master rad - web1.pmf.ni.ac.rs€¦ · 1.1.2. habitus i anatomija pinus sylvestris je drvo visoko...

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Diferencijacija i fitohemijska raznovrsnost populacija

Pinus sylvestris centralnog dela Balkanskog poluostrva na

osnovu epikutikularnih voskova

MASTER RAD

Kandidat: Mentor:

Katarina Stamenković 191 Dr Zorica S. Mitić

Niš, 2017.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Differentiation and phytochemical diversity of Pinus

sylvestris populations from the central Balkans based on

epicuticular waxes

MASTER THESIS

Candidate: Mentor:

Katarina Stamenković 191 Dr. Zorica S. Mitić

Niš, 2017.

BIOGRAFIJA KANDIDATA

Katarina Stamenković rođena je 16. aprila 1993. godine u Prokuplju. Osnovnu školu

“Čegar” završava 2008. godine u Nišu, nakon čega upisuje gimnaziju “Bora Stanković”,

prirodno-matematički smer. Prirodno-matematički fakultet u Nišu upisuje 2012. godine na

Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2015. godine i iste

godine upisuje Master akademske studije, smer Biologija, koje u predviđenom roku završava.

ZAHVALNICA

Najveću zahvalnost i poštovanje dugujem svom mentoru dr Zorici Mitić na

entuzijazmu, strpljenju i posvećenosti. Takođe, najlepše se zahvaljujem i članovima Komisije

za ocenu master rada dr Bojanu Zlatkoviću i dr Snežani Jovanović.

Bratu Nikoli i roditeljima,

jer su najveća podrška i moj vetar u leđa.

Hvala!

SAŽETAK

U radu je analizirana fitohemijska varijabilnost i diferencijacija populacija P.

sylvestris poreklom sa dva planinska sistema centralnog dela Balkanskog poluostrva

(Dinaridi i Balkansko-Rodopske planine). Kombinacijom GC/FID i GC/MS analize

epikutikularnih voskova izolovanih sa dvogodišnjih četina 29 jedinki P. sylvestris utvrđeno je

prisustvo četiri diterpena (pimaradien, sandarakopimaradien, 18-norabieta-8,11,13-trien i

abietartrien), tri primarna alkohola (1-heksadekanol, cis-9-oktadecen-1-ol i 1-oktadekanol) i

10 n-alkana u seriji od C20 do C31. Dominantne komponente voskova u populaciji sa Dinarida

su n-alkani C25, C27 i C23 (17.4, 13.1 i 8.1%) i alkohol cis-9-oktadecen-1-ol (9.7%), dok su u

populaciji sa Balkansko-Rodopskih planina alkohol cis-9-oktadecen-1-ol (14.1%) i n-alkani

C27, C29 i C25 (9.4, 8.2 i 8.1%) detektovani kao glavne komponente. Iako se, četinari se,

generalno, odlikuju niskim stepenom genetičke diferencijacije populacija usled efektivnog

protoka gena putem rasejavanja polena i semena i visoke konektivnosti populacija, ANOVA

je ukazala na hemijsku diferencijaciju ispitivanih populacija P. sylvestris na području

centralnog Balkana. Naime, od ukupno 17 ispitivanih komponenti epikutikularnih voskova,

šest poseduje visok nivo statističke značajnosti, što ukazuje na to da postoji statistički

značajna razlika između ispitivanih populacija na nivou pojedinih karaktera. Sa druge strane,

u saglasnosti sa činjenicom da četinare odlikuju izuzetno visok nivo genetičkog diverziteta u

populacijama i vrstama u celini, analizi glavnih komponenti (PCA) je ukazala na postojanje

tri različita hemotipa kod 29 ispitivanih jedinki P. sylvestris: hemotip 1 odlikuju voskovi sa

većim sadržajem n-alkana C22-C28; hemotip 2 voskovi sa većim procentom primarnih

alkohola i n-alkana C29; i hemotip 3 voskovi sa većim procentom diterpena i n-alkana C20 i

C21. U populaciji sa Dinarida utvrđeno je prisustvo sva tri tipa epikutikularnih voskova, dok

su u populaciji sa Balkansko-Rodopskih planina detektovani samo hemotipovi 2 i 3. Dobijeni

rezultati upoređeni su sa morfološkim, biohemijskim i molekularnim karakterima koji su

korišćeni u dosadašnjim istraživanjima diverziteta i diferencijacije P. sylvestris populacija.

Ključne reči: Pinus sylvestris, epikutikularni voskovi, Balkan, PCA

ABSTRACT

This paper includes analysis of phytochemical variability and differentiation of P.

sylvestris populations from two mountain systems in the central part of Balkan Peninsula

(Dinarides and Balkan-Rhodope mountains). Combination of GC/FID and GC/MS analyses

of epicuticular waxes isolated from two-year-old needles from 29 individuals of P. sylvestris

has shown presence of four diterpenes (pimaradiene, sandaracopimaradiene, 18-norabieta-

8,11,13-triene and abietatriene), three primary alcohols (1-hexadecanol, cis-9-octadecen-1-ol

and 1-octadecanol) and 10 n-alkanes ranging from C20 to C31. The dominant wax components

in Dinaride populations were n-alkanes C25, C27 and C23 (17.4, 13.1 and 8.1%, respectively)

and alcohol cis-9-octadecen-1-ol (9.7%), while the main components recorded in the

populations from Balkan-Rhodope mountains were alcohol cis-9-octadecen-1-ol (14.1%) and

n-alkanes C27, C29 and C25 (9.4, 8.2 and 8.1%, respectively). Although conifers are generally

characterized by a low level of genetic differentiation of populations due to effective gene

flow through pollen and seed dispersal and high connectivity of populations, ANOVA

indicated a possibility of chemical differentiation of studied P. sylvestris populations in the

area of central Balkans. Out of 17 studied components of epicuticular waxes, six have shown

a high level of statistical significance, indicating a statistically significant difference in certain

characters between the studied populations. On the other hand, in accordance with the fact

that conifers are characterized by extremely high level of genetic diversity within populations

and species, the principal component analysis (PCA) has shown existence of three different

chemotypes in 29 studied individuals of P. sylvestris: chemotype 1 was characterized by

waxes with higher percentage of n-alkanes C22-C28; chemotype 2 by high percentage of

primary alcohols and n-alkane C29; and chemotype 3 by high percentage of diterpenes and n-

alkanes C20 and C21. All three types of epicuticular waxes were recorded in the Dinaride

population, while only chemotypes 2 and 3 were recorded in the population from Balkan-

Rhodope mountains. The data collected in this study were compared with morphological,

biochemical and molecular characters used in previous studies of diversity and differentiation

of P. sylvestris populations.

Keywords: Pinus sylvestris, epicuticular waxes, the Balkans, PCA

SADRŽAJ

1. UVOD ................................................................................................................................................. 1

1.1. Opšte karakteristike vrste Pinus sylvestris ................................................................................... 1

1.1.1. Sistematski položaj ................................................................................................................ 1

1.1.2. Habitus i anatomija ................................................................................................................ 1

1.1.3. Stanište i distribucija ............................................................................................................. 2

1.1.4. Privredni značaj ..................................................................................................................... 5

1.2. Epikutikularni vosak: sastav i funkcija......................................................................................... 5

1.2.1. Opšte karakteristike i distribucija alkana............................................................................... 8

2. CILJEVI RADA .............................................................................................................................. 10

3. MATERIJAL I METODE .............................................................................................................. 11

3.1. Biljni materijal ............................................................................................................................ 11

3.2. Ekstrakcija epikutikularnih voskova .......................................................................................... 12

3.3. GC-FID i GC-MS analiza epikutikularnih voskova ................................................................... 12

3.4. Statistička analiza ....................................................................................................................... 13

4. REZULTATI ................................................................................................................................... 15

4.1. Hemijski sastav epikutikularnog voska četina P. sylvestris sa područja centralnog Balkana .... 15

4.1.1. Promenljivost pojedinačnih komponenti epikutikularnog voska ........................................ 17

4.1.2. Analiza varijanse (ANOVA) ............................................................................................... 22

4.1.3. Analiza glavnih komponenti (PCA) .................................................................................... 23

5. DISKUSIJA ...................................................................................................................................... 27

6. ZAKLJUČCI ................................................................................................................................... 30

7. LITERATURA ................................................................................................................................ 33

Katarina Stamenković Master rad

1

1. UVOD

1.1. Opšte karakteristike vrste Pinus sylvestris

1.1.1. Sistematski položaj

Pinus sylvestris L. (beli bor) pripada najvećoj (više od 230 vrsta), ekonomski

najznačajnijoj i filogenetski bazičnoj familiji četinara Pinaceae (Stefanović et al., 1998).

Prema filogenetskoj klasifikaciji kopnenih biljaka, koju su predložili Chase i Reveal 2009.

godine, ova vrsta pripada potklasi Pinidae (=Pinophyta, Pinopsida), redu Pinales i familiji

Pinaceae (tabela 1.1).

Tabela 1.1. Položaj vrste P. sylvestris u filogenetskom sistemu kopnenih biljaka.

Klasa (classis): Equisetopsida

Potklasa (subclassis): Pinidae

Red (ordo): Pinales

Familija (familia): Pinaceae

Podfamilija (subfamilia): Pinoideae

Rod (genus): Pinus

Podrod (subgenus): Pinus (Diploxylon)

Sekcija (section) Pinus

Podsekcija (subsection) Pinus

1.1.2. Habitus i anatomija

Pinus sylvestris je drvo visoko do 40 m, staro do 150-200 godina sa retkom, uskom do

ambrelasto raširenom krošnjom. Kora u donjem delu odraslog stabla sivosmeđa, debela, a u

gornjem delu, u regionu krošnje, sa tankim crvenkastosmeđim ljuspama (slika 1.1). Korenov

sistem vrlo plastičan, prilagodljiv. Mlade grančice u početku zelenožute, kasnije sivosmeđe.

Javljaju se po dve četine koje traju 2-3 godine, otvorenozelene, duge 4-7 cm, široke do 2 mm,

često uvrnute oko svoje ose (slika 1.2). Smoni kanali do epidersmisa; ćelije epidermisa imaju

jednaku visinu i širinu. Rukavci trajni, u početku dugi do 1 cm, kasnije kraći. Muške šišarke

(mikrostrobilusi) resoliko zbijeni. Ženske šišarke (makro-, megastrobilusi) zrele krajem


2

sledeće godine, sa jasnom drškom, sivosmeđe, bez sjaja, duge 2.5-7 cm, široke 2-3.5 cm.

Apofize piramidalno izvučene ili ravne, vrlo varijabilne. Seme sitno, dugo 3-4 mm, sa 3-4

puta dužim kriocetom. Oprašivanje je anemofilno, muški i ženski strobilusi se pojavljuju V i

VI meseca (Jovanović, 1992).

1.1.3. Stanište i distribucija

Beli bor ima veliku edafsko-klimatsku amplitudu, ali kao izrazita vrsta svetlosti,

osetljiv je na konkurenciju (naročito pri prirodnom podmlađivanju semenom) – senčenje

sciofilnih vrsta (bukva, jela, smrča i dr.). Pretežno je u montanom (planinskom) pojasu, iznad

1000 m nadmorske visine, ponekad i niže, mešajući se sa crnim borom. Javlja se najčešće na

serpentinu i krečnjaku, ali i na drugim geološkim supstratima. Opisan je izvestan broj

fitocenoza sa belim borom; Pinetum nigrae-sylvestris Z. Pav. 1951, je čest na serpentinskim

strmenima zapadne Srbije. Beli bor dominira na većim nadmorskim visinama i na staništima

sa blažim nagibom, dubljim i svežijim zemljištima. Javlja se, u manjoj meri, kao primešana

Slika 1.1. P. sylvestris iz zapadne Srbije (Tara, Zaovinsko jezero; foto: Zlatković, 2013)


3

vrsta, u fitocenozama kitnjaka, omorike, bukve, jele, smrče i molike. Beli bor je izložen

napadima velikog broja vrsta insekata i gljivica (Jovanović, 1992).

Slika 1.2. P. sylvestris iz jugozapadne Bugarske (Pirin, Dobrinište; foto: Zlatković, 2016)


4

P. sylvestris ima vrlo prostran areal u Evropi i Aziji; počev od istočnog dela

Pirinejskog poluostrva, Škotske i gotovo cele Skandinavije do oko 70 severne geografske

širine severne Azije, do Ohotskog mora (slika 1.3). Na jugu Evrope se javlja disjunktno na

visokim planinama sva tri velika poluostrva; takođe na Krimu i Kavkazu. Pripadnost flornom

elementu: Evroazijski borealno-subborealni (bor-temp), mont-subalp (Jovanović, 1992).

Za područje Srbije, Jovanović (1992) navodi sledeće lokalitete: severnozapadna

Srbija - Povlen, Maljen; zapadna Srbija - Zlatibor, Mokra gora, Tara; jugozapadna Srbija -

Slika 1.3. Oblast rasprostranjenja vrste P. sylvestris prema Euro+Med PlantBase (preuzeto sa:

http://euromed.luomus.fi/euromed_map.php?taxon=341361&size=medium)


5

Nova Varoš, Radočelo, Zlatar; centralna Srbija - Kopaonik, Stolovi, Studena; Metohija -

Prokletije, Mokra planina; Kosovo - Šar-planina (Jovanović, 1992).

1.1.4. Privredni značaj

Veoma važna šumska vrsta, vrlo često upotrebljavana pri pošumljavanju teških

terena (ispranih plitkih, degradiranih zemljišta), peskova, brdskih i planinskih krajeva. Brzo

rastuća vrsta, naročito od 10 do 40 godina. Česta po parkovima i gradskom zelenilu. Drvo je

veoma upotrebljivo: građevinsko i stolarsko drvo, vodogradnje, rudničko drvo, stubovi za

vodove, pragove, elise, celulozno drvo, ploče vlaknatice, pougljavanje. Smolarenjem se

dobija smola. Iz panjeva i otpadaka dobija se katran i terpentinsko ulje. Mlade grančice i

četine se upotrebljavalju u medicini (Jovanović, 1992).

1.2. Epikutikularni vosak: sastav i funkcija

Kada su prve biljke, pre 460 miliona godina, napustile vodenu sredinu i “preselile se”

na kopno, za novu sredinu, razvile su zaštitni omotač – intaktnu ekstracelularnu membranu, tj.

kutikulu. Preko kutikule biljka ostvaruje kontakt sa svojom okolinom. Struktura kutikule

varira u zavisnosti od biljne vrste, organa i faze razvića (Jovanović, 2016).

Biljna kutikula je lipofilna struktura nataložena na spoljašnjim zidovima

epidermalnih ćelija. Na osnovu rastvorljivosti u organskim rastvaračima razlikuju se dva

osnovna tipa komponenti biljne kutikule: lipofilna jedinjenja koje se oslobađaju ekstrakcijom

u organskim rastvaračima kolektivno su označena kao "kutikularni vosak", dok je lipofilna

komponenta koja se ne može ekstrahovati zbog polimerne strukture označena kao "kutin"

(Šarac et al., 2014).

Vosak ima veoma značajnu ulogu u životu svake vaskularne biljke. U najširem

smislu, biljka preko njega ostvaruje kontakt sa svojom okolinom: funkcionalni i ekološki

aspekt (Reicosky i Hanover, 1978; Post-Beittenmiller, 1996; Kunst i Samuels, 2003; Maffei,

et al. 2004; Koch, et al. 2008, prema Jovanović 2016).

Štiteći biljku od štetnih uticaja sredine, njegova struktura i sastav se menjaju. Među

mnogobrojnim faktorima sredine, najprimetnije promene izazivaju temperatura i intenzitet

svetlosti. Promene u strukturi se češće dešavaju kod epikutikularnih voskova sačinjenih od

predstavnika različitih klasa jedinjenja u odnosu na voskove u kojima dominira samo jedna

klasa jedinjenja.


6

Najčešća i najzastupljenija grupa jedinjenja u kutikularnim voskovima su alifatični,

acikični, negranati, zasićeni ugljovodonici, koji sadrže najmanje 20 ugljenikovih atoma.

Ovakva "dugolančana jedinjenja" nastaju elongacijom masnih kiselina sa više od 18

ugljenikovih atoma i daljom modifikacijom u odgovarajuće alkane, aldehide, ketone,

primarne i sekundarne alkohole, kao i estre koji se formiraju između masnih kiselina i

alkohola (Samuels et al., 2008). Manje zastupljena grupa jedinjenja u kutikularnim voskovima

mnogih biljnih vrsta su pentaciklični triterpenoidi. U kutikularnom vosku pojedinih biljnih

vrsta mogu se naći i aromatična jedinjenja, ali u manjim količinama (Jetter et al., 2007).

Vosak prožima kutikulu celom debljinom, pri čemu je jedan deo voska ugrađen u

kutinski polimerni matriks (intrakutikularni vosak), a drugi nataložen na spoljašnjoj

površini kutina (epikutikularni vosak) (Jeffree, 1996). Naime, intrakutikularni vosak je

amorfna smeša lipida uronjenih u kutin, koja povezuje kutikulu sa ćelijskim zidom, dok se

epikutikularnim voskom smatraju površinski lipidi (u kontaktu sa atmosferom) nataloženi na

spoljašnjoj površini kutina. Istraživanja pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije (SEM)

otkrila su da epikutikularni vosak formira površinski voštani film sa posebnim

trodimenzionalnim strukturama (kristaloidima) koje štrče u atmosferu i čiji oblik, veličina, i

orjentacija u odnosu na površinu izuzetno variraju kod različitih biljnih vrsta (Barthlott et al.,

1998; Jeffree, 2006). Prema Koch i sar. (2008), najčešći mikromorfološki tipovi

epikutikularnih voštanih kristaloida koji se sreću u biljnom svetu su: korice, pločice, štapići,

tubule (cevčice), končaste strukture itd.


7

Kod golosemenica, voštani kristaloidi uglavnom imaju izgled tubula i odlikuje ih

dominacija sekundarnog alkohola nonakozan-10-ola (tzv. nonakozanol-tubule, Barthlott et al.,

1998). Nonakozan-10-ol je dominantna komponenta kutikularnih voskova većine

golosemenica (Ginkgo, Pinus, Abies, Picea, Wollemia, Taxus itd.) kao i nekih

skrivenosemenica, i smatra se odgovoranim za tubularnu mikrostrukturu epikutikulanog

voštanog sloja kod ovih biljaka (Jeffree, 2006). Iako se hemijski sastav različitih tipova

kristaloida odnosi na dominantnu komponentu ukupnog ekstrahovanog voska, nekoliko

istraživanja potvrdilo je sposobnost nonakozan-10-ola da rekristališe in vitro u formi tubula

(Jetter i Riederer, 1994; Ensikat et al., 2006). Kod Pinus spp., voštane tubule su vrlo guste, sa

mrežastim izgledom, i koncentrisane uglavnom u stominim komorama, dok najveću površinu

četina prekriva glatki voštani sloj, tj. amorfni vosak, sa uočljivim granulama na pojedinim

mestima (slika 1.4; Mitić et al., nepublikovani podaci).

Fizičke i hemijske osobine kutikularnih voskova određuju neke od vitalnih funkcija

biljaka (Šarac, 2014). Pre svega, vosak značajno redukuje nestomaternu transpiraciju, a veza

Slika 1.4. SEM mikrografija voštanih tubula u stominoj komori u na licu četine P. nigra

(Mitić et al., unpublished data)


8

između kserofitnog karaktera pojedinih biljaka i količine lisnih kutikularnih voskova je

potvrđena u velikom broju radova. Vosak, takođe, štiti biljku od raznih spoljašnih uticaja:

vetra, snega, mraza i ultravioletnog zračenja (Reicosky i Hanover, 1978; Barnes et al., 1996);

redukuje zadržavanje vode na površini biljaka, smanjuje apsorpciju prašine, polena i ostalih

zagađujućih materija iz vazduha (Kerstiens, 1996; Barthlott i Neinhaus, 1997) pri čemu

pokazuje osobinu "samo-čišćenja" (lotus efekat – Barthlott i Neinhaus, 1997). Takođe,

pokazano je da kutikularni vosak ima značajnu ulogu u zaštiti biljaka od mnogih bakterijskih i

fungalnih infekcija (Jenks et al., 1994) i da učestvuje u različitim interakcijama između

biljaka i insekata (Eigenbrode i Espelie, 1995).

Analiza hemijskog sastava epikutikularnog voska se izvodi nakon njegovog

izolovanja. Najčešće korišćena metoda za ekstrakciju je tzv. spiranje sa površine biljnog

organa pogodnim rastvaračem (heksan, hloroform, itd.) ili potapanjem materijala u rastvarač.

Obzirom na isparljivost voštanih jedinjenja, gasna hromatografija i masena sprektrometrija

(GC i MS) su tehnike koje se najčešće koriste za analizu konstituenata smeše voska

(Jovanović, 2016).

1.2.1. Opšte karakteristike i distribucija alkana

Alkani su zasićeni ugljovodonici, poznati pod nazivom parafini. Sastoje se od dva

elementa: ugljenika (C) i vodonika (H), povezanih kovalentnim vezama. Veličinu alkana

određuje broj međusobno vezanih C atoma. Alkani sa više od tri C atoma mogu formirati

različite strukturne izomere. Na taj način možemo razlikovati linearne, normalne alkane (n-

alkane), sa ugljenikovim skeletom cik-cak strukture i opštom formulom: CnH2n+2 i račvaste

(iso-alkane) sa opštom formulom CnH2n+2, n>3 (Nikolić, 2008).

Alkani doprinose hidrofobnosti epikutikularnog voska. Štiteći biljne organe od

gubitka vode isparavanjem, oni predstavljaju primarnu barijeru ka spoljašnjoj sredini. Biljke

sintetišu dugolančane alkane i to češće sa neparnim nego sa parnim brojem C- atoma, pri

čemu je sadržaj jednog ili dva predstavnika dominanatan u vosku. Kod većine terestričnih

biljaka najzastupljeniji su n-alkani C27, C29 i C31, koji ponekad čine i do 90% ukupnog sastava

voska (Nikolić, 2008). Akvatične biljke karakteriše dominacija n-alkana C23 i C25, dok je

dominacija n-alkana relativno kratkih nizova ugljenikovih atoma (C15, C17, i C19) utvrđena

kod nekih algi i cijanobakterija (Chikaraishi and Naraoka, 2003). U kutikularnim voskovima

četinara najčešće dominira n-alkan C31, a zatim C27, C29 i C25 (Maffei et al., 2004). Alkane


9

karakteriše izuzetna stabilnost, pa ih je moguće detektovati u svežem biljnom materijalu, ali i

u fosilnom materijalu, zemljištu i sedimentima.

Sadržaj alkana u voskovima varira u zavisnosti od biljne vrste, roda, familije, pa se

identifikovanje, kvantifikovanje i predstavljanje distribucije alkana u voskovima vrlo često

koristi u hemotaksonomskim studijama (Jovanović, 2016). Međutim, i pored neosporne

činjenice da su sastav i produkcija alkana u kutikularnim voskovima genetički determinisani,

kod alkana (kao i kod drugih sekundarnih metabolita biljaka) uočava se određena

varijabilnost, kao posledica uticaja različitih ekoloških faktora. Zbog toga je pre analize

taksonomskog značaja neophodno istražiti intra- i interpopulacionu varijabilnost alkana

određenog taksona. Takođe, pravilno uzorkovanje i doslednost u postupcima branja,

skladištenja i izolacije alkana su preduslovi validne interpretacije dobijenih rezultata (Marin,

2003).

Generalno, n-alkani se mogu okarakterisati kao dobri markeri na nižim nivoima

klasifikacije (do nivoa roda), osim u slučajevima njihove velike varijabilnosti u uzorcima.

Kada se taksoni na nivou vrste morfološki teško razlikuju, karakterističan sadržaj pojedinih n-

alkanskih nizova može da bude od koristi u njihovom diferenciranju. Mnoge studije su

pokazale da se n-alkani mogu koristiti i kao veoma informativni markeri u proučavanjima

geografske varijabilnosti i/ili identifikaciji infraspecijskih taksona Pinus (Nikolić et al.,

2012a; 2012b; Bojović et al., 2012; Šarac et al., 2016), Picea (Nikolić et al., 2013) i Juniperus

(Rajčević et al., 2014) vrsta. Tokom protekle dve decenije, Massimo Maffei je u seriji radova

publikovao veliku količinu rezultata istraživanja koja se bave taksonomskim značajem alkana

iz kutikularnih voskova različitih biljnih familija. Prema Maffei et al. (1996a; 1996b; 1996c;

1997; 2004) n-alkani mogu se koristiti kao pouzdani hemotaksonomski markeri na višim

nivoima klasifikacije, kao što su tribusi, potfamilije i familije.


10

2. CILJEVI RADA

Osnovni naučni ciljevi ovog istraživanja mogu se predstaviti u nekoliko teza:

1. Određivanje hemijskog sastava epikutikularnih voskova četina P. sylvestris

poreklom sa dva planinska sistema (Dinaridi i Balkansko-Rodopske planine)

centralnog dela Balkanskog poluostrva.

2. Uvrđivanje diverziteta i diferencijacije autohtonih populacija P. sylvestris sa

područja centralnog Balkana na nivou epikutikularnih voskova

3. Definisanje potencijalnih hemotipova istraživanih populacija P. sylvestris

4. Poređenje dobijenih rezultata sa morfološkim, biohemijskim i molekularnim

karakterima koji su korišćeni u dosadašnjim istraživanjima P. sylvestris


11

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Biljni materijal

Biljni materijal (dvogodišnje četine) P. sylvestris sakupljen je sa dva planinska sistema

centralnog Balkana (Dinaridi i Balkansko-Rodopske planine; tabela 3.1). Na području

Dinarida, materijal je sakupljen sa tri susedne planine iz zapadne i jugozapadne Srbije – Tara

(4 jedinke), Zlatibor (5 jedinki) i Zlatar (5 jedinki), koje su zbog svoje geografske blizine

tretirane kao jedna populacija; dok je sa područja Balkansko-Rodopskih planina analizirana

populacija iz jugozapadne Bugarske – Pirin (15 jedinki). Prilikom odabira pojedinačnih

stabala, nije se rukovodio superiornim morfološkim karakteristikama (npr. Visinski i

debljinski prirast, dužina četina i šišarki, oblik krune), već prostornom pokrivanju celokupne

populacije, odabirajući stabla na što većoj horizontalnoj i vertikalnoj razdaljini, u zavisnosti

od veličine odabrane populacije. Grančice su brane po celokupnom obimu donje trećine

krune. Uzorci svakog pojedinačnog stabla stavljani su u zasebnu polietilensku kesu, zajedno

sa oznakom lokaliteta, datumom sakupljanja i rednim brojem stabla, kako ne bi došlo do

mešanja uzoraka. Geografski položaj populacija je određen uz pomoć GPS uređaja (GPS

Garmin eTrex Vista® C). Orografske karakteristike staništa, pre svega nadmorska visina i

ekspozicija su preuzeti iz SRTM (Shuttle Radar Topography Mission) (Reuter et al., 2007)

digitalnog elevacionog modela rezolucije 90 x 90 m (Farr et al., 2007) pomoću softvera

ArcGIS 10 (ESRI, 2011) (tabela 3.1). Herbarski primerci su deponovani u Herbarijumu

Departama za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu (“Herbarijum

Moesiacum Niš” – HMN).

U ručnom frižideru uzorci su sa mesta sakupljanja prenešeni do zamrzivača (- 20°C)

na skladištenje do momenta upotrebe.


12

Tabela 3.1. Geografski položaj i stanišne karakteristike odabranih populacija P. sylvestris.

Takson P. sylvestris

Planinski sistem Dinaridi Balkansko-

Rodopske planine

Lokalitet Tara (Zaovinsko

jezero) Zlatibor (Tornik) Zlatar (Matovići) Pirin (Dobrinište)

Broj analiziranih

jedinki (n) 4 5 5 15

Geografska širina (N) 43°52'40.30“ 43°40'1.08“ 43°22'32.07“ 41°47'58.55“

Geografska dužina (E) 19°24'55.56'' 19°37'36.95“ 19°50'58.90“ 23°33'58.47“

Nadmorska visina (m

a.s.l.) 912 1159 1339 1480

Geološka podloga Serpentinit Serpentinit Krečnjak Silikat

Datum sakupljanja 26.06.2013. 28.04.2013. 19.05.2013. 02.07.2016.

Vaučer broj 6938 HMN 6919 HMN 6921 HMN 13099 HMN

3.2. Ekstrakcija epikutikularnih voskova

Epikutikularni voskovi ekstrahovani su potapanjem 5 g iglica u 10 ml n-heksana u

trajanju od 60 sekundi. Nakon toga ekstrakti su filtrirani, upareni do suvog stanja i zatim

rastvoreni u 1 ml n-heksana. Koncentrovani ekstrakti su frakcionisani na mini koloni

korišćenjem Paster pipete napunjene florisilom (60–100 mesh). Voskovi su dobijeni

eluiranjem sa 5 ml n-heksana, nakon čega su upareni do suvog, ponovo rastvoreni u 1 ml n-

heksana i čuvani na 4-6°C do dalje analize. Ekstarkcija voskova izvršena je posebno za svaku

jedinku (29 uzoraka).

3.3. GC-FID i GC-MS analiza epikutikularnih voskova

Hemijski sastav heksanskih ekstrakata je određen pomoću GC-FID (gasna

hromatografija sa plameno jonizacionim detektorom) i GC-MS (gasna hromatografija-masena

spektrometrija) tehnika analize. Svi uzorci su snimani u triplikatu, na 7890/7000B

GC/MS/MS tripl-kvadripol sistemu (Agilent Technologies, USA) sa Combi PAL auto-

semplerom i HP-5 MS kolonom (5% fenil metil siloksan, 30 m x 0.25 mm i.d. i 0.25 µm

debljina filma).


13

Temperaturni program: prvih 2.25 minuta izotermalno na 70 0C, zatim linearni porast

temperature, od 70 do 300 0C (5 °C min-1), potom izotermalno na 300 0C, zadnjih 10 minuta

programa. Injektovana zapremina uzorka 5 µL (split 2:1). Bekfleš (nakon završetka analize)

1.89 min, na 280 0C, sa helijumom pod pritiskom od 50 psi. MS uslovi: jonizacija -70 eV,

opseg masa 50-650 amu, vreme skenova 0.32 sekunde. GC-FID analiza je izvedena pod istim

eksperimentalnim uslovima kao što je već navedeno za GC-MS analizu. Procentni sastav je

preračunat na osnovu površine GC-FID pikova, bez korekcionih faktora.

Identifikacija komponenti. Komponente voskova su identifikovane pomoću

AMDIS softvera (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, Ver.

2.1, DTRA/NIST, 2011), na osnovu lineranih retencionih indeksa (RI), koji su određeni na

osnovu retencionih vremena standardne serije alkana (C8-C40), snimljene na istom aparatu i

pod istim uslovima kao i uzorci. RI su upoređivani sa literaturnim vrednostima (Van Den

Dool i Kratz, 1963; Stein, 1990; Adams, 2007; NIST Chemistry WebBook); identifikacija je

izvršena na osnovu upoređivanja masenih spektara komponenata voska sa

literaturnim/bibliotečkim masenim spektrima Wiley 6, NIST02, MassFinder 2.3 (Stein, 1990)

i MS bibliotekama dobijenih na osnovu snimanja čistih supstanci.

3.4. Statistička analiza

Sve identifikovane komponente epikutikularnih voskova P. sylvestris obrađene su

metodama univarijantne i multivarijantne statistike (Quinn i Keough, 2002) uz pomoć

programskog paketa Statistica, version 5.1 (StatSoft Inc., 1996, Tulsa, OK, USA).

Deskriptivna statistika. Za sve identifikovane komponente urađena je osnovna

deskriptivna statistika (srednja vrednost, maksimum, minimum, standardna devijacija i

koeficijent varijacije) na osnovu koje je urađena analiza varijabilnosti ispitivanih karaktera u

okviru istraživanih populacija. Ovi rezultati su grafički prikazani uz pomoć whisker box plota

gde je za svaki karakter prikazana njegova varijabilnost na nivou ispitivane populacije.

Koeficijent varijacije (CV%) je korišćen za opisivanje hemijske varijabilnosti karaktera i u

odnosu na njegove vrednosti karakteri su okarakterisani kao nisko varijabilni (CV% < 10),

umereno varijabilni (10 < CV% < 50), visoko varijabilni hemijski karakteri (50 < CV% <

100), oni karakteri kod kojih je CV% >100 su okarakterisani kao jako visoko varijabilni.

Jednofaktorska analiza varijanse (ANOVA) je urađena da bi se utvrdilo da li

postoji statistički značajna razlika u prosečnim vrednostima analiziranih karaktera između


14

populacija. Osnovni postupak na kome se zasniva ova tehnika jeste izvođenje dve različite

ocene varijanse populacija iz podataka, za koje se zatim računa količnik. Jedna od ovih ocena

(varijansa između grupa) predstavlja meru efekata nezavisne promenljive udružene sa

varijansom greške. Druga ocena (varijansa unutar grupa) je mera samo varijanse greške.

Količnik varijansi između i unutar grupa označava se kao F-vrednost ili F-količnik. Statistički

značajnan F-količnik ukazuje da su prosečne vrednosti posmatranog karaktera za date

populacije veoma različite.

Analiza glavnih komponenti (PCA) je urađena na kompletnom uzorku, odnosno

korelacionoj matrici individualnih vrednosti svih hemijskih karaktera (29 individua, 16

karaktera). Ova tehnika je primenjena da bi se utvrdilo koliko koji hemijski karakter doprinosi

ukupnoj varijabilnosti uzorka kao i da bi se utvrdio odnos između pojedinih grupa jedinki,

odnosno populacija u multidimenzionalnom hemijskom prostoru. PCA ima za cilj da smanji

dimenzionalnost izvornih podataka prevodeći ih u skup novih promenljivih koje se nazivaju

glavne komponente. Glavne komponetne nisu korelisane među sobom i sukcesivno opisuju

najveći moguć procenat varijabilnosti. Rezultati su prikazani grafički scatterplotovima u

prostoru koji je definisan prvom i drugom glavnom komponentom koje opisuju najveći

procenat varijabilnosti uzorka.


15

4. REZULTATI

4.1. Hemijski sastav epikutikularnog voska četina P. sylvestris sa područja

centralnog Balkana

Dvogodišnje četine sa 29 odraslih stabala P. sylvestris sakupljene sa dva planinska

sistema centralnog dela Balkanskog poluostrva (Dinaridi i Balkansko-Rodopske planine;

tabela 3.1). Kombinacijom GC/FID i GC/MS analize u epikutikularnim voskovima četina

identifikovano je 17 komponenti čije su relativne koncentracije date u tabeli 4.1, a nekoliko

odabranih hromatograma prikazano je na slikama 4.1 i 4.2. Utvrđeno je prisustvo četiri

diterpena (dva pimaranskog – pimaradien i sandarakopimaradien i dva abietanskog tipa – 18-

norabieta-8,11,13-trien i abietartrien), tri primarna alkohola (1-heksadekanol, cis-9-

oktadecen-1-ol i 1-oktadekanol) i 10 n-alkana u seriji od C20 do C31. Obe ispitivane populacije

odlikuju se dominacijom n-alkana, iako je njihov sadržaj veći u populaciji sa Dinarida

(62.1%) u poređenju sa populacijom Balkansko-Rodopske planine (41.6%). Sa druge strane,

sadržaj diterpena i primarnih alkohola veći je u populaciji sa Balkansko-Rodopskih planina u

odnosu na populaciju Dinaridi (9.3 vs. 6.4% i 27.6 vs. 18.5%, resp.). Dominantne

komponente voskova u populaciji Dinaridi su n-alkani C25, C27 i C23 (17.4, 13.1 i 8.1%) i

alkohol cis-9-oktadecen-1-ol (9.7%), dok su u populaciji sa Balkansko-Rodopskih planina

alkohol cis-9-oktadecen-1-ol (14.1%) i n-alkani C27, C29 i C25 (9.4, 8.2 i 8.1%) detektovani

kao glavne komponente (tabela 4.1).

U literaturi postoji samo jedan rad u kome se navode podaci o n-alkanima iz

epikutikularnih voskova četina P. sylvestris (Maffei et al., 204), prema kome se n-alkani

nalaze u seriji C18-C33, a dominiraju C31, C24, C25 i C23 (24.8%, 9.0%, 8.1%, 7.3%, resp.).

Dakle, rezultati publikovani od strane Maffei et al. (2004) nisu u saglasnosti sa rezultatima

prikazanim u ovom radu, s obzirom na: 1) dominaciju n-alkana C31 i 2) prisustvo n-alkana sa

parnim brojem C atoma (C24) u profilu glavnih alkanskih komopnenti voskova P. sylvestris.

Uzorkovanje biljnog materijala je izvršeno tokom leta u Botaničkoj bašti Univerziteta u

Turinu (Italija), a hemijska analiza je sprovedena na jako malom broju uzoraka (tri jedinke;

Maffei et al., 2004).


16

Tabela 4.1. Rezultati deskriptivne statistike za 17 komponenti epikutikularnih voskova P. sylvestris sa dva planinska masiva centralnog Balkana

(četiri dominantne komponente su boldirane; Avg – srednja vrednost, Min – minimalna vrednost, Max maksimalna vrednost, St.Dev –

standardna devijacija, CV – koeficijent varijacije).

Takson P. sylvestris

Populacija Dinaridi (Tara, Zlatibor, Zlatar) Balkansko-Rodopske planine (Pirin)

Broj analiziranih jedinki (n) 14 15

R. br. Komponenta Avg Min Max St.Dev. CV% Avg Min Max St.Dev. CV%

1. 1-Heksadekanol 4.04 0.00 11.43 3.43 85.02 5.68 3.14 11.22 2.19 38.49

2. Pimaradien 1.16 0.00 5.96 1.79 154.29 1.10 0.00 5.41 1.33 120.35

3. C20 2.28 0.38 5.33 1.44 63.14 2.44 1.14 6.54 1.76 72.03

4. Sandarakopimaradien 1.45 0.00 6.57 1.94 134.23 0.88 0.00 2.58 0.72 82.72

5. 18-Norabieta-8,11,13-trien 1.71 0.33 5.16 1.40 82.01 3.64 0.25 13.66 3.83 105.21

6. cis-9-Oktadecen-1-ol 9.70 0.59 24.51 9.23 95.19 14.10 6.82 28.67 6.83 48.42

7. Abietatrien 2.09 0.00 6.51 2.24 106.90 3.63 0.00 6.23 2.14 59.02

8. 1-Oktadekanol 4.75 0.36 10.90 4.03 84.75 7.79 4.45 13.82 3.00 38.57

9. C21 3.88 1.08 9.44 1.99 51.19 3.07 1.95 5.24 0.95 30.97

10. C22 2.11 0.87 3.66 0.93 44.19 1.41 0.83 2.33 0.40 28.59

11. C23 8.14 4.27 17.18 3.96 48.67 4.93 3.59 8.57 1.38 28.07

12. C24 4.77 2.05 8.94 2.18 45.66 2.03 0.00 3.24 0.81 39.86

13. C25 17.36 7.54 44.29 9.44 54.37 8.09 4.08 12.97 2.60 32.15

14. C26 2.74 0.89 5.96 1.35 49.39 1.34 0.53 2.66 0.71 52.81

15. C27 13.09 5.95 35.35 7.53 57.55 9.43 4.82 15.65 3.45 36.57

16. C28 0.87 0.00 2.13 0.53 61.11 0.67 0.00 1.70 0.52 77.88

17. C29 6.88 2.78 12.27 2.54 36.85 8.17 4.40 11.91 2.71 33.17

Diterpeni 6.41 0.75 22.63 6.48 101.04 9.25 0.25 21.28 6.56 70.90

Primarni alkoholi 18.49 0.95 46.14 16.29 88.11 27.56 14.46 51.56 11.30 41.00

n-Alkani 62.13 38.13 96.75 18.60 29.93 41.58 24.45 55.14 9.32 22.41


17

4.1.1. Promenljivost pojedinačnih komponenti epikutikularnog voska

Promenljivost pojedinačnih hemijskih karaktera analizirana je na osnovu rezultata

deskriptivne statistike koji su bazirani na statističkoj obradi podataka svih identifikovanih

komponenti voskova izolovanih sa četina 29 jedinki P. sylvestris.

Kao rezultat deskriptivne statistike, izračunate su srednja vrednost, standardna

devijacija i koeficijent varijacije (CV%). Srednja vrednost je pokazatelj prosečne vrednosti

ispitivanih karaktera i omogućava dalje korišćenje statističkih pokazatelja varijabilnosti –

standardne devijacije i koeficijenta varijacije. Standardna devijacija, kao mera apsolutne

varijabilnosti, ukazuje na prosečno odstupanje vrednosti ispitivanog karaktera od srednje

vrednosti. Varijabilnost ispitivanih karaktera se ocenjuje pomoću koeficijenta varijacije i

izražava u procentima (Bojović i Mitrović, 2010).

Koeficijent varijacije (CV%). Vrednosti koeficijenta varijacije za identifikovane

komponente epikutikularnih voskova P. sylvestris variraju u opsegu od 28.1 do 154.3%

(tabela 4.1). U populaciji sa Dinarida jako visok koeficijent varijacije CV%>100 pokazuju tri

diterpena (pimaradien, sandarakopimaradien i abietatrien), a sličana situacija je i u populaciji

sa Balkansko-Rodopskih planina, u kojoj jako visok koeficijent varijacije, takođe, pokazuju

diterpenska jedinjenja (pimaradien i 18-norabieta-8,11,13-trien). Visok nivo koeficijenta

varijacije (50<CV%<100) u populaciji sa Dinarida pokazuje najveći broj komonenti (9), dok

u populaciji sa Balkansko-Rodopskih planina pet komponenti (sandarakopimaradien,

abietartrien i n-alkani C20, C25 i C27) odlikuje visok nivo koeficijenta varijacije. Sa druge

strane, u ovoj populaciji najveći broj komponenti (10) pokazuje umeren nivo koeficijenta

varijacije (10<CV%<50). Nijedna od analiziranih komponenti se nije pokazala kao nisko

varijabilan karakter (CV% <10) u obe ispitivane populacije. Međutim, generalno veća

varijabilnost komponenti epikutikularnih voskova u populaciji sa Dinarida može se pre svega

objasniti činjenicom da je ova populacija uključila jedinke P. sylvestris sa šireg geografskog

prostora (Tara, Zlatibor i Zlatar), u poređenju sa populacijom sa Balkasnko-Rodopskih

planina (Pirin).


18

A

C23 C25

C27

C29

B

C25

1-Heksadekanol

cis-9-Oktadecen-1-ol

1-Oktadekanol

Slika 4.1. Hromatogram epikutikularnog voska četina P. sylvestris sa Dinarida: A) subpolulacija Zlatar i B) subpopulacija

Zlatibor


19

18-Norabieta-8,11,13-trien

C27

C25 C29

C29

C27 C25

cis-9-Oktadecen-1-ol

Slika 4.2. Hromatogram epikutikularnog voska četina P. sylvestris sa Balkansko-Rodopskih planina (Pirin)


20

A

B

Slika 4.3. Whisker plot za 17 komponenti epikutikularnih voskova P. sylvestris: A) populacija

Dinaridi i B) populacija Balkansko-Rodopske planine


21

Sadržaj najzastupljenijeg primarnog alkohola, cis-9-oktadecen-1-ola, varira od 9.7%

u populaciji sa Dinarida, u kojoj pokazuje visok nivo koeficijenta varijacije, do 14.1% u

populaciji sa Balkansko-Rodopskih planina gde spada u karaktere sa umerenom

varijabilnošću (tabela 4.1 i slike 4.3 i 4.4).

Sadržaj n-alkana C23 varira od 4.9% u populaciji sa sa Balkansko-Rodopskih planina,

do 8.1% u populaciji sa Dinarida. U obe ispitivane populacije ovaj n-alkan spada u karaktere

sa umerenom varijabilnošću.

Sadržaj n-alkana C25 varira od 8.1% u populaciji sa Balkansko-Rodopskih planina gde

spada u karaktere sa umerenom varijabilnošću, do 17.4% u populaciji sa Dinarida, u kojoj

pokazuje visok nivo koeficijenta varijacije.

Sadržaj n-alkana C27 varira od 9.4% u populaciji sa Balkansko-Rodopskih planina, u

kojoj pokazuje umeren nivo koeficijenta varijacije, do 13.1% u populaciji sa Dinarida gde

spada u karaktere sa visokom varijabilnošću.

Sadržaj n-alkana C29 varira od 6.9% u populaciji sa Dinarida do 8.2% u populaciji sa

sa Balkansko-Rodopskih planina. U obe analizirane populacije ovaj n-alkan pokazuje umeren

nivo koeficijenta varijacije.

Slika 4.4. Varijabilnost dominantnih komponenti epikutikularnih voskova P. sylvestris


22

4.1.2. Analiza varijanse (ANOVA)

U cilju utvrđivanja da li postoji statistički značajna razlika u prosečnim vrednostima

hemijskih karaktera (komponenti epikutikularnih voskova) između analiziranih populacija

(Dinaridi vs. Balkansko-Rodopske planine) urađena je analiza varijnse (ANOVA). ANOVA

ili disperziona analiza, predstavlja analitički model za testiranje značajnosti razlika između

srednjih vrednosti ispitivanih grupa, koji omogućava izdvajanje karaktera koji su statistički

značajni za izdvajanje i diferencijaciju ispitivanih grupa (Bojović i Mitrović, 2010).

ANOVA je pokazala da od ukupno 17 ispitivanih karaktera, šest (n-alkani C22-C26 i

alkohol 1-oktadekanol) poseduje visok nivo značajnosti (tabela 4.2), što ukazuje na to da

postoji statistički značajna razlika između ispitivanih populacija na nivou pojedinih karaktera.

Naime, najveći nivo statističke značajnosti (P<0.001) pokazuje n-alkan C24, srednje visok

nivo značajnosti (P<0.01) pokazuju n-alkani C23, C25 i C26, a najmanji nivo statističke

značajnosti (P<0.05) poseduju primarni alkohol 1-oktadekanol i n-alkan C22.

Tabela 4.2. Koeficijenti dobijeni ANOVA analizom (karakteri koji poseduju statističku

značajnost su boldirani; nivoi statističke značajnosti: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001).

R. br. Karakter F P

1. 1-Heksadekanol 2.39

2. Pimaradien 0.01

3. C20 0.07

4. Sandarakopimaradien 1.13

5. 18-Norabieta-8,11,13-trien 3.16

6. cis-9-Oktadecen-1-ol 2.14

7. Abietatrien 3.56

8. 1-Oktadekanol 5.34 *

9. C21 2.01

10. C22 7.16 *

11. C23 8.74 **

12. C24 20.70 ***

13. C25 13.43 **

14. C26 12.31 **

15. C27 2.90

16. C28 1.09

17. C29 1.74


23

Ukoliko uzmemo u obzir svih šest komponenti epikutikularnih voksova koje su

pokazale statističku značajnost, razlike istraživanih populacija mogu se predstaviti na sledeći

način:

1. Populacija sa Dinarida – epikutikularni voskovi sadrže veći procenat n-alkana C22,

C23, C24, C25 i C26 (2.1, 8.1, 4.8, 17.4 i 2.7%, resp.), a manji procenat alkohola 1-

okadekanola (4.8%).

2. Populacija sa Balkansko-Rodopskih planina – epikutikularni voskovi sadrže manji

procenat n-alkana C22, C23, C24, C25 i C26 (1.4, 4.9, 2.0, 8.1 i 1.3%, resp.), a veći

procenat alkohola 1-okadekanola (7.8%).

4.1.3. Analiza glavnih komponenti (PCA)

Analiza glavnih komponenti (PCA) komponenti epikutikularnih voskova, koja je

bazirana na korelacionoj matrici individualnih vrednosti, pokazala je da prve tri glavne

komponente opisuju 70.2% ukupne varijabilnosti uzorka (tabela 4.3). Prva glavna

komponenta (PC1) opisuje 36.2% ukupne varijabilnosti, druga (PC2) 22.4%, a treća (PC3)

11.7%. Karakteri koji najviše doprinose ukupnoj varijabilnosti na prvoj glavnoj komponenti

su dva primarna alkohola (1-heksadekanol i 1-oktadekanol) i četiri n-alkana (C23-C26). Na

drugoj glavnoj komponenti varijabilnosti najviše doprinose tri diterpena (pimaradien,

sandarakopimaradien i abietatrien).

Rezultati ove analize pokazuju delimično preklapanje ispitivanih populacija što

ukazuje da je varijabilnost epikutikularnih voskova P. sylverstris složena (slika 4.5A). Naime,

na osnovu disperzije jedinki u koordinantnom sistemu definisanom osama PC1 i PC2, može

se uočiti tendencija formiranja tri grupe jedinki: prva grupa, koju čini 6 jedinki P. sylvestris sa

Dinarida, pokazuje negativne vrednosti za PC1, dok se pretežno u pozitivnom delu PC1

nalaze druga i treća grupa, međusobno odvojene po PC2. Druga grupa, koja se sastoji od 9

jedinki sa Pirina i 5 jedinki sa Dinarida nalazi se u pozitivnom delu PC2, dok se u negativnom

delu nalazi treća grupa, koju čini 6 jedinki sa Pirina i 3 jedinke sa Dinarida.

Na opisanu varijabilnost utiče nekoliko komponenti epikutikularnih voskova (slika

4.5B). Prva grupa jedinki, koja uključuje samo jedinke sa Dinarida, može biti okarakterisana

kao Hemotip 1, čiji voskovi sadrže veći procenat n-alkana C22-C28, s obzirom da su ove

jedinke pozicionirane u istom smeru sa vektorima C22, C23, C24, C25, C26, C27 i C28. Druga

grupa, koja uključuje jedinke sa oba planinska masiva, može biti okarakterisana kao hemotip


24

2, čiji voskovi sadrže veći procenat primarnih alkohola (1-heksadekanola, cis-9-Oktadecen-1-

ola i 1-oktadekanola) i najdužeg n-alkana C29. Treća grupa koja, takođe, uključuje jedinke sa

oba planinska masiva, je hemotip 3 čiji voskovi sadrže veći procenat diterpena (pimaradiena,

sandarakopimaradiena, 18-norabieta-8,11,13-triena i abietatriena) i dva najkraća n-alkana C20

i C21.

Na ovaj način, u populaciji Dinaridi utvrđeno je prisutvo sva tri hemotipa, što nam

ukazuje da se ova populacija odlikuje i većim nivoom varijabilnosti komponenti

epikutikularnih voskova u odnosu na populaciju Balkansko-Rodopske planine. Zastupljenost

hemotipova u ispitivanim populacijama P. sylvestris prikazana je na slici 4.6.

Tabela 4.3. Opterećenje hemijskih karaktera na na prve tri ose analize glavnih komponenti

(PCA). Boldirane vrednosti su statistički značajne >0.7.

R. br. Karakter Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3

1. 1-Heksadekanol 0.778 0.414 0.266

2. Pimaradien 0.212 -0.838 0.058

3. C20 0.598 -0.118 0.283

4. Sandarakopimaradien 0.065 -0.834 0.049

5. 18-Norabieta-8,11,13-trien 0.362 -0.485 -0.135

6. cis-9-Oktadecen-1-ol 0.670 0.661 0.212

7. Abietatrien 0.319 -0.729 0.018

8. 1-Oktadekanol 0.701 0.610 0.160

9. C21 0.036 -0.542 0.581

10. C22 -0.565 0.087 0.698

11. C23 -0.719 -0.095 0.372

12. C24 -0.808 0.063 0.378

13. C25 -0.781 0.009 -0.415

14. C26 -0.890 0.100 0.178

15. C27 -0.689 0.150 -0.587

16. C28 -0.677 0.045 0.283

17. C29 -0.368 0.544 0.093

Prp.Totl 0.362 0.224 0.117


25

C21

Sandarakopimaradien

C23

C25

C27 C22 C26

C24 C28

Slika 4.5. A) Analiza glavnih komponenti (PCA) 29 P. sylvestris individua sa dva planinska

sistema centralnog Balkana (Dinaridi i Balkansko-Rodopske planine) B) Prikaz 17 komponenti

epikutikularnih voskova u projekciji prve dve PC ose.

A

B


26

Slika 4.6. Zastupljenost hemotipova u ispitivanim populacijama P. sylvestris:

voskovi sadrže veći procenat n-alkana C22-C28

voskovi sadrže veći procenat primarnih alkohola (1-heksadekanola, cis-9-Oktadecen-1-ola i 1-

oktadekanola) i n-alkana C29.

voskovi sadrže veći procenat veći procenat diterpena (pimaradiena, sandarakopimaradiena, 18-

norabieta-8,11,13-triena i abietatriena) i n-alkana C20 i C21 u poređenju sa ostalim grupama


27

5. DISKUSIJA

Na osnovu varijabilnosti komponenti epikutikularnih voskova, PCA je ukazala na

prisustvo tri različita hemotipa kod 29 jedinki P. sylvestris sa dva planinska sistema

centralnog Balkana: hemotip 1 odlikuju epikutikularni voskovi sa većim sadržajem n-alkana

C22-C28; hemotip 2 voskovi sa većim sadržajem primarnih alkohola (1-heksadekanola, cis-9-

Oktadecen-1-ola i 1-oktadekanola) i najdužeg n-alkana C29; i hemotip 3 voskovi sa većim

procenatom diterpena (pimaradiena, sandarakopimaradiena, 18-norabieta-8,11,13-triena i

abietatriena) i njakraćih n-alkana C20 i C21. Populacija sa Dinarida odlikuje se većim nivoom

varijabilnosti epikutikularnih voskova, s obzirom na prisustvo sva tri hemotipa u sledećem

odnosu: najzastupljeniji je „alkanski“ - hemotip 1 (42.9%), a zatim sledi „alkoholski“ -

hemotip 2 (35.7%) i „diterpenski“ - hemotip 3 (21.4%). Sa druge strane, u populaciji sa

Balkansko-Rodopskih planina nije utvrđeno prisustvo „alkanskog“ hemotipa koji je

najzastupljeniji u populaciji Dinaridi, dok su preostala dva hemotipa su detektovana u

sledećem odnosu: „alkoholski“ - 60.0% i „diterpenski“ - 40.0%.

Na osnovu dobijenih rezultata možemo zaključiti da P. sylvestris odlikuje relativno

visok nivo varijabilnosti voskova (tri hemotipa kod svega 29 ispitivanih jedinki), što je

donekle i očekivan rezultat. Naime, poznato je da se četinari kao višegodišnje, stranooplodne

vrste koje se oprašuju i rasejavaju putem vetra, sa velikim fekunditetom, brojem hromozama,

arealom i karakteristične za kasne stadijume sukcesije fitocenoza, odlikuju izuzetno visokim

stepenom genetičkog diverziteta u populacijama i vrstama u celini (Hamrick et al., 1979).

Takođe, Balkansko poluostrvo zajedno sa Apeninskim i Pirinejskim predstavlja tzv. vruće

tačke diverziteta četinara u Evropi, prvenstveno zbog uloge refugijuma tokom poslednje

Pleistocenske glacijacije (Last Glacial Maximum, LGM). Kao rezultat neprekidnog prisustva,

borovi imaju veći genetički diverzitet na ovim poluostrvima nego u ostalim delovima Evrope

koje su rekolonizovani posle LGM (Naydenov, 2006, prema Šarac, 2014). Ipak, na osnovu

pregleda objavljenih rezultata genetičkog diverziteta evroazijskih borova na osnovu cpSSRs

(hloroplastnih mikrosatelita), očigledno je da postoji ogromna varijabilnost: termofilni

mediteranski borovi kao što su P. pinaster, P. brutia, P. halepensis i P. pinea pokazuju

izuzetno niske nivoe ili čak odsustvo genetičkog diverziteta dok se frigorifilni borovi, P.

sylvestris, P. mugo, P. uncinata i P. nigra odlikuju najvećim stepenom genetičkog diverziteta


28

(Bucci et al., 1998; Robledo-Arnuncio et al., 2005; Afzal-Rafii and Dodd, 2007; Vendramin

et al., 2008; Jaramillo-Correa et al., 2010; Soto et al., 2010, prema Šarac, 2014). Smatra se da

su tokom klimatskih fluktuacija u periodu Kvartara kserotermni borovi preživeli izuzetno

snažan efekat "uskog grla" (bottleneck effect) odnosno rapidno smanjenje brojnosti, s obzirom

da su tokom poslednje glacijacije mogli da opstanu isključivo u najjužnijim tačkama

refugijuma u kojima su postojali povoljni ekološki uslovi za njihov opstanak. Ovo je za

posledicu imalo drastično smanjenje brojnosti i efektivne veličine populacija kao i gubitak

genetičkog diverziteta. Na žalost, fitohemijski diverzitet populacija termofilnih mediteranskih

borova još uvek nije istraživan na nivou epikutikularnih voskova, tako da za sada ne postoje

podaci o razlici između varijabilnosti epikutikularnih voskova frigorifilnih vs. termofilnih

borova.

Sa druge strane, frigorifilni borovi su, s obzirom na bolju adaptiranost na hladnije

uslove, mogli da održe veće efektivne veličine populacija i genetičku varijabilnost tokom

klimatskih fluktuacija Kvartara. Na primer, za P. sylvestris je objavljeno da je preživeo sve

glacijalne faze u kontinentalnim visoravnima severne Španije (Franco-Múgica et al., 2001,

prema Šarac, 2014), gde je utvrđen i veoma visok nivo diverziteta cpSSRs, na osnovu koga su

Robledo-Arnuncio et al. (2005) ukazali na mogućnost da je P. sylvestris uspeo da održi

demografsku stabilnost tokom uzastopnih klimatskih ciklusa u najsevernijim delovima

Iberijskog poluostrva i da je ovo verovatno slučaj i sa P. nigra i P. mugo sensu lato. Takođe,

najveći nivo polimorfizma mtDNK (mitohondrijalne DNK) uočava kod Pinus spp. koje imaju

najširu trenutnu distribuciju i za koje se pretpostavlja da nisu preživele ozbiljnije redukcije

veličine populacija tokom glacijacija u Kvartaru, kao što je slučaj sa azijskim borom P.

kvangtungensis (Tian et al., 2010) i severnoameričkim P. banksiana (Godbout et al., 2005). U

slučaju evroazijskih borova, veći mtDNK polimorfizam utvrđen je kod frigorifilnih borova P.

sylvestris (Naydenov et al., 2007) i P. nigra (Jaramillo-Correa et al., 2010), koji imaju i

najširu trenutnu distribuciju, u odnosu na termofilniji P. pinaster (Jaramillo-Correa et al.,

2010) i naročito P. halepensis (Jaramillo-Correa et al., 2010) (slična situacija je i sa cpSSR

diverzitetom; prema Šarac, 2014).

Na ovaj način, visok nivo varijabilnosti epikutikularnih voskova P. sylvestris

populacija sa dva planinska masiva centralnog Balkana u saglasnosti je sa dosadašnjim

populaciono-genetičkim i filogeografskim istraživanjima ove frigorifilne Pinus vrste. Ipak,

veći nivo diverziteta koji je utvrđen u populaciji sa Dinarida u odnosu na populaciju sa

Balkansko-Rodopskih planina možemo objasniti na sledeći način:


29

1. populacija sa Dinarida uključila je jedinke sa većeg geografskog prostora, tj. sa tri

planine iz zapadne i jugozapadne Srbije (Tara, Zlatibor i Zlatar), dok je populacija

Balkansko-Rodopske planine obuhvatila samo jedinke sa Pirina. Navedeni podaci

mogu ukazivati na to da u ovom radu možda nije detektovana ukupna fitohemijska

varijabilnost prisutna kod P. sylvestris na teritoriji Bugarske, i da je vrlo verovatno

da bi se sa povećanjem broja aliziranih jedinki i geografskog područja,

najverovatnije, detektovali i neki novi hemotipovi.

2. mogućnost intraspecijske hibridizacije i introgresije na području Dinarida. Naime,

poznato je da je beli bor vrsta koja se intenzivno koristi za pošumljavanje u Srbiji,

a prilikom pošumljavanja, poreklo individua može biti nepoznato (cf. Vendramin

et al., 2000). To ukazuje na činjenicu da populacije belog bora koje nisu prirodne,

a koje se nalaze na većim ili manjim geografskim distancama od ispitivanih

subpopulacija sa Dinarida, mogu sadržavati genetičke varijante koje su egzotične

za Balkan, odnosno, mogu sadržavati genetičke varijante karakteristične za druge

delove areala ove vrste. Imajući u vidu veliku moć ekspanzije polena belog bora,

uticaj ovakvog potencijalnog egzotičnog genskog pool-a na području zapadne

Srbije ne može biti isključen.

Iako se, četinari se, generalno, odlikuju niskim stepenom genetičke diferencijacije

populacija usled efektivnog protoka gena putem rasejavanja semena i polena i visoke

konektivnosti populacija, ANOVA je ukazala na mogućnost hemijske diferencijacije

ispitivanih populacija P. sylvestris na području centralnog Balkana. Naime, od ukupno 17

ispitivanih komponenti epikutikularnih voskova, šest poseduje visok nivo statističke

značajnosti (tabela 4.2), što ukazuje na to da postoji statistički značajna razlika između

ispitivanih populacija na nivou pojedinih karaktera. Populacija sa Dinarida se, genaralno,

odlikuje većim sadržajem pet n-alkana (C22-C26) i manjim sadržajem jednog alkohola (1-

oktadekanola) u poređenju sa populacijom sa Balkansko-Rodopskih planina. Ipak za sticanje

boljeg uvida u hemijsku diferencijaciju populacija belog bora na području Balkanskog

refugijuma potrebno je uključiti u analizu mnogo veći broj populacija, koji bi omogućio

primenu multivarijantnih analiza za utvrđivanje diferencijacije (npr. kanonijske

diskrimininantne analize - CDA), kao i veći broj fitohemijskih markera (npr. terpene, fenole,

flavnoide, masne kiseline itd.).


30

6. ZAKLJUČCI

1. U epikutikularnim voskovima dvogodišnjih četina P. sylvestris poreklom sa dva

planinska sistema centralnog dela Balkanskog poluostrva (Dinaridi i Balkansko-

Rodopske planine) utvrđeno je prisustvo četiri diterpena (pimaradien,

sandarakopimaradien, 18-norabieta-8,11,13-trien i abietartrien), tri primarna alkohola

(1-heksadekanol, cis-9-oktadecen-1-ol i 1-oktadekanol) i 9 n-alkana u seriji od C21 do

C31.

2. Obe ispitivane populacije odlikuju se dominacijom n-alkana, iako je njihov sadržaj

veći u populaciji sa Dinarida (62.1%) u poređenju sa populacijom sa Balkansko-

Rodopskih planina (41.6%). Sa druge strane, sadržaj diterpena i primarnih alkohola

veći je u populaciji Balkansko-Rodopske planine u odnosu na njihov sadržaj u drugoj

ispitivanoj populaciji (9.3 vs. 6.4% i 27.6 vs. 18.5%, resp.). Dominantne komponente

voskova u populaciji sa Dinarida su n-alkani C25, C27 i C23 (17.4, 13.1 i 8.1%) i

alkohol cis-9-oktadecen-1-ol (9.7%), dok su u populaciji sa Balkansko-Rodopskih

planina alkohol cis-9-oktadecen-1-ol (14.1%) i n-alkani C27, C29 i C25 (9.4, 8.2 i 8.1%)

detektovani kao glavne komponente.

3. Vrednosti koeficijenta varijacije, za komponente epikutikularnih voskova P. sylvetrsis,

variraju u opsegu od 28.1 do 154.3%. U populaciji sa Dinarida jako visok koeficijent

varijacije CV%>100 pokazuju tri diterpena (pimaradien, sandarakopimaradien i

abietatrien), a slična situacija je i u populaciji Balkansko-Rodopske planine, u kojoj

jako visok koeficijent varijacije, takođe, pokazuju diterpenska jedinjenja (pimaradien i

18-norabieta-8,11,13-trien). Visok nivo koeficijenta varijacije (50<CV%<100) u

populaciji sa Dinarida pokazuje najveći broj komonenti (9), dok u populaciji sa

Balkansko-Rodopskih planina pet komponenti (sandarakopimaradien, abietartrien i n-

alkani C20, C25 i C27) odlikuje visok nivo koeficijenta varijacije. Sa druge strane, u

ovoj populaciji najveći broj komponenti (10) pokazuje umeren nivo koeficijenta

varijacije (10<CV%<50). Nijedna od analiziranih komponenti se nije pokazala kao

nisko varijabilan karakter (CV% <10) u obe ispitivane populacije.

4. Iako se, četinari se, generalno, odlikuju niskim stepenom genetičke diferencijacije

populacija usled efektivnog protoka gena putem rasejavanja polena i semena i visoke


31

konektivnosti populacija, ANOVA je ukazala na hemijsku diferencijaciju ispitivanih

populacija P. sylvestris na području centralnog Balkana. Naime, od ukupno 17

ispitivanih komponenti epikutikularnih voskova, šest poseduje visok nivo statističke

značajnosti, što ukazuje na to da postoji statistički značajna razlika između ispitivanih

populacija na nivou pojedinih karaktera. Populacija sa Dinarida se, genaralno, odlikuje

većim sadržajem pet n-alkana (C22-C26) i manjim sadržajem jednog alkohola (1-

okadekanola) u poređenju sa populacijom sa Balkansko-Rodopskih planina.

5. Na osnovu varijabilnosti komponenti epikutikularnih voskova, PCA je ukazala na

prisustvo tri različita hemotipa kod 29 ispitivanih jedinki P. sylvestris: hemotip 1

odlikuju epikutikularni voskovi sa većim sadržajem n-alkana C22-C28; hemotip 2

voskovi sa većim sadržajem primarnih alkohola i n-alkana C29; i hemotip 3 voskovi sa

većim procenatom diterpena i n-alkana C20 i C21 u poređenju sa ostalim grupama.

Populacija sa Dinarida odlikuje se većim nivoom varijabilnosti voskova, s obzirom na

prisustvo sva tri hemotipa u sledećem odnosu: najzastupljeniji je „alkanski“ - hemotip

1 (42.9%), a zatim sledi „alkoholski“ - hemotip 2 (35.7%) i „diterpenski“ – hemotip 3

(21.4%). Sa druge strane, u populaciji sa Balkansko-Rodopskih planina nije utvrđeno

prisustvo „alkanskog“ hemotipa koji je najzastupljeniji u populaciji Dinaridi, dok su

preostala dva hemotipa su detektovana u sledećem odnosu: „alkoholski“ – 60.0% i

„diterpenski“ – 40.0%. Na osnovu dobijenih rezultata možemo zaključiti da P.

sylvestris odlikuje relativno visok nivo varijabilnosti voskova (tri hemotipa kod svega

29 ispitivanih jedinki), što je donekle i očekivan rezultat, s obzirom da se četinari,

generalno, odlikuju izuzetno visokim stepenom genetičkog diverziteta u populacijama

i vrstama u celini, kao i da su na to ukazala sva dosadašnja populaciono-genetička

istraživanja ove frigorifilne Pinus vrste.

6. Veći nivo varijabilnosti koji je utvrđen u populaciji Dinaridi u odnosu na populaciju sa

Balkansko-Rodopskih planina može se objasniti na sledeći način: 1) populacija

Dinaridi uključila je jedinke sa većeg geografskog prostora, tj. tri planine iz zapadne i

jugozapadne Srbije (Tara, Zlatibor i Zlatar), dok je populacija sa Balkansko-

Rodopskih planina obuhvatila samo jedinke sa Pirina. Navedeni podaci mogu

ukazivati na to da u ovom radu možda nije detektovana ukupna fitohemijska

varijabilnost prisutna kod P. sylvestris na teritoriji Bugarske, i da je vrlo verovatno da

bi se sa povećanjem broja aliziranih jedinki i geografskog područja, najverovatnije,

detektovali i neki novi hemotipovi. 2) mogućnost intraspecijske hibridizacije i


32

introgresije na području Dinarida. Naime, poznato je da je beli bor vrsta koja se

intenzivno koristi za pošumljavanje u Srbiji, a prilikom pošumljavanja, poreklo

individua može biti nepoznato. To ukazuje na činjenicu da populacije belog bora koje

nisu prirodne, a koje se nalaze na većim ili manjim geografskim distancama od

ispitivanih subpopulacija sa Dinarida, mogu sadržavati genetičke varijante koje su

egzotične za Balkan, odnosno, mogu sadržavati genetičke varijante karakteristične za

druge delove areala ove vrste. Imajući u vidu veliku moć ekspanzije polena belog

bora, uticaj ovakvog potencijalnog egzotičnog genskog pool-a na području zapadne

Srbije ne može biti isključen.

7. Za sticanje boljeg uvida u fitohemijski diverzitet i diferencijaciju populacija belog

bora na području Balkanskog refugijuma potrebno je uključiti u analizu mnogo veći

broj populacija, koji bi omogućio primenu multivarijantnih analiza za utvrđivanje

diferencijacije (npr. Kanonijske diskrimininantne analize – CDA), kao i veći broj

fitohemijskih markera (npr. Terpene, fenole, flavnoide, masne kiseline itd.).


33

7. LITERATURA

Adams R. P. 2007. Identification of Essential Oil Component by Gas

Chromatography/Quadrupole Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation,

Carol Stream, IL.

Afzal-Rafii Z., Dodd R. S. 2007. Chloroplast DNA supports a hypothesis of glacial refugia

over postglacial recolonization in disjunct populations of black pine (Pinus nigra) in

western Europe. Mol. Ecol. 16, 723-736.

Barnes J. D., Percy K. E., Paul N. D., Jones P., McLaughlin C. K., Mullineaux P. M.,

Creissen G., Wellburn A. R. 1996. The influence of UV–B radiation on the

physicochemical nature of tabacco (Nicotiana tabacum L.) leaf surfaces. J. Exp. Bot.

47, 99–109.

Barthlott W., Neinhaus C. 1997. Purity of the sacred lotus or escape from contamination in

biological surfaces. Planta 202, 1–8.

Barthlott W., Neinhuis C., Cutler D., Ditsch F., Meusel I., Theisen I., Wilhelmi H. 1998.

Classification and terminology of plant epicuticular waxes. Bot. J. Linn. Soc. 126,

237–260.

Bojović S., Mitrović S. 2010. Biostatistika - primena statističkih metoda u biologiji. Institut za

šumarstvo, Beograd.

Bojović S., Šarac Z., Nikolić B., Tešević V., Todosijević M., Veljić M., Marin P. D. 2012.

Composition of n-alkanes in natural populations of Pinus nigra from Serbia –

chemotaxonomic implications. Chem. Biodiversity 9, 2761-2774.

Bucci G., Anzidei M., Madaghiele A., Vendramin G.G. 1998. Detection of haplotypic

variation and natural hybridization in halepensis-complex pine species using

chloroplast simple sequence repeat (SSR) markers. Mol. Ecol. 7, 1633-1643.

Chikaraishi Y., Naraoka H., 2003. Compound-specific delta D-delta C-13 analyses of n-

alkanes extracted from terrestrial and aquatic plants. Phytochemistry 63(3), 361-371.

Eigenbrode S. D., Espelie K. E. 1995. Effects of plant epicuticular lipids on insect herbivores.

Annu. Rev. Entomol. 40, 171–194.


34

Farr T. G., Rosen P. A., Caro E., Crippen R., Duren R., Hensley S., Kobrick M., Paller M.,

Rodriguez E., Roth L., Seal D., Shaffer S., Shimada J., Umland J., Werner M.,Oskin

M., Burbank D., Alsdorf D. 2007. The shuttle radar topography mission. Rev.

Geophys. 45, RG2004.

Franco-Múgica F., García-Antón M., Maldonado-Ruiz J., Morla-Juriasti C., Dainz-Ollero H.

2001. The Holocene history of Pinus forests in the Spanish Northern Meseta. The

Holocene 11, 343–358.

Godbout J., Jaramillo-Correa J. P., Beaulieu J., Bousquet J. 2005. A mitochondrial DNA

minisatellite reveals the postglacial history of jack pine (Pinus banksiana), a broad-

range North American conifer. Mol. Ecol. 14, 3497-3512.

Jaramillo-Correa J. P., Grivet D., Terrab A., Kurt Y., De-Lucas A. I., Wahid N., Vendramin

G. G., González-Martínez S. C. 2010. The Strait of Gibraltar as a major biogeographic

barrier in Mediterranean conifers: a comparative phylogeographic survey. Mol. Ecol.

19, 5452-5468.

Jeffree C. E. 1996. Structure and ontogeny of plant cuticles. In: Kerstiens G., editor. Plant

cuticles. An integrated approach. BIOS Scientific, Oxford, 33–82.

Jeffree C. E. 2006. The fine structure of the plant cuticle. In: Riederer M., Müller C., editors.

Biology of the plant cuticle. Vol. 23. Blackwell, Oxford, 11–144.

Jenks M. A., Joly R. J., Peters P. J., Rich P. J., Axtell J. D., Ashworth E. N. 1994. Chemically

induced cuticle mutation affecting epidermal conductance to water vapor and disease

susceptibility in Sorghum bicolor (L.) Moench. Plant Physiol. 105, 1239–1245.

Jetter R., Kunst L., Samuels A. L. 2007. Compostion of plant cuticular waxes. In: Rieder M.,

Müler C., editors. Biology of the plant cuticle. Vol. 23. Blackwell, Oxford, 145-181.

Jetter R., Riederer M. 1994. Epicuticular crystals of nonacosan-10-ol: in vitro reconstitution

and factors influencing crystal habits. Planta 195, 25-270.

Jovanović B. 1992. P. sylvestris In: Sarić M., editor. Flora Srbije 1. Srpska akademija nauka i

umetnosti, Beograd, 205-206.

Jovanović S. 2016. Sekundarni metaboliti predstavnika roda Sedum L. (Crassulaceae)

centralnog Balkanskog poluostrva i njihov hemotaksonomski značaj. Doktorska

disertacija, Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Nišu.


35

Kerstiens G. 1996. Signalling across the divide: a wider perspective of cuticular structure –

function relationships. Trends Plant Sci. 1, 125–129.

Koch K., Bhushan B., Barthlott W. 2008. Diversity of structure, morphology and wetting of

plant surfaces. Soft Matter 4, 1943-1963.

Kunst L., Samuels L. 2009. Plant cuticles shine: advances in wax biosynthesis and export.

Curr. Opin. Plant. Biol. 12, 721-727.

Maffei M. 1996a. Chemotaxonomic significance of leaf wax alkanes in the Compositae. In:

Hind D. J. N., Beentje H. J., editors. Compositae: Systematics. Proceedings of the

International Compositae Conference. Vol. 1. Royal Botanic Gardens, Kew, pp. 141-

158.

Maffei M. 1996b. Chemotaxonomic significance of leaf wax n-alkanes in the Umbelliferae,

Cruciferae and Leguminosae (Subf. Papilionoideae). Biochem. Syst. Ecol. 24, 531-

545.

Maffei M. 1996c. Chemotaxonomic significance of leaf wax alkanes in the Gramineae.

Biochem. Syst. Ecol. 24, 53-64.

Maffei M., Badino S., Rossi S. 2004. Chemotaxonomic significance of leaf wax n-alkanes in

the Pinales (Coniferales). J. Biol. Res. 1, 3-19.

Maffei M., Meregalli M., Scannerini S. 1997. Chemotaxonomic significance of surface wax

n-alkanes in the Cactaceae. Biochem. Syst. Ecol. 25, 241-253.

Marin P. D. 2003. Biohemijska i molekularna sistematika biljaka. NNK international,

Beograd.

Moulallis D., Mitsopoulos D. 1975. Artificial hybrids among certain pine species in Greece.

Sci. Ann. of Forestry Fac. IH, 57-96.

Naydenov K. D., Tremblay F. M., Fenton N. J., Alexandrov A. 2006. Structure of Pinus nigra

Arn. populations in Bulgaria revealed by chloroplast microsatellites and terpene

analysis: Provenance tests. Biochem. Syst. Ecol. 34, 562-574.

Naydenov K., Senneville S., Beaulieu J., Tremblay F., Bousquet J. 2007. Glacial vicariance in

Eurasia: mitochondrial DNA evidence from Scots pine for a complex heritage

involving genetically distinct refugia at mid-northern latitudes and in Asia Minor.

BMC Evol. Biol. 7, 233-244.


36

Nikolić B. 2008. Varijabilnost sastava terpena i alkana u četinama omorike (Picea

omorica/Panč./Purkynĕ), munike (Pinus heldreichii Christ.) i molike (Pinus peuce

Griseb.). Doktorska disertacija. Biološki fakultet, Beograd.

Nikolić B., Tešević V., Đorđević I., Todosijević M., Jadranin M., Bojović S., Marin P. D.

2012a. Chemodiversity of nonacosan-10-ol and n-alkanes in the needle wax of Pinus

heldreichii. Chem. Biodiversity 9, 80-90.


2012b. Population variability of nonacosan-10-ol and n-alkanes in needle cuticular

waxes of Macedonian pine (Pinus peuce Griseb.). Chem. Biodiversity 9, 1155-1165.


2013a. Variability of n-alkanes and nonacosan-10-ol in natural populations of Picea

omorika. Chem. Biodiversity 10, 473-483.

Post-Beittenmiller D., 1996; Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular

Biology, 1996, 47:405-430.

Quinn G. P., Keough M. J. 2002. Experimental Design and Data Analysis for Biologists.

Cambridge Univ. Press., Cambridge

Rajčević N., Janaćković P., Dodoš T., Tešević V., Marin P. D. 2014. Biogeographic variation

of foliar n-alkanes of Juniperus communis var. saxatilis Pallas from the Balkans.

Chem. Biodiversity 11, 1923-1938.

Reicosky D. A., Hanover J. W. 1978. Physiological effects of surface waxes. Light

reflectance for glaucos and nonglaucos Picea pungens. Plant Physiol. 62, 101-104.

Reuter H. I., Nelson A., Jarvis, A. 2007. An evaluation of void filling interpolation methods

for SRTM data. Int. J. Geogr. Inf. Sci. 21, 983-1008.

Robledo-Arnuncio J. J., Collada C., Alía R., Gil L. 2005. Genetic structure of montane

isolates of Pinus sylvestris L. in a Mediterranean refugial area. J. Biogeogr. 32, 595-

605.

Samuels A. L., Kunst L., Jetter R. 2008. Sealing plant surfaces: cuticular wax formation by

epidermal cells. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 683-707.


37

Šarac Z. 2014. Utvrđivanje varijabilnosti i diferencijacije prirodnih populacija Pinus nigra

Arnold u Srbiji korišćenjem fitohemijskih i molekularnih markera. Doktorska

disertacija. Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu

Šarac Z., Zlatković B., Jovanović S., Stojanović G., Marin P. D. 2016. Geographically related

variation in epicuticular wax traits of Pinus nigra populations from Southern

Carpathians and Central Balkans – taxonomic considerations. Chem. Biodiversity 13,

931-942.

Soto A., Robledo-Arnuncio J. J., González-Martínez S. C., Smouse P. E., Alía R. 2010.

Climatic niche and neutral genetic diversity of the six Iberian pine species: a

retrospective and prospective view. Mol. Ecol. 19, 1396-1409.

StatSoft. 1997. Statistica for Windows, version 5.1. StatSoft Inc., Tulsa.

Stefanovic S., Jager M., Deutsch J., Broutin J., Masselot M. 1998. Phylogenetic relationships

of conifers inferred from partial 28S rRNA gene sequences. Am. J. Bot. 85, 688-697.

Stein S.E., National Institute of Standards and Technology (NIST) Mass Spectral Database

and Software, Version 3.02, USA, 1990.

Tian S., López-Pujol J., Wang H.-W., Ge S., Zhang Z.-Y. 2010. Molecular evidence for

glacial expansion and interglacial retreat during Quaternary climatic changes in a

montane temperate pine (Pinus kwangtungensis Chun ex Tsiang) in southern China.

Plant Syst. Evol. 284, 219-229.

Van den Dool H., Kratz P. D. 1963. A generalization of the retention index system including

linear temperature programmed gasliquid partition chromatography. J. Chromatogr. A,

11, 463-471.

Vendramin G. G., Fady B., González-Martínez S. C., Hu F. S., Scotti I., Sebastiani F., Soto

A., Petit R. J. 2008. Genetically depauperate but widespread: the case of an

emblematic Mediterranean pine. Evolution 62, 680-688.

Vidaković M. 1958. Investigations on the intermediate type between the Austrian and the

Scots pine. Silvae Genet. 7, 12-19.

Vidaković M. 1977. Some morphological characteristics of Pinus x nigrosylvis (P. nigra x P.

sylvestris). Ann. Forest. 8, 15-27.


38

von Wettstein W. 1951. Über Bastarde Pinus nigra var. austriaca x sylvestris. Z.

Pflanzenzücht. 30, 473-477.

Прилог5/1

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Катарина Стаменковић

Ментор, МН: Зорица С. Митић

Наслов рада, НР: Диференцијација и фитохемијска разноврсност популација Pinus sylvestris

централног дела Балканског полуострва на основу епикутикуларних воскова

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2017.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

38 страна; 10 слика; 5 табела

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Ботаника

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Pinus sylvestris, епикутикуларни воскови, Балкан, PCA

УДК 575.875+57.032:007.2+674.032.475.4:547.916(1-191.2)(497)

Чува се, ЧУ: Библиотека

Извод, ИЗ: У раду је анализирана фитохемијска варијабилност и диференцијација

популација P. sylvestris пореклом са два планинска система централног Балкана:

Динариди и Балканско-Родопске планине. Комбинацијом GC/FID и GC/MS

анализе епикутикуларних воскова изолованих са четина 29 јединки P. sylvestris

утврђено је присуство четири дитерпена, три примарна алкохола и 10 n-алкана у

серији од C20 до C31. Анализа главних компоненти (PCA) је указала на постојање

три хемотипа P. sylvestris: хемотип 1 одликују воскови са већим садржајем n-

алкана C22-C28, хемотип 2 воскови са већим садржаје примарних алкохола и n-

алкана C29; и хемотип 3 воскови са већим процентом дитерпена и n-алкана C20 и

C21. У популацији са Динарида утврђено је присуство сва три типа

епикутикуларних воскова, док су у популацији са Балканско-Родопских планина

детектовани само хемотипови 2 и 3. Добијени резултати су упоређени са

морфолошким, биохемијским и молекуларним карактерима који су коришћени у

досадашњим истраживањима диверзитета и диференцијације популација P.

sylvestris.

Датум прихватања теме, ДП: 17.05.2017.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Др Бојан Златковић

Члан: Др Снежана Јовановић

Члан,

ментор:

Др Зорица Митић

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Katarina Stamenković

Mentor, MN: Zorica S. Mitić

Title, TI: Differentiation and phytochemical diversity of Pinus sylvestris populations from the

central Balkans based on epicuticular waxes

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2017

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendi

xes)

38 p.; 10 pictures; 5 tables

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Botany

Subject/Key words, S/KW: Pinus sylvestris, epicuticular waxes, the Balkans, PCA

UC 575.875+57.032:007.2+674.032.475.4:547.916(1-191.2)(497)

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: This paper includes analysis of phytochemical variability and differentiation of P.

sylvestris populations from two mountain systems in the central part of Balkan

Peninsula (Dinarides and Balkan-Rhodope mountains). Combination of GC/FID and

GC/MS analyses of epicuticular waxes isolated from two-year-old needles from 29

individuals of P. sylvestris has shown presence of four diterpenes, three primary

alcohols and 10 n-alkanes ranging from C20 to C31. Тhe principal component analysis

(PCA) has shown existence of three different chemotypes in 29 studied individuals of

P. sylvestris: chemotype 1 was characterized by waxes with higher percentage of n-

alkanes C22-C28; chemotype 2 by high percentage of primary alcohols and n-alkane C29;

and chemotype 3 by high percentage of diterpenes and n-alkanes C20 and C21. All three

types of epicuticular waxes were recorded in the Dinaride population, while only

chemotypes 2 and 3 were recorded in the population from Balkan-Rhodope mountains.

The data collected in this study were compared with morphological, biochemical and

molecular characters used in previous studies of diversity and differentiation of P.

sylvestris populations.

Accepted by the Scientific Board on,

ASB:

17.05.2017.

Defended on, DE:

Defended

Board, DB:

President: Dr. Bojan Zlatković

Member: Dr. Snežana Jovanović

Member, Mentor: Dr. Zorica Mitić

master rad - web1.pmf.ni.ac.rs€¦ · 1.1.2. habitus i anatomija pinus sylvestris je drvo visoko...

Documents