh, V. H., 1993: Freshwater biomonitoring and benthic

macroinvertebrates. Chapman & Hall, New York.

Slobodnik, J., 2013: Emerging Environmental Pollutants in the Context of Risk Assessment of

European River Basin. UNESCO Conference on Emerging Pollutants in Water,

Belgrade, Serbia. pp. 35-38.

Van Gestel, C.A.M., Van Brummelen, T.C., 1996: Incorporation ofthe biomarker concept in

ecotoxicology calls for a redefinition of terms.Ecotoxicology. Vol.5. pp. 217-225.

Warwick, W. F., Tisdale, A. N., 1988: Morphological deformities in Chironomus,

Cryptochironomus, and Procladius larvae (Diptera:Chironomi-dae) from two

differentially stressed sites in Tobin Lake, Saskatchewan. Canadian Journal of Fish-

eries and Aquatic Sciences. Vol. 45. pp. 1123-1144.

Watts, M., Pascoe, D., 1998: Selection of an appropriate life-cycle stage of Chironomus

riparius Meigen for use in chronic sediment toxicity testing. Chemosphere. Vol.36. pp.

1405-1413.

Wentsel, R.,McIntosh, A., McCafferty,W. P., 1978: Emergence of theMidgeChironomus

tentansWhen Exposed to Heavy Metal Contaminated Sediment. Hydrobiology.Vol. 57.

pp 195–196.

Wright, D., Welbourn, P., 2002: Environmental toxicology. The press syndicate of the

University of Cambridge, Cambrige UK.

Who International Programme On Chemical Safety – IPCS, 1993: Biomarkers and risk

assessment: concepts and principles. Environmental Health Criteria 155. World Health

Organization. Geneva, Switzerland.

Zhou, Q., Zhang, J., Fu, J., Shi, J., Jiang, G., 2008: Biomonitoring: an appealing tool for

assessment of metal pollution in the aquatic ecosystem. Anal. Chim. Acta.Vol. 606. pp

135-150.

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редниброј, РБР:

Идентификациониброј, ИБР:

Типдокументације, ТД: монографска Типзаписа, ТЗ: текстуални / графички Врстарада, ВР: мастер рад Аутор, АУ: Настасја Манић Ментор, МН: Ђурађ Милошевић Насловрада, НР:

Утицај типа подлоге на варијабилност

морфометријских параметара код врсте

Chironomus tentans у тестовима токсичности Језикпубликације, ЈП: српски Језикизвода, ЈИ: енглески Земљапубликовања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2018. Издавач, ИЗ: ауторскирепринт Местоиадреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/

цитата/табела/слика/графика/прилога)

43стр. ; граф. Прикази 11

Научнаобласт, НО: Биологија Научнадисциплина, НД: екологија Предметна одредница/Кључне

речи, ПО: Екотоксиколошки тестови, мониторинг, заштита

животне средине УДК

Чувасе, ЧУ: библиотека

Важнанапомена, ВН:

Извод, ИЗ: Резултати овог истраживања показали су да

постоје статистички значајне разлике између

дужине тела и ширине главе ларви хирономида у

зависности од типа подлоге.

Тестиран је и утицај подлоге на вијабилност

ларви, где се показало да подлоге које садрже

глину изазивају већу стопу морталитета код ларви

Chironomus tentans.

Датумприхватањатеме, ДП:

Датум oдбране, ДО:

08. 10. 2018

Члановиком

исије, КО:

Председник: Ана

В.Савић

Члан: Владимир

Ј. Цветковић

Члан, ментор:

Ђурађ Д.

Милошевић

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: Master thesis Author, AU: Nastasja Manic Mentor, MN: Djuradj Milosevic Title, TI: The influence of substrate type on morphometric

parameters of Chironomus tentans Fabricius, 1805 in

toxicity tests

Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2018 Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

43 p. ; graphic representations 11

Scientific field, SF: biology Scientific discipline, SD: ecology Subject/Key words, S/KW: Ecotoxicology tests, monitoring, environment quality

monitoring

UC

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: Results obtained from this research points out statistically

significant variability of body length and head width, so as significant

differences of dry weight between larvae which were cultivated on

different substrate types. Also, substrate type effects on viability rate

of chironomids were tested. Results points to higher mortality rates of

Chironomus tentans larvae from substrate which had clay as

component.

Accepted by the Scientific Board on,

ASB:

Defended on, DE: 08.10.2018

Defended

Board, DB:

President: Ana V.

Savic

Member: Vladimir

J. Cvetkovic

Member, Mentor:

Djuradj D.

Milosevic