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Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Unidad de Bioquímica, Facultad de Medicina
Regulación de la plasticidad astrocitaria por ibuprofeno y
FGF2
Mathieu Lichtenstein
TESIS DOCTORAL
Belleterra Junio 2011
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Unidad de Bioquímica, Facultad de Medicina
Memoria de tesis doctoral presentada por Mathieu Lichtenstein para optar al título de doctor por la Universidad Autónoma de Barcelona.
Trabajo realizado en la Unidad de Bioquímica de la Facultad de Medicina, del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular bajo la dirección de la Dra Elena Galea Rodríguez de Velasco.
Proyecto subvencionado por la Fundació Marató de TV3 y Ministerio de Ciencia e Innovación
Bellaterra, 9 de Mayo de 2011
Doctorando Director de Tesis
Mathieu Lichtenstein Elena Galea
A mi madre, mis hermanos,
a Paco,
mis abuelos Marie et Robert, Jacqueline et Paul
y a todo el resto de la famila.
ÍNDICE
I. Índice ......................................................................1
II. Abreviaturas ............................................................5
III. Resumen..................................................................7
IV. Introducción ..........................................................11
1. Los astrocitos son un tipo celular altamente plástico y
polivalente 1.1... Morfología y tipos de astrocitos.........................................12
1.2 Fisiología astrocitaria..........................................................13
Soporte neuronal Gliotransmisión y participación a la sinapsis tripartita Regulación de los niveles sinápticos de glutamato Acoplamiento neurovascular
2. Participación de los astrocitos en la neuroinflamación 2.1 Conceptos generales sobre la
inflamación cerebral .............................................................19
2.2 Privilegio inmune del SNC......................................................19
2.3 La células gliales participan en
la inmunidad innata del SNC ..............................................20
2.4 Los astrocitos en la inmunidad innata ..................................22
MCP1 ICAM1 COX2
2.5 Migración astrocitaria.........................................................29
2.6... Rho-GTPasas .......................................................................31
1
ÍNDICE
3. FGF2 en la plasticidad astrocitaria 3.1 Recpetores de FGF..................................................................34
3.2 Funciones generales de los FGF ...........................................36
3.3 FGF2 .........................................................................................38 Descubrimiento y primeros trabajos Estructura del FGF2 Secreción del FGF2
3.4 FGF2 en el SNC........................................................................41
Control de la expresión de FGF2 Funciones de FGF2 en el SNC
3.5 Papel del FGF2 en la inflamación cerebral ...........................48
4. Efecto protector de los antiinflamatorios no esteroideos sobre la
aparición de la enfermedad de Alzheimer.
4.1 Etiologia y patología de la enfermedad
de Alzheimer ...........................................................................50
4.2 Fases de la enfermedad de Alzheimer ..................................54
4.3 Tratamientos ............................................................................54
4.4 Efecto protector de los AINES sobre la AD
V. Objetivos ...................................................................59
VI. Materiales y métodos ...............................................61
1. Material biológico 1.1 Cultivos primarios de astrocitos
1.2 Tratamiento farmacológico de las células en cultivo
1.3 Infecciones virales
2. Métodos bioquímicos 2.1 PCR en tiempo real
2.2 Fraccionamiento subcelular
2
ÍNDICE
2.3 Western Blot
2.4 EMSA
2.5 ELISA para la detección de ICAM
2.6 ELISA para la detección de MCP
2.7 G-LISA
3. Métodos de biología celular 3.1 Inmunofluorescencia
3.2 Ensayos de migración
4. Métodos estadísticos
VII. Resultados ..............................................................71
1. Capítulo 1: JNK/ERK/FAK mediate pro-migratory actions of basic fibroblast growth factor in astrocytes via MCP1 and COX2 ............................................................................72
2. Capítulo 2: Secretase-independent and RhoGTPase/PAK/ ERK-dependent regulation of cytoskeleton dynamics in astrocytes by NSAIDs and derivatives................................110
VIII. Discusión 1. Inflamación cerebral como diana terapéutica en enfermedades
neurodegenerativa........................................................141
2. Nuevo papel de las cascadas de quinasas en la señalización inflamatoria ...................................................................144
2.1 Señalización inflamtoria por FGF2
2.2 Regulación de las kinasas PAK y ERK por los profenos
3. Nuevo papel de las RhoGTPasas en la señalización inflamatoria ...................................................................153
3.1 Dianas de los AINES en astrocitos
3.2 Nuevo papel de las RhoGTPasas en la señalización inflamatoria
3
ÍNDICE
4. Nuevo papel de la migración en la respuesta Inflamatoria...................................................................156
4.1 FGF2 promueve la migración astrocitaria
4.2 Los profenos en la migración astrocitaria
5. Conclusiones y valor terapéutico ................................165 5.1 FGF2 5.2 AINES
IX. Conclusiones .............................................................168
X. Otras publicaciones...................................................171
1. Staging anti-inflammatory therapy in Alzheimer's disease.
XI. Bibliografía .................................................................178
4
ABREVIATURAS
AD Alzheimer’s disease
AINEs Anti-inflamatorios no esteroideos
APP Amyloid precursor protein
ATP Adenosina trifosfato
Aβ Péptido β-amiloide
BHE Barrera hemato-encefálica
cAMP AMP cíclico
COX Ciclooxigenasa
CREB cAMP-response element binding
CSPG Chondroitin-sulfate proteoglycan
EAATs Excitatory aminoacid transporters
ELISA Enzyme-linked inmunoassay
ERK Extracelular response kinase
FAK Focal adhesion kinase
FGF Fibroblast growth factor
FGFR Fibroblast growth factor receptor
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate
GLAST Glutamate/Aspartate transporter
GPCR G-coupled protein receptor
GTP Guanidina trifosfato
HSPG Heparan-sulfate proteoglycan
ICAM Intercelular adhesion molecule
IFN Interferón
IL Interleuquina
IP3 Inositol trifosfato
JNK c-Jun N-terminal kinase
5
ABREVIATURAS
LPA Ácido lipofosfatídico
LPS Lipopolisacárido
MAPK Mitogen-activated protein kinase
MCP Monocyte chemoatractant protein
MS Multiple sclerosis
NF-kB Nuclear factor kB
PAK p21-activated kinase
PCR Polymerase chain reaction
PD Parkinson’s disease
ROCK Rho kinase
SNC Sistema nervioso central
TNF Tumor necrosis factor
VCAM Vascular adhesion molecule
WB Western Blot
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Resumem
RESUMEN
OBJETIVO GENERAL: Los astrocitos, el tipo celular más abundante en el sistema
nervioso central (SNC) desempeñan un papel clave en la homeostasis, la
neurotransmisión y, como tema central en esta tesis, en la neuroinflamación, es decir,
el conjunto de reacciones del cerebro al trauma, las infecciones virales o bacterianas,
o la neurodegeneración. El astrocito es extremadamente plástico, respondiendo a un
amplio repertorio de estímulos fisiológicos o insultos patológicos con cambios
morfológicos, migración, o cambios funcionales por modificación de su expresión
génica. El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la plasticidad astrocitaria en dos
paradigmas distintos relacionados con la neuroinflamación. En el primer bloque hemos
estudiado el efecto de un factor trófico de especial importancia en el SNC, el Factor
Básico de Fibroblastos, o FGF2, en la expresión de genes inflamatorios astrocitarios.
El FGF2 es un factor de crecimiento cuya expresión en el SNC adulto es muy alta,
localizada principalmente en astrocitos, y que se regula a la alza en condiciones
patológicas como el Alzheimer- alrededor de la placas de amiloide- o el ictus. Así
como las propiedades tróficas del FGF2, y su papel en el desarrollo del cerebro, son
ampliamente conocidos, su papel en la respuesta inflamatoria está pobremente
caracterizado. En el segundo bloque hemos analizado la capacidad de fármacos anti-
inflamatorios no esteroideos (AINES) como el ibuprofeno y derivados (R-flurbiprofeno y
CHF5074) los cuales, según estudios epidemiológicos, reducen la aparición de la
enfermedad de Alzheimer, de modular la dinámica del citoesqueleto de actina
astrocitario.
METODOS/MODELOS: Modelo de inflamación (LPS o scratch-wound en cultivos
primarios de astrocitos. Estudio expresion moléculas: RTPCR, Western Blot,
inmunocitoquímica, ELISAS, GLISAS. Manipulación mecanística: inhibidores
farmacológicos, sobreexpresión de proteínas mutantes dominantes negativos o
constitutivamente activos.
RESULTADOS: En los cultivos primarios mostramos que FGF2 modula de una
manera bifásica la respuesta inflamatoria inducida por LPS aumentando en estadíos
iniciales la expresión de genes inflamatorios como el de la quimocina MCP1, mientras
que potencia su regulación a la baja e inhibe la expresión de ICAM1 en estadíos más
avanzados. Esta regulación es dependiente de las vías de señalización de ERK, JNK
y FAK a través de la activación del receptor FGFR2 pero independiente del factor de
trasncripción NF-kB. Mostramos también que el tratamiento de astrocitos con
ibuprofeno y derivados produce un rápido cambio morfológico caracterizado por una
retracción del soma y emisión de procesos dependiente de la modulación de las
8
RESUMEN
proteínas Rho-GTPasas RhoA, Rac1 y cdc42 e independiente de las diana “clásica” de
los antiinflamatorios las ciclooxigenasas (COX2). Este fenotipo resulta en una
capacidad migratoria acelerada en el caso del ibuprofeno o inhibida en el caso del R-
Flurbiprofeno y CHF5074.
CONCLUSIONES: Los resultados expuestos en esta tesis demuestran el papel
inmunomodulador del FGF2 en la respuesta inflamatoria astrocitaria. Especulamos
que el carácter bifásico de la respuesta permite los efectos beneficiosos de la
inflamación pero evitando su cronificación. Además mostramos que los profenos son
capaces de promover la aparición de fenómenos plásticos en astrocitos a través de la
modulación de nuevas dianas como las Rho-GTPasas, abriendo nuevas perspectivas
en la terapia de enfermedades neurodegenerativas en las que los astrocitos estén
implicados.
9
RESUMEN
10
Introducción
INTRODUCCIÓN
1. Los astrocitos son un tipo celular altamente plástico y polivalente.
1.1 Morfología y tipos de astrocitos Los astrocitos, representan un 90% del total de células del SNC (Sistema Nervioso
Central) y son una población diversa, siendo su presencia más abundante en áreas
cerebrales determinadas como el hipocampo o el cerebelo (Norenberg, 1979). In vivo,
presentan una morfología estrellada, extendiendo desde el soma numerosos procesos
que rodean a las neuronas vecinas y contactan con los microvasos cerebrales
(Nedergaard et al., 2003). Estos procesos, altamente ramificados, se caracterizan por
la presencia de la proteína glial acídica fibrilar (GFAP) que se utiliza muy a menudo
como marcador de astrocitos. Poseen una morfología altamente compleja y
heterogénea, y cada uno de ellos ocupa compartimentos o territorios bien definidos
que apenas solapan con el de los astrocitos vecinos (Bushong et al., 2002;Wang and
Bordey, 2008), con los que está conectado a través de canales tipo gap junction
formando un sincitio funcional (Konietzko and Muller, 1994). Las gap junctions,
formadas por proteínas de la familia de las conexinas, son permeables a moléculas
cargadas y permiten el flujo de sustratos energéticos desde los vasos hasta las
neuronas que se hallan en el territorio de un astrocito (Simard et al., 2003)
Históricamente se ha dividido a los astrocitos en dos grupos atendiendo a su
morfología y ubicación. Así, los astrocitos protoplasmáticos, localizados en la materia
gris cerebral, presentan muchos procesos ramificados que contactan sinapsis y vasos
cerebrales (Frederickson and Silver, 1991), mientras que los astrocitos fibrosos se
localizan en la materia blanca y poseen menos procesos, más largos y sin ramificar,
que contactan con los nódulos de Ranvier (Wang and Bordey, 2008). Esta clasificación
puede considerarse actualmente simplista ya que dos astrocitos adyacentes y de
morfología comparable pueden tener perfiles de expresión muy diferentes. Estudios de
expresión por microarrays demuestran que en realidad hay pocos genes que se
expresen específicamente en todos los astrocitos, y que se producen patrones de
expresión dependientes de la localización celular (Bachoo et al., 2004).
A grandes rasgos, los astrocitos presentan un soma relativamente pequeño de 7-9 μm
desde donde extienden entre cinco a ocho procesos principales que se ramifican
uniformemente en pequeños apéndices distribuidos uniformemente que se infiltran en
la intrincada red neuronal incluyendo terminales sinápticos, dendritas y espinas
dendríticas en un volumen que puede llegar a ocupar 66000 μm3. Esta morfología les
12
INTRODUCCIÓN
permite interaccionar con la mayoría de tipos celulares del SNC. En este sentido, se
considera que el 99% de la microvasculatura cerebral está cubierta por pies
astrocitarios (Kacem et al., 1998) y que en el dominio de un solo astrocito en corteza o
hipocampo de un roedor se pueden localizar hasta 105 sinapsis (Bushong et al., 2002),
Alaza et al 2007), un valor que en humanos resulta superior, hasta el punto que se ha
propuesto que una característica del cerebro humanos en relación al de otros
mamíferos, es su complejidad astrocitaria (Oberheim et al., 2009).
Se puede considerar a los astrocitos como unidades de integración local de la
información sináptica y no-sináptica de la microregión que cubre cada uno de ellos. La
membrana plasmática de los astrocitos contiene microdominios específicos que origina
señales intracelulares que pueden propagarse en estos dominios sin afectar la
totalidad de la célula, permitiendo el control por fracciones de territorio dominados por
un astrocito de manera independiente (Wang and Bordey, 2008).
Es importante destacar que todas estas observaciones sobre la morfología astrocitaria
realizadas in vivo, no se reproducen en cultivos puros de astrocitos in vitro. En efecto,
la mayoría de protocolos para conseguir este tipo celular en cultivo da como resultado
monocapas confluentes de astrocitos de morfología epitelioide (plana y poligonal) que
no reproducen su morfología original in vivo (McCarthy and de, 1980;Won and Oh,
2000). Ésta se consigue al tratar las células con diferentes factores como el cAMP
(Won and Oh, 2000) algunos neurotransmisores como la noradrenalina (Shao et al.,
1994) o el ATP (Neary et al., 1994) y con factores de crecimiento como el EGF o el
FGF2 (Heffron and Mandell, 2005). También la presencia de neuronas en co-cultivos
de neuronas-astrocitos, genera en estos últimos una morfología estrellada. Estas
observaciones denotan que probablemente la compleja morfología estrellada de los
astrocitos in vivo, depende de numerosos factores, entre ellos el entorno en el que se
encuentren.
1.2 Fisiología astrocitaria 1.2.1 Soporte neuronal Se han descrito numerosas funciones esenciales para los astrocitos, especialmente
aquellas relacionadas con el correcto funcionamiento de las neuronas y de la
transmisión neuronal. Ambos tipos celulares comparten varias funciones sobre todo
en el terreno metabólico, aunque los astrocitos están a menudo mejor posicionados
que las neuronas, poseen mecanismos más eficientes y disponen de reservas
13
INTRODUCCIÓN
energéticas mayores para realizarlas (Fuller et al., 2009). Entre estas funciones de
soporte estructural y metabólico las más importantes son:
- Soporte metabólico a neuronas, captando glucosa desde los microvasos y
transformándola a lactato mediante la glicólisis, que al ser liberado al medio
extracelular constituye el principal sustrato energético para las neuronas
(Tekkok et al., 2005;Pellerin, 2005). Además los astrocitos son las únicas
células del SNC capaces de almacenar reservas de glucosa en forma de
glucógeno, las cuales pueden movilizarse en respuesta a algunos
neurotransmisores (Brunet et al., 2010;Gavillet et al., 2008)
- Regulación de la concentración extracelular de iones. La actividad
neuronal, es decir, la generación de impulsos nerviosos entre neuronas, genera
en el espacio extracelular un gran aumento en las concentraciones de K+ y de
protones (resultado del metabolismo del piruvato por parte de las neuronas). La
acumulación de estos productos, en altas concentraciones, dificultan el
correcto funcionamiento de la actividad neuronal. Los astrocitos disponen de
canales que permiten recaptar específicamente estos iones, y trasladarlos a
zonas donde su concentración es menor, o directamente al torrente sanguíneo
(revisado en Simard and Nedergaard, 2004)
- Síntesis y liberación de glutatión. El glutatión es un tripéptido que en el SNC
es principalmente sintetizado por los astrocitos, y tiene varias funciones
esenciales como antioxidante frente a las especies reactivas de oxígeno, pero
también como cofactor en procesos de síntesis de proteínas y ácidos
nucleicos. Los astrocitos liberan el dipéptido CysGly, precursor del glutatión,
que puede ser recaptado por las neuronas (revisado en Dringen and Hirrlinger,
2003).
1.2.2 Gliotransmisión y participación a la sinapsis tripartita El hecho de que no sean células excitables eléctricamente llevó a la conclusión
incorrecta de que los astrocitos eran elementos pasivos en la neurotransmisión. Los
astrocitos expresan en sus membranas receptores acoplados a proteína G, (GPCRs)
que les permiten responder a neurotransmisores. Este descubrimiento, allá en los 70
(McCarthy and de, 1978;van et al., 1978) puso de manifiesto que podía responder a
estímulos extracelulares que se pensaba que eran dirigidos exclusivamente a las
14
INTRODUCCIÓN
neuronas. A través de la estimulación de estos receptores se desencadenan vías de
señalización, entre ellas la de calcio y el cAMP, que permiten a los astrocitos
comunicarse entre ellos y con otras células vecinas. Hasta entonces la visión
predominante era que los astrocitos eran células eléctricamente silentes y por lo tanto
no participaban en la neurotransmisión. El descubrimiento de que los astrocitos
respondían a estímulos extracelulares mediante fluctuaciones de Ca2+ puso de
maifiesto que se trataba de células excitables, aunque esta excitabilidad no dependa
de potenciales de acción y que existe un sistema de comunicación neurona-astocito
que permite ligar la actividad neuronal con las ondas de Ca2+ astrocitarias (Agulhon et
al., 2008). Actualmente se sabe que astrocitos expresan una batería de receptores
para la mayoría de sustancia neuroactivas incluyendo neurotransmisores,
neuropéptidos, factores de crecimiento y citoquinas, que les permiten responder a
estímulos a los que también responden las neuronas.
La vía molecular más estudiada en la elevación del calcio citosólocio es la de la
PLC/IP3. Tras la activación de los GPCRs, la formación del segundo mensajero IP3, y
su subsiguiente unión a receptores IP3R, permite la liberación de Ca2+ del retículo
endoplasmático (aunque existen otros almacenes de calcio intracelular). Las
oscilaciones de calcio pueden ser muy variables, según su amplitud, duración y
frecuencia. Según estos parámetros afectarán únicamente un microdominio del
astrocito, o se propagarán por toda la célula afectando incluso las células vecinas. Así,
los astrocitos son células capaces de discriminar estímulos de diversos orígenes e
integrar señales concomitantes (Fiacco et al., 2009;Petravicz et al., 2008). Se han
descrito también oscilaciones de Ca2+ espontáneas, es decir independientes de
señales neuronales. Estas oscilaciones se observan in vivo y podrían depender de
canales de calcio dependientes de voltaje (Parri and Crunelli, 2003).
Diversos estudios han puesto de manifiesto que las señales de Ca2+ pueden
propagarse de un astrocito a otro recorriendo distancias relativamente largas. Esto
descubrimientos in vitro, por estimulación eléctrica, mecánica o química, han dado a
pensar que puede existir una red de comunicación entre astrocitos (Sul et al., 2004).
No obstante no queda claro si este fenómeno se reproduce en condiciones
fisiológicas. Estudios in vivo muestran que en respuesta a estímulos fisiológicos no se
generan ondas de Ca2+ que viajen de una zona a otra. Más bien se observa que cada
uno de los astrocitos estimulados responde de manera más bien independiente
(Schummers et al., 2008). Existen dos modelos que podrían explicar cómo las señales
de calcio se propagan de una célula a otra. Intracelularmente el IP3 generado en
15
INTRODUCCIÓN
respuesta a una señal extracelular puede difundir a través de las gap-junctions que
unen a los astrocitos entre ellos (Newman, 2001) Extracelularmente, la elevación del
calcio intracelular puede promover la liberación de factores como el ATP, que a su vez
podrían excitar a las células vecinas (Innocenti et al., 2000).
La señalización por Ca2+ en algunos casos promueve la rápida liberación de los
denominados gliotransmisores, moléculas provenientes del astrocito que son activas in
situ sobre neuronas pre- y post-sinápticas modulando su actividad, como el glutamato,
la D-Serina, el ATP, algunas prostaglandinas y el TNF-α, revisado en (Halassa et al.,
2007). Todos estos descubrimientos han colocado a los astrocitos en un puesto muy
activo en la neurotransmisión, añadiendo un nuevo elemento, la glia perisináptica, en
el tradicional modelo de la sinapsis formada por las neuronas pre- y postsinápticas.
Este nuevo modelo recibe el nombre de sinapsis tripartita y es sujeto de un activo
debate en la actualidad (Perea et al., 2009).
1.2.3 Regulación de los niveles sinápticos de glutamato.
El glutamato es considerado como el principal neurotransmisor excitador en el SNC y
está involucrado en la mayoría de procesos que conforman el funcionamiento normal
del SNC como la cognición, la memoria y el aprendizaje. Aproximadamente el 90% de
las neuronas liberan glutamato al ser excitadas. Éste es liberado al espacio sináptico
por exocitosis de las vesículas que lo contienen, donde difunde hasta unirse a sus
receptores en la membrana post-sináptica. Para permitir una señalización sináptica
fina, el glutamato sobrante debe ser retirado rápidamente del espacio sináptico
(Danbolt, 2001).
Además, el glutamato es una potente neurotoxina, y la excitoxicidad producida por
glutamato participa en numerosas patologías del SNC. Altas concentraciones
extracelulares de este neurotransmisor producen una sobrestimulación de las
neuronas, que provoca daños en éstas y que pueden llevar a su muerte, bien por una
vía rápida dependiente de Ca2+, bien por apoptosis como ocurre en enfermedades
neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (AD).
El glutamato liberado al espacio intersináptico es rápidamente recaptado por los
astrocitos circundantes, terminando así su función neurotransmisora y evitando la
sobrestimulación neuronal. La recaptación se lleva a término mediante transportadores
específicos para glutamato presentes en la membrana de los astrocitos, siendo los
principales EAAT1 (GLT1) y EAAT2 (GLAST1). El glutamato recaptado es
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INTRODUCCIÓN
transformado a glutamina, a través de la glutamina sintasa, enzima de expresión
localizada principalmente en astrocitos, y se libera al medio donde es recaptada de
nuevo por las neuronas. El glutamato es recaptado por los EAATs astrocitarios juntos
con tres iones Na+, produciendo una aumento intracelular en la concentración de este
ión. Para reducirla, los astrocitos utilizan la ATPasa Na+/K+, provocando una demanda
energética en estas células que como consecuencia activan las vías de la glicólisis.
Este aumento intracelular de los niveles de Na+ a causa de la recaptación de
glutamato sirve como un sistema integrador entre la actividad neuronal con la
utilización de glucosa y confiere a los astrocitos un nivel adicional de control sobre la
actividad sináptica (Magistretti et al., 1999;Azarias et al., 2011;Danbolt, 2001).
Figura1. Metabolismo de la recaptación del glutamato en la sinapsis glutamatérgica. De Magistretti et al, 1999
En esta línea, la recaptación de glutamato es un proceso dinámico y se incrementa
durante la actividad neuronal, incluyendo la potenciación a largo término (LTP).
Descubrimientos recientes han demostrado que la expresión de los EAATs son
regulados a nivel de la sinapsis por la interacción neurona-astrocito mediante el
sistema de señalización de las efrinas. En el área CA1 del hipocampo la presencia del
receptor de efrina A4 en la neurona post-sináptica, a través de su interacción con su
ligando, la efrina A3, que se encuentra expresada en los procesos astrocitarios peri-
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INTRODUCCIÓN
sinpápticos, disminuye la expresión de los EAATs gliales (Carmona et al., 2009) y es
capaz de modular la LTP (Filosa et al., 2009). La señalización ephrin-A3/EphA4
modula también la longitud y morfología de las espinas dendríticas (Murai et al., 2003).
En resumen, esta vía de señalización controla bidireccionalmente la función sináptica y
el transporte de glutamato, incidiendo directamente en la función hipocampal, una
evidencia adicional sobre la participación de los astrocitos en la transmisión sináptica.
Se ha mostrado que la regulación dinámica de los EAATs participa en procesos de
aprendizaje. En ratas sometidas al test del laberinto acuático de Morris, se ha
observado una disminución en los niveles de expresión en hipocampo de GLAST y
EAAC1 (transportador de glutamato neuronal). Los autores proponen que esta
disminución en las primeras fases del aprendizaje espacial podría permitir una
transmisión sináptica glutamatérgica de mayor intensidad durante las fases críticas del
aprendizaje (Fraticelli-Torres et al., 2010).
1.2.4 Acoplamiento neurovascular A través de la interacción con las células endoteliales los astrocitos controlan también
la formación de la barrera hematoencefálica (Abbott et al., 2006), y son capaces de
regular el flujo sanguíneo cerebral. El control del flujo sanguíneo cerebral (CBF) es
vital para mantener el aporte energético necesario para el funcionamiento neuronal
correcto. Descubrimientos recientes muestran que los astrocitos participan
directamente en el control del CBF, permitiendo acoplar las demandas energéticas de
las neuronas de un área con alta actividad neuronal con un incremento en el flujo
sanguíneo. Este nivel de control parece depender de la gliotransmisión dependiente
de Ca2+ que conlleva variaciones en el tono arteriolar en una zona determinada. Así, la
elevación de la concetración de Ca2+ intracelular conlleva a la formación de la
prostaglandina PGE2 capaz de producir vasodilatación en los capilares cerebrales
(Mulligan and MacVicar, 2004).
18
INTRODUCCIÓN
2. Participación de los astrocitos a la neuroinflamación
2.1 Conceptos generales sobre la inflamación cerebral La inflamación es una reacción de defensa de los tejidos destinada a neutralizar
estímulos perjudiciales y restaurar la integridad tisular. En enfermedades
neurodegenerativas la inflamación tiene lugar como una respuesta local conducida por
las células gliales y el endotelio cerebral.
De una manera simplista, según su duración en el tiempo la neuroinflamación puede
clasificarse en aguda o crónica. La inflamación aguda consta de las reacciones
inmediatas de las células gliales a un daño, y es básicamente un proceso defensivo
que prepara el terreno para la reparación del área lesionada. La inflamación crónica es
característica de las enfermedades neurodegenerativas en las que existe un estímulo
que persiste en el tiempo y se caracteriza por una activación glial sostenida (Streit et
al., 2004) y en algunos casos, como en la esclerosis múltiple, por la acumulación de
leucocitos en el parénquima cerebral. Bioquímicamente, el grado de activación viene
determinado por el espectro de mediadores inflamatorios generados por las células
gliales. Este espectro incluye prostaglandinas, proteínas del complemento, citoquinas,
quimiocinas, proteasas, moléculas de adhesión y radicales libres (McGeer and
McGeer, 2004).
2.2. Privilegio inmune del SNC El sistema nervioso central (SNC) presenta particularidades en cuanto a la respuesta
inflamatoria respecto a la inflamación sistémica. La magnitud de las respuestas
inflamatorias en el parénquima cerebral es menor comparada con la de otros tejidos,
fenómeno conocido como privilegio inmune del cerebro (Matyszak, 1998). Esta menor
reactividad inflamatoria está basada en la existencia de la barrera hematoencefálica
(Pachter et al., 2003) y en la presencia de moléculas endógenas con propiedades anti-
inflamatorias como la noradrenalina (Frohman et al., 1988;Feinstein et al., 2002;Galea
et al., 2003a).
1. La barrera hematoencefálica (BHE) representa una especialización del endotelio
cerebral que se caracteriza por una densa red de uniones estrechas entre células
endoteliales y la presencia de numerosos procesos astrocitarios que se encuentran
rodeando los vasos cerebrales. Estas características confieren a la BHE la capacidad
19
INTRODUCCIÓN
de restringir el acceso de células inmunes y sustancias potencialmente nocivas de la
circulación sistémica al SNC (Wolburg and Lippoldt, 2002).
2. Existen en el SNC sistemas neuronales con capacidad inmunomoduladora: Este
sería el caso de locus coeruleus que manda proyecciones a todo el cerebro y a la
espina dorsal y que en primates produce el 70% de la noradrenalina cerebral (Galea et
al., 2003b). La noradrenalina ejerce un papel inmunomodulador sobre la producción de
moléculas proinflamatorias en células gliales (astrocitos y microglía) (Galea and
Feinstein, 1999a) y el endotelio cerebral (Balyasnikova et al., 2000). Estos tres tipos
celulares son los principales responsables del desarrollo de la respuesta inflamatoria
en el cerebro.
3. El SNC es un tejido extremadamente rico en todo tipo de factores de crecimiento y
neurotrofinas. La expresión de algunos de estos factores está regulada por la
activación de receptores beta-adrenérgicos (que son reconocidos por la noradrenalina)
(Riva et al., 1998a) y podrían estar mediando los efectos de los sistemas
neuromoduladores. La hipótesis de la primera parte de este trabajo es que los
factores de crecimiento pueden regular las respuestas inflamatorias en el SNC. 2.3 La células gliales participan en la inmunidad innata del SNC El sistema inmunitario posee dos grandes rutas de defensa: la inmunidad innata y la
adquirida. La inmunidad innata representa la capacidad inmediata del organismo de
responder a patógenos y otros tipos de trauma, y se caracteriza por la producción de
novo de mediadores para eliminar los microorganismos y reparar el daño, bien
directamente o a través de la activación de células fagocíticas. Estos mediadores son
las citoquinas, quimiocinas y proteínas del complemento. En el SNC los genes que
codifican proteínas que participan en la inmunidad innata pueden ser inducidos no sólo
por microorganismos sino que también por células dañadas en lesiones y patologías
neurodegenerativas (Rivest, 2003;Becher et al., 2000) La inmunidad adquirida se
desarrolla frente a un antígeno específico y es mediada por células del sistema
inmunitario: limfocitos B y T, requiriendo complejas reorganizaciones génicas para la
producción de anticuerpos.
Las células gliales participan activamente en la respuesta inmune innata del cerebro,
respondiendo ante la presencia de microorganismos patógenos. Los sistemas de
reconocimiento enfocados a patrones moleculares presentes sobre los patógenos
(PAMP) son la base de la inmunidad innata, la cual inicia y dirige la respuesta inmune
20
INTRODUCCIÓN
adaptativa. Entre estos sistema de reconocimiento de patrones moleculares destacan
la familia de los toll-like-receptors (TLRs). Existen hasta once miembros de esta familia
de receptores transmembrana, cada uno de los cuales presenta especificidad por
ligandos presentes en patógenos y son expresados de manera tejido-específica
(Iwasaki and Medzhitov, 2004). Así algunos TLRs reconocen moléculas que se
encuentran en la superficie de patógeno, el TLR2 (como heterodímero con TLR1 o
TLR6) se activa tras la unión a lipoproteínas de origen bacteriano, TLR4 se une al
lipopolisacárido de la pared de bacterias gram negativas y a proteínas de origen vírico,
mientras que el TLR5 reconoce una proteína presente en los flagelos de algunas
bacterias denominada flagelina. Algunos TLRs son capaces de detectar la presencia
intracelular de ácidos nucleícos de origen bacteriano o vírico; TLR3 reconoce ARN de
doble cadena, los TLR7/8 reconoce RNA de cadena sencilla y el TLR9 ADN
hipometilado rico en CpG. (Liew et al., 2005). La capacidad de los TLRs de reconocer
ácidos nucleicos debe de tenerse en cuenta a la hora de realizar experimentos en los
que se pretende introducir construcciones de ARN mediante transfecciones utilizando
reactivos lípidicos (la mayoría de kits comerciales de transfección utilizan moléculas de
origen lipídico), para silenciar genes mediante siRNA, ya que algunas células, entre
ellas los astrocitos, desencadena una respuesta inmune a cadenas cortas de ARN en
conjunción con lípidos a través de la activación de los TLR3 y 7 (Gorina et al., 2009).
Tras la unión de los TLRs a sus ligandos, proteínas adaptadoras como MyD88, MAL,
TRIF y TRAM, son reclutadas al dominio intracelular de los receptores y se unen a él a
través de dominios TIR. Este reclutamiento permite la activación de kinasas de la
familia IRAK (IL-1 receptor-asociated kinases) 1,2 y 4. IRAK4 es la primera en ser
reclutada, y tas su activación fosforila a IRAK1, que es capaz de activar a otros
efectores de esta vía de señalización como son las kinasas del inhibidor de NF-κB
(IκB) que reciben el acrónimo IKK. La fosforilación del IκB por parte de las IKKs,
resulta en su degradación vía el proteasoma y en la traslocación nuclear del factor de
transcripción NF-κB que media la transcripción de genes inflamatorios generando una
respuesta pro-inflamatoria (Flannery and Bowie, 2010;Flannery et al., 2011).
Adicionalmente a la capacidad de los TLRs de reconocer PAMPs (Patogen-associated
molecular patterns) presentes en patógenos, recientemente se ha descubierto que
éstos pueden ser activados por ligandos endógenos, a los que se conoce como
DAMPs (Danger-associated molecular patterns). Los TLRs extracelulares 2 y 4
reconocen moléculas liberadas al medio extracelular por células muertes o dañadas
que han perdido la integridad de la membrana plasmática. Entre los putativos DAMPs
21
INTRODUCCIÓN
que activan a TLR2 y 4 se encuentran algunas proteínas de choque térmico (HSPs),
proteínas del gurpo HMGB1, el ácido hialurónico, la fibronectina o el heparan sulfato
(Sirisinha, 2011). El amplio perfil de expresión de los TLRs y su capacidad de de
reconocer a muchos ligandos que se encuentran presentes a consecuencia de
situaciones de infecciones, heridas o estrés, hacen que la señalización por TLR
constituya un mecanismo de respuesta rápida frente al daño tisular. Debido a esto,
empiezan a ser considerados como dianas terapéuticas, tanto para prevenir el shock
séptico que puede aparecer como consecuencia a algunas infecciones (Kuno et al.,
2009), o en enfermedades autoinmunes en las que los TLR parecen jugar un papel
como es el caso del lupus eritromatoso, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple u
otras patologías como la enfermedad de Alzheimer (Midwood et al., 2009;Marta et al.,
2009).
Los astrocitos expresan el TLR4 (Qin et al., 2005;Bowman et al., 2003a) que reconoce
el LPS (lipopolisacárido). Esta molécula ha sido ampliamente utilizada como estímulo
inflamatorio en todo tipo de modelos celulares y animales por su capacidad de inducir
una respuesta inmune/inflamatoria de tipo innata. La inducción de la respuesta
inflamatoria por LPS se produce por la acción coordinada de 4 proteínas que
reconocen a esta endotoxina. Inicialmente LBP (LPS-binding protein) interacciona con
las membranas bacterianas ricas en LPS, o agregados de LPS, catalizando la
extracción y transfiriendo los monómeros de endotoxina a CD14, que a su vez los
transfiere a la proteína MD2. La heterodimerización de esta última proteína con los
receptores TLR4 desencadenan las vías de señalización de las que se ha hablado
anteriormente. Es importante destacar que tanto LBP como CD14 son capaces de
detectar a LPS, incluso a muy bajas concentraciones (Jerala, 2007;Teghanemt et al.,
2007). El modelo inflamatorio inducido por LPS es relativamente fácil y económico de
establecer y presenta la ventaja de que activa vías de transducción de señales
comunes a las citoquinas inflamatorias IL-1� y TNF-�(Palsson-McDermott and O'Neill,
2004), conocidas por ser las iniciadoras de diversas patologías con componente
inflamatorio.
2.4 Los astrocitos en la inmunidad innata La respuesta de los astrocitos a condiciones patológicas como la inflamación o lesión,
recibe el nombre de astrogliosis y se caracteriza por hipertrofia, proliferación, y
migración a las zona dañadas acompañado de un aumento de la expresión de
proteínas como GFAP (Hozumi et al., 1990;Pekny and Pekna, 2004), vimentina
(Ekmark-Lewen et al., 2010), S100β (Willoughby et al., 2004) y el receptor B de
22
INTRODUCCIÓN
endotelinas (ETbR) (Peters et al., 2003). Estos marcadores han sido los más utilizados
para detectar astrocitos reactivos en el SNC en todo tipo de trastornos neurológicos.
Además, en el proceso de astrogliosis se sobreexpresan un buen número de
moléculas de diversos tipos como citoquinas, quimiocinas (Meeuwsen et al., 2003),
moléculas de adhesión (Lee and Benveniste, 1999), enzimas del sistema óxido-
reducción, enzimas sintetizadoras de mediadores de inflamación como NOS2 o COX2
(Galea et al., 1994), componentes de la matriz extracelular, entre ellos los
proteoglicanos (McKeon et al., 1999) y factores de crecimiento (Miklic et al.,
2004;Suzuki et al., 2006).
La astrogliosis puede variar cualitativa y cuantitativamente según la naturaleza de la
lesión y el microentorno de la zona lesionada, poniendo de manifiesto la plasticidad de
los astrocitos reactivos. En general, la activación de los astrocitos se considera un
mecanismo beneficioso a través del cual el SNC normal responde a un daño y
reestablece la homeostasis (Faulkner et al., 2004a). Sin embargo la activación glial
crónica, característica de las enfermedades neurodegenerativas y de lesiones como la
sección medular, se considera patológica en parte por la sobreexpresión de citoquinas
pro-inflamatorias y por la formación de la cicatriz glial que impide la regeneración
axonal (Ridet et al., 1997;Wilhelmsson et al., 2004). La naturaleza dual de la reacción
astrocitaria fue puesta de manifiesto en un estudio donde se muestra que la ablación
química de los astrocitos, en el SNC lesionado. La ausencia de astrocitos reactivos
resulta en una mayor pérdida de neuronas adyacentes a la lesión, así como en un fallo
en el restablecimiento de la integridad de la BHE y una mayor infiltración de leucocitos.
Estos datos ilustran el papel reparador de los astrocitos reactivos en respuesta a
lesiones. Por otra parte la pérdida de astrocitos está asociada a un dramático
incremento en el crecimiento local de neuritas indicando que la formación de la cicatriz
glial constituye un impedimento para regeneración axonal (Bush et al., 1999;Faulkner
et al., 2004b).
La cicatriz glial representa un intento por parte de los astrocitos de aislar la zona
lesionada para evitar daños secundarios a las regiones adyacentes al foco. Está
constituida por astrocitos hipertrofiados que presentan alta expresión de GFAP,
rodeados de una densa matriz extracelular formada por una red molecular muy rica en
condroitín-sulfato proteoglicanos (CSPG). Los CSPG, entre ellos el neurocán y
fosfacán (Morgenstern et al., 2002), son glicoproteínas de muy alto molecular, cuya
parte glucídica, entre otros factores, es la que convierte la cicatriz glial en restrictiva
para el crecimiento axonal y por la tanto a la completa regeneración funcional de los
23
INTRODUCCIÓN
tejidos afectados. Sin embargo, estudios recientes muestran que la formación y
composición de la cicatriz glial pueden modularse, resultando en una resolución de la
lesión acompañada de una mejoría en la recuperación funcional, poniendo en duda la
idea preestablecida de que la presencia de esta cicatriz es siempre perjudicial. Así, un
estudio (Renault-Mihara et al., 2011) muestra, que el tratamiento de ratas a las que se
efectúa una lesión de espina dorsal con un inhibidor de la GSK3, resulta un aumento
en la migración astrocitaria, asociada a una mayor compactación, entendida como
aislamiento, del infiltrado celular inflamatorio, a una reducción de la desmielinización y
a un incremento en el crecimiento axonal. En la misma línea el tratamiento con FGF2
en un modelo similar de sección de espina dorsal, da lugar a una mejoría en la
recuperación funcional debido a modificaciones en la composición de la cicatriz glial
que permiten el crecimiento axonal (Kasai et al., 2010). Estos estudios ponen de
manifiesto que la modulación de la migración astrocitaria representa una diana terapéutica en procesos de regeneración.
El carácter difuso de la reactividad astrocitaria en el SNC sugiere un papel de
mediadores solubles como las citoquinas, y/o a la presencia de un sincitio integrado
entre astrocitos que permite la transferencia de información a largas distancias.
Existen evidencias que muestran tanto in vivo como in vitro que ambos sistemas,
mediadores solubles y conexión por sincitio, son operativos en el SNC lesionado. En
este sentido la función de las citoquinas en el establecimiento, mantenimiento y, en
algunos casos, resolución de la reactividad astrocitaria han sido ampliamente
caracterizadas y sigue siendo un tema activamente estudiado. Las citoquinas son
glicopéptidos solubles de bajo peso molecular que actúan de manera autocrina o
paracrina mediante la interacción con receptores de membrana. La mayoría de
citoquinas pueden actuar como ligando para más de un receptor. Aquéllas con un
claro papel en iniciar las astrogliosis son la IL-1β (Giulian et al., 1988;Herx and Yong,
2001) y el TNF-α (Rostworowski et al., 1997), mientras que el IFN-γ (Yong et al.,
1991;Balasingam et al., 1994) jugaría un papel potenciador, mientras que existen
citoquinas con un claro papel antiinflamatorio como el TGF-β (Shrikant et al., 1996a) o
neuroprotector como la IL-6 (Quintana et al., 2008).
Hay que tener en cuenta que el término neuroinflamación engloba fenómenos tan
diversos como la respuesta de las células gliales a infecciones, a mecanismos
reparadores como los que ocurren durante la isquemia o las lesiones de espina dorsal,
o a las reacciones a las que están sometidas los astrocitos en la fases iniciales
asintomáticas que, en la mayor parte de los casos, preceden la manifestación de
24
INTRODUCCIÓN
muchas enfermedades neurodegenerativas. Todos estos procesos inflamatorios, que
pueden considerarse relacionados de alguna manera, no tendrían por qué estar
incluidos en un mismo grupo. En efecto, el patrón de expresión génico de un astrocito
reactivo puede variar según cuál sea la naturaleza del estímulo inflamatorio. Además
existe una heterogeneidad astrocitaria durante la reactividad glial, que hasta el
momento ha sido pobremente caracterizada. Por eso, hemos creído conveniente
escoger genes candidatos, que cubren diferentes aspectos de la reactividad
astrocitaria, para el estudio de la modulación de la plasticidad astrocitaria. Estos genes
son la MCP1, ICAM1 y COX2.
2.4.1 MCP1
MCP1 (Monocyte chemoatractant molecule), otramente denominada CCL2, es una
quimiocina de 20kDA que es secretada al medio extracelular donde ejerce sus
funciones. Pertenece al grupo de las quimiocinas tipo CC, que comparten la
característica de presentar en su secuencia aminoacídica dos residuos de cisteína
adyacentes (Laing and Secombes, 2004). Las quimiocinas son un amplio grupo de
proteínas funcionalmente relacionadas, que, al generar gradientes de concentración,
guían y atraen al tejido lesionado, a un extenso espectro de células inmunes, entre
ellas monocitos, leucocitos, células NK y células T, y que además son capaces de
señalizar de manera parecida a las citoquinas (Ubogu et al., 2006). Adicionalmente al
bien establecido papel que ejercen en el sistema inmune, las quimiocinas ejercen
funciones en el SNC tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Por ejemplo,
CXCL1, CXCL8, y CXCL12 regulan la liberación de neurotransmisores y la actividad
de canales iónicos en las pre- y post-sinapsis. (Bertollini et al., 2006). La expresión de
la MCP1 se localiza en poblaciones concretas de neuronas colinérgicas,
dopaminérgicas y de Purkinje en el SNC normal, colocalizando con neurotransmisores
y neuropéptidos, sugiriendo un papel como modulador de la actividad neuronal
(Banisadr et al., 2005). En la patología, las quimiocinas y sus receptores participan en
la patogénesis y desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, como la
enfermedad de Alzheimer (Kiyota et al., 2009;Xia and Hyman, 1999) y la esclerosis
múltiple y en trastornos neurológicos como la isquemia y la demencia asociada al
SIDA (Eugenin et al., 2006;Dhillon et al., 2008).
En particular, la MCP1 ha sido implicado en el daño neuronal que ocurre en la
isquemia y en la esclerosis múltiple ya que los animales KO (knock out) para esta
quimiocina o para su principal receptor, el CCR2, son resistentes a la EAE
25
INTRODUCCIÓN
(experimental autoinmune encephalomyelitis, modelo in vivo de la esclerosis múltiple)
(Fife et al., 2000) o presentan un menor daño cerebral en respuesta a modelos de
isquemia (Hughes et al., 2002). Además de su papel quimiotáctico sobre los monocitos
y la microglía (Tanuma et al., 2006;El-Hage et al., 2006), recientemente se han
descrito nuevas funciones neuroprotectoras para la MCP1. Así, reduce la muerte
neuronal en cultivo inducida por excitotoxicidad, por exposición a proteínas del virus
del VIH (Eugenin et al., 2003) o durante la deprivación de oxígeno y glucosa (Madrigal
et al., 2009a). Adicionalmente participa en el reclutamiento de precursores neuronales
tras un episodio isquémico (Yan et al., 2007;Xu et al., 2007). Recientemente, se ha
publicado un trabajo que muestra que la MCP1 podría tener per se, un papel
neuromodulador en los astrocitos, disminuyendo la expresión de citoquinas, como la
IL-6, tras un estímulo pro-inflamatorio (Semple et al., 2010b) Todos estos resultados
hacen pensar que la MCP1 desempeña un papel importante en procesos de
regeneración en el SNC.
A pesar de que varios tipos celulares, incluyendo neuronas, endotelio y glía, pueden
expresar la MCP1, (Thibeault et al., 2001;Flugel et al., 2001), los astrocitos parecen
ser su principal fuente en respuesta a lesiones (Khorooshi et al., 2008;Glabinski et al.,
1996). El gen de la MCP1, es del tipo early-response, y se transcribe de manera
rápida en respuesta a estímulos específicos por la acción de factores de trancripción
como NF-κB (Giraud et al., 2010), HIF1α (Mojsilovic-Petrovic et al., 2007) y CEBPs
(Abraham et al., 2005). Su expresión aumenta dramáticamente en respuesta a
estímulos proinflamatorios como el TNFα (Gao et al., 2010;Giraud et al., 2010), LPS
(Thompson and Van Eldik, 2009), o por Aβ (Smits et al., 2002;Prat et al., 2000) pero es
también regulable por gliotransmisores como la noradrenalina (Madrigal et al., 2010) y
ATP (Panenka et al., 2001). La presencia del principal receptor para la MCP1, el
CCR2, de tipo 7 dominios transmembrana asociado a proteínas G, se expresa en
astrocitos, sugiriendo que puede tener funciones autocrinas (Andjelkovic et al., 2002)
aunque poco se conoce sobre el papel de esta quimiocina sobre los astrocitos. Un
único estudio muestra que, durante la formación de las placas de amiloide en estadíos
iniciales de la enfermedad de Alzheimer, los astrocitos migran hacia las placas
siguiendo un gradiente de MCP1 hasta que contactan físicamente con el Aβ de éstas,
momento en el cual se detienen. Los autores (Wyss-Coray et al., 2003a) sugieren que
los astrocitos atraídos de esta manera a las placas son capaces de degradar el Aβ. La
recopilación de estos datos pone de manifiesto que es importante estudiar el posible
efecto autocrino de la MCP1, en fenómenos en que la migración astrocitaria esté
implicada.
26
INTRODUCCIÓN
2.4.2 ICAM1 La molécula de adhesión intracelular (ICAM1) juega un papel importante en las
reacciones inflamatorias en el SNC. ICAM1 es una glicoproteína transmembrana
integral que contiene 5 dominios Ig-like extracelulares. Actúa como ligando de las
integrinas del tipo β2 LFA-1 (CD11a/CD18) y Mac-1 (CD11b/CD18) expresadas tanto
por leucocitos y macrófagos como por la microglia. En el cerebro adulto normal se
expresa en bajos niveles y de manera constitutiva en las células endoteliales de los
microvasos y en los astrocitos perivasculares , siendo su expresión regulable durante
condiciones inflamatorias (Dietrich, 2002). In vitro su expresión se regula a la alza en
respuesta a citoquinas como TNF-α, Il-1β.(Fabry et al., 1992)
Su papel en la extravasación de leucocitos a través de las paredes vasculares ha sido
extensamente estudiado. Este proceso consta de diversas fases. Inicialmente los
leucocitos deben interaccionan con componentes de la matriz extracelular de los vasos
como las selectinas. A continuación se produce la adhesión firme a las membranas
luminales de las células endoteliales, proceso en el que participan diversas proteínas
de membrana como selectinas, VCAM e ICAM. La interacción de la ICAM con sus
receptores presentes en los leucocitos genera cascadas de señalización que conllevan
la activación del leucocito, permitiendo la diapedesis de estos, entre las céulas
endoteliales que forman el vaso para llegar al parénquima del tejido. Hasta hace poco
el papel de la ICAM se limitaba a ser de ancla para los leucocitos, pero nuevos
descubrimientos demuestran su dominio intracelular es también capaz de señalizar
tras la interacción con Mac-1 y LFA-1, dando lugar a cambios en la dinámica del
citoesqueleto y de la expresión génica en el endotelio (Greenwood et al.,
2002;Dietrich, 2002).
El significado funcional de la expresión de ICAM en astrocitos ha sido poco estudiado,
y su estudio se ha limitado a la interacción intercelular entre astrocitos y leucocitos. Su
expresión se ve aumentada en algunas de las enfermedades neurodegenerativas
como AD, PD y MS. En la AD, los astrocitos que rodean las placas de amiloide son
positivos para ICAM. En el interior de las placas se encuentran también células
microgliales que expresan los co-receptores para la ICAM, sugiriendo un papel para la
interacción entre astrocitos y microglia mediada por la interacción LFA/ICAM en la AD.
(Akiyama et al., 1993) Se ha descrito también la sobre-expresión de ICAM en
esclerosis múltiple y la enfermedad de Parkinson. Estudios in vitro demuestran que la
mutación de la α-sinucleína causante de las formas autosómicas dominantes de la PD
es capaz de incrementar la ICAM (Klegeris et al., 2006) y que la expresión de ésta se
27
INTRODUCCIÓN
ve aumentada en la substantia nigra de pacientes con dicha enfermedad (Miklossy et
al., 2006).
La activación de la ICAM puede mimetizarse en astrocitos en cultivo mediante el uso
de anticuerpos anti-ICAM, que generan cross-linking de esta proteína (Etienne et al.,
1998). Así, el uso de anticuerpos anti-ICAM desencadena la expresión de TNF-� y IL-
6 a través de las vías de las MAPK y AMPc.(Etienne-Manneville et al., 1999;Lee et al.,
2000) Las consequencias de la activación de ICAM sobre la morfología y migración
astrocitarias no han sido estudiadas.
2.4.3 COX2 Las ciclo-oxigenasas (COX) son enzimas claves en la síntesis de prostaglandinas que
regulan el paso limitante de la producción de éstas utilizando como sustrato el ácido
araquidónico. Se conocen dos principales isoformas, siendo la COX1 de expresión
ubicua y constitutiva y la COX2 de carácter inducible en numerosos tipos celulares en
respuesta a estímulos inflamatorios. Las prostaglandinas regulan múltiples funciones
fisiológicas, como el acoplamiento neurovascular, y desempeñan un papel importante
en el control de la respuesta inmune innata, actuando bien como segundos
mensajeros pro-inflamatorios (Verma et al., 2011) de manera paracrina mediante de la
activación de receptores de prostaglandinas, proteínas de membrana asociadas a
proteínas G, o anti-inflamatoria por activación de los receptores nucleares PPARγ
(Martinez-Gras et al., 2011), según el tipo de prostaglandina y el contexto celular.
La COX2 se expresa en células gliales y endoteliales en condiciones de inflamación
pero existen algunas situaciones en las que su loclización es principalmente
astrocitaria. Por ejemplo, se expresa principalmente en astrocitos en respuesta a
isquemia, mientras la COX1 se observan en neuronas y microglía tanto en basal como
en isquemia (Wu et al., 2011). Se induce también por inyección de ácido kaínico intra-
hipocampal específicamente en astrocitos de CA1 y CA3 (Serrano-Perez et al., 2011).
Su expresión es dependiente de factores de transcripción como NF-kB (Serrano-Perez
et al., 2011) y NFAT (Blanco et al., 2010), AP1 y PPARγ (Aleshin et al., 2009). El Aβ la
induce de manera dependiente de NF-κB, asociado a un aumento en la liberación de
PGE2 (Blanco et al., 2010). Las prostaglandinas son moléculas vasoactivas. En este
sentido, los astrocitos actúan como puentes en el acoplamiento neurovascular, el ATP
liberado por los propios astrocitos en respuesta a la actividad neuronal, induce la
expresión de COX2 que sintetiza prostaglandinas que al actuar sobre las células
28
INTRODUCCIÓN
endoteliales regulan el flujo cerebral y participan en la protección ofrecida por el
precondicionamento isquémico (Birnbaum et al., 2005). Las prostaglandinas pueden
participar en la neurotransmisión ya que aumentan excitabilidad neuronal asociado a
un incremento en las sinapsis excitadoras (Koch et al., 2010). A pesar de que los
mecanismos de expresión de la COX2 han sido ampliamente estudiados, y su
presencia se interpreta muy a menudo como un marcador de inflamación, poco se
conoce sobre el papel de la COX2 y las prostaglandinas sobre los astrocitos.
En otro contexto, es bien conocida la participación de la COX2 en el desarrollo de
tumores y el establecimiento de metástasis, revisado en (Harris, 2007). En esta línea,
se ha detectado la sobre-expresión de COX2 en diferentes tipos de tumores y se
conoce que las prostaglandinas son capaces de estimular la migración de células
cancerosas, y que este efecto se revierte en presencia de inhibidores específicos del
enzima como son el NS398 y el celecoxib (Rodriguez et al., 2008), y ocurre a través de
la activación de receptores de prostaglandinas. Teniendo en cuenta estos resultados,
resulta interesante preguntarse si la COX2 puede intervenir en fenómenos de
plasticidad astrocitaria como es la migración.
2.5 Migración astrocitaria La migración celular es esencial para la organización y mantenimiento de la integridad
tisular y participa en el desarrollo embrionario, regeneración, inflamación e invasión a
través de la matriz extracelular (Lauffenburger, 1996). La migración celular es un
proceso vital en todos los organismos multicelulares y es importante no solamente
durante el desarrollo sino que también durante toda la vida en fenómenos como la
regeneración y la inmunidad. La migración celular es dirigida por señales
extracelulares que actúan como atrayentes o repelentes. Estas señales desencadenan
respuestas intracelulares que incluyen cambios en el citoesqueleto (tanto microtúbulos
de tubulina como microfilamentos de actina), en el transporte vesicular y en la
expresión génica.
Cuando el SNC atraviesa una situación traumática, los astrocitos reactivos migran a
los bordes de la zona lesionada y/o inflamada donde forman la cicatriz glial, separando
el tejido sano de la zona dañada. (Ellison et al. 1998; Saadoun et al. 2005).
Numerosas evidencia tanto in vivo como in vitro señalan a los mediadores
inflamatorios, incluyendo citoquinas, factores de crecimiento y ligandos de los
receptores Toll-like (TLRs), como directores de la astrogliosis (Ghirnikar et al.1998;
29
INTRODUCCIÓN
Caso et al. 2007), aunque el efecto beneficioso o deletéreo de los procesos
inflamatorios sigue siendo tema de debate (Kriz, 2006).
Un papel importante de los mediadores inflamatorios podría ser el de regular la capacidad migratoria de los astrocitos a las zonas dañadas (Norton et al. 1992;
Ghirnikar et al. 1998). En numerosos estudios se muestras que citoquinas y LPS son
capaces de estimular la migración de diferentes tipos celulares. Por ejemplo la IL-1
promueve la migración de células de músculo liso vasculares (Delbosc et al. 2008) y
en células tubulares de riñón humano (Zhang et al. 2005), TNF-α en células
epidermales de Langherhans (Griffiths et al. 2005, TNF-α e IFN-γ en precursores
multipotentes neurales (Ben-Hur et al. 2003). Aunque la IL-1 es capaz de dar lugar a
astrogliosis in vivo (Giulian et al. 1988), esta misma citoquina inhibe la migración de
astrocitos fetales humanos in vitro (John et al. 2004), a diferencia de otros trabajos
(Sato et al., 2011). El papel de los mediadores inflamatorios en la migración
astrocitaria no queda claro, por ejemplo el LPS, no es capaz de estimular migración en
astrocitos (Sato et al., 2011), aunque en presencia de otros mediadores de la
inflamación, como moléculas lipídicas como el LPA, sí es capaz de acelerar este
proceso. Por lo tanto, parece claro que existe cierta especificidad en las moléculas
capaces de regular los fenómenos de migración astrocitaria.
Es importante destacar también que en los últimos años está cobrando importancia la
hipótesis de que enzimas que participan en la respuesta inflamatoria pueden participar
también en un incremento de la capacidad migratoria de los astrocitos reactivos. De
esta manera MMP-9, una metaloproteinasa capaz de degradar componentes de la
matriz extracelular y ya implicada en otros fenómenos migratorios como en el
establecimiento de metástasis (van Kempen and Coussens, 2002), parece ser pro-
migratoria, ya que al inhibir su actividad, astrocitos tratados con TGF-β disminuyen la
velocidad de migración (Hsieh et al., 2010). Asimismo, la sintasa de óxido nítrico
inducible (iNOS) es capaz de estimular la migración astrocitaria a través de su
producto, el óxido nítrico y las especies reactivas de oxígeno que de él se derivan
(Wang et al., 2010). Queda por ver si otras moléculas que participan en la reacción
inflamatoria como las quimiocinas, por su conocido papel de establecer gradientes
quimiotácticos que son reconocidos por las células inmunes para localizar zonas de
lesión, y la ciclooxigneasa-2 (COX2), que juega un papel claro en la formación de
metástasis, o moléculas de adhesión como ICAM y VCAM promueven la migración
astrocitaria.
30
INTRODUCCIÓN
2.6. Participación de las Rho GTPasas en la reactividad glial A modo de resumen, el primer paso en la migración celular es la emisión de un
proyección o proceso guía (leading edge), formado por un lamelipodio, que al crecer
establece nuevos puntos de adhesión al frente del sentido migratorio, seguido de una
contracción del soma celular y la pérdida de los puntos de anclaje de la célula en su
parte trasera lo que permite el avance de la célula. Todos estos pasos son posibles
por la reorganización del citoesqueleto de actina, el ensamblaje y desensamblaje de
las adhesiones focales y el establecimiento de la polaridad celular que determina el
sentido de la migración. Estos procesos deben estar coordinados localmente de una
manera muy fina, tanto en el espacio como en el tiempo, para generar un movimiento
productivo. Se han descrito múltiples vías de señalización involucradas en el control de
la migración celular como las MAPKs y las fosfolipasas, pero una familia de proteínas,
las Rho GTPasas, destaca sobre las demás por desarrollar un papel esencial en la
regulación de las vías bioquímicas relevantes en la migración.
Las Rho-GTPasas son una familia de proteínas G pequeñas que, fluctuando entre
estados activos (cuando se encuentran unidas a GTP) e inactivos (al transformar el
GTP a GDP) coordinan cambios en la organización del citoesqueleto de actina y en la
transcripción de genes, regulando así procesos biológicos como la morfogénesis, la
quimiotaxis, el crecimiento de los axones y la progresión del ciclo celular. La actividad
de las Rho-GTPasas está regulada por las GEFs (“guanine-nucleotide-exchange
factors”) que facilitan el intercambio de GDP por GTP y por las GAPs (“GTPase
activating proteins”), que tienen el efecto contrario al aumentar la velocidad de
hidrólisis del GTP. En su forma inactiva las Rho-GTPasas se encuentran formando un
complejo con GDIs (“GDP-dissociation inhibitors”) en el citoplasma mientras que su
activación implica translocación a la membrana con la que interaccionan mediante una
isoprenilación. Las Rho-GTPasas incluyen a las Rho (A, B y C), las Rac, y las Cdc42,
que regulan diferentes aspectos de la dinámica del citoesqueleto. Generalizando, las
Rho activan la formación de complejos actina-miosina que forman las fibras de estrés
en cuyo extremo se forman focos de adhesión a la matriz extracelular. Las Rac
inducen la formación de una red de filamentos de actina en la periferia celular que da
lugar a la formación de lamelipodios, mientras que las Cdc42 inducen extensiones
ricas en actina en la membrana llamadas filopodios (revisión en Bishop and Hall,
2000)). En su conformación activada las Rho-GTPasas son capaces de interaccionar
de manera específica con sus proteínas efectoras que median sus efectos. La
serina/treonina kinasa ROCK es activada por la unión a Rho-GTP (Kubo and
Yamashita, 2007), así como mDia (Narumiya et al., 2009); por otro lado Rac1 y cdc42-
31
INTRODUCCIÓN
GTP promueven la actividad de la kinasa PAK (Szczepanowska, 2009;rias-Romero et
al., 2010), entre otras (Bishop and Hall, 2000).
Existe un cierto consenso en atribuir la formación de las protrusiones que establecen
el sentido migratorio y el establecimiento de la polaridad celular a la cdc42 (Yokota et
al., 2010) y a la Rac1, mientras que la RhoA regula adhesión/deadhesión de la parte
trasera mediante el control de la contractibilidad de las fibras de actina-miosina, y la
formación de adhesiones focales. Las adhesiones focales son microrregiones
especializadas de la membrana plasmática, que constituyen puntos de unión con el
sustrato. Estas uniones se establecen a través de proteínas como las integrinas que
reconocen componentes de la matriz extracelular a los que se unen, y actúan como
anclas que ligan en el citoesqueleto de actina con la matriz a través de toda una serie
de proteínas adaptadoras. Entre ellas se encuentran la paxilina (Yu et al., 2010) o la
kinasa de adhesiones focales (FAK). La FAK regula el reciclaje
(formación/desensamblaje) de las adhesiones focales a través de la fosforilación de
varias proteínas efectoras, y su actividad está directamente relacionada con la
adhesión y migración celular (Chalkiadaki et al., 2011).
Se han desarrollado distinto modelos experimentales in vitro para poner de manifiesto
la capacidad migratoria de las células y así estudiar las vías de señalización
implicadas en este fenómeno. Uno de los más utilizados, el ensayo de scratch wound
assay, consiste en realizar una herida en una monocapa de células confluentes,
eliminando los contactos inhibidores célula-célula, estimulando así la migración celular
para regenerar la herida. En el caso de los astrocitos, éstos se polarizan en dirección
perpendicular a la herida, emitiendo largos procesos y cerrando totalmente zona libre
de células 48h después de su generación (Etienne-Manneville, 2006). Este ensayo
reproduce varios de los fenómenos que ocurren durante la migración in vivo, y permite
ensayar cómo modulan la capacidad migratoria fármacos y moléculas sobre la
polaridad, morfología y velocidad migratoria.
32
INTRODUCCIÓN
3. FGF2 en la plasticidad astrocitaria Los factores de crecimiento fibroblástico (FGF) y sus receptores (FGFR) constituyen
un elaborado sistema de señalización que participa en numerosos procesos durante el
desarrollo embionario y la edad adulta en virtualmente todos los tejidos en mamíferos.
Fue una de las primeras familias de factores de crecimiento en ser descritas. El primer
miembro de esta familia fue identificado por su capacidad de estimular la proliferación
de fibroblastos, de allí su nombre. Hasta la fecha se conocen veintitrés miembros de
esta familia que señalizan a través de cuatro receptores distintos. No todos los FGFs
pueden ser detectados en todas las especies incluyendo la humana. Así, en humanos
el FGF15 no se detecta en el genoma resultando en un total de veintidós miembros de
esta familia (Itoh and Ornitz, 2008). Por análisis filogenético la familia de los genes
FGF humanos pueden dividirse en siete subfamilias compartiendo algunos de los
miembros de cada subfamilia funciones y patrones de expresión parecidos.
La mayoría de FGFs se expresan durante el desarrollo con patrones de expresión
diferenciales y muy dinámicos. En el adulto la expresión de algunos de estos factores
se mantiene y en algunos casos de manera muy restringida a ciertos órganos. A
menudo varios FGFs se co-expresan en el mismo tejido, lo que resulta en cierta
redundancia funcional que se refleja en la generación de KOs para FGFs específicos.
Este es el caso del ratón KO para FGF2, que es viable y no presenta un fenotipo
dramático a pesar de que este factor esté implicado en procesos tan importantes como
la inducción del mesodermo, angiogénesis y formación de extremidades (Ortega et al.,
1998). Es posible que la redundancia funcional haya sido un mecanismo seleccionado
evolutivamente para conferir robustez a un sistema de señalización
Los genes de todos los FGFs conocidos se estructuran en tres exones codificantes
siendo el exón 1 el que contiene el codón de inicio (Arnaud et al., 1999;Prats et al.,
1989). Aún así numerosos FGFs presentan secuencias codificantes en 5’ cuya
transcripción se inicia a través de codones CUG alternativos. Respecto a su
localización cromosómica los genes de los FGF no se localizan en un cluster
delimitado si no que muestran una localización altamente dispersa en el genoma (Itoh
and Ornitz, 2008).
Los FGFs son moléculas evolutivamente antiguas. Han sido identificados tanto en
invertebrados como en vertebrados, pero no se encuentran en el genoma de
33
INTRODUCCIÓN
organismos unicelulares como E. coli o S. cerevisae. En Drosophila se conoce un solo
gen de FGF, branchless, y en C. Elegans dos (egl-17 and let-756), contrastando con el
alto número de FGFs identificados en vertebrados. La mayoría de proteínas FGF
ortólogas se encuentran altamente conservadas entre especies mostrando un 90% de
identidad en la secuencia aminoacídica. El tamaño de estos factores oscila entre 17 y
34 kD y la mayoría contienen un secuencia interna altamente conservada de 28
aminoácidos (core domain) que determinan la interacción con heparina y con los
FGFRs (Beenken and Mohammadi, 2009).
3.1 Los FGF señalizan a través de los FGFR Los FGFs ejercen sus funciones extracelulares a través de la unión y activación de
receptores de alta afinidad presente en la membrana extracelular, los FGFR. Los
FGFR son una subfamilia de receptores tirosina-quinasa de membrana, que en
vertebrados consta de cuatro miembros FGFR1-4. Son proteínas con un solo dominio
transmembrana con un motivo de unión a ligando extracelular y dominios tirosina-
kinasa intracelulares. La región extracelular está compuesta de tres dominios Ig (IgI,
IgII, IgIII) que son los responsables de la unión a FGF, determinando las especificidad
y afinidad por el ligando. Localizado entre los dominios IgI y II, se halla un motivo de
aa ácidos (acídic box domain) seguido de un motivo de unión a heparina y un dominio
de homología a moléculas de adhesión (CHD). Estos dominios permiten la interacción
de los FGFRs con moléculas de la matriz extracelular, principalmente la heparina de
los heparan-sulfato-proteoglicanos (HSPGs) y moléculas de adhesión como N-CAM.
Contigua a la parte extracelular se encuentra el domino transmembrana seguido de la
parte intracelular. Esta última consta de una región yuxtamembrana, un dominio
tirosina-quinasa partido por un dominio interquinasa no catalítico y una cola C-terminal
corta. Además del dominio catalítico, la región intercelular contiene varios motivos de
fosforilación así como de unión a proteínas adaptadoras como FRS2 (Mohammadi et
al., 2005a;McKeehan et al., 1999;Gotoh, 2008).
La mayoría de FGFs pueden unirse a más de un FGFR. La diversidad de funciones
que presentan los distintos FGFs se consigue, a parte de la existencia de cuatro
receptores diferentes, gracias a la generación de isoformas por splicing alternativo en
los ARN mensajeros de los receptores. La región con un mayor impacto sobre la
afinidad del ligando por el receptor es la IgIII, para la cual existen tres variantes de
splicing denominadas IgIIIa, IgIIIb, IgIIIc (Mohammadi et al., 2005b).
34
INTRODUCCIÓN
El mecanismo de activación de los FGFR no está del todo dilucidado. Se piensa que el
mecanismo común a todos los receptores es la formación de dos complejos FGF-
FGFR independientes que son de baja afinidad. Estos complejos pueden dimerizar y
subsecuentemente ser conectados por una molécula de heparina o HSPGs
estabilizando y activando el complejo, formado finalmente por dos moléculas de FGF,
dos de FGFR y una de heparina (McKeehan et al., 1999).
La activación del complejo conlleva un aumento en la actividad tirosina quinasa del
dominio intracelular resultando en la autofosforilación de varios residuos tirosina del
propio receptor. Estas fosforilaciones sirven como puntos de amarre (docking sites)
para el reclutamiento y unión de varias proteínas de docking como FRS2, GAB1,
proteínas adaptadoras como GRB2 y proteínas señalizadoras como la fosfatasa Shp2.
Las interacciones entre estas proteínas se llevan a cabo a través de dominio SH2 (src-
homology2) y PTB (phosphotyrosine binding). Estos componentes se ensamblan en
complejos señalizadores que inician distintas vías de señalización que modifican la
expresión génica y el comportamiento celular
Figura 2. Principales vías de trasducción de señales activadas por la activación del FGFR1. Launión del FGFR con su ligando, provoca la dimerización del receptor y la activación de diversasvías de trasducción de señales. La activación de la fosfolipasa C (PLC) y la movilización de calciointracelular producen cambios morfológicos en la célula, mientras que la acción de la fosfatidil-inositol kinasa (PI3K) media la activación de la proteín quinasa B que regula la supervivenciacelular. La estimulación de la vía de las MAP quinasas transduce las señales iniciadas por elreceptor al núcleo modificando la expresión de genes. (Mohammandi et al, 2005)
35
INTRODUCCIÓN
Un fenómeno intrigante en la señalización por receptores FGFR es que, según el
contexto y el tipo celular, tras la unión del ligando al receptor, el complejo es
internalizado y transportado al núcleo (Clarke et al., 2001). Esto sugiere que el
complejo ligando-receptor puede tener acciones nucleares facilitando la expresión de
genes (Peng et al., 2002;Stachowiak et al., 2003). Este proceso de internalización y
señalización intracrina representa una peculiaridad del sistema FGF-FGFR sobre otros
sistemas de señalización por factores tróficos a los que se atribuye un mecanismo de
acción paracrino.
3.2 Funciones de los FGFs Un número relativamente bajo de factores de crecimiento orquestan el desarrollo,
señalizando sobre células indiferenciadas proliferación, diferenciación y organización
en patrones específicos. Entre ellos se encuentran los FGFs y su receptores
involucrados en la mayoría de procesos embrionarios tempranos como: el
establecimiento de los ejes corporales, formación del mesodermo y el endodermo,
inducción neural y regionalización de la placa neural y somitogénesis (Bottcher and
Niehrs, 2005;Mason et al., 2004).
Los FGFs a menudo señalizan de manera direccional y recíproca en fronteras epitelio-
mesenquimales. Por ejemplo en vertebrados, en el desarrollo de las extremidades, el
FGF10 expresado por el mesodermo de placa lateral induce la formación de la cresta
apical ectodérmica. La cresta expresa entonces FGF8 con el que señaliza sobre el
mesodermo. Esta señalización direccional inicia feedback loops, que junto con otros
factores solubles, promueven el crecimiento y la correcta organización de la
extremidad (Grieshammer et al., 1996). La expresión diferencial de las distintas
variantes de splicing de los receptores FGFR (que determinan la especificidad por el
ligando) permite esta señalización direccional evitando la señalización autocrina sobre
el mismo compartimiento.
Los FGFs juegan un papel importante en el desarrollo del SNC. El FGF3 y FGF8 han
sido implicados en el establecimiento de la regionalización del la estructuras
embrionarias que darán lugar al SNC maduro (Raible and Brand, 2004). Además
participan en el desarrollo de los órganos sensoriales, en la condrogénesis y en la
formación del sistema esquelético, de las extremidades, así como del corazón y
sistema digestivo
36
INTRODUCCIÓN
Para estudiar las funciones de los FGF, el abordaje utilizando en la mayoría de los
casos ha sido la generación de knock-outs mediante recombinación homóloga. Los
fenotipos varían de una letalidad severa embrionaria por fallos importantes en la
organogénesis a cambios sutiles en el adulto. Es difícil atribuir funciones específicas a
cada uno de los FGFs por la redundancia funcional que presentan. Aún así, algunas
de las subfamilias de los FGFs presentan funciones bien delimitadas.
Figura 3. Agrupación filogenética de los FGFs de mamífero por subfamilias. Análisisfilogenéticos sugieren que los FGFs pueden dividirse en siete subfamilias quecontienen entre dos y cuatro miembros. La longitud de las ramificaciones esproporcional a la distancia evolutiva de cada uno de los genes. (Ithoh N., 2008).
La familia de hFGF (formado por los FGF19, FGF21, FGF23) presenta un claro papel
en la regulación metabólica, funcionando como hormonas endocrinas. FGF19 podría
ser un regulador energético por su control sobre el metabolismo de lípidos y formación
de bilis, FGF21 regula también el metabolismo de la glucosa y lípidos, mientras que
FGF23 controla el metabolismo de la vitamina D e iones fosfato. Otra peculiaridad de
esta subfamilia es que sus miembros muestran poca afinidad por los FGFRs,
requiriendo la presencia de co-receptores como Klotho y β-Klotho para activar los
FGFR de manera eficiente (Itoh, 2010).
La familia del FGF11 (FGF11-14) se expresan tanto en el SNC en desarrollo como en
el adulto lo que hace pensar que estos factores desarrollan un papel importante en el
desarrollo y mantenimiento de este sistema, Como peculiaridad los miembros de esta
37
INTRODUCCIÓN
subfamilia no se secretan y su localización subcelular es principalmente nuclear
(Smallwood et al., 1996). La familia del FGF7 (FGF7, FGF10 y FGF22) presenta
funciones en la formación de sinapsis como organizadores presinápticos. (Umemori et
al., 2004).
Las demás subfamilias de FGFs no presentan funciones más definidas. En
organismos adultos los FGFs están implicados en la regeneración de tejidos,
angiogénesis y homeostasis tisular (Lee and Kay, 2006a;Chang et al., 2006). Tiene
además una importancia capital en cáncer. Los FGF3-6 fueron inicialmente
identificados como proto-oncogenes. Además junto con los FGFRs, los FGFs tiene un
importante papel en la proliferación celular. Numerosas evidencias muestran que están
involucrados en la carcinogénesis y formación de tumores de origen mamario, de piel,
de próstata, del tracto urinario, así como de patologías de tipo hematológico (Lin and
Wang, 2010;Knights and Cook, 2010).
Además por la importancia de la señalización de FGFs en el desarrollo del sistema
esquelético, mutaciones en los FGFR generan displasias esqueléticas que se pueden
agrupar en dos grupos: acondroplasias (Aviezer et al., 2003), la forma más común de
enanismo de origen genético en humanos o craneosinostosis (cierre prematuro de las
suturas craneales, (Hatch, 2010).
3.3. FGF2 3.3.1 Descubrimiento y primeros trabajos El FGF2 fue uno de los primeros factores de crecimiento en ser descubierto, hace más
de 30 años. Se identificó en extractos de la glándula pituitaria bovina un factor capaz
de estimular la proliferación de fibroblastos murinos (Armelin, 1973). Posteriormente
Gospodarowich et al lo purificaron de la pituitaria y lo nombraron factor de crecimiento
de fibroblastos (FGF). El FGF2 se expresa en grandes cantidades en esta glándula,
así como en el resto del cerebro, representando 5 mg de factor por kg de tejido. El
FGF2 se purifica con un punto isoeléctrico de pH 9.6 por lo que fue llamado bFGF (b
de básico) para diferenciarlo del aFGF (acídico o FGF1), que fue caracterizado en la
misma época. Se demostró también que el FGF2 actuaba a través de receptores de
membrana (Neufeld and Gospodarowicz, 1985).
La sospecha de que se tratara de un factor neurotrófico venía dada por haber sido
purificado en la pituitaria y en el cerebro. En 1986 se demostró que el FGF2 mejoraba
la supervivencia de neuronas corticales en cultivo (Morrison et al., 1986). Más tarde el
38
INTRODUCCIÓN
FGF2 humano fue clonado de fibroblastos de piel y se determinó que estimulaba la
proliferación celular al ser transfectado su cDNA y que se secretaba al medio
extracelular (Kurokawa et al., 1987). Desde entonces las funciones que se atribuyen al
FGF2 no han parado de aumentar.
3.3.2 Estructura del FGF2
El FGF2 es un polipéptido de cadena sencilla compuesto por 146 aminoácidos que
carece de la secuencia señal de secreción pero ha adquirido una secuencia de
localización nuclear NLS (Florkiewicz et al., 1991). Se originan múltiples isoformas del
FGF2, todas provenientes del mismo ARNm, por el uso alternativo de distintos inicios
de la traducción en el extremo 3’ del mensajero. La isoforma de 18kDa se sintetiza a
partir del codón AUG, a diferencia de las isoformas de mayor peso molecular (HMW:
21, 21.5 y 22kDa en rata) que se sintetizan a partir de los codones CUG upstream.
Todas las isoformas de alto peso molecular contienen la NLS en su extremo N-
terminal, lo que causa su acumulación nuclear. Esta localización nuclear es más
prominente en el nucleolo a pesar de que distribuye por todo el núcleo. Por el
contrario, el FGF2 18kDa, que no posee la NLS, presenta una localización
predominantemente citoplasmática y es secretado al medio extracelular por
mecanismos independientes del aparato de Golgi, donde puede ejercer sus funciones
extracelulares a través de los FGFR1-4 (Mohammadi et al., 2005c)
GFAP FGF2GFAP FGF2
18 kD
21 kD
22 kD
18 kD
B
NUCCITC
22KD
21 kD
22 kD 21KD
18KD
39
Esquema 4. Isoformas del bFGF y localización subcelular en astrocitos. A, Diagrama mostrando laestructura polipeptídica con los sitios de inicio de transcripción de las distintas isoformas del FGF2(Adaptado de Ornitz et al.); B, Inmunocitoquímica para la GFAP (verde) y FGF2 (rojo) mostrando lalocalización predominantemente nuclear de FGF2 en astrocitos primatios en cultivo, identificados porla detección de GFAP. C, Western Blot de fracciones nucleares y citosólicas de astrocitos. El FGF2de 18kD es exclusivamente citosólico y el núcleo está enriquecido en isoformas de alto pesomolecular.
INTRODUCCIÓN
Las isoformas de alto peso molecular se expresan de manera específica de tejido
detectándose in vivo en el cerebro y corazón entre otros tejidos y ejercen funciones
intracrinas en las células que los expresan. Su función es poco conocida pero parece
tener un papel en la regeneración y la supervivencia de los tejidos en los que se
expresa, a través de la interacción con otras proteínas como el factor antiapoptótico
Api65 o factores de splicing como SMN (survival of motoneurons) (Claus et al.,
2003;Gringel et al., 2004), lo que hace pensar que algunas de las funciones intracrinas
del FGF2 de alto peso molecular podrían acontecer a través de la regulación del
splicing de diversos tránscritos.
3.3.3 Secreción del FGF2 La mayoría de factores solubles de origen peptídico, entre ellos los FGFs, son
secretados al medio extracelular por mecanismos convencionales que dependen de su
paso por el retículo endoplasmático (ER) y el aparato de Golgi, siendo empaquetados
en vesículas que al fusionarse con la membrana plasmática por mecanismos
dependiente de Ca2+, liberan su contenido fuera de la célula. Este mecanismo depende
de la presencia en las proteínas que van a ser secretadas de un secuencia o péptido
señal presente en la cadena aminoacídica. Por razones todavía desconocidas, un
grupo de factores extracelulares son secretados por mecanismos que no dependen del
péptido señal y de su paso por el ER/Golgi. Entre ellos se encuentran factores de
relevancia clínica como el FGF1 y FGF2, así como el mediador inflamatorio IL-1β.
Inicialmente se pensó que el FGF2 podía liberarse de células dañadas o muertas en la
que la integridad de la membrana plasmática estaba comprometida. Estudios recientes
muestran que el FGF2 puede ser liberado al medio mediante un mecanismo
dependiente de su transporte directo a través de la membrana. La identidad de este
transporte no es todavía conocida, pero se sabe que el transporte en sí depende del
correcto plegamiento y adquisición de un estructura terciaria del FGF2 (Nickel, 2005).
Asimismo la introducción en el FGF2 del péptido señal del FGF4 que sí se secreta a
través de la vía ER/Golgi, redirige el FGF2 al mecanismo convencional de secreción
haciéndole perder la capacidad de interaccionar con los HSPG (Wegehingel et al.,
2008). Estos resultados hacen pensar que para su función normal el FGF2 debe ser
secretado al medio extracelular por mecanismos todavía poco conocidos directamente
a través de la membrana plasmática. Otros mecanismos de transporte propuestos son
la ATPasa dependiente de Na+/K+ (Florkiewicz et al., 1998) o la multidrug resistance-
associated protein (Aggarwal and Gupta, 1998).
40
INTRODUCCIÓN
3.3.4 FGF2 en el SNC En el SNC en condiciones fisiológicas el FGF2 se localiza principalmente en astrocitos
y en algunas poblaciones de neuronas (Gonzalez et al., 1995). Las neuronas
diferenciadas pierden la habilidad de proliferar y su supervivencia requiere el sostén de
factores de crecimiento y neurotrofinas. Numerosos estudios sostienen un papel
neurotrófico para el FGF2 en condiciones normales. En (Forget et al., 2006a) se
demuestra que la presencia de FGF2 en el núcleo (endógeno) de astrocitos
mesencefálicos es necesaria para el correcto funcionamiento de neuronas
dopaminérgicas. Estos datos concuerdan con la menor immunoreactividad para FGF2
que se observa en la sustancia negra de pacientes con la enfermedad de Parkinson
(Tooyama et al., 1994). Paralelamente el FGF2 exógeno es capaz de inhibir la
apoptosis inducida por rotenona o MPTP en un modelo de neuronas dopaminérgicas
(Hsuan et al., 2006), o por daño excitotóxico (Lenhard et al., 2002). El FGF2 parece
estar implicado también en el crecimiento axonal y en la neuritogénesis (Aoyagi et al.,
1994), en la modulación de la transmisión sináptica (Boxer et al., 1999) y en la
neurogénesis en adultos (Nelson and Svendsen, 2006). Otra función que se atribuye al
FGF2 en el cerebro normal es el mantenimiento de la barrera hematoencefálica
(Reuss et al., 2003), promoviendo la expresión de proteínas de las uniones estrechas
en células endoteliales de los microvasos cerebrales. Todos estos datos sugieren que
el papel trófico de los astrocitos sobre las neuronas podría estar mediado en parte por
el FGF2, pero poco se conoce sobre el posible papel autocrino que podría ejercer
sobre los propios astrocitos, lo que convierte en relevante el estudio de los efectos de FGF2 sobre este tipo celular.
En el SNC se expresan altos niveles de FGF2. Estudios inmunohistoquímicos
muestran que la localización de FGF2 en el cerebro es principalmente astrocitaria por
todo el SNC, aunque es expresado también en algunas poblaciones de neuronas,
incluyendo las neuronas piramidales del área CA2 del hipocampo (Gomez-Pinilla et al.,
1992;Woodward et al., 1992;Chadashvili and Peterson, 2006). El FGF2 in vivo se
encuentra también distribuido en el citoplasma y núcleo de los astrocitos, siendo más
intensa la inmunoreactividad nuclear. La presencia de FGF2 en el núcleo ha sido
confirmada por microscopía electrónica y se mantiene en astrocitos en cultivo. En
respuesta a distinto modelos de lesiones traumáticas o a la presencia de placas de
amiloide, la expresión del factor aumenta en astrocitos y en el neuropilo (Stopa et al.,
1990a). Estos hechos demuestran que el FGF2 presenta funciones tanto en el cerebro
normal como en respuesta a lesiones.
41
INTRODUCCIÓN
Control de la expresión de FGF2 en astrocitos Los niveles de FGF2 en astrocitos son altamente regulables y son modificados por
numerosos estímulos de caracteres muy diversos, hecho que correlaciona con la
especulación que el FGF2 está altamente implicado en los fenómenos de plasticidad
astrocitaria.
En astrocitos en cultivo ha sido demostrado que la estimulación con la citoquina pro-
inflamatoria Il-1β, factores de crecimiento como PDGF, EGF o el propio FGF2, los
glucocorticoides, neurotransmisiores como el glutamato, la noradrenalina y la
dopamina y activadores de las vías del cAMP (tras activación de receptores β-
adrenérgicos), o las PKC son capaces de aumentar la expresión del factor (Pechan et
al., 1993;Li et al., 2006;Riva et al., 1998b;Braun et al., 2009).
In vivo la expresión del FGF es regulada tanta en condiciones patológicas como
fisiológicas. Ha sido demostrado que los niveles de FGF2 aumentan específicamente
en el cerebelo y el hipocampo (Gomez-Pinilla et al., 1997;Gomez-Pinilla et al., 1998)
durante el aprendizaje espacial y la actividad física, dando lugar a la especulación que
la actividad neuronal puede regular los niveles de factores tróficos y que estos pueden
participar en procesos de memoria y aprendizaje.
Desarrollo La mayoría de funciones que se atribuyen al FGF2 durante el desarrollo del SNC se
conocen a través del estudio del ratón FGF2 -/-. El KO para el factor es viable y no
presenta grandes alteraciones fenotípicas, a pesar del gran número de funciones que
se le atribuyen en el desarrollo, salvo una reducción en el tamaño del cortex y retrasos
en la regeneración de la epidermis e hipotensión (Dono et al., 1998;Ortega et al.,
1998). La reducción en el tamaño cortical es debida a una disminución en el número
de neuronas de la corteza principalmente de áreas motoras, debido a defectos en la
capacidad proliferativa de los precursores neurales. Además algunas neuronas
postmitóticas no consiguen llegar a su destino quedando acumuladas en el habeas
callosum (Dono et al., 1998). Paralelamente, la inyección intraventricular de FGF2 en
ratones embrionarios promueve un aumento en el tamaño de la corteza debido a un
aumento de neuronas y astrocitos (Vaccarino et al., 1999). Todo esto hacer pensar
que el FGF2 regula durante el desarrollo la capacidad proliferativa de los precursores
neurales.
42
INTRODUCCIÓN
Neurogénesis y gliogénesis Durante muchos años, el cerebro adulto ha sido erróneamente considerado como una
estructura totalmente postmitótica. En los últimos años se ha demostrado que existen
en el cerebro adulto células madre en zonas cerebrales determinadas capaces de
diferenciarse en neuronas y/o astrocitos sustituyendo células dañadas. (Robel et al.,
2011). Las células madre adultas se caracterizan por ser capaces de auto-renovarse y
de dar lugar a diferentes tipos de células tras su diferenciación. Estas características
dependen del entorno o “nicho” en el que se encuentran y depende en gran partida de
señales solubles de células diferenciadas adyacentes y de componentes de la matriz
extracelular.
En el cerebro adulto de los mamíferos existen básicamente dos regiones donde se
produce neurogénesis: la zona subventricular (SVZ) en las paredes de los ventrículos
laterales y la zona subgranular (SGZ) del giro dentado del hipocampo. Numerosos
factores de crecimiento y hormonas tienen la capacidad de promover la proliferación
y/o diferenciación de los precursores neurales localizados en estas zonas, entre ellos
el FGF2.
Aunque varios estudios han demostrado el potencial neurogénico del FGF2 in vitro en
precursores de ambas zonas, este factor parece promover neurogénesis en la SVZ,
mientras que los progenitores de la SGZ aparentemente responden en menor medida
a FGF2 en el adulto. En la SVZ el FGF2 se expresa en células GFAP+, pero está
ausente en células precursoras que por el contrario sí expresan FGFRs. El FGF2
parece regular la capacidad neurogénica de la SVZ manteniendo un pool de células
indiferenciadas que proliferan a una velocidad muy lenta, bien alargando la duración
del ciclo celular bien alterando la diferenciación.
El tratamiento con FGF2 tras diversos tipos de lesiones como trauma (Tripathi and
McTigue, 2008) o isquemia (Fagel et al., 2009) parece promover la recuperación
funcional a través de un aumento en la neurogénesis. Este hecho es de vital
importancia para la clínica ya que el FGF2 puede ser administrado por vía intranasal
por ser capaz de atravesar la BHE, evitando así todos los efectos secundarios
negativos que el factor puede desencadenar tras una administración sistémica (Wang
et al., 2008).
Además de regular la adquisición de un fenotipo neuronal, el FGF2 regula también
diversos pasos de la gliogénesis. Durante la formación del neocorteza el balance entre
43
INTRODUCCIÓN
la glia radial, cuya población es capaz de autoregenerarse, y la producción de células
precursoras a las que da lugar es esencial en la generación del tamaño y composición
correcta de la corteza. Se ha demostrado que el FGF2 promueve el mantenimiento del
fenotipo de glia radial reprimiendo la transición de glia radial a progenitores (Kang and
Song, 2010). Además la señalización por los FGFRs participa de manera muy
importante en el correcto posicionamiento de la glia en el cortex durante el desarrollo,
siendo el FGFR2 el receptor que permite a la glia radial translocar a través de la
corteza, y adquirir el fenotipo de astrocito maduro (Smith et al., 2006).
El FGF2 regula también el número de oligodendrocitos en el SNC, siendo su efecto
principalmente inhibidor ya que disminuye la diferenciación de los precursores de
oligodendrocitos a oligodendrocitos maduros, tanto in vitro (Zhou et al., 2006), como in
vivo evidenciado por un menor número de oligodendrocitos maduros en los mutantes
FGF2 -/- (Murtie et al., 2005)
Crecimiento y ramificación axonal Además de participar en la proliferción y maduración de precursores neuronales, el
FGF2 es un potente estimulador de la morfogénesis de las neuronas. Un paso
importante en la adquisición de la morfología madura de las neuronas es el
crecimiento y ramificación axonal (Kalil et al., 2000). En comparación con otros
factores de crecimiento como BDNF y NT-4 que también influencian estos procesos, el
FGF2 es un potente estimulador del crecimiento y ramificación axonal.
En neuronas corticales en cultivo, el FGF2 produce un aumento en el tamaño del cono
de crecimiento, disminuyendo su avance y promoviendo un aumento dramático en la
ramificación del axón (Szebenyi et al., 2001). Este efecto es también visible en
neuronas hipocampales en cultivo, y se observa de manera más pronunciada con
FGF2 que con otras neurotrofinas. Cabe destacar que el aumento en la ramificación se
observa en el axón pero no sobre las dendritas (Patel and McNamara, 1995). Todas
estas observaciones hacen pensar que el FGF2 puede participar en la remodelación
axonal en el desarrollo o tras una lesión que comprometa la integridad de los axones.
Uno de los componentes críticos en el establecimiento de una correcta conectividad en
el SNC es el direccionamiento de los axones a sus dianas específicas, que se
consigue a través de la interacción del cono de crecimiento axonal con señales
moleculares en el entorno. El FGF2 modula también este paso de la guía de los
axones a su destino correcto. Se ha demostrado que este factor regula la expresión de
44
INTRODUCCIÓN
señales moleculares como la semaforina3A o slit1 durante el desarrollo del tracto
óptico en Xenopus que va desde las célulares ganglionares de la retina hasta el
tectum óptico en el cerebro (Pollock et al., 2005).
Maduración de sinapsis y transmisión sináptica Para el establecimiento de las sinapsis maduras, se requiere un proceso de
maduración en el que el cono de crecimiento axonal de la neurona pre-sináptica sufre
cambios hasta convertirse en un botón axonal correctamente ensamblado con el
terminal post-sináptico. Para ello moléculas de origen post-sináptico señalizan sobre al
axón para cesar el crecimiento y formar sinapsis. La formación de sinapsis comporta el
correcto posicionamiento de las membranas pre y post-sinápticas a una distancia
constante formando la hendidura sináptica en la que serán liberados los
neurotransmisores; este proceso depende mayoritariamente de la formación de
uniones entre cadherinas. A continuación es necesario la formación coordinada, en un
proceso dependiente del citoesqueleto, de las denominadas zonas activas,
especializadas en la liberación y reciclaje de vesículas de neurotransmisores en la
membrana pre-sináptica, y de la zona de densidad post-sináptica compuesta por una
gran cantidad de receptores, canales iónicos, proteínas de ensamblaje y maquinaria
de transducción de señales. Algunos factores tróficos entre ellos el FGFs, WNTs i
TGFβ ha sido relacionado con algunos pasos de la maduración axonal (Terauchi et al.,
2010).
El FGF2 juega un papel importante en el ensamblaje del terminal pre-sináptico, ya que
es capaz de promover el clustering de proteínas pre-sinápticas como la
sinaptotagmina dando lugar a zonas activas de docking y liberación de vesículas (Dai
and Peng, 1995) y de reciclaje de estas (Li et al., 2002). Estos efectos van
acompañados de un incremento en puncta de PSD95 y GluR1 en la membrana post-
sináptica (Li et al., 2002), demostrando que el FGF2 es capaz de regular la formación
de sinapsis en cultivo. Paralelamente, otra proteína de la familia FGF, el FGF22
producido por neuronas granulares cerebelares ha sido implicada en la formación de
sinapsis con las fibras musgosas in vivo (Umemori et al., 2004). Este fenómeno se
produce a través de la activación del FGFR2 que puede ser también activado por
FGF2. En otro estudio se demuestra que el FGF2 interviene en la remodelación
sináptica después de una lesión participando en el mantenimiento y/o mejorando la
recuperación después de una sobre-estimulación sonora de los terminales del núcleo
coclear (D'Sa et al., 2007).
45
INTRODUCCIÓN
Transmisión Sináptica El FGF2 es un neuromodulador de la transmisión sináptica y dada su expresión
principalmente astrocitaria podría considerarse como un gliotransmisor. Disminuye la
amplitud de las oscilaciones en la concentración de Ca2+ intracelular en neuronas
corticales in vitro (Tanaka et al., 1996). Participa en el procesos de memoria,
facilitando la generación de LTP disminuyendo el umbral a partir del cual se puede
producir este fenómeno (Ishiyama et al., 1991), o mejorando el déficit en el aprendizaje
inducido por lesión (Ishihara et al., 1992). Estos efectos parecen ser mediados a través
del FGFR1 ya que el mutante KO para este receptor muestra déficit para LTP y
consolidación de la memoria (Zhao et al., 2007). También se ha descrito que los FGFR
pueden unirse a los receptores de adenosina A2a modulando la plasticidad sináptica
(Flajolet et al., 2008). El FGF2 modula también la liberación de neurotransmisores
como la dopamina (Forget et al., 2006b) o el glutamato (Numakawa et al., 2002) y
regula la expresión de algunas subunidades de receptores NMDA (de vital importancia
en la LTP) modificando la composición de este receptor y reduciendo así la entrada de
Ca2+ provocada por la activación de este receptor (Brandoli et al., 1998).
Depresión-Ansiedad Como se ha discutido, el FGF2 ejerce funciones neurotróficas sobre poblaciones
específicas de neuronas y previene la muerte neuronal en diferentes tipos de lesiones
mecánicas y químicas. Se puede especular que la reducción de la expresión de FGF2
en astrocitos ligada a la edad, podría aumentar la vulnerabilidad de las poblaciones
neuronales sobre las que ejerce su función trófica. Es bien conocido el papel del BDNF
(Hashimoto, 2010) en la depresión y estudios recientes parecen indicar que FGF2
puede también ser relevante en la etiología y tratamiento de ciertas alteraciones
psiquiátricas. Un estudio en muestras post-mortem de pacientes con depresión severa
y trastorno bipolar muestra una reducción en la expresión del FGF2 específicamente
en los cerebros de pacientes con depresión respecto a los controles y los enfermos
bipolares (Evans et al., 2004).
El estrés es uno de los mayores factores de riesgo en la aparición de trastornos
psiquiátricos. Un estrés agudo como la inmovilización, puede inducir en ratas la
expresión de FGF2 en diversas zonas cerebrales incluyendo la corteza prefrontal y el
hipocampo. Este efecto parece depender del la activación del eje hipotalámico-
pituitario-adrenal ya que puede ser mimetizado por el tratamiento con agonistas del
receptor de glucocorticoides. Esta regulación aguda de la expresión del FGF2 puede
representar un intento de impedir los daños producidos por la exposición crónica al
46
INTRODUCCIÓN
estrés y evitar así los efectos deletéreos sobre las neuronas observados en la
depresión mayor (Molteni et al., 2001).
El mecanismo de acción de los antidepresivos no es bien conocido. La mayoría de
ellos son inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, pero este
mecanismo no explica la eficacia de estos fármacos que requieren un tratamiento
crónico. Algunos estudios muestran que los antidepresivos como la desipramina y la
fluoxetina son capaces de inducir la expresión del FGF2 en el cortex y el hipocampo
de ratas (Mallei et al., 2002) y también de otros factores tróficos como BDNF y NGF.
Este efecto no está restringido a los antidepresivos sino que los ansiolíticos, como el
diacepam, son también capaces de aumentar la expresión de este factor (Gomez-
Pinilla et al., 2000). Dado que los efectos sobre el comportamiento de los
antidepresivos pueden ser mediados por la estimulación de la neurogénesis en el
hipocampo (Santarelli et al., 2003), y como ya ha sido discutido, el FGF2 juega un
papel importante en la neurogénesis, la modulación de la expresión o señalización de
este factor puede que esté contribuyendo en estos efectos plásticos.
Estudios recientes ponen de relevancia el papel de FGF2 en el control de la ansiedad.
Perez et al demuestran que ratas con un fenotipo ansioso muestran un reducción en la
expresión de FGF2 hipocampal respecto a las ratas control, y que este efecto puede
ser rescatado por el enriquecimiento del ambiente en el que viven las ratas.
Paralelamente el tratamiento crónico con FGF exógeno reduce la ansiedad a través de
un aumento en la supervivencia de nuevas células generadas en el hipocampo,
particularmente de astrocitos. Los autores proponen al FGF2 como un inhibidor
endógeno de la ansiedad que mediaría sus efectos sobre el comportamiento
modificando los circuitos hipocampales (Perez et al., 2009). En otro estudio se pone de
manifiesto el posible papel de FGF2 en la extinción del miedo aprendido post-
traumático y en su reaparición (Graham and Richardson, 2011).
Adicción-Dopamina EL FGF2 parece tener una importante función en el establecimiento y mantenimiento
del sistema de transmisión dopaminérgico (Grothe and Timmer, 2007). Durante el
desarrollo los niveles de FGF2 en áreas cerebrales donde se encuentran las neuronas
dopaminérgicas, como el mesencéfalo y el estriado, son altos. Además promueve la
supervivencia de neuronas dopaminérgicas tanto in vivo como in vitro (Jensen et al.,
2011). En pacientes con enfermedad de Parkinson la inmureactividad para FGF2 en la
sustancia nigra disminuye (Tooyama et al., 1993), revelando un posible ciclo de
47
INTRODUCCIÓN
feedback entre los niveles de dopamina y la expresión del factor. Recientemente ha
sido demostrado que en respuesta a dopamina la expresión de FGF2 aumenta en
astrocitos estriatales por mecanismos dependientes de oscilaciones de Ca2+ y este
efecto promueve la supervivencia de neuronas dopaminérgicas (Zhang et al.,
2009;Reuss and Unsicker, 2000). Paralelamente, el FGF2 controla también la
susceptibilidad a dopamina de los astrocitos regulando la expresión de los receptores
astrogliales de dopamina en coteza y en estriado (Reuss et al., 2000). Todos estos
datos revelan que el control de los niveles de FGF2 puede ser una interesante diana
terapéutica para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
La exposición repetida a drogas estimulantes como la cocaína o las anfetaminas, que
actúan como agonistas dopaminérgicos indirectos a través de la elevación de los
niveles de dopamina sinápticos, resulta en una sensibilización a sus efectos en el
comportamiento y en el sistema dopaminérgico. Esta sensibilización, que produce un
aumento de los efectos de las drogas, se produce por cambios plásticos en el área
tegmental ventral (VTA), un núcleo neuronal dopaminérgico que depende de
inervación glutamatérgica. En los últimos años se ha demostrado que el fenómeno de
la sensibilización es dependiente de la transmisión glutamatérgica y recientemente se
ha demostrado que el FGF2 está también implicado. Durante la sensibilización a
anfetaminas la expresión del FGF2 aumenta en astrocitos del VTA de manera
dependiente de glutamato, y la interferencia en la señalización de este factor mediante
anticuerpos bloqueantes previene el establecimiento de la sensibilización (Flores and
Stewart, 2000). El aumento del FGF2 en los astrocitos del VTA es duradero en el
tiempo, observándose hasta meses después de la última administración de
anfetamina, y correlaciona con la permanencia de la sensibilización (Flores et al.,
1998).
3.5. Papel del FGF2 en la inflamación cerebral En condiciones patológicas como el infarto cerebral se ha descrito un aumento
generalizado de la expresión del FGF2 en astrocitos y neuronas pero también en
microglía y células endoteliales (Issa et al., 2005). En esta misma patología el
tratamiento con FGF2 resulta en una reducción de la pérdida de neuronas y en una
mejora en la recuperación funcional (Baldauf and Reymann, 2005). En cerebros con la
enfermedad de Alzheimer existe un aumento de la expresión de FGF2 alrededor de las
placas de amiloide, particularmente en zonas de gliosis (Stopa et al., 1990b). En un
modelo animal de esclerosis múltiple la expresión de FGF2 aumenta en astrocitos y
microglía en zonas de desmielinización (Messersmith et al., 2000).
48
INTRODUCCIÓN
Es bien sabido que enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de
Alzheimer, la esclerosis múltiple o la enfermedad de Parkinson cursan con un
importante componente inflamatorio. Durante el desarrollo de estas patologías se ha
descrito la liberación de neurotrofinas y factores de crecimiento (como acabamos de
ver para el FGF2 en el apartado anterior), citoquinas y quimiocinas por parte de las
células gliales. Así como el papel de las citoquinas y quimiocinas en regular aspectos generales de la reacción inflamatoria y en mediar quimiotaxis son bien conocidos, la función de los factores de crecimiento en la inflamación ha sido poco estudiada.
Existen precedentes que atribuyen al FGF2 un papel anti-inflamatorio. En células
microgliales el tratamiento con el factor disminuye la liberación de especies reactivas
de oxígeno inducidas por TNF-�(Colasanti et al., 1995). Además, el FGF2 disminuye,
en células endoteliales, la expresión de moléculas de adhesión como ICAM o VCAM y
de quimiocinas como MCP1 y IL-8 reduciendo lo capacidad de monocitos de migrar a
través del endotelio (Zhang and Issekutz, 2002). Se ha descrito también la facultad del
FGF2 en inducir la activación del factor de transcripción CREB, que en el contexto de
la inflamación puede inhibir la expresión de genes inflamatorios como la NOS2
(Gavrilyuk et al., 2001).
Algunos estudios han mostrado el potencial de otros factores de crecimiento en regular
la inflamación cerebral. El TGF-β parece tener un papel claramente antiinflamatorio ya
que reduce la sobreexpresión de quimiocinas(Guo et al., 1998), la producción de TNF-
α (Benveniste et al., 1995) y de ICAM1 (Shrikant et al., 1996b) en astrocitos. La
vasopresina es capaz de reducir la expresión de IL-1β y TNF-� a través de la
activación de CREB (Zhao and Brinton, 2004). Por otra parte el factor neurotrófico
PEDF induce per se la expresión de citoquinas y quimiocinas mediante la activación
del factor de transcripción NF-kB en astrocitos y microglía (Takanohashi et al.,
2005;Yabe et al., 2005).
Dado que el papel de las neurotrofinas en la inflamación cerebral es poco conocido y considerando numerosas evidencias que muestran que, en concreto, FGF2 se sobre-expresa en astrocitos en diversas patologías que cursan con un componente inflamatorio, hemos examinado en este trabajo el posible papel autocrino de este factor sobre los astrocitos, en un modelo in vitro analizando dos aspectos relevantes en la reactividad glial como son la expresión de genes
49
INTRODUCCIÓN
inflamatorios y la capacidad migratoria, así como la vías de señalización implicadas en estos efectos.
4. Efecto protector de los antiinflamatorios no esteroideos sobre la aparición de la enfermedad de Alzheimer.
Como dijimos anteriormente, el cerebro muestra reacciones inflamatorias también
durante enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson o el Alzheimer, por lo
que también es importante entender el papel de la reactividad astrocitaria y su
componente migratorio, y su potencial terapéutico en estas enfermedades.
El aumento de la esperanza de vida en nuestra sociedad ha supuesto también un
incremento en la prevalencia de la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de
Alzheimer. Dado que este alargamiento de la duración de la vida no se correlaciona en
todos los casos con una preservación de la calidad de ésta, actualmente se invierten
grandes recursos en la investigación de estas enfermedades, tanto en aspectos de
prevención y/o curación, así como de identificación de los factores que las provocan y
los mecanismos que actúan en su desarrollo.
4.1 Etiologia y patología de la enfermedad de Alzheimer La enfermedad de Alzheimer (o AD) es la forma más común de demencia siendo
responsable del 50-60% de los casos. Es una de las patologías con mayor prevalencia
en nuestra sociedad, siendo de un 1,5% a los 65 años de edad y aumentando hasta
un 30% a los 85 años (Barranco-Quintana et al., 2005;Ferri et al., 2005). Las
consecuencias de esta enfermedad son la pérdida progresiva de las principales
cualidades humanas: memoria, entendimiento, juicio, abstracción y lenguaje. Fue
descrita por Alois Alzheimer en 1906, al presentar a la comunidad científica los
resultados de la neuropatología de una de sus pacientes, August D, que presentaba a
los 56 años una demencia progresiva acompañada de delirios y alucinaciones
(Bertram and Tanzi, 2005). Para el correcto diagnóstico de la enfermedad de
Alzheimer es necesario un estudio neuropatológico para excluir otras posibles
demencias. El cerebro de un paciente afectado por esta enfermedad presenta una
atrofia hipocampal y cortical, paralelamente a un incremento en el volumen de los
ventrículos cerebrales. En el plano microscópico se observa una pérdida de neuronas
en el sistema límbico y la corteza asociativa y en algunos núcleos subcorticales que
proyectan a estas zonas. Las alteraciones más características que se hallan en los
50
INTRODUCCIÓN
cerebros de los pacientes de AD son la presencia de ovillos neurofibrilares
(neurofibrillary tangles, NFT), formados principalmente por acumulaciones de la
proteína tau hiperfosforilada, y el incremento en el número y tamaño de las placas
seniles, formadas mayoritariamente por el péptido Aβ. Estos dos tipos de lesiones se
hallan de manera abundante en la corteza, hipocampo, amígdala y algunos otros
núcleos subcorticales (O'Brien, 1996). Los NFT están formados de filamentos
helicoidales aparejados o PHF. Los PHF están constituidos en gran parte por la
proteína asociada a microtúbulos tau, anormalmente hiperfosforilada por diferentes
kinasas. La fosforilación de tau es un evento que provoca la disociación de esta
proteína de los microtúbulos, a los que se encuentra unida en condiciones normales,
perdiendo su solubilidad, dando lugar a los PHF que al agregarse entre sí originan los
NFT. Éstos se acumulan principalmente en cuerpos neuronales y dendritas,
provocando daños sinápticos y muerte neuronal (Friedhoff et al., 2000). Las placas de
amiloide están formadas de un núcleo central de Aβ, normalmente de 40 y 42
aminoácidos, y están rodeadas de axones y dendritas degenerados y células gliales
activadas (tanto astrocitos como microglia). Los péptidos Aβ de 40 y 42 aminoácidos
son generados constitutivamente por el corte secuencial de la proteína precursora de
amiloide (APP), por parte de las beta y gamma secretasas. La forma Aβ42 del amiloide
presenta una mayor tendencia a la agregación, siendo la especie de Aβ más tóxica. A
menudo, además de la afectaciones neuronales descritas, aparecen también lesiones
vasculares características, como la Angiopatía Cerebral Amiloide (CAA), la
degeneración microvascular o lesiones periventriculares en la sustancia blanca (de la
Torre, 1997;Kalaria, 1999).
El péptido Aβ se deriva del procesamiento de la proteína precursora del amiloide
(APP). APP es una glicoproteína transmembrana expresada ubicuamente y de forma
constitutiva, cuyas funciones fisiólogicas son: regulación del crecimiento de la
dendritas (Sabo et al., 2003), migración de los precursores neurales durante el
desarrollo (Young-Pearse et al., 2007), interacciones célula-matriz extracelular
(Mattson, 1997), regulación de la señalización por Ca2+ en respuesta a ApoE o del
mismo Aβ (Leissring et al., 2002;Reinhard et al., 2005). El APP puede ser procesado
por dos vías distintas:
- La vía no amiloidogénica: que es la predominante en condiciones normales. Al
inicio de esta vía el APP es proteolizado por la actividad α-secretasa,
constituída por proteasas de la familia ADAM (a desintegrin and
metalloproteinase) como las ADAM9, ADAM10 y ADAM17. El corte del APP se
produce por el dominio Aβ impidiendo así la formación de este péptido tóxico.
51
INTRODUCCIÓN
La porción C-terminal restante es cortada por la actividad enzimática γ-
secretasa, formada por un complejo multiproteico que contiene como unidad
catalítica a la presenilina-1 (PS-1) o la presenilina-2 (PS-2), y a PEN-2
(presenilin enhancer-2), nicastrina (NCT) como proteínas adaptadoras.
(Edbauer et al., 2003).
- La vía amiloidogénica: en la que durante el procesamiento del APP se genera
el péptido Aβ. El primer corte es realizado por el enzima BACE (β-site APP
cleaving enzyme) de la actividad β-secretasa (Sastre et al., 2006), seguido de
un segundo corte por parte de la γ-secretasa. El Aβ así generado presenta
distinto número de aminoácidos, siendo las formas mayoritarias las de 40 y 42
aminoácidos, de las que, como ya se ha comentado, el Aβ42 es el que
presenta mayor tendencia a agregarse (Munoz and Inestrosa, 1999)
La enfermedad de Alzheimer es una patología heterogénea que se presenta con una
etiología de origen familiar o esporádico. El Alzheimer familiar (FAD) es una
enfermedad autosómica dominante que aparece en edades tempranas (antes de los
65 años) y representa menos del 5% del total. La mayoría de pacientes de FAD
presenta mutaciones en los genes del APP o de la presenilinas. El gen APP fue
clonado a partir del análisis del amiloide cerebrovascular de pacientes de AD en el
cromosoma 21. Al cabo de poco tiempo un estudio estableció un relación entre una
mutación en el cromosoma 21 con la aparición de la patología en cuatro familias que
presentaban FAD y la descripción de la primera mutación en el gen del APP, revisado
en (Bertram and Tanzi, 2005). Aún así, la mutaciones en el gen del APP explican sólo
un pequeño porcentaje de la FAD, entre un 5-7 % (Small, 1998).
Posteriormente se clonó el gen de la PS-1 en el cromosoma 14, que representa el
locus mayoritario que origina el Alzheimer de tipo familiar (Sherrington et al., 1995).
Actualmente hay descritas más de 160 mutaciones en el gen de la PS-1, y bastantes
menos en su homólogo la PS-2, que causan FAD. Las mutaciones en los genes de las
presenilinas se localizan en las regiones transmembrana que son las más
conservadas y conllevan un aumento en la relación Aβ42/ Aβ40, bien por un aumento
en la producción del Aβ42, bien por una disminución en la generación de Aβ40 o una
combinación de ambos (De, 2007).
52
INTRODUCCIÓN
En el caso de la AD no familiar se han identificado numerosos factores de riesgo
asociados a un mayor riesgo de sufrir esta patología. Entre ellos se pueden citar la
edad, la arterioesclerosis, la hipertensión, la diabetes, lesiones cerebrales, la
hiperhomocisteonemia, la hipercolesterolemia, factores trombogénicos, y la dosis
génica del alelo ε4 del gen de la apolipoproteina E (ApoE), (Corder et al.,
1993;Gorelick, 2004;Saunders et al., 1993). Este gen codifica para una lipoproteína
plasmática que participa en la recaptación de varios lípidos, entre ellos el colesterol, y
que podría participar también en el metabolismo del Aβ. El alelo ε4 de ApoE presenta
una alta asociación con la aparición del AD esporádico pero también del FAD,
mientras el alelo ε2 parece ser protector frente a la patología (Corder et al.,
1994;Bertram and Tanzi, 2005).
A pesar de la asociación de estos factores de riesgo, la etiología de la AD esporádica
no es bien conocida desde el punto de vista bioquímico. Se piensa que la pérdida de
control sobre los niveles de formación y degradación del Aβ podría ser una de las
primeras alteraciones, pero evidencias recientes muestran que terapias enfocadas a
reducir la formación de Aβ mediante semagacestat, un inhibidor selectivo de la
presenilinas, no son efectivas en reducir el avance de la enfermedad (Cummings,
2010;Imbimbo and Giardina, 2011), poniendo en duda la teoría según la cual el Aβ
sería el principal causante de la AD.
Existen evidencias experimentales que muestran que el estrés oxidativo juega un
papel importante en el desarrollo y la evolución de la AD. En estadíos leves de AD, o
en pacientes de AD ya se observan marcadores oxidativos en proteínas, lípidos y
ácidos nucleicos y una disminución en los sistemas antioxidantes (Pratico et al.,
2002;Behl, 2005). Hay que tener en cuenta que el cerebro es un órgano especialmente
sensible al estrés oxidativo por su naturaleza rica en ácidos grasos peroxidables, una
alta tasa metabólica y por lo tanto un consumo de oxígeno muy alto, y una menor
disponibilidad de antioxidantes que en tejidos periféricos. Existe también una estrecha
relación entre el estrés oxidativo, la deposición de Aβ y la inflamación subyacente a la
patología (Tamagno et al., 2002;Lustbader et al., 2004). Un estudio muestra que el
tratamiento con citoquinas pro-inflamatorias causa un aumento de la liberación de Aβ
en neuronas que sobre-expresan la proteína APP (Sastre et al., 2003). El mecanismo
parece ser un aumento de la expresión y de la actividad de la (BACE1). Es decir, se
crea un círculo vicioso en el que la Aβ desencadena una respuesta inflamatoria que a
su vez favorece su producción y depósito.
53
INTRODUCCIÓN
4.2 Fases de la enfermedad Alzheimer La AD es una patología de lenta evolución que se puede definir en fases. La primera
es una fase pre sintomática en la que la mayoría de individuos no presentan síntomas
congintivos y en la que empiezan a acumularse el péptido Aβ y la proteína tau
hiperfosforilada. Esta primera fase tiene una larga duración, pudiendo durar dos
décadas antes de la manifestación de los primeros síntomas de demencia. A
continuación, las lesiones acumuladas progresivamente durante años por el depósito
anormal de proteínas se manifiestan en alteraciones sinápticas y metabólicas que dan
lugar a los primeros síntomas cognitivos. En esta fase los pacientes muestran
alteraciones en la memoria, principalmente pérdidas en la memoria episódica, a los
que se refiere genéricamente, como mild cognitive impairment (MCI). La última fase en
la evolución de la AD es la demencia, definida como una disfunción en varios dominios
que son suficientemente severos para producir pérdida de función, y cursa con atrofia
cerebral (Jack, Jr. et al., 2010).
4.3 Tratamientos Actualmente no existe cura para la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, existen
fármacos que pueden ayudar a controlar sus síntomas. Además, los tratamientos
también están disponibles para ayudar a manejar la agitación, depresión o los
síntomas sicóticos (alucinaciones o delirios), que suelen ocurrir a medida que la
enfermedad progresa.
Tratamiento sintomático: Existen cinco fármacos aprobadas por la Food and Drug
Administration (FDA) que pueden controlar los síntomas y retrasar la progresión de la
AD. Cuatro de ellas, son inhibidores de la colinesterasa: Cognex ® (tacrine), Aricept ®
(donepezil), Exelon ® (rivastigmine), y Razadyne ® (galantamine), bloquean la
degradación metabólica de la acetilcolina, manteniendo concentraciones más elevadas
de este neurotransmisor (Larner, 2010). Esto retarda la progresión del deterioro
cognitivo y puede ser eficaz para algunos pacientes con AD. El quinto fármaco,
Namenda ® (memantine), antagonista de los receptores NMDA, está aprobado para el
tratamiento de la AD, de tipo moderada hasta la grave (Cranwell-Bruce, 2010).
Namenda protege las neuronas frente a la excitotoxicdad inducida por glutamato que
se libera en grandes cantidades por las células dañadas del cerebro de la AD
(Volbracht et al., 2006).
54
INTRODUCCIÓN
Paralelamente en etapas intermedias de la enfermedad, cuando empiezan a aparecer
los primeros síntomas cognitivos también existen medicamentos para controlar la
depresión, ansiedad y comportamiento psicótico, incluidos los pensamientos
paranoicos, delirios y alucinaciones. Estas personas también pueden mostrar
agresividad e hiperactividad. Los medicamentos para estos síntomas son
considerados cuando las alternativas no medicinales han fracasado y/o estos síntomas
ponen en peligro al paciente de AD o a su entorno.
Puesto que los tratamientos actuales son solo paliativos para los síntomas de la AD, el
desarrollo de un tratamiento para curar esta enfermedad es uno de los retos de la
neurociencia actual. Numerosos ensayos clínicos son lanzados cada año. De la
diversas estrategias que se han ensayado a continuación se destacan las siguiente:
Tratamientos anti-oxidantes: Hemos comentado anteriormente que el estrés
oxidativo constituye uno de los causantes del daño celular que se produce durante el
desarrollo de la AD. La vitamina E puede ofrecer cierta protección contra el daño
celular causado por los radicales libres (Ayasolla et al., 2004). Sin embargo, las
investigaciones han producido resultados conflictivos y un estudio científico riguroso
será necesario para aclarar el papel de este antioxidante en la evolución de esta
patología (Devore et al., 2010;Lee et al., 2010). Otros compuestos que han sido
testados con el fin de prevenir la AD o el deterioro cognitivo son: el extracto de ginkgo
biloba (Janssen et al., 2010), la curcumina (Zhang et al., 2010a), los ácidos grasos
omega-3 (Huang, 2010) o el selenio (van et al., 2010).
Inmunoterapia: En 1999 algunos estudios revelaron que la inyección del péptido Aβ
por sí mismo, llamada inmunización activa, era capaz de inducir en ratones la
producción de anticuerpos contra el péptido reduciendo así su acumulación y la
formación de placas (Schenk et al., 1999). Alentados por el potencial de la
inmunoterapia, algunas compañías farmacéuticas comenzaron los ensayos clínicos
humanos en 2001. No obstante, en 2002, los ensayos se interrumpieron cuando
alrededor del seis por ciento de los participantes desarrolló un efecto secundario
potencialmente grave, encefalitis aguda (Munch and Robinson, 2002;Pfeifer et al.,
2002). Las autopsias de varios participantes que murieron de otras causas revelaron
una gran reducción en número y superficie de placas de amiloide, y una disminución
en la cantidad de NFT y en la reactividad para tau-hiperfosforilada. En el caso de los
participantes del ensayo que desarrollaron anticuerpos, éstos evidenciaron una
mejoría en funciones como memoria, atención y concentración. Más recientemente,
55
INTRODUCCIÓN
algunas empresas farmacéuticas han comenzado mas ensayos clínicos humanos
utilizando inmunoterapia pasiva, en la que anticuerpos en lugar de proteína en sí, son
administrados a los pacientes.
Tratamiento con antiinflamatorios no esteroideos: A principios de los años noventa
fue cobrando fuerza la idea de que la inflamación es un factor patogénico en la
enfermedad de Alzheimer. En esta línea fue en esa época cuando se asoció el uso
crónico de anti-inflamatorios no esteroides (AINES) a una protección contra la
aparición de la AD. Se publicaron numerosos estudios epidemiológicos que mostraban
que pacientes tratados para la artritis con AINES tales como el ibuprofeno tenían un
riesgo menor de padecer la enfermedad de Alzheimer. En Szekely et al., 2004 se ha
realizado una revisión sistemática de varios estudios epidemiológicos y se concluye
que los AINES reducen la incidencia de la enfermad de Alzheimer entre un 20 y un
80%, según el estudio, con un promedio del 50% y que el efecto protector se
manifiesta con más claridad en pacientes que empezaron el tratamiento antes de tener
síntomas acusados de la enfermedad, es decir, es un efecto más bien preventivo. Los
estudios epidemiológicos se han visto confirmados en animales que sobre-expresan
APP, donde el tratamiento prolongado con AINES reduce la activación glial, la
formación de placas y mejora el déficit cognitivo (Lim et al., 2000;Lim et al., 2001).
4.4 Efecto protector de los AINES sobre la AD A pesar de las expectativas generadas por los datos epidemiológicos, los resultados
del efecto protector de los AINES frente a la AD son paradójicos. La mayoría de
ensayos clínicos utilizando diferentes AINES, realizados de manera prospectiva en
pacientes con MCI o estadíos ya avanzados de la patología, no han mostrado efectos
beneficiosos o incluso empeoran el estado de los pacientes. Esta falta de efecto se ha
atribuido a la elección de los AINES sujetos al estudio, a las dosis empleadas o a que
el efecto protector se manifiesta únicamente en las fases iniciales de la enfermedad.
(Imbimbo et al., 2010). Con la intención de verificar esta última hipótesis, se inició en el
año 2000 un ensayo preventivo (el ADAPT trial) con personas no afectadas de una
media de edad de 70 años, utilizando el naproxeno (un AINE con capacidad de inhibir
tanto la COX1 como la COX2) y el celecoxib (inhibidor específico de la COX2). Este
estudio se detuvo dos años después de su inicio porque los participantes parecían
mostrar una mayor incidencia a desarrollar patologías cardiovasculares, además de no
mostrar efectos protectores frente a la AD (Lyketsos et al., 2007);ADAPT(ADAPT Trial
group, 2006)). Aún así los participantes del estudio siguieron siendo monitorizados y
se observó que con el paso de los años, aquellos a los que se había administrado
56
INTRODUCCIÓN
naproxeno tenían una reducción del 70% en el desarrollo de la patología (Hayden et
al., 2007). Estas evidencias ponen de manifiesto que los AINES muestran efectos
protectores cuando son tomados antes de la aparición de los síntomas clínicos de la
AD, validando así los estudios epidemiológicos.
La diana “tradicional” a través de la cual los AINES ejercen su efecto anti-inflamatorio
siempre ha sido la COX2, de hecho la inhibición de esta enzima en astrocitos es capaz
de reducir la gliosis (Heneka et al., 2005). Un giro inesperado en la interpretación del
efecto preventivo de los AINES en la enfermedad de Alzheimer provino de varias
evidencias. La primera, que el efecto protector de los AINES en la enfermedad de
Alzheimer es independiente de la COX-2, porque inhibidores específicos de esta
enzima como el rofecoxib no tienen un efecto preventivo (Reines et al., 2004). El
segundo, es la demonstración de que algunos AINES regulan in vitro la actividad de la
gamma secretasa y que dicho efecto es independiente de la COX-2 (Weggen et al.,
2001). Surgió así la idea de que los AINES eran capaces de prevenir la enfermedad de
Alzheimer más por sus propiedades anti-amiloidogénicas que por las anti-
inflamatorias. En esta línea se generaron nuevos AINES, mejorados para inhibir la
actividad gamma secretasa y con poco o ningún efecto sobre las COX con la intención
de reducir los problemas gástricos asociados a la toma crónica de estos fármacos.
Surgieron así fármacos como el R-flurbiprofeno (Kukar et al., 2007) o el CHF5074
(Imbimbo et al., 2007), que a pesar de dar excitantes resultados tanto en modelos in
vitro como in vivo, no han sido efectivos, en el caso del R-flurbiprofeno, en ensayos
clínicos con pacientes (Green et al., 2009). El CHF5074 de la compañía italiana Chiesi
Farmaceutici sigue todavía en ensayo clínico. La hipótesis anti-amiloidogénica, aunque
todavía vigente y objeto de intensa investigación, tiene algunos puntos débiles: el
efecto se ha observado sólo in vitro y a dosis muy altas, que quizá no se alcancen in
vivo dentro del cerebro, y existen AINES como el naproxeno que tienen un claro efecto
preventivo en estudios epidemiológicos, pero ningún efecto sobre la gamma secretasa
in vitro discutido por Gasparini et al., 2004.
Por otra parte, la hipótesis anti-inflamatoria no se puede desdeñar porque existen al
menos dos vías anti-inflamatorias alternativas a la COX-2 que pueden ser moduladas
por los AINES: la vía de los PPARγ (“peroxisome-proliferator activated receptors”)
(Landreth and Heneka, 2001), y la vía de las Rho-GTPasas, que proponemos
nosotros.
57
INTRODUCCIÓN
La activación inflamatoria de los astrocitos implica una profunda reorganización del
citoesqueleto de actina que incluye la aparición y desaparición coordinada de fibras de
estrés, focos de adhesión, lamelipodios y filopodios. Es decir, existen fenómenos de
plasticidad asociados a la respuesta inflamatoria. Se ha mostrado la mediación de las
Rho-GTPasas en los cambios morfológicos (Abe and Misawa, 2003;Avalos et al.,
2004;John et al., 2004), la migración (Holtje et al., 2005) y en la expresión de genes
inflamatorios en la glía reactiva (Cordle and Landreth, 2005).
Así mismo, se ha establecido una relación entre la actividad de la Rho y el
procesamiento de la proteína APP. Un estudio muestra que la estimulación de Rho en
líneas neuronales transfectadas con una forma mutada de la APP induce la liberación
de beta amiloide, y revierte el efecto anti-amiloidogénico de los AINES (Zhou et al.,
2003). Este estudio es importante porque demuestra, por un lado, que la Rho es una
diana de los AINES y, por otro, porque permite un nexo de unión entre las hipótesis
anti-amiloidogénica y anti-inflamatoria. Por lo tanto, se puede deducir que, regulando
las Rho-GTPasas, los AINS tendrían varios efectos beneficiosos en la enfermedad de
Alzheimer: i) la reducción de la liberación de βA, y ii) reducción de los efectos nocivos
derivados de la inflamación por vías alternativas a la COX.
En los últimos años un número creciente de trabajos han puesto de manifiesto que los
AINEs pueden modular a la Rho incidiendo sobre diferentes aspectos de la fisiología
neuronal y promoviendo la regeneración de axones en modelos de lesión de espina
dorsal (Dill et al., 2010;Fu et al., 2007a;Wang et al., 2009b). La hipótesis de la segunda parte de este trabajo es que los AINEs pueden modular la Rho también en los astrocitos y que este efecto podría explicar los efectos preventivos de estos fármacos sobre la aparición de la AD. Para validarla hemos examinado la actividad de distintas Rho-GTPasa en astrocitos en cultivo tras el tratamiento con AINES y cómo afectan estos cambios de actividad sobre la dinámica del citoesqueleto y la capacidad migratoria así como las vías de señalización implicadas.
58
Objetivos
OBJETIVOS
Los objetivos de este trabajo han sido:
Trabajo 1:
Objetivo general: Estudiar el papel inmunomodulador del FGF2 en astrocitos.
1.1. Análisis de la expresión de genes inflamatorios MCP1, COX2, ICAM1
1.2. Análisis de las vías de señalización
1.3. Análisis de la migración.
Trabajo 2:
Objectivo general: Estudiar el efecto de los AINES sobre la dinámica del citoesqueleto de actina en astrocitos
2.1. Análisis de cambios morfológicos.
2.2. Análisis de la migración.
2.3. Análisis del papel de las Rho-GTPasas.
60
Materiales y métodos
MATERIALES Y METODOS 1.Material biológico 1.1 Cultivos primarios de astrocitos Los cultivos primarios de astrocitos se obtuvieron a partir de cerebelos de ratas de la
cepa Sprague-Dawley de 7-8 días de edad y, en algunos casos, de corteza de
animales de 0-3 días suministrados por el Servicio de Estabulario de la propia
Universidad Autònoma de Barcelona. El procedimiento experimental fue aprobado por
el Comité ético de la Universidad Autònoma de Barcelona en conformidad con las
líneas directrices de las instituciones nacionales (Generalitat de Catalunya)
Para la realización del cultivo hemos utilizado un método de disgregación enzimático-
mecánico del tejido, para el que son necesarias las siguientes soluciones que se
preparan frescas justo antes de empezar el procedimiento:
Solución 1: 50ml de tampón Krebs-Ringer (NaCl 120 mM, KCl 4.8 mM, KH2PO4 1.2
mM, NaHCO3 25 mM, Glucosa 14.3 mM), 0.15 g de albúmina de suero bovino (BSA) y
0.4 ml de una solución 3,8% de MgSO4
Solución 2: 10ml de solución 1 conteniendo 2.5mg de tripsina (Sigma)
Solución 3: 10ml de solución 1 conteniendo 5.2mg de inhibidor de tripsina (CASA),
0.8mg de DNAsa (Sigma) y 0,1ml de solución 3,8% de MgSO4
Solución 4: 8,4ml de solución 1, 1,6ml de solución 3
Solución 5: 5ml de solución 1 conteniendo 40ul de solución 3,8% de MgSO4 y 6ul de
una solución 1.2% de CaCl2.
Los animales fueron sacrificados por decapitación y la disección de los cerebelos o
las cortezas se realizó bajo lupa en campana de flujo laminar en PBS (138 mM NaCl,
2,70 mM KCl, 1 mM Na2HPO4, 1,76 mM KH2PO4, pH 7,4). Los cerebelos fueron
disgregados por trituración con un bisturí. El tejido disgregado se sumergió en la
solución 1 y se centrifugó un pulso a 1500rpm. Seguidamente se añadió al precipitado
la solución 2, que contiene tripsina, para disgregar enzimáticamente el tejido durante
10 minutos a 37ºC. Trascurrido este tiempo se añadió la solución 4 para parar la
reacción enzimática. Se volvió a centrifugar la suspensión celular con un pulso a
1500rpm, se elimina el sobrenadante y se añade la solución 3. A continuación la
suspensión celular se pasó 10 veces con una pipeta Pasteur de vidrio a través de una
malla de nylon de 0.2um, y fue transferida a la solución 5 para restablecer la
homeostasis celular. Finalmente se centrifugó a 1000rpm durante 5 minutos y las
62
MATERIALES Y METODOS células se resuspendieron en medio de cultivo (90 % DMEM (Sigma-Aldrich), 10 %
FBS (Chambrex) suplementado con 2 mM glutamina, 20 unidades de penicilina y 20
μg/ml de estreptomicina (Gibco). De esta suspensión se realizó un recuento de células
con una cámara de Neubauer utilizando Tripan Blue para descartar las células
muertas. Las células fueron sembradas a una densidad de 6x105 células/ml (astrocitos
cerebelares) o 3x105 (astrocitos corticales) y mantenidas en un incubador a 37ºC con
una atmósfera de 10% CO2 y 95% de humedad. Las células se sembraron en
diferentes tipos de placas de cultivo según el tipo de ensayo. Para extracciones de
proteínas las células se sembraron en placas de 100mm (Nunc), para extracciones de
RNA e inmunofluorescencia en placas de 35mm (Corning) y para ELISA en placas de
96 pocillos (Falcon). El medio de cultivo fue cambiado cada 7 días y los cultivos
confluentes se utilizaron entre los días 10 y 12 en caso de los astrocitos cerebelares o
7-9 en el caso de astrocitos corticales que es cuando los astrocitos llegan a
confluencia, evitando la proliferación masiva de la contaminación microglial. En el
momento de utilización de los cultivos el porcentaje de células era de un 90% de
astrocitos y un 10% de microglía
1.2 Tratamiento farmacológico de células en cultivo Una vez alcanzada la confluencia, las monocapas de astrocitos fueron deprivadas de
suero durante 18 horas antes del procedimiento experimental mediante la incubación
en DMEM 0% de suero para G-LISA o 1% FBS para los restantes experimentos. En el
caso de utilizar inhibidores farmacoógicos, estos fueron añadidos al medio 1h antes
del experiemto. En todos los casos, los tratamientos fueron detenidos colocando las
placas rápidamente en hielo y lavandolas con PBS frio.
1.3 Infecciones virales Dado que los astrocitos primarios son relativamente resistentes a los métodos de
trasnfección convencionales y más ampliamente utilizados como son la técnica del
calcio o los basados en detergentes, hemos optado por la utilización de vectores
virales para la introducción de plásmidos en las células.
Adenovirus. Las monocapas confluentes de astrocitos fueron incubadas durante 3
horas en DMEM conteniendo 1% de FBS con adenovirus que codificaban para
mutantes constitutivamente activos (CA) o dominantes negativo (DN) de proteínas
Rho-GTPasas: V17-RhoA (CA-RhoA), N17cdc42 (DN-cdc42), V17-Rac1 (CA-Rac1) o
N17Rac1 (DN-Rac1),cedidos por la Dra Beata Wojhack-Stothar y amplificados en el
63
MATERIALES Y METODOS servicio de producción de virus del CBATEG. La infección se realizó utilizando una
MOI (multiplicity of infection) de 50 en el caso del CA-RhoA, y de 100 para los demás
adenovirus. Alcanzadas las 3 horas, el medio fue sustituido por medio completo al
10% de FBS hasta el día siguiente (18horas) para conseguir una expresión completa
de los mutantes de Rho-GTPasas antes del procedimiento experimental. La expresión
de todos los mutantes fue confirmado mediante Westen Blot.
Retrovirus: Las partículas retrovirales, obtenidas de Sigma, fueron incubadas con las
células pre-confluentes (días 7-8 in vitro), en un relación de 15 µl del concentrado
vírico por ml de medio al 10% de FBS durante 24h. Transcurrido este tiempo, el medio
fue cambiado y los experimentos se realizaron 6-7 días después para permitir la
intergración de los constructos en el genoma de las células infectadas y la reducción
en la expresión del FGFR2 por acción de los shRNA.
2. Métodos bioquímicos
2.1 PCR en tiempo real Se siguieron los siguientes pasos: Aislamiento del ARN: Tras los tratamientos, el ARN total se extrajo mediante el
reactivo Trizol (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Durante la
fase de precipitación del ARN en isopropanol se añadió 0.3M de acetato de sodio
(Sigma-Aldrich) para mejorar la eficiencia de esta reacción. La concentración del RNA
total se estimó por métodos fluorométricos mediante el kit comercial Qubit de
Invitrogen.
Retrotranscripción del ARN: Un total de 1µg de ARN se incubó con 900ng de
random primers (Invitrogen) 2 minutos a 65°C para permitir la linearización de los ARN
mensajeros e interacción con los primers. A continuación se añadió a las muestras el
siguiente mix de reacción: 10U de Superscript II en presencia de 0.5mM de dNTPs y
10mM DTT en el tampón adecuado para el enzima en un volumen final de 20ul
(Reactivos de Invitrogen). La reacción se incubó 1h a 42°C en un termociclador
seguido de 5 minutos a 95°C para desnaturalizar el enzima. Finalmente el cDNA se
diluyó en 80ul de tampón Tris-EDTA y las muestras se guardan a -20°C
PCR en tiempo real o cuantitativa: 2µl de cDNA fueron amplificados en una mezcla
64
MATERIALES Y METODOS de reacción que contenía 25U de Taq polymerase, 1.5mM MgCl2, 200mM dNTPs
(reactivos de Invitrogen), 0.5µM de primers específicos para cada gen de interés (TIB
Molbiol) y SYGB Green (Molecular Probes, 1:100.000), en capilares de vidrio (Roche)
de un volumen final de 20µl. Los primers utilizados fueron los siguientes:
MCP1 forward 5’-CTTCTGGGCCTGTTGTTCAC-3’,
MCP1 reverse 5’GGGACGCCTGCTGCTGGTGATTC-3’;
ICAM1forward 5’- GGGCCCCCTACCTTAGGAA-3’,
ICAM1 reverse 5’- GGGACAGTGTCCCAGCTTTC-3’;
18S forward 5’-GGGAGGTAGTGACGAAAAATAACAAT-3’,
18S reverse 5’-TTGCCCTCCAATGGATCCT-3’
El programa de PCR utilizado fue: 30 segundos a 93°C (desnaturalización), 30
segundos a 58°C (annealing) seguidos de 30 segundos a 72°C (elongación) durante
35 ciclos y un ciclo final de 10 minutos a 72°C La reacción se realizó en un
termociclador LightCycler (Roche) que es capaz de detectar el incremento en la
fluorescencia respecto al ciclo de PCR. Para una cuantificación precisa de la muestra
se asignó un valor umbral por encima del ruido, y se determinó en qué punto cada
muesrtra sobrepasaba el valor umbral. Este punto recibe el nombre de ciclo umbral o
Cp (crossing point). Las diferencias en los Cp de la muestras fueron utilizadas para
cuantificar las concentraciones relativas contenidas en cada tubo. La expresión relativa
de los mRNAs se calculó utilizando el método comparativo Cp. Para ello el Cp de las
muestras tratadas se restó del Cp de las muestras controles y el valor obtenido se
utilizó para calcular el índice de acumulación de tránscrito (TAI).
TAI=2^(Cp controles-Cp tratadas)
Este cálculo asume que todas las reacciones de PCR funcionan con una eficiencia del
100%. La eficiencia de los primers utilizados para estos ensayos de PCR resultaron
ser de entre el 85 y el 110% por lo que esta asunción introduce errores mínimos en
estos cálculos.
2.2 Fraccionamiento subcelular Para conseguir muestras enriquecidas en fraciones citosólicas o nucleares hemos
utilizado el siguiente protocolo de fraccionamiento subcelular. Después de los
tratamientos correspondientes, las células fueron despegadas de la placa con un
scraper en PBS a 4ºc, centrifugadas 5 minutos a 1000g y resuspendidas en un
tampón hipotónico (10mM HEPES pH 7.9, 1.5mM MgCL2, 10mM KCl, 1mM DTT) con
65
MATERIALES Y METODOS inhibidores de proteasas (Roche) y fosfatasas (Sigma-Aldrich). Tras 5 minutos en hielo,
se añadió detergente NP-40 (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 0.6 %, los
lisados se agitaron 10 segundos con un vortex a la máxima velocidad y se
centrifugaron a 1000g durante 30 segundos. En este punto el sobrenadante contiene
el extracto citosólico, y el pellet está constituido de núcleos. Se recogió el extracto
citosólico y los núcleos se lavaron en el mismo tampón por resuspensión y
centrifugación. Los extractos nucleares se obtuvieron incubando los núcleos en el
tampón siguiente: 10mM HEPES pH 7.9, 25% glicerol, 400mM NaCl, 1mM EDTA,
1mM DTT con inhibidores de proteasas y fosfatasas durante 30 minutos en agitación
suave a 4°C. A continuación los extractos se centifugaron a 13000rpm durante 15
minutos se recogió el sobrenadante en el que están disueltas las proteínas nucleares.
La concentración de proteína en la muestra se midió utilizando el método Bradford.
Las muestras se almacenaron a -80°C
2.3 Western Blot Las muestras de proteína obtenidas siguiendo el protocolo detallado en el apartado
anterior se diluyeron en tampón de carga (62.5 mM Tris HCl pH 6.8, 10 % Glicerol, 2%
SDS, 5% beta-ME, 0,01% Azul de Bromofenol), fueron hervidas 5 minutos a 95°C y
fueron separardas por electroforesis en geles de un porcentaje variable de acrilamida
según el experimento. Para cada muestra se cargaron cantidades iguales de proteínas
entre 5-20µg según la proteína a detectar. La electroforesis se realizón en tampón
Tris-glicina pH8.5.
Acabada la electroforesis las proteínas fueron transferidas a membranas de PVDF
(Roche) previamente activadas con metanol y equilibradas en tampón de transferencia
( Tris-CAPS: 60mM Tris base, 40mM CAPS, pH 9.6) durante al menos 30 minutos. La
transferencia se realizó por el método semi-seco a voltaje constante a 15V durante 30-
60 minutos según el peso molecular de la proteína de interés.
Las membranas con las proteínas transferidas se bloquearon durante 1 hora en
tampón de bloqueo TBS-T+leche (20mM Tris, 137mM NaCl, pH 7.6 + 0,1 % Tween- +
5% de leche desnatada) para evitar uniones inespecíficas. A continuación las
membranas se incubaron durante toda la noche con el anticuerpo primario pertinente
en tampón de bloqueo a 4°C. Tras 4 lavados de 15 minutos con TBS-T la membrana
se incubó durante una hora con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa
diluido en tampón de bloqueo (1:5000), a temperatura ambiente. Las proteínas se
detectaron mediante un kit de quimioluminiscencia (Santa Cruz) en un film (Kodak).
En algunos casos fue necesario visualizar bandas que migran al mismo peso
66
MATERIALES Y METODOS molecular; para ello se incubaron las membranas en tampón de stripping (2% SDS,
100mM β-mercaptoetanol, 50mM Tris ph 6.8) a 50°C al baño maría durante 20
minutos con agitación. A continuación se lavaron las membranas con abundante TBS-
T, se bloquearon de nuevo y se incubaron con el nuevo anticuerpo primario.
2.4 Ensayos de retraso de mobilidad electroforética (EMSA) Para monitorizar el estado de activación del factor de transcripción NF-κB, hemos
analizado su capacidad de unirse a ADN que contiene secuencias de unión para este
factor.
Para obtener sonda de doble cadena se incubaron cantidades iguales (1 pmol) de
ambas cadenas sencillas en un termociclador mediante el siguiente programa: 5min a
95°C, 10 min 70°C, 10min 50°C, 10 min 37°C y 10 min a 4°C. La sonda hibridada se
guardó a -20°C.
Para marcar radioactivamente la sonda, se incubaron 5µl de la solución que contenía
la sonda de doble cadena con 10 unidades de T4 polinucleótido quinasa (Fermentas)
en presencia de [32P]γATP (Perkin) en un volumen final de 10µl a 37°C durante 30
minutos. Para parar la reacción se añadieron 90µl de tampón Tris-EDTA. La
separación de la sonda marcada del exceso de [32P]γATP se consigue mediante
columnas de Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich).
Para permitir la interacciones sonda-proteína los extractos nucleares se incubaron 20
minutos a temperatura ambiente en 20µl de mix compuesto por 1µg poly dI:dC (Sigma-
Aldrich), 50mM Hepes pH 7.5, 1mM EDTA, 5% glicerol y aproximadamente 20000dpm
de sonda de doble cadena marcada con [32P]γATP. Los complejos sonda-proteína se
separaron por electroforesis durante 2.5h a 100V a través de geles de 6 % de
archilamida (BioRad). Los geles contenían tampón Tris-Borato-EDTA 0.5x y fueron
pre-corridos 30 minutos antes de ser utilizados. Una vez acabada la electroforesis los
geles se deshidrataron sobre papel Watman 30 minutos a 80°C, y se expusieron en
films (Kodak) durante 12-72h, según la intensidad de la sonda, a -80°C.
2.5 ELISA para la detección de ICAM Una vez realizados los tratamientos, se aspiró el medio de la placa de 48 pocillos y las
células se lavaron con 200ul de PBS. A continuación, se fijaron con 200ul de
paraformaldehído 4% p/v durante 15 minutos a temperatura ambiente y se lavaron 3
veces con PBS durante 5 minutos. Tras bloquear con BSA 5% en PBS durante 30
minutos a temperatura ambiente para eliminar uniones inespecíficas, las células se
incubaron durante toda la noche con el anticuerpo primario (anti-ICAM-CD54 3ug/mL,
67
MATERIALES Y METODOS Pharmingen 1A29) a 4ºC disuelto 1:200 en PBS-BSA 1%. Como control se utiliza
también un anticuerpo primario del mismo isotipo (IgG de sueron murino, Sigma) a la
misma concentración. A continuación se realizaron 3 lavados y se añadió el anticuerpo
secundario conjugado a la fosfatasa alcalina (Sigma) disuelto 1:1000 en PBS-BSA 1%
durante 1 hora a temperatura ambiente.
Tras 5 lavados con PBS, se incubaron las células en 150 ul de tampón de revelado
(400ml H2O, 48.5ml Dietanolamina, 50mg MgCl2, pH8.9) que contiene el sustrato de
la fosfatasa alcalina (Sigma) durante aproximadamente 30 minutos hasta que la
reacción se reveló. La cuantificación se lleva a cabo por espectofotometría a 450nm en
un lector de placas Bio-TeK Power-Wave XS.
2.6 ELISA MCP Tras los tratamientos se recogió una alícuota de 100 µl de sobrenadante celular, que
fue clarificada por centrifugación a 2000g , diluída 1/200 y almacenada a -80ºC. La
presencia de MCP1 en el medio se llevó a cabo mediante un kit comercial de R&D
Systems siguiendo las instrucciones del productor. El rango de especificidad del
ensayo fue de 30-2000 pg/mL.
2.7 Ensayos para determinar la actividad de las Rho-GTPasas (G-LISAS) Para medir la activación de las Rho-GTPasas, cdc42, Rac1 y RhoA se estimó su unión
al nucleótido GTP mediante un kit comercial (G-LISA Activation Assay, Cytoskeleton,
Denver, CO) siguiendo los pasos sugeridos por el fabricante. Se usaron astrocitos
primarios confluentes sembrados en placas de 60mm, que fueron incubados en medio
sin suero 24h antes del experimento. Las células fueron tratadas con los fármacos
indicados o con reconocidos activadores de Rac1 y cdc42 como el factor de
crecimiento epitelial - EGF (100ng/ml) durante 2min o de RhoA como el ácido
lipofosfatídico - LPA (10uM) 5min. Alternativamente, las células fueron infectadas con
adenovirus que inducían la sobrexpresión de mutantes CA o DN o adenovirus control
(GFP) durante 24h, seguidas de 24h adicionales de deprivación de suero. Tras los
tratamientos, las células se lavaron con PBS enfriado en hielo y se lisaron con un
scrapper en 80-100ul de tampón de lisado (suministrado por el fabricante). Los lisados
se recogieron en tubos eppendorf y fueron rápidamente clarificados por centrifugación
a 14.000rpm a 4ºC. Los lisados clarificados fueron inmediatamente congelados a –60
en isopropanol enfriado en nieve carbónica, conservándose una alícuota del clarificado
hielo para la posterior determinción de la concentración de proteína. Después de
ajustar la concentración de proteína, los lisados se descongelaron en un baño a
68
MATERIALES Y METODOS temperatura ambiente y se cargaron 50ul en una placa de unión a Rho-GTP. Estas
placas permiten la determinación del grado de activación de las diferentes Rho-
GTPasas ya que sus pocillos están recubiertos de dominios de unión a estas proteínas
(ROCK para RhoA, y PAK para Rac1 y cdc42). Pocillos adicionales se cargaron con
tampón de lisado o con proteína Rho-GTP constitutivamente activa, como controles
negativo y positivo respectivamente. La placa se colocó inmediatamente en un
agitador orbital a 400rpm a 4ºC. Tras 30min de agitación la placa fue lavada 2 veces
con 200ul de tampón de lavado e incubada durante 2 min en tampón de exposición
antigénica. A continuación se lavó tres veces y se incubó durante 45min a temperatura
ambiente con 50ul de anticuerpo primario. Después de 3 lavados adicionales se
incubó en 50ul de anticuerpo secundario ligado a peroxidasa HRP, que permite la
detección colorimétrica de los complejos unidos a la placa. Discurridos 45min de
incubación los pocillos fueron lavados 3 veces y se cargaron con 50ul de una solución
que contenía el sustrato de la peroxidasa a 37ºC durante 5-10min. La reacción
colorimétrica fue detenida con la solución de Stop 50ul y la señal medida
inmediatamente a 490nm en un lector de placas Bio-TeK Power-Wave XS-
3. Métodos de biología celular
3.1 Inmunofluorescencia Para la detección de proteínas por inmunofluorescencia de células en cultivo se
siguieron los siguientes pasos:
1) Fijación: Después de aspirar el medio a las placas de 35mm, las células se lavaron
con tampón PBS, y se fijaron con paraformaldehído durante 30 minutos a 4°C.
2) Permeabilización y bloqueo de uniones inespecíficas: Las células se lavaron dos
veces con PBS a temperatura ambiente, se incubaron 15 minutos con PBS
conteniendo el detergente tritón X-100 (Fluka) al 0,1 % v/v, luego se lavaron
nuevamente con PBS para incubarlas con BSA 1 % en PBS durante 30 minutos.
3) Incubación con el anticuerpo primario: Las células se incubaron 18 horas a 4°C
con anticuerpo/s específicos para la/s proteína/s que se desee detectar en PBS-BSA
0.01 % p/v. Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes: GFAP (Sigma; 1:500),
MCP1 (Serotech; 1:3000), ICAM (Pharmingen 1:200), iNOS (Santa Cruz FGF2
(1:1000 Transduction Labs).
4) Incubación con el anticuerpo secundario: Tras lavados (3 x 15 minutos) en PBS, las
células se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios
69
MATERIALES Y METODOS conjugados con Alexa 488 y 555 (Molecular Probes; 1:1000 en PBS-BSA 0.1% p/v)
Este paso y los sucesivos se realizaron en la oscuridad. Luego se efectuaron lavados
(3 x 15 minutos) con PBS. En algunos casos se marcaron los núcleos de las células
con DAPI (Molecular Probes). Para ello tras los 3 lavados con PBS, se realizó una
incubación de 5 minutos a temperatura ambiente con DAPI 1µg/ml disuelto en PBS.
Finalmente las células se lavaron con agua destilada para eliminar la presencia de
sales. Las células se observaron y fotografiaron en un microscopio de fluorescencia
Nikon Eclipse.
3.2 Ensayos de migración La capacidad migratoria de los astrocitos fue analizada mediante el ensayo del scratch
wound assay, que consite en generar una zona libre de células de aproximadamente
500µm de ancho en monocapa confluentes, generando un herida rascandolas con el
extremo más fino de una punta amarilla estéril. Inmediatamente después el medio fue
retirado para eliminar la presencia de células levantadas y las células se incubaron en
medio con un 1% de suero conteniendo el tratamiento durante 0, 12, 24 o 48h, tiempos
a los que fueron fijadas con paraformaldehido 4% y procesadas para la
inmunocitoquímica para GFAP/DAPI y otros. Para el análisis cuantitativo, fueron
tomadas 4-5 imágenes por condición a magnificación 2X y el área libre de células fue
medida utilizando el progama ImageJ.
Para descartar fenómenos de proliferación en el cierre de las heridas generadas, se
analizó la incorporación de BrdU en el ADN de las células. Para ello se añadió BrdU
(1ug/mL) al medio durante el ensayo en presencia o ausencia de los diferentes
tratamientos. Al finalizar los tratamientos las células fueron fijadas, tratadas con HCl
0.1M durante 30min y neutralizadas con un tampón borato 0.1M, pH 8.0 y la BrdU
incorporada se visualozó por inmunofluorescencia, con un anti-BrdU (1:100 Abcam).
4. Métodos estadísticos Los experimentos han sido repetidos como mínimo en tres ocasiones. Los
resultados de las gráficas muestran la media de los diferentes experimentos ±
la desviación estándar. Los grupos experimentales fueron comparados
mediante el análisis de la variancia con el test ANOVA seguido del test
Neuwman-Kuels post hoc. Los resultados se consideraron estadísticamente
siganificativos si p≤0,05
70
Resultados
71
RESULTADOS
Capítulo 1: JNK/ERK/FAK mediate pro-migratory actions of basic fibroblast growth factor in astrocytes via MCP1 and COX2
72
RESULTADOS
Running title: Regulation of astrocyte migration by FGF2
JNK/ERK/FAK mediate pro-migratory actions of basic fibroblast growth factor in astrocytes via CCL2 and COX2
Mathieu P. Lichtenstein1,2, José M. Madrigal3,4, Aurora Pujol5,6,7
and Elena Galea1,2,5
1. Institute de Neurociències, Universitat Autònoma de Barcelona, Spain
2. Departament de Bioquímica, Universitat Autònoma de Barcelona, Spain
3. Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad
Complutense de Madrid, Spain
4. Centro de Investigación Biomédica en Red de Salud Mental (CIBERSAM),
Spain
5. Catalonian Institute for Advanced Studies (ICREA), Spain
6. Centre de Genètica Mèdica i Molecular, Institut d'Investigació Biomèdica de
Bellvitge (IDIBELL), Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spain.
7. Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras
(CIBERER), Spain
Corresponding autor: Mathieu P. Lichtenstein
Institut de Neurociències
Key words: Astrocyte, basic fibroblast growth factor (FGF2), c-jun N-terminal kinase
(JNK), cytoskeleton, extracellular-signal regulated kinase (ERK), focal adhesion kinase
(FAK), intercellular adhesion molecule (ICAM) migration, monocyte chemo attractant
protein (CCL2), cyclo-oxygenase 2 (COX2) .
73
RESULTADOS
ABSTRACT
While the role of cytokines in causing pro- and anti-inflammatory cascades in the brain
and that of chemokines in promoting chemotaxis is well recognized, the
immunomodulatory actions of neurotrophins released during brain injury remains
largely undetermined. This knowledge gap affects basic fibroblast growth factor, or
FGF2, which in the brain is mainly produced by astrocytes and characteristically
upregulated in reactive astrocytes. The goal of this study was to characterize the
inflammatory actions of FGF2 in astrocytes using primary cultures. We report that
FGF2 induced the upregulation of monocyte chemoatractant protein (CCL2) and
cycloxygenase type 2 (COX2), and the inhibition of lipopolysaccharide-elicited ICAM1
upregulation. The effects of FGF2 were: i) dependent on gene transcription as revealed
by the concomitant regulation of CCL2 or ICAM1 mRNAs, ii) mediated by the FGF2
receptor type 2 (gene silencing approach), iii) dependent on ERK, JNK and FAK
(pharmacological modulations), and iv) NFkappaB-independent (electrophoresis
mobility shift assays). FGF2 also caused accelerated wound closure dependent on
CCL2, COX2, ERK, JNK and FAK in a scratch assay. We conclude that the signaling
network triggered by FGF2 in astrocytes converged into accelerating directed motion. It
follows that astrocyte migration to injury sites may be a key factor in the repair
mechanisms orchestrated by FGF2.
74
RESULTADOS
INTRODUCTION
Basic fibroblast growth factor, or FGF2, is a ubiquitous and versatile peptide that
regulates cell proliferation, migration, cell survival and differentiation during
development, tissue repair or tumor growth. FGF2 is produced in several isoforms
ranging between 18-34KD that are produced by alternative use of two initiation codons
at translation [1]. The low molecular weight (LMW) isoform (18KD) is secreted [2,3] by
a mechanism implicating multidrug resistance-associated proteins [4] and Na+/K+-
ATPase [4,5], and accounts for most of the biological functions attributed to FGF2 by
acting through membrane-spanning tyrosine kinase receptors in conjunction with low
affinity binding to heparin sulfate proteoglycans [6]. In addition, LMW-FGF2 can exert
nuclear actions upon internalization - alone or in complex with its receptors - and
subsequent import to the nucleus [7-10]. Specific proteins like translokin [11], or
importin [12] mediate the intracellular trafficking of FGF2 and FGFR1, respectively. By
contrast, high molecular weight (HMW) FGF2 isoforms (21-25KD) are localized in the
nucleus and cytoplasm and their function remains largely unknown, although some
reports point to an implication in cell growth control [13,14].
In the brain, FGF2 is a regulator of processes leading to tissue repair and
regeneration after injury including scar formation [15], angiogenesis [16], neuronal
survival [17], and recruitment of neuronal progenitors [18]. An often underappreciated
fact in FGF2-dependent repair is that astrocytes are the primary source of the factor
and, indeed, overexpression of FGF2 in reactive astrocytes is a hallmark of brain injury
[18-21]. The terms “reactive astrocytes” or “gliosis” define the cellular hypertrophy that
astrocytes undergo as part of the inflammatory reactions that follow brain injury,
infection or degeneration. While the post-injury increase of FGF2 expression in
astrocytes suggests a role of the factor in driving astrogliosis, it has never been
examined whether FGF2 controls astrocyte inflammatory responses and, if so, what
precise molecules and pathways are involved. A hint is provided by a preliminary study
wherein the effect of axonal injury-associated factors in astrocyte migratory response
was tested in a model of scratch injury in cultured astrocytes. LMW-FGF2 strongly
stimulated astrocyte migration and this response was the greatest among all factors
tested, which included transforming growth factor β (TGF-β), epidermal growth factor
(EGF) and insulin-like growth factor (IGF) [22]. Here we sought to further characterize
the FGF2-elicited immunomodulation of astrocytes by focusing on the expression of
molecules with documented ability to regulate migration. These were monocyte
75
RESULTADOS
chemoattractant protein (CCL2, formerly called MCP1), cyclooxygenase 2 (COX2), and
intercellular adhesion molecule 1 (ICAM1). CCL2 is a potent chemoattractant and
activator for monocytes, and is primarily expressed in astrocytes in ischemia and after
peripheral administration of bacterial lipopolysaccharide (LPS) [23]. CCL2 plays a
critical role in the migration of newly formed neuroblasts from neurogenic niches to
damaged regions of the brain after focal ischemia [24]. ICAM1, in addition to its well
established control of leukocyte adhesion and migration across the blood-brain barrier
[25,26], is expressed in astrocytes in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative
diseases [27], where it is believed to contribute to microglia recruitment [28]. COX2, in
turn, is expressed in reactive astrocytes in neuropathological conditions [29,30], and a
wealth of evidence documents the capacity of COX2-released prostaglandins to
increase cancer-cell motility [31,32]. The role of COX2 in astrocytes is, however,
largely unknown. Lipopolysaccharide (LPS) was used as a positive control of
inflammatory activation in astrocytes. We report that LMW-FGF2 stimulated the
expression of CCL2 and COX2, whereas it decreased the LPS-induced ICAM1
expression, in astrocytes cultured from rat cerebella. FGF2 accelerated astrocyte
migration in a scratch model in vitro, the effect being mediated by CCL2 and COX2 but
not ICAM1. The actions of FGF2 were mediated by the FGF2 receptor type 2 (FGFR2)
and JNK/FAK/ERK-dependent signaling. Cell proliferation did not contribute to this
phenomenon because inhibitors of cell growth had no effect. We conclude that FGF2
induces a pro-migratory phenotype in astrocytes, which may be a key factor in the
repair mechanisms orchestrated by FGF2 during brain injury.
76
RESULTADOS
MATERIAL AND METHODS
Materials
Recombinant human FGF2 was purchased from R&D Systems. Dulbecco’s modified
Eagle’s medium (DMEM), penicillin, streptomycin, paraformaldehyde, Triton X-100,
bovine serum albumin (BSA), cytosine-arabinoside, LPS, 4',6-diamidino-2-phenylindole
(DAPI), phosphatase inhibitors, mouse anti-actin (1/10000) antibody, rabbit anti-FGFR1
and anti-FGFR2 (1/500), mouse anti-GFAP antibodies were obtained from Sigma.
Protease inhibitors, PVDF membranes and Light Cycler capillaries were from Roche.
Reverse transcriptase and Taq Polymerase were purchased from Invitrogen. Foetal-
bovine serum (FBS) was from Cambrex. Anti-COX2 (1/1000) rabbit polyclonal antibody
was from Cayman. Anti-CCL2 (1/500) rabbit polyclonal antibody was from Abcam. Anti-
ICAM1 (CD54, clone 1A29) mouse monoclonal antibody and isotype matched IgG1
were purchased at BD Pharmingen. Primers and NFkappaB oligonucleotides were
synthesized by Roche. Rabbit monoclonal antibodies against ERK1/2 and phospho-
ERK (pERK), JNK1/2 and phospho-JNK (pJNK), FAK and phospho-FAK (Tyr 397)
were from Cell Signaling (all used a 1/1000 dilution). Viral particles encoding shRNA for
FGFR2, and GFP, and rabbit anti-FGFR3 antibody were from Santa Cruz
Biotechnology. ERK (PD98059), JNK (SP600125) and FAK (PF573228) inhibitors were
from Tocris.
Astrocyte cultures
Astrocyte cultures were prepared from cerebellum from 7-8 day-old Sprague-Dawley
rats as described [33]. In brief, rats were decapitated and brains immediately dissected
out. After meninges and blood vessels were removed, the tissue was minced and
incubated for 10 min at 37 °C in Ca2+-free Krebs-Ringer buffer containing 0.025 %
trypsin. Cells were then mechanically triturated through a glass pipette and filtered
through a 40 μm nylon mesh in the presence of 0.52 mg/ml soybean trypsin inhibitor
and 170 IU/ml DNase. After centrifugation (500 x g), cells were stained by Trypan Blue
exclusion and counted in a Neubauer chamber and then resuspended in 90% DMEM,
10% FBS, 20 U/ml penicillin and 20 µg/ml streptomycin at 6x105 cells/ml. The dishes
used for each experiment were: 35-mm dishes for immunofluorescence and migration
experiments, 48-well plates for ELISAS, 100-mm plates for Western Blot 60mm and
EMSA. The cells were maintained in a humidified atmosphere of 90 % air-10 % CO2.
77
RESULTADOS
The medium was changed at day 7, and the cells were immediately used when
cultures reached confluency (around 12 DIV). This minimizes contamination by
microglia, which rapidly proliferate when the astrocyte monolayer reaches confluency
[33]. To quantify microglia, cultures were incubated with DiL-Ac-LDL (Molecular
Probes) 10µg/ml for 2h, which is readily taken up by microglia ((Hao and Fedoroff
1991)), and counterstained with DAPI to label nuclei thereby obtaining the total number
of cells. The percentage of DiL-Ac-LDL-positive cells/total number of cells was 10.74%
± 4.09 (n=4).
The medium was changed to 1 % FBS-DMEM overnight before treating cultures with
different compounds for the indicated times and concentrations to minimize cell
proliferation. Cerebellar granule cells were obtained by the same protocol as astrocytes
but were seeded at 1.3x106 cells/ml in the same culture media as astrocytes. At day 1
in vitro, cytosine arabinoside (10 µM) was added to prevent glia proliferation. Cell lines
3T3s, HeLa and SH-SY5Y were passaged every 3-4 days and cultured in 90 % DMEM,
10 % FBS, 20 U/ml penicillin and 20 µg/ml streptomycin, except for SH neuroblastoma
that were cultured in 20 % FBS.
Immunocytochemistry
Cultures were fixed for 30 min with 4 % paraformaldehyde in phosphate buffered saline
(PBS) at room temperature. After several washes, the monolayers were incubated with
PBS-0.1% Triton X-100 for 15 min to permeabilize cells. This permeabilization step
was omitted in the case of ICAM as this protein is extracellular. Blockade of non-
specific binding was performed with 1 % BSA in PBS, and afterwards cells were
incubated overnight at 4 ºC with mouse monoclonal anti-GFAP (1/1000), rabbit anti-
CCL2 (1/3000), anti-COX2 (1/500) or anti-ICAM1 (1/200) antibodies in 0.1 % BSA-
PBS). After washing, cells were incubated for 1 h with Alexa labeled secondary IgGs
diluted 1/1000 in 0.1 % BSA-PBS. The primary antibody was omitted in controls. In the
last wash, cells were incubated with DAPI to perform nuclear staining.
CCL2 ELISA
After indicated treatment, CCL2 levels in the culture medium were assessed using an
ELISA specific for rat CCL2 according to manufacturer ´s instructions (R&D systems).
The assay detection limits were 30-2000 pg/mL
78
RESULTADOS
Whole-cell ELISA ELISAs were performed as thoroughly described elsewhere [34]. In brief, the cells were
fixed with 4 % paraformaldehyde in PBS, and incubated overnight with a monoclonal
antibody against rat ICAM1 (clone 1A29, Pharmingen, concentration: 3 μg/mL).
Isotype-matched IgG1κ (Pharmingen) was used at the same concentration as the
negative control. The cells were finally incubated with a goat anti-mouse antibody
conjugated to alkaline phosphatase (1:1000, Sigma). The alkaline phosphatase
substrate was added, and the cells incubated at room temperature until the reaction
developed. The OD405 was measured in a Bio-TeK Power-Wave XS microplate
spectrophotometer.
Real Time PCR Total RNA was prepared from cells using the trizol reagent (GIBCO); aliquots (0.5 to
1.0 μg) were converted to cDNA (SuperScript II, Invitrogen) using random hexamer
primers, and mRNA levels estimated by real time, quantitative RT-PCR (Q-PCR). The
primers used were: CCL2 fwd: 5’- CTTCTGGGCCTGTTGTTCAC-3’, CCL2 rvs: 5’-
GGGACGCCTGCTGCTGGTGATTC-3’; ICAM1 fwd 5’- GGGCCCCCTACCTTAGGAA-
3’, ICAM1 rvs 5’- GGGACAGTGTCCCAGCTTTC-3’; 18S fwd 5’-
GGGAGGTAGTGACGAAAAATAACAAT-3’, 18S rvs 5’-TTGCCCTCCAATGGATCCT-
3’ Q-PCR cycling conditions were: 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 s,
annealing at 58 °C for 30 s, and extension at 72 °C for 30s, followed by 2 min at 72 °C,
in the presence of SYBR Green (1:10,000 dilution of stock solution from Molecular
Probes, Eugene, OR). Reactions were carried out in a 20 µL reaction volume in a Life-
cycler (Roche). Relative mRNA concentrations were calculated from the take-off point
(Ct) of the PCR reactions, and normalized for the levels of 18S ribosomal RNA using
the software provided by the manufacturer. Correct product amplification was
confirmed by the existence of a single melting point in melting curve analysis, and by
size determination using 2 % agarose gel electrophoresis.
Preparation of cytosolic and nuclear extracts
After treatment, the cells were scraped out of the plates in ice-cold PBS, collected by
brief centrifugation, resuspended in buffer A containing 10 nM HEPES pH 7.9; 1.5 mM
MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM dithiothreitol and a cocktail of protease (Roche) and
phosphatase (Sigma) inhibitors. Nonidet P-40 was added (final concentration 0.6 %)
79
RESULTADOS
and the cells vortexed for 10 seconds. The nuclei were collected by brief centrifugation
in a microcentrifuge, and the supernatants kept at –80 oC as cytosolic extracts. The
nuclei were washed once with buffer A and collected again by centrifugation. Nuclear
extracts were obtained by incubating nuclei in buffer B (20 mM HEPES buffer pH 7.6,
25 % glycerol, 420 mM NaCl, 0.2 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), 0.5 mM
dithiothreitol, and protease and phosphatase inhibitors) at 4 oC for 30 min with gentle
rocking. The suspensions were centrifuged at 15000 xg for 15 min at 4 oC, and the
supernatants stored at –80 oC. Protein concentrations were measured by the Bradford
method.
Western blot
Samples containing equal amounts of protein (15-30 µg) were subjected to sodium
dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) on 8-15 %
gradient gels. The proteins were then transferred to polyvinyl difluoride membranes,
which were blocked with 5% milk in Tris-buffered saline (TBS) containing 0.1% Tween-
20 for 1 h, and incubated overnight at 4 ºC with primary antibodies (indicated in
Materials). This was followed by incubation with anti-IgG-horseradish peroxidase-
labelled secondary antibodies (Pierce, 1/10000) for 1 h at room temperature and
subsequent detection with an enhanced chemiluminescence detection kit (ECL,
Amersham Life Science). Proteins were visualized by autoradiography on X-ray film
(AGFA). Relative band intensity was quantified with Image J (National Institutes of
Health).
Electrophoretic mobility shift assays
Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were performed as thoroughly described
previously [34]. In brief, the NFkappaB oligonucleotides corresponding to the
palindromic consensus sequences were end-labeled with 10 μCi [γ32P ATP
(Amersham*) with 10U T4 polynucleotide kinase (Fermentas) and purified in G-25
sephadex columns (Sigma). Nuclear extracts (5-10 μg protein) were incubated with
radiolabeled oligonucleotides in a final volume of 20 μl in the presence of 1 μg poly
dIdC, 20 mM HEPES buffer pH 7.9, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 100 mM NaCl and 0.5
mM dithiothreitol. DNA-protein complexes were resolved by electrophoresis in 4 % non
80
RESULTADOS
denaturing polyacrylamide gels using 0.5 x Tris-Borate-EDTA as the running buffer.
Autoradiographs were obtained by placing dried gels in close contact with films
(AGFA).
Retroviral infection
Viral particles encoding for rat shRNA FGFR2 were purchased from Santa Cruz
Biotechnology. Pre-confluent cultures (DIV 6-7) were infected with 2x104 retroviral
particles per ml overnight in 10% FBS containing DMEM, and were grown for 7 days to
confluency to permit integration and expression of shRNAs. The efficiency of FGFR2
silencing was confirmed by Western Blotting. GFP-expressing (Santa Cruz) viruses
were used as a control for efficient infection.
Scratch wound assay
The capacity of astrocytes to migrate was tested by scratching confluent astrocyte
monolayers to induce natural cell migration to close the scratch, as previously reported
[35]. The scratch was 500 µm in width and 35 mm in length, and was done with a
sterile yellow pipette tip. The cells were treated immediately after scratching, and
pharmalogical inhibitors, when indicated, were present the entire time. In some cases
blocking/activating antibodies were used as follows: anti-CCL2 4µg/ml, anti-ICAM1
10µg/ml, and unspecific isotype-matched IgG1 antibody (as control) 10µg/ml, which
were also present during the entire length of migration experiments. The cells were
fixed at 0-24 h thereafter, and immunostained for GFAP/DAPI, and/or COX2, CCL2 or
ICAM. Individual images (6 per scratch-wound) were taken with the 2 x magnification
lens, and the cell-free area was measured using ImageJ Software.
Statistical analysis
Experiments were always reproduced a minimum of 3 times. Quantifiable
determinations were expressed as means ± SEM of the indicated number of
experiments performed in independent cultures. Significance of differences was
evaluated by one-way ANOVA followed by the Newman-Keuls posthoc test when more
than 2 conditions were evaluated.
81
RESULTADOS
RESULTS
FGF2 modulated the expression of CCL2, ICAM1 and COX2 in astrocytes The joint evaluation of CCL2 by ELISAs of culture media (Fig. 1A, B, C),
immunocytochemistry (Fig.1D), western blots of whole cells (Fig. 1E), and RT-PCR
(Fig. 1F) indicated that FGF2 caused expression of the CCL2 gene and protein, and
the release of the latter to the extracellular media. CCL2 was barely detectable in
control cells by any approach. The increased CCL2 expression appeared to derive
from de novo synthesis as judged by the robust perinuclear immunolabeling in the
Golgi apparatus (Fig. 1D). The effect of FGF2 was time- and dose-dependent (Fig. 1A,
B). CCL2 was thus detected in the extracellular media as early as 6 h after the
administration of FGF2, and the chemokine contents increased progressively up to 48
h, the last time analyzed. When assessed at 24 h the extracellular CCL2 increased
linearly upon exposure to 5-100 ng/mL FGF2. The factor was hence used in the
ensuing experiments at the submaximal dose of 25 ng/mL. Overall, the ELISAs
appeared more sensitive than western blots to quantify CCL2 production. Plausibly, the
secretion of newly synthesized CCL2 diminishes the intracellular pool detected by
western blot. Considering that FGF2 is produced in the brain during the inflammatory
reactions that follow injury, we also examined whether the increased production of
CCL2 was enhanced when provoking a standard inflammatory condition by LPS. As
previously reported [36] LPS caused expression of CCL2 gene and protein in
astrocytes (Fig. 1C, E, F). LPS moderately increased the FGF2-elicited expression of
CCL2, indicating additive rather than synergistic actions of both factors. The combined
effect was evident at early (i.e. 5-12 h) but not late (i.e. 48 h) treatment times (Fig. 1C,
E, F) suggesting a detrimental effect of excess co-stimulation.
FGF2 also caused the transient expression of COX2 in astrocyte cultures (Fig.
2) with a peak at 8 h, as revealed by western blot (Fig. 2A). The immunocytochemical
analyses confirmed that the increased expression originated in astrocytes and
revealed, surprisingly, that part of COX2 was localized to the nucleus (Fig. 2C),
suggesting heretofore undescribed nuclear actions of the enzyme. Of note, FGF2
caused a morphological change in astrocytes consisting in soma retraction followed by
process emission. The change, which has been previously reported and characterized
[37], was clearly established 8 h after the addition of the factor. As compared with
82
RESULTADOS
FGF2, LPS caused a more sustained increase of COX2 expression, and potentiated
the effect of FGF2 (Fig. 2B).
Cells displayed a slight basal expression of ICAM1, detected by both ELISA
(Fig. 3A) and immunocytochemistry, which revealed that ICAM was localized to cell-to-
cell contacts following a pattern reminiscent of a beehive (Fig. 3C). FGF2 had no effect
per se on ICAM1 expression, although it completely inhibited the increase of ICAM1
mRNA and protein caused by LPS (Fig. 3B, C). So far, the data indicated that FGF2
can exert both pro- or anti-inflammatory actions in astrocytes, and that the anti-
inflammatory effects (i.e. ICAM1 down-regulation) were only manifest when additional
inflammatory stimulation was performed as with LPS.
ERK, JNK and FAK but not NFkappaB mediated the immunomodulatory actions
of FGF2
FGF2 has been reported to activate numerous signal transduction pathways including
MAPK (ERK, JNK, p38), PKC, PI3K-Akt, PKA, PKG, and calcium-calmodulin kinase IV
[38]. We sought proof of the participation of these kinases by determining: i) whether
specific inhibitors reversed the immunomodulatory actions of FGF2, using CCL2 as the
endpoint in preliminary screens, and ii) if FGF2 stimulated the pathways, which was
assessed by western blot analyses. Both requirements were only met by ERK and
JNK, as documented below, while pharmacological inhibitors of p38, PKC, Akt, PKA or
PKG had no effect (data not shown). Inhibitors of ERK (PD98059), and JNK
(SP600125) completely inhibited the increase in CCL2 release (Fig. 4A), and reversed
the inhibition of ICAM1 caused by FGF2 back to “LPS-plus-inhibitors” controls (Fig.
4B). Of note, these values were slightly reduced as compared with the ICAM1
expression attained with LPS alone (Fig. 4B). FGF2 caused the phosphorylation of
both ERK and JNK, which was detected as early as 1 h after the administration of the
factor and persisted over the next 5 h (Fig. 4C). Interestingly, LPS caused a small,
barely detectable increase of pERK and pJNK, and did not alter significantly the
increases elicited by FGF2 (Fig. 4C). This is in accordance with the small inhibitory
effect of ERK and JNK inhibitors detected in the LPS-elicited ICAM up-regulation. By
contrast, EMSA analysis showed a strong and long-lasting activation of NFkappaB
upon LPS administration (Fig. 4D). NFkappaB was thus present in the nucleus of LPS-
treated astrocytes as soon as 30 min after treatment (data not shown), and remained
activated for at least 48 h. FGF2 neither activated NFkappaB per se nor it interfered
83
RESULTADOS
with the LPS-mediated activation of the transcription factor. The immunomodulatory
effects of FGF2 were hence NFkappaB independent. Overall, the data support the
notion that immunomodulatory regulation by LPS and FGF2 encompasses different
signaling pathways. Finally, the JNK inhibitor SP600125, but not the ERK inhibitor
PD98059, completely abrogated COX2 expression, indicating a role of JNK but not
ERK in the upregulation of COX2 by FGF2 (Fig. 5A).
Because studies exist documenting a strong interplay between ERK and FAK in
directed cell movement [39], we also examined the role of FAK in the
immunomodulatory effects of FGF2. The FAK inhibitor PF573238 completely inhibited
COX2 (Fig. 5A) and CCL2 (Fig. 5B) up-regulation, and reversed the inhibition of ICAM1
up to the “LPS-plus-PF573238” control (Fig. 5C). Accordingly, FGF2 caused activation
of FAK, as judged by the increased pFAK, which was clearly detected 4 h after the
addition of the factor and lasted for the ensuing 48 h (Fig. 5D). We next examined the
possible interplay between ERK, JNK and FAK by testing the effect of pharmacological
inhibitors on kinase phosphorylations at 4 h after the administration of FGF2.
PF573238 completely inhibited ERK and JNK stimulation, whereas SP600125
completely inhibited FAK and ERK (Fig. 5E). By contrast, PD98059 inhibited JNK but
not FAK (Fig. 5E), indicating that ERK is downstream of the other two kinases. A model
reconciling these findings is depicted in Fig. 8.
FGFR2 mediated the immunomodulatory actions of FGF2
We next sought to identify the FGF2 receptor involved. We first determined whether
astrocytes expressed FGFR1, FGFR2 or FGFR3 by western blot analysis. Cerebellar
granule cells (CGCs), C6 glioma, SHSY-5Y neuroblastoma, Hela and NIH3T3 cell lines
were used as positive controls. FGFR3 was highly expressed in C6, SHSY-5Y, Hela
and NIH3T3 while FGFR1 was detected in C6 glioma and NIH3T3, and FGFR2 only in
NIH3T3 (Fig. 6A). Of the three receptors, only FGFR2 was detected in astrocytes (Fig.
6A), where it appeared, in blots, as two differently-migrating bands that apparently
arise from receptor glycosylation [40, 41]. Interestingly, exposure to FGF2 caused
FGF2R to transiently disappear within 6-12 h after the addition of the factor (Fig. 6B).
Analysis of FGFR2 expression in cytosolic and nuclear fractions indicated that the
receptor did not migrate to the nucleus (Fig. 6C). The finding supports instead that the
receptor was degraded after the exposure of astrocytes to FGF2.
84
RESULTADOS
Overall, the results pointed to FGFR2 as the receptor mediating the
immunomodulatory effects of FGF2 in astrocytes. To establish this further, we tested
whether astrocytes became unresponsive to FGF2 when obliterating FGFR2
expression by RNA interference. Activation of ERK and JNK pathways - assessed by
the phosphorylation of the kinases - was used as the endpoint. Lentivirally-induced
expression of FGFR2 shRNA in astrocytes reduced the expression of FGFR2, hence
validating the gene silencing approach (Fig. 6D). FGFR2 shRNA inhibited the activation
of ERK and JNK by FGF2 (Fig. 6E).
FGF2-mediated migration
FGF2 has been shown to promote migration of astrocytes in a scratch-wound injury
[22]. Here, we sought to establish whether the signaling pathways described above
play a role in this phenomenon. First, we confirmed that FGF2 accelerated scratch
closure (Fig. 7A). The effect was not due to cell proliferation because the proliferation
inhibitor cytosine arabinoside had no effect (Fig. 7A). Rather, increased astrocyte
polarity appeared to account for the acceleration, as revealed by the long protruding
edges assembled in parallel in FGF2-treated astrocytes (Fig. 7B). We next tested the
implication of the pathways regulated by FGF2 by interfering with their actions. We thus
inhibited ERK, FAK, JNK and COX2 with the pharmacological inhibitors PD98059,
PF573238, SP600125, or NS398, respectively. Specific antibodies were used to block
the released CCL2 [42] or to stimulate ICAM1 [26], thereby reversing the dual, opposite
actions of FGF2 on chemokine and adhesion molecule expression. The increased
migration was completely abrogated by ERK, FAK and JNK inhibitors (Fig. 7C).
Likewise, blockade of CCL2 or COX2 reversed the increased migration with no effects
on controls (Fig. 7D). By contrast, the antibody against ICAM1 had no effect (Fig. 7D).
In accordance with the effects of pharmacological inhibitors or modulatory antibodies,
robust CCL2 and COX2 upregulation was detected in FGF2-treated astrocytes all over
the cultures, not just near the migration fronts (Fig. 7E), whereas no change was
observed for ICAM1 expression (data not shown). Note that the picture in 7E was taken
at 6 h after the administration of FGF2 to facilitate detection of intracellular CCL2, at
which time the morphological changes produced by the factor or the injury are not very
pronounced yet. Incidentally, LPS had no effect on astrocyte migration (data not
shown).
85
RESULTADOS
DISCUSSION
We have shown here that LMW-FGF2 induced the upregulation of CCL2 and COX2 in
astrocytes, while it completely antagonized the upregulation of ICAM1 caused by LPS.
The data thus support an immunomodulatory rather than a pro-inflammatory or anti-
inflammatory role of FGF2 in astrocytes.
To date, four similar, high affinity fibroblast growth factor receptor (FGFR)
genes have been identified from several species [43]. FGFR1-3 are widely expressed
in the adult brain and show different cellular locations depending on the region [44].
FGFR1 is abundant in cortex, hippocampus and cerebellum, while FGFR2 is amply
expressed in olfactory bulb, hippocampus, and cerebellum [45]. Cell-wise, FGFR1 is
predominantly expressed in neurons, while FGFR2 and FGFR3 are mainly present in
astrocytes [46,47]. FGFR4, by contrast, is only expressed in early stages of
development and, with the exception of the lateral habenular nucleus, is not detectable
in the adult brain [48]. In the cerebellar astrocytes used for the present study we
detected FGFR2, but not FGFR1 or 3, indicating that FGFR expression in astrocyte
cultures is region specific, that it closely mirrors the distribution described in vivo, and
that FGFR2 is therefore the receptor type candidate accounting for the observed
actions of FGF2. Accordingly, silencing FGFR2 expression by RNA interference led to
blockade of ERK and JNK, the uppermost mediators of FGF2 signaling.
The FGFR1-4 genes encode for structurally similar peptides containing an
extracellular domain of three immunoglobulin-like domains, a transmembrane domain,
and an intracellular tyrosine kinase domain. Cells also exhibit low-affinity FGF-binding
sites composed of heparin sulphate proteoglycans [6], which enhance the stability of
FGF2-FGFR complexes. Binding of FGF2 to FGFR results in receptor dimerization and
autophosphorylation at tyrosine residues. It has been reported that, after binding of
FGF2 to FGFR1, the FGF2-FGR1 complex translocates to the nucleus [49,50], where it
initiates several signalling pathways leading to differentiation and proliferation [8,51].
Nuclear trafficking of FGF2 and FGFR1 in neurons and astrocytes is indeed a hallmark
of injury in the adult brain cortex [19,20]. However, we found no evidence in the present
study that the effect of LMW-FGF2 via FGFR2 involved nuclear actions of the receptor.
Western blot analyses showed no signs of nuclear translocation of FGFR2. Rather, a
most striking phenomenon was the transient disappearance of FGFR2 in FGF2-
stimulated cells, unveiling an inhibitory feedback controlling FGF2-dependent signaling
in astrocytes. A comparable phenomenon has been reported in NIH 3T3 cell lines [52],
86
RESULTADOS
wherein FGFR internalization followed by degradation leads to receptor
desensitization. It appears overall that a cell membrane rather than a nuclear FGFR2
accounts for the immunomodulatory actions of LMW-FGF2 in cerebellar astrocytes.
In contrast to FGFR1, the best characterized FGFR, little is known about the
intracellular signaling of FGFR2. For FGFR1, a wealth of evidence documents the
activation of three major pathways: phospholipase C/PKC, Ras/MAPK (including ERK,
JNK and p38), and PI3K/AKt (for review [53,54]). While these intracellular signaling
cascades have not been confirmed for FGFR2, it is believed that, owing to the strong
structural resemblance, the signaling pathways driven by different FGFRs are very
similar. Studies with chimeric receptors composed of cytoplasmic domains of FGFR1-4
indeed suggest that the main difference among FGFRs is the strength of tyrosine
kinase activity and not the target proteins [55]. No report exists about FGF2 regulating
FAK. Since FAK is a key molecule in cell migration (see below), this knowledge gap is
consistent with the lack of attention that FGF2 has received as a migration modulator
thus far.
We have shown that FAK, JNK and ERK mediate the regulation of CCL2 and
ICAM1 by FGF2, while FAK/JNK mediate that of COX2. Downstream effectors remain
to be identified, although our data rules out the participation of NFkappaB. While a
precedent exists of activation of ERK-dependent pathways by FGFR2 [56], the
inhibition and not the activation of JNK is involved in the FGF2-mediated protection of
myocardial cells from ischemia [57]. This suggests that cells, and not receptors, instruct
the particulars of FGF2-elicited signaling. All in all, the data reveal that the various
kinases regulating FGF2-mediated immunomodulation interact in a rather complex
manner. First, there is gene specificity since ERK regulated CCL2 and ICAM1 but not
COX2. Second, depending on the target gene, kinases can play both stimulatory (e.g.
CCL2 and COX2) and inhibitory (e.g. ICAM1) roles. Third, examination of hierarchic
arrangements with pharmacological kinase inhibitors suggest the existence of intricate
feedback loops whereby there is reciprocal regulation of ERK-JNK, and FAK-JNK,
while FAK stimulates ERK but not the opposite. A schematic consistent with these
observations is provided in Fig. 8. In brief, FGF2 would regulate two intertwined kinase
loops in astrocytes. One would encompass JNK and ERK and lead to the stimulation of
CCL2 synthesis and release, and to the inhibition of the LPS-dependent ICAM1
regulation. A second loop would implicate FAK and contribute to: i) CCL2 and ICAM1
modulation via ERK/JNK, and ii) ERK-independent COX2 up-regulation. The delayed
and more long-lasting FAK activation with respect to ERK and JNK - as assessed by
87
RESULTADOS
kinase phosphorylation - suggest a maintenance function of FAK in FGF2
immunomodulatory signaling.
The adaptor protein FAK recruits proteins that regulate the turnover of focal
adhesion assemblies during cell migration [58, 59]. The higher the turnover of focal
adhesion assemblies the faster the cell moves. FGF2 has been reported to induce
focal adhesion disassembly in brain capillary endothelial cells thus leading to FGF2-
directed chemotaxis [60]. The central role of FAK in the FGF2-mediated
immunomodulation described in the present study suggests that, like in endothelial
cells, the factor may coordinate directed motility in astrocytes through promoting focal
adhesion disassembly. Indeed, focal adhesions may contain FGFR [61].
Within focal adhesions, FAK is activated upon ligation of integrins to the
extracellular matrix. Integrins, in turn, have been reported to down-regulate ICAM1
expression via FAK [62], suggesting that migration requires the down-regulation of this
adhesion molecule. It was therefore not surprising at first that FGF2 decreased ICAM1
expression while increasing migration via CCL2, all phenomena depending on FAK.
We even reasoned that stimulating ICAM1 activity with an anti-ICAM1 antibody would
reverse the pro-migratory actions of FGF2 but, unexpectedly, the antibody had no
effect, indicating that the decrease in ICAM1 expression did not contribute to the
observed accelerated movement. We speculate that CCL2 and ICAM1 may embody
distinct functions of cell adhesion during astrocyte migration upon injury. One is the cell
movement along chemotactic gradients, which involves highly controlled cycles of
adhesion/de-adhesion to the extracellular matrix. Another is the recognition of and the
cross-talk with locally activated immune cells, namely microglia. The scratch injury
model used in the present study may hence simulate chemotaxis, but not the full range
of post-injury immune reactions.
The notion that migration is an integral part of the post-injury inflammatory
response in astrocytes has not been recognized, nor the molecular mechanisms
dissected out until recently. Thus, it has been reported that TGFβ, tissue plasminogen
activator (tPA), and endothelin stimulate astrocyte migration through metalloprotease 9
(MMP9) [63,64,65]. The pro-migratory actions of tPA requires COX2, too [64], where
those of endothelin involve the nitric-oxide mediated tyrosine nitration of MMP9 [65].
Our study implicates CCL2 and COX2 in the autocrine regulation of astrocyte
migration. While CCL2 is a paradigmatic chemotactic agent acting via its receptor
CCR2, the mechanisms underlying the pro-migratory actions of COX2 remain
88
RESULTADOS
undetermined, although they may involve the interaction of the prostaglandin E2 with
receptor EP1 [66].
Future research will further clarify the molecular signaling guiding astrocyte
migration, but for the time being it is worth stressing two ideas. One, that the signaling
and the derived effects will strictly depend on the stimulating agents. Our data show,
for example, that the robust CCL2 expression caused by LPS in astrocytes is not
associated with accelerated motion as with FGF2, or that NFkappaB does not mediate
the effects of FGF2, which is at variance with the reported implication of the
transcription factor in the pro-migratory actions of TGFβ [63]. Two, that Rho-GTPases,
which play a key role in directed movement in astrocytes by guiding cytoskeleton
remodeling [67,68], are plausible downstream targets of CCL2 and COX2-produced
prostaglandins.
It is widely believed that FGF2 is a key regulator of the wounding response in
the adult brain. Protective and regenerative effects of FGF2 have been described in
brain ischemia [69-71], and spinal cord injury [72, 73]. Plausibly, multiple functions
relating to neurons, microvasculature and glia are involved in the beneficial actions of
FGF2, but the exact mechanisms of protection are yet unclear. Likewise, while reactive
astrocytes over-expressing FGF2 and FGFRs are an indisputable hallmark of brain
injury [18, 20], the role and consequences of astrocyte reactivity are ill-defined. In fact,
a widespread misconception in the neuroinflammation field is to ascribe roles, generally
deleterious, to astrocytes or microglia based exclusively on morphological changes.
The existence of a complex, temporally evolving, disease-specific functional
heterogeneity in glia after brain injury remains to be fully recognized and characterized.
This knowledge void also affects the astrocytes rendered “reactive” by the in vivo
injection of FGF2 to the site of a brain injury [74, 75]. Here we posit that migration of
reactive astrocytes to injury sites and eventual formation of a glia limitans lead to repair
and tissue regeneration. Recent evidence indeed challenges the prevailing view that
astrocyte scars impair tissue repair by hindering axon growth. First, scars are dynamic,
highly regulatable proteoglycan networks whose composition can, by controlling the
activity of signaling molecules like FGF2, render the microenvironment conducive for
axon regeneration [76]. Second, astrocyte scars lead to the compaction of microglia
and macrophages within necrotic areas thereby preventing inflammation-derived
secondary damage [77]. In this study, we have unveiled molecules and signaling
pathways contributing to astrocyte migration. Additional molecular profiling of the
astrocyte phenotype induced by FGF2 will aid progress towards the understanding,
89
RESULTADOS
and ultimately the therapeutical utilization, of the repair capability of FGF2 through
increasing migratory ability of astrocytes in the injured brain.
90
RESULTADOS
FIGURE LEGENDS
Figure 1. FGF2 induced CCL2 expression in astrocytes. A-C) ELISA measurements
of CCL2 in extracellular media: (A) dose response; (B) time course; (C) effect of LPS;
D) Immunocytochemistry, images are representative of at least 3 independent
experiments and show perinuclear localization of CCL2, presumably in the Golgi
apparatus; E) Western blot analysis of whole cell extracts showing a representative gel
and densitometries; and F) RT-PCR analysis at 5 h (top) and 48 h (bottom) after the
addition of FGF2 and/or LPS. The astrocytes were incubated with FGF2 (5-100 ng/mL
in A and 25 ng/ml in the rest of panels) or LPS (10 ng/mL) for 3-48 h. Values are the
means ± SEM, of n=3-5 independent experiments. (*) p<0.05, (**) p<0.01 and (***)
p<0.001, against control condition (no FGF2 no LPS), and (##) p< 0.01, (###) p<0.001
against LPS-treated cultures at the same time of analysis. ANOVA analysis, Newman-
Keuls post-hoc. FGF2 caused the de novo synthesis of CCL2 mRNA and protein,
which was released. FGF2 moderately potentiated the LPS-elicited increase of CCL2
expression at early (i.e. 12 h) but not late times (i.e. 48 h). Scale bar 50µm.
Figure 2. FGF2 increased the expression of COX2. A) Western blot analysis
showing a representative gel and densitometry; B) Effect of co-stimulation with LPS
assessed by western blot; and C) Immunocytochemistry representative of at least 3
independent determinations. The astrocytes were incubated with FGF2 (25 ng/mL)
and/or LPS (10 ng/mL) for 0.5-48 h as indicated. Values are the means ± SEM, of n=4
independent experiments. (**) p<0.01, (***) p<0.001, with respect to controls, and (##)
p< 0.01, (###) p<0,001, with respect to LPS-treated cultures at the same time of
analysis. ANOVA analysis, Neumann-Keuls post-hoc. Scale bar 50µm. FGF2 caused a
transient expression of COX2 protein (maximal effect detected at 8 h), and LPS
potentiated this increase.
Figure 3. FGF2 inhibited LPS-elicited increase in ICAM1 protein and mRNA expression. A) ELISA; B) RT-PCR; and C) Immunocytochemistry showing results
representative of 3 independent experiments. The astrocytes were incubated with
FGF2 (25 ng/mL) and/or LPS (10 ng/mL) for 12-48 h as indicated. Values are the
means ± SEM, of n=4 independent experiments. (*) p<0.05, (***) p<0.001, with respect
91
RESULTADOS
to controls, and (##) p< 0.01, (###) p<0,001, with respect to LPS-treated cultures at the
same time of analysis. ANOVA analysis, Neumann-Keuls post-hoc. Scale bar 50µm.
Figure 4. FGF2 immunomodulatory actions were mediated by ERK and JNK but not NFkappaB. A) Effect of PD98059 (ERK inhibitor) and SP600125 (JNK inhibitor) on
the expression of CCL2 measured by ELISA; B) Effect of PD98059 and SP600125 on
ICAM1 expression measured by ELISA; C) Western blot analysis of ERK and JNK
phosphorylations showing a representative blot; and D) EMSA analysis of NFkappaB
nuclear translocation. Arrows point to NFkappaB complexes of different electrophoretic
mobility. Astrocytes were incubated with 25 ng/mL FGF2 (and 10 ng/mL LPS in the
case of ICAM1 and NFkappaB). Cells had been pre-incubated for one hour with
PD98059 (50 µM) or SP600125 (10 µM) before the addition of factors. FGF2 activated
ERK and JNK-dependent pathways to a much greater extent than LPS, and ERK and
JNK pharmacological inhibitors reversed the actions of FGF2. LPS caused a long
lasting activation of NFkappaB that was not mimicked nor modified by FGF2. Values
are means ± SEM of n=3-5 independent experiments. (***) p<0.001, with respect to
controls, and (#) p<0.05, (##) p< 0.01, and (###) p<0,001, with respect to FGF2- or
LPS-treated cultures; (ns), not significant. ANOVA analysis followed by Neumann-
Keuls. ERK/JNK and NFkappaB blots are representative of at least 3 independent
determinations.
Figure 5. FGF2 immunomodulatory actions were mediated by FAK. A) Western
blot analysis of the effect of PD98059 (ERK inhibitor), SP600125 (JNK inhibitor) and
PF573238 (FAK inhibitor) on the expression of COX2, showing a representative blot
and a densitometry; B) Effect of PF573238 on the secretion of CCL2 measured by
ELISA; C) Effect of PF573238 on ICAM1 expression measured by ELISA; D) Western
blot analysis of FAK phosphorylation showing a representative blot and densitometry,
and E) Western blot analysis of the interplay between ERK, FAK and JNK showing a
representative blot. Astrocytes were incubated with 25 ng/mL FGF2 (and 10 ng/mL
LPS in the case of ICAM1). Cells had been pre-incubated for one hour with PD98059
(50 µM), SP600125 (10µM) or PF573238 (2.5 µM) before the addition of factors.
Values are means ± SEM of 3 independent experiments, except for E that shows
results representative of at least 3 independent determinations.(*) p<0.05, (**) p<0.01,
(***) p<0.001 against control conditions; (#) p< 0.05, (###) p<0.001 against FGF2 or
LPS alone. ANOVA analysis followed by Neumann-Keuls.
92
RESULTADOS
Figure 6. FGFR2 mediated the immunomodulatory actions of FGF2. A) Western
blot analysis of FGFR1-3 in astrocytes, cerebellar granule cells (CGCs), glioma (C6),
SH neuroblastoma, HeLa and NIH3T3. Astrocytes only expressed FGFR2, which
appeared in two bands; B) Western blot analysis of FGFR2 expression in astrocytes
upon incubation with FGF2 showing representative blot and densitometry. FGF2
induced the transient disappearance of FGFR2; C) FGFR2 did not migrate to the
nucleus upon FGF2 treatment, as shown in western blot analysis of cytosolic and
nuclear fractions. Protein loading of nuclear fractions was controlled for with CREB
expression. Gels show analysis in subcellular fractions obtained from the same whole-
cell extract; D) Western blot analysis of FGFR2 after over-expressing FGFR2 shRNA,
which reduced the expression of the receptor; E) FGHFR2 shRNA completely
obliterated pERK and pJNK expression, as shown by western blot analysis. Data are
the means ± SEM of n=3 independent experiments, except for C where a result
representative of 2 experiments is shown. (*) p<0.05, (**) p<0.01, (***) p<0.001 with
respect to control, and (###) p<0.01 with respect to Retro-GFP as indicated; ANOVA
analysis, Neumann-Keuls post-hoc.
Figure 7. FGF2 accelerated astrocyte migration in a scratch-injury assay. A)
Effect of FGF2 on the scratch width in the presence or absence of cytosine arabinoside
(20 µM) to prevent proliferation; B) Migration fronts of control and FGF2-treated cells
(24 h) stained for GFAP; C) Effect of PD98059 (50 µM), SP600125 (10 µM) or
PF573238 (2.5 µM) on FGF2-induced acceleration; D) Effect of antibodies blocking
CCL2 (αMCP, 4 µg/ml), stimulating ICAM1 (αICAM1, 10 µg/ml), or control unspecific
isotype-matched IgG (10 µg/ml), as well as the COX2 inhibitor NS398 (25 µM); and E)
Control and FGF2-treated (6 h) astrocytes stained for GFAP, CCL2 or COX2. FGF2-
treated astrocytes adopted overtime a polarized morphology bearing long processes
arranged perpendicularly to the scratch. In all experiments, cells were incubated with
25 ng/mL FGF2, and/or the pharmacological inhibitors or αMCP/αICAM1 the entire
time. Migration was measured as the percentage of free area 24 h after the scratch
was made. Values are means ± SEM of n=3-4 independent experiments. (*) p<0.05,
(**) p<0.01, (***) p<0.001 against control condition unless otherwise noted, ANOVA
analysis followed by Neumann-Keuls. Images are representative of 3 independent
experiments. Scale bar 50 µm. FGF2 increased astrocyte acceleration and the
phenomenon was dependent on ERK, FAK, JNK, COX2, and CCL2 but not ICAM1.
93
RESULTADOS
Figure 8. Schematic representation of FGF2-elicited pro-migratory signaling pathways in astrocytes. FGF2, acting through FGFR2 receptor, may regulate two
kinase loops in astrocytes. One would encompass JNK and ERK and lead to CCL2
synthesis and release, and to the inhibition of LPS-dependent ICAM1 regulation. A
second loop would implicate FAK and contribute to: i) CCL2 and ICAM1 modulation via
ERK/JNK and ii) ERK-independent COX2 upregulation. The delayed and more long
lasting FAK activation suggest a maintenance function of FAK in FGF2
immunomodulatory signaling.
Acknowledgements
The authors want to thank Cristina Gutiérrez and Mar Castillo for expert assistance
with astrocyte cultures and immunocytochemical analyses, respectively. The study was
supported by BFU2004-00729/BFI and BFU2007-63031/BFI to EG, and FPI to ML.
94
RESULTADOS
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Capítulo 2: Secretase independent and RhoGTPase-PAK/ERK dependent
regulation of cytoskeleton dynamics in astrocytes by NSAIDs and derivatives
110
Journal of Alzheimer’s Disease 22 (2010) 1135–1155 1135DOI 10.3233/JAD-2010-101332IOS Press
Secretase-Independent andRhoGTPase/PAK/ERK-DependentRegulation of Cytoskeleton Dynamics inAstrocytes by NSAIDs and Derivatives
Mathieu P. Lichtensteina,b,1, Paulina Carribaa,b,1, Marıa Antonia Baltronsb,c, Beata Wojciak-Stothardd,Jeffrey R. Petersone, Agustina Garcıab,c,1 and Elena Galeaa,b,f,1,∗
aInstitut de Neurociences, Universitat Autonoma de Barcelona, SpainbDepartament de Bioquımica i Biologia Molecular, Universitat Autonoma de Barcelona, SpaincInstitut de Biotecnologia i de Biomedicina, Universitat Autonoma de Barcelona, SpaindDepartment of Experimental Medicine and Toxicology, Hammersmith Campus, Imperial College London, UKeFox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA, USAf Institut Catala d’Estudis Avancats(ICREA), Spain
Accepted 13 August 2010
Abstract. Profens like ibuprofen, R-flurbiprofen, or CHF5074 are being considered for the treatment of Alzheimer’s diseasebecause epidemiological data indicates that non-steroidal anti-inflammatory drugs are protective against neurodegeneration.Rho-GTPases are small G proteins, including RhoA, Cdc42, and Rac1, which control cytoskeleton dynamics. Because ibuprofenpromotes axon growthvia RhoA in neurons, we examined whether profens modulate astrocyte plasticityvia Rho-GTPases. Wereport that ibuprofen (100–500µM), R-flurbiprofen (100–500µM), and CHF5074 (10–30µM) caused a concentration-dependentstellation of astrocytes in primary cultures, associated with the reorganization of GFAP and actin filaments. The stellation wasindependent of COX2,α-, β- or γ-secretase as judged by the lack of effect of inhibitors of these enzymes. RhoA, PAK, andCdc42, but not Rac1, accounted for the profen-mediated stellation, as concluded from the joint analyses of activities and reversalexperiments with adenoviral or pharmacological manipulations. Ibuprofen accelerated migration in a scratch-wound assay, whileR-flurbiprofen had no effect and CHF5074 caused deceleration. Cell polarity regulation by Cdc42 and ERK1/2 may underliethe paradoxical effects of profens on migration. We conclude that profens regulate cytoskeleton dynamics in astrocytesviaRho-GTPases, PAK, and ERK1/2. Since migration is a hallmark of astrocyte response during inflammation we propose that, inaddition to (or instead of) lowering amyloid-β42 via secretases, ibuprofen and its derivatives may prevent Alzheimer’s disease bymodulating astrocyte reactivity through Rho-GTPase/PAK/ERK-dependent signaling.
Keywords: Actin, Alzheimer’s disease, astrocytes, Cdc42, CHF5074, ibuprofen, IPA3, NSAIDs, Rac1, RhoA, R-Flurbiprofen
Supplementary data available online: http://www.j-alz.com/issues/22/vol22-4.html#supplementarydata02
1Equal author contribution.∗Correspondence to: Elena Galea, PhD, Institut of Neurociencies,
Edifici M Universitat Autonoma de Barcelona, Bellaterra, 08193Barcelona, Spain. Tel.: +34 93 586 8143; Fax: +34 93 581 1575;E-mail: [email protected].
ISSN 1387-2877/10/$27.50 2010 – IOS Press and the authors. All rights reserved
1136 M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes
INTRODUCTION
Numerous epidemiological studies have shownthat long-term use of certain non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like ibuprofen corre-lates with reduced incidence of Alzheimer’s disease(AD) [1]. This correlation was initially taken as a proofof the pathogenic role of the inflammation that, in ad-dition to plaques, is a prominent feature in AD [2].However, the mechanism of action of NSAIDs is underdebate because clinical trials using specific inhibitorsagainst cyclooxygenases (COX) 1 and 2, the canoni-cal targets of NSAIDs, have failed to show clear ben-efits [1]. A common belief in AD is that NSAIDstargetγ-secretase and not COXs, based upon numer-ous studies showing that some NSAIDs modulateγ-secretase thereby lowering the production of the morepathogenic form of amyloid-β, Aβ42 [3,4]. This evi-dence has prompted the development of several COXinactive, secretase-active, ibuprofen derivatives such asR-flurbiprofen [5] and CHF5074 [6,7] to treat AD whileavoiding the gastric problems associated with chronicCOX inhibition. Despite promising results in trans-genic animal models [5,8] and in a Phase II clinicaltrial [9] R-flurbiprofen has failed to show in Phase IIIany improvement in primary endpoints such as cogni-tion and activities of daily living. It has therefore beendiscontinued [10]. Explanations for the negative re-sults are that brain levels of R-flurbiprofen were insuf-ficient to achieve a meaningful reduction in Aβ gener-ation, that the disease was too advanced to be reversed,that the amyloid cascade hypothesis is wrong, or that aresidual COX inhibitory activity worsens the patholo-gy in already settled AD [11]. Further insight into thecorrect answer will be obtained with CHF5074, whichhas a greatly improved pharmacological and pharma-cokinetic profile over R-flurbiprofen [6,7], decreasesAβ pathology and cognitive deficits in two transgenicmodels of AD [12,13] and is now in Phase 2 clinicaltrial.
A very recent development in the issue of NSAIDsand AD comes from the last report of the only primaryprevention trial in AD (ADAPT) which, although in-complete, points to almost 70% protection in naproxen-but not celecoxib-treated individuals [14]. Naproxenis a non-selective COX2 inhibitor with no effect onγ-secretase [15], challenging the prevailing view that sec-retases account for the protection afforded by NSAIDs.RhoA, a small G protein member of the Rho-GTPasefamily, emerges as an alternative target. RhoA regu-lates the actin cytoskeleton and gene transcription, thus
coordinating cellular events that require both morpho-logical and functional changes such as morphogene-sis, axon growth, migration or progression of cell cy-cle [16]. Ibuprofen promotes the regeneration of sev-ered axons via inhibition of RhoA [17,18]. This is atpresent the only valid evidence linking ibuprofen toRhoA because a report claiming that RhoA accountsfor the ibuprofen-mediated reduction of Aβ productionin neurons [19] has not been validated thereafter [20].
Numerous reports indicate that RhoA, and otherRho-GTPases including Cdc42 and Rac1,regulate plas-ticity and motility in astrocytes [21–26]. Here wesought to analyze: i) if ibuprofen modulates RhoAin astrocytes as it does in neurons; ii) the implica-tions in plasticity, that is, effects on morphology andmotility; iii) whether the effects on RhoA extend toCdc42, Rac1 and downstream kinases; iv) whetherthe ibuprofen derivatives R-flurbiprofen and CHF5074still target Rho-GTPases despite the chemical trans-formation towards improved secretase inhibition, andv) the effects ofγ-secretase-modulating NSAIDs (in-domethacin, sulindac sulfide, diclofenac)versusnonmodulators (naproxen).
We report that ibuprofen, R-flurbiprofen, andCHF5047 induced stellation but differentially affectedmigration of astrocytes in primary cultures. The stella-tion appeared dependent on RhoA inhibition and PAKactivation, whereas ERK1/2 and Cdc42 might medi-ate differences in migration patterns, and Rac1 did notseem to be involved. The other NSAIDs tested mim-icked the effect of ibuprofen in stellation and migration.These findings are relevant to AD because astrocyte re-activity, manifested as hypertrophy, and migration to-wards Aβ plaques, is a hallmark of the disease [2,13]. Itfollows that profens may influence the AD progressionby modulating astrocyte plasticity and motility throughsome Rho-GTPases, PAK and ERK1/2. Our data thussupport that astrocyte Rho-GTPases, PAK and ERK1/2be brought to the spotlight as additional targets to neu-ronal secretases in the protective effects of profens inAD.
MATERIALS AND METHODS
Materials
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM),penicillin, streptomycin, paraformaldehyde, Triton X-100, bovine serum albumin (BSA), 4’,6-diamidino-
M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes 1137
2-phenylindole (DAPI), bromodeoxyuridine (BrdU),ibuprofen, naproxen, diclofenac, indomethacin, sulin-dac sulfide, GW9662, lipophosphatidic acid (LPA),phosphatase inhibitors, mouse anti-actin antibody wereobtained from Sigma. R-Flurbiprofen, pioglitazoneand rabbit polyclonal anti-COX2 antibody was fromCayman. CH5074 was from Chiesi Farmaceutici (Par-ma, Italy). Foetal-calf serum (FCS) was from Cam-brex. ROCK (RhoA GTPase kinase) and Rac1 in-hibitors, Y27632 and NSC23766 respectively, BACEinhibitor (β-secretase inhibitor IV), TAPI1 and N-terminal PS1 rabbit polyclonal antibody (1/3000) werefrom Calbiochem. The PAK1/2/3 inhibitor IPA3was from Jeffrey Peterson (Fox Chase Cancer Cen-ter, Philadelphia, USA). The protease inhibitor cock-tail was from Roche. Rabbit monoclonal antibodiesagainst ERK1/2 and phospho-ERK (pERK) were fromCell Signaling (1/1000). Rabbit monoclonal to PAK1was from Abcam or Invitrogen (1/3,000). Rabbit poly-clonal against phospho-PAK1/2/3 serines 144/141/139(1/3,000) was from Abcam or Invitrogen. Rabbit mon-oclonal against phosho-PAK1/2 threonines 423/402was from Cell Signaling. Rabbit anti-GFAP (1/1,000)and mouse anti-BrdU (1/100) antibodies were fromDAKO. Mouse anti-myc antibodies (1/300) were fromSanta Cruz Biotechnology. Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit or mouse IgG from AmershamLife Science. RhoA and Cdc42 monoclonal antibod-ies and Rhodamine Phalloidin were from Cytoskeleton.Rabbit polyclonal anti-GLAST antibody was from Ab-cam, and anti-BACE1 and anti-ADAM10 from Milli-pore. Epidermal Growth Factor (EGF) from R&D wasused as a positive control in GLISAs.
Cultures
Astrocyte cultures were prepared from cerebellumfrom 7-day-old or cortex from 1-day-old Sprague-Dawley rats [27]. In brief, rats were decapitated andbrain immediately dissected out. After meninges andblood vessels were removed, the tissue was mincedand incubated for 10 min at 37◦C in Ca2+-free Krebs-Ringer buffer containing 0.025% trypsin. Cells werethen mechanically triturated through a glass pipetteand filtered through a 40µm nylon mesh in the pres-ence of 0.52 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 170IU/ml DNase. After centrifugation (500 xg), cellswere stained by Trypan Blue exclusion and countedin a Neubauer chamber and then resuspended in 90%DMEM, 10% FCS, 20 U/ml penicillin and 20µg/mlstreptomycin in a volume to be seeded on plastic Petri
dishes at 1.25× 105 cells/cm2. For immunofluores-cence experiments, a 24× 24 mm glass cover slipwas inserted into each dish before seeding. Cells weremaintained in a humidified atmosphere of 90% air-10%CO2. The medium was changed at day 7, and the cellswere immediately used when cultures reached conflu-ency (around 10 DIV). This minimizes contaminationby microglia that rapidly proliferate when the astrocytemonolayer reaches confluency [27]. The medium waschanged to 1%FCS-DMEM for 3 h before treating cul-tures with different compounds for the indicated timesand concentrations.
Immunocytochemistry
Astrocytes were labeled by fluorescence immunos-taining for GFAP. Cultures were fixed for 40 min with4% paraformaldehyde in phosphate buffered saline(PBS) at room temperature. After several washes,monolayers were incubated with PBS-0.1% Triton X-100 for 15 min. Then, blockade of non-specific bind-ing was performed with 1% BSA in PBS, and after-wards cells were incubated overnight at 4◦C with a rab-bit polyclonal anti-GFAP antibody (1/1,000) in 0.1%BSA-PBS). After washing, cells were incubated for 1 hwith Alexa 488 anti-rabbit IgG diluted 1:1000 in 0.1%BSA-PBS. The primary antibody was omitted in con-trols. F-actin was stained with rhodamine-phalloidin(1/200, 1 h) from Cytoskelton Inc, added together withthe secondary antibody in double-labeling procedures.
Adenoviral infections
We used adenoviruses containing constitutively ac-tive (CA) or dominant negative (DN) forms of Rho-GTPases: V17-RhoA (CA-RhoA), N17Cdc42 (DN-Cdc42), V17-Rac1 (CA-Rac1), N17Rac1 (DN-Rac1).Virus generation was described in [28]. In brief, cD-NAs encoding aminoterminal GFP-tagged V17-RhoA,N17Rac1 and V17Rac1, or myc-tagged N17Cdc42,were subcloned into the admid transfer vectors pCR259and pCR244. The admid transfer vectors were thentransformed into anE. coli strain containing a vectorencoding a transposase and an Ad5-based adenovirusvector deleted in the E1 and E3 genes (Ad5 DE1DE3).Transposition of the Rho cDNAs from the admid trans-fer vectors into Ad5 DE1DE3 created the adenoviralvectors where the Rho transgenes are under the controlof a IRES-CMV promoter. Recombinant adenoviralDNA was purified fromE. coli and transfected into
1138 M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes
Fig. 1. Profens induced astrocyte stellation in a time- and concentration-dependent manner. Cerebellar (A, B) or cortical (C) astrocytes wereincubated with ibuprofen (100–500µM), R-flurbirprofen (100–500µM), or CHF5074 (10–30µM) for 0.5–24 h as indicated in the figure, andstained for GFAP (red) or F-actin (green). A) Concentration dependency for ibuprofen, R-flurbiprofen and CHF5074. B) Time course foribuprofen. C) Effect of profens in cortical astrocytes. Profens caused a time-dependent retraction of the soma and process elongation that wasdetected at 30 min for the higher concentrations. (See Supplementary Figs 1–4). The stellation was fully developed by 3 h, and partially reversedby 24 h. Scale bar, 25 or 50µm.
293 human embryonic kidney cells, which express E1genes, to allow purification of adenoviral particles.
To establish appropriate MOIs, astrocytes were in-fected with MOIs ranging 1–100. Cells were infect-ed for 2 h 1% serum-containing DMEM. The medi-um was then replaced by complete medium, and thecells left overnight to allow full expression of mutatedRho-GTPases. Infection was verified by visualizationof tags (GFP or myc, the latter after performing im-munocytochemistry). The MOI chosen for the exper-iments was the one that produced infection in 100%of the cells. Expression of transgenes was confirmedby western blots (Fig. 5), where mutated RhoA andCdc42 appeared as bands with reduced electrophoreticmobility due to the tags.
Scratch-wound assay
The capacity of astrocytes to migrate was put to thetest by scratching confluent astrocyte monolayers to in-duce natural cell migration to close the scratch, as pre-viously reported [24]. Immediately after profens wereadded to the cultures, a scratch of 500µm in width wasdone with a sterile yellow pipette tip. The cells werefixed at 0, 12, 24, or 48 h thereafter and immunostainedfor GFAP/DAPI. Individual images (4–5 per scratch-wound) were taken with the 20 x magnification lens,and the cell-free area (given in mm2) was measuredusing ANALYSIS software (version 3.2, Soft ImageAnalysis System, Munster, Germany).
M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes 1139
Fig. 2. Profens modulated migration following a scratch-injury. Cultures were scratched and immunostained for GFAP at the times indicated.A) Migration profiles showing that ibuprofen but not the other profens accelerated the scratch closure; B) Migration fronts. Ibuprofen andR-flurbiprofen enhanced the length of the leading edges, whereas CHF5074 caused a remarkable loss of cell polarity; C) Quantification ofmigration rates as percentage of cell free area. Data are the means± SEM of 5–8 independent determinations. Statistical differences respect to 0h ∗∗∗p < 0.001 or respect to untreated cultures at the same migration time #p < 0.05, ##p < 0.01 were obtained by ANOVA analysis followedby Newman-Keuls post-hoc test.
1140 M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes
Fig. 3. Effect of profens is secretase independent. A) Western blots were performed on astrocyte membrane fractions and secretases detected byincubation with antibodies againstα-secretase, BACE, PS1. N-ter is N-terminal, the active form of PS1. Anti-glutamate transporter GLAST wasused as a membrane marker; B) Effect of NSAIDs on stellation. Cells were treated with ibuprofen (ibu), naproxen (nap) indomethacin (indo)and diclofenac (diclo) at 125 and 250µM, and sulindac sulphate (SS) at 30 and 60µM. All profens caused stellation, sulindac sulphate being themost potent and naproxen the least. C) Naproxen and indomethacin (250µM) accelerated migration in a scratch-wound injury when tested at 18h. Fronts showed enhanced protrusions. Data are means± SEM of 3 independent experiments.∗p < 0.05, Student T-test.
M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes 1141
Fig. 4. Antagonistic effects of profens and LPA on stellationand RhoA-GTP loading. A) Cells were treated with 10µM LPA, 250µM ibuprofen,250µM R-flurbiprofen or 30µM CHF5074 in the combinations indicated for 3 h, and then stained for F-actin (green) or GFAP (red). Imagesare representative of 3 independent determinations. B) RhoA-GTP contents. Cells were incubated with profens with/without LPA for 4–5 minand processed for GLISAs. The data are expressed as the means± SEM of n = 3–5 experiments.∗p < 0.05,∗ ∗ p < 0.01 respect to basalcontents; #p < 0.05, ##p < 0.01 respect to LPA alone. ANOVA analysis, followed by the Newman-Keul test. The three profens inhibited theincrease in RhoA-GTP contents caused by LPA. Only CHF5074 exerted an inhibitory effect on basal contents.
1142 M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes
Fig. 5. CA-RhoA and DN-Cdc42 overexpression prevented stellation. A) Astrocytes were infected with adenoviruses containing only GFP,CA-RhoA/GFP or DN-Cdc42/c-myc, and exposed to ibuprofen, R-flurbiprofen or CHF5074. All cells were processed for fluorescent detection ofF-actin (red). Infection efficiency was controlled for by counterstaining with c-myc (green) or GFP flurorescence (green). Images are representativeof 3 independent determinations. Bar is 50µm. CA-RhoA and Cdc42 prevented stress-fiber disassembly upon profen administration. B) Westernblot analyses confirmed expression of CA-RhoA and DN-Cdc42, detected as forms with reduced electrophoretic mobility due to the tags; GLISAmeasurements confirmed that CA-RhoA and DN-CDc42 respectively increased and decreased RhoA and Cdc42 activities. C) Measurements ofCdc42-GTP amounts by GLISA revealed differing effects of profens. Epidermal Growth Factor (EGF, 100 ng/mL) was used as a positive control.The data are expressed as the means± SEM ofn = 3 experiments.∗p < 0.05,∗ ∗ p < 0.01, Student T test.
Bromodeoxyuridine(BrdU) staining
This was performed to examine the contribution ofnew cell generation, as opposed to migration to theclosure of scratches. BrdU (1µg/mL) was added inDMEM-1% FCS with or without different compoundsand the monolayer scratched as described above. After24 h cells were fixed and incubated with 1N HCl during30 min, followed by several washes with 0.1 M boratebuffer pH 8.5, to denaturate the DNA to allow for theantibody to bind. Cells were then permeabilized withPBS-0.1% Triton X-100 and double-immunostainedfor BrdU, GFAP and DAPI. Mouse anti-BrdU (1/100)
was incubated with a rabbit anti-GFAP antibody for3 h followed by secondary antibodies together withDAPI (0.25µg/ml). BrdU- and DAPI-positive astro-cytes were counted in photomicrographs whose rightmargin coincided with the midline of the wound toassure that the analyses were performed in equivalentareas.
Western blots
Cultures were scraped out of the plates with PBS,collected by brief centrifugation (5 min, 1,000 x g), andthen homogenized in ice-cold 10 mM HEPES pH 7.9,
M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes 1143
1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1 mM DTT containingantiprotease and antiphosphatase cocktails, and placedin ice 5 min. NP-40 was added to 0.6%, and the ho-mogenates were vortexed and centrifuged 30 s at highspeed (20,000 x g). The supernatants were then cen-trifuged at 100,000x g for 2 h. The resulting pellets andsupernatants were respectively considered membraneand cytosolic fractions. Samples containing equalamounts of protein (15–30µg) were subjected to sodi-um dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel elec-trophoresis (PAGE) (SDS-PAGE). After running thesamples, proteins were transferred to polyvinyl difluo-ride membranes, and incubated with primary antibod-ies (indicated in Materials). This was followed by in-cubation with anti-IgG-horseradish peroxidase-labeledsecondary antibodies (1:10,000) and subsequent detec-tion with an enhanced chemiluminescence detection kit(Millipore). Protein concentration was determined bythe method of Bradford [29] with BSA as standard.
GLISAs
GLISA Activation Assay Biochem kits (Cytoskele-ton, Denver, CO) were used to measure RhoA, Cdc42and Rac1 activation according to the manufacturer’srecommendations. Astrocyte cultures were grown in60-mm dishes and incubated in serum-free medium24 h prior to experimental procedures. Cells werethen incubated in the presence or absence of pro-fens (250µM ibuprofen or R-flurbiprofen or 30µMCHF5074 for 4–5 min), or known activators of Rac1and Cdc42 such as EGF (100 ng/ml) or LPA (15µM) forRhoA. Afterwards, monolayers were washed with ice-cold PBS to remove serum proteins. Ice-cold cell lysisbuffer (80–100µl) was added, dishes were scrapped,and cell lysates were harvested by centrifugation at20,000 x g at 4◦C for 1 min. An aliquot was kept onice for protein concentration measurement, and sam-ples were snap frozen at−70◦C. After adjustment ofprotein concentrations, cell lysates were thawed in aroom temperature bath and 50µl of lysates were addedto the wells of the GTPase binding plate. Wells weresequentially incubated with antigen-presenting buffer,primary antibodies, a secondary anti-horseradish per-oxidase (HRP)-labeled antibody, and horseradish per-oxidase. Signals were measured at 490 nm using a Bio-TeK Power-Wave XS microplate spectrophotometer.
Statistical analysis
Experiments were always reproduced a minimum ofthree times. Quantifiable determinations are expressed
as means± SEM of the indicated number of experi-ments performed in independent cultures. Significanceof differences was evaluated by one-way ANOVA fol-lowed by the Newman-Keuls post-hoc test when morethan two conditions were evaluated, or the Student’s Ttest when only two conditions were compared.
RESULTS
Profens caused astrocyte stellation and alteredmigration
The used concentrations of profens were based onpilot dose-response analyses where we tested rangesof ibuprofen (10µM-1 mM) R-flurbiprofen (10µM-1 mM), and CHF5074 (5–60µM) at concentrationsbased upon the IC50 values or concentration rangesof action on possible targets namely COX, PPAR andγ-secretase (Table 1). Of note, 500µM ibuprofenhas been the concentration used to induce RhoA inhi-bition in vitro [17–19]. Cerebellar astrocytes treatedwith profens went from a flat fibroblast-like morphol-ogy to a highly ramified stellate shape caused by so-ma retraction and process elongation. Stellation wasevident with GFAP immunostaining (Fig. 1A) and un-der phase contrast (Supplementary Figs 1–4; avail-able online: http://www.j-alz.com/issues/22/vol22-4.html#supplementarydata02). The effect was time andconcentration-dependent for the three profens. Thestellation was incipient, but detectable, as early as30 min after administration of the profens at the low-est concentrations, and it was clearly in progress atthe highest ones. By 3 h the stellation was fully set-tled. The order of potencies was CHF5074> R-flurbiprofen> ibuprofen. By 24 h the stelllation wasreversed (Fig. 1B). The staining of polymerized actin(F-actin) revealed actin organization on parallel stressfibers and adhesion rings in control cells as previous-ly described [25]. Profens caused the disorganizationof stress-fibers (Fig. 1A). Profens also caused stella-tion in cortical astrocytes (Fig. 1C), suggesting that thephenomenon was not region-specific. The ensuing ex-periments were performed in cerebellar astrocytes atconcentrations that produced maximal effects, whichwere 250µM for ibuprofen and R-flurbiprofen (notethat 250 and 500µM had similar effects), and 30µMfor CHF5074.
To examine the effect of profens in migration weused the scratch-woundin vitro assay wherein the lossof cell contacts induces local chemokine release that
1144 M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes
Table 1Potential targets of profens and NSAIDS (µM)
Ibuprofen R-flurbiprofen CHF5074 Indomethacin Sulindac Sulfide Naproxen Diclofenac
γ-secretase (decrease in Aβ42) 300(3) 268(7) 40(7) 100(3) 100(3,15) none(3,15) ndCOX1 5(30) 100*(7) 300*(7) 0.27(30) nd 9.5(30) 1.69(30)
COX2 72(30) 300*(7) None*(7) 1.7(30) nd 5.6(30) 1.18(30)
PPARγˆ 300(44) 75# 30# 5 fold activation 100(63) 5 fold activation 25(64)
at 10µM (34) at 10µM (34)
For γ-secretase and COXs all values were obtained from assays involving living cells except∗ and represent the IC50 . ∗Values obtained frompurified enzymesˆConcentrations associated with a 2-fold increase in PPAR-γ activity (EC200)Imbimbo BP. personal communication.
drives the cells to close the scratch. Ibuprofen acceler-ated the scratch closure, as judged by the smaller cell-free areas observed 12–24 h after the scratch was per-formed (Fig. 2A, C). The accelerated migration was notdue to increased cell proliferation because the analysisof proliferating cells with BrdU revealed no change inthe presence of ibuprofen (data not shown). The scratchfronts in cells treated with ibuprofen showed longerleading edges than control cells, arranged in paralleland perpendicular to the wound (Fig. 2B), suggestingincreased polarity. R-flurbiprofen, by contrast, showedno significant effect on migration (Fig. 2A, C). Howev-er, fronts showed no obvious difference with culturestreated with ibuprofen, for cells also displayed longand orderly protrusions (Fig. 2B). This suggests that,in astrocytes, migration, motion and polarity are inde-pendently regulated and that ibuprofen increases both,while R-flurbiprofen only the latter. CHF5074, by con-trast, inhibited migration at all times tested (Fig. 2A,C). The moving front looked highly disorganized indi-cating a dramatic loss of polarity in the presence of thisnew profen derivative (Fig. 2B).
Role of COX2, secretases, or RhoA
In order to gain insight into the mechanism under-lying the structural and dynamic changes we consid-ered five possible targets of profens: i) COX2, ii)γ-secretase, iii)α-secretase, iv) PPARγ, and v) β-secretase (BACE). Ibuprofen inhibits COX2 [30], andmodulatesγ-secretase by binding to the amyloid-β pro-tein precursor (AβPP) [31] thereby shifting its cleav-age to produce Aβ40 instead of Aβ42 [3]. Ibuprofen al-so inhibitsα-secretase according to one study [32] butnot to another [33], and is a ligand of PPARs [34,35].R-flurbiprofen has residual COX [7], and PPARγ ac-tivities (BP Imbimbo, personal communication), whileit modulatesγ-secretase like ibuprofen [5]. CHF5074inhibits γ-secretase thereby lowering both Aβ40 and
Aβ42 [7], while it does not inhibit COX [7], but canstimulate PPARγ activity (BP Imbimbo, personal com-munication). We also considered BACE, which can beinhibited by ibuprofen via PPARγ upon inflammatorystimulation [36].
It is worth stressing that the inhibitory versus mod-ulatory actions of ‘profens onγ secretase have beendefined based on AβPP metabolism and Aβ42/Aβ40 ra-tios, which have no place in this study because expres-sion of AβPP is not detected (data not shown). How-ever, molecules cleaved by secretases other than AβPPmay be relevant in regulating astrocyte dynamics.
The expression ofα-secretase, BACE, PS1, COX2and PPARγ was examined in cytosolic and membranefractions by Western blot analysis. Whileα-secretase,BACE, and PS1 were detected in membranes (Fig. 3A),COX2 and PPARγ were not detected in either fraction(data not shown). The most abundantly expressed sec-retase was PS1 in its cleaved, active N-terminal form.The inhibition of α-secretase (25µM TAPI), COX2(10µM NS398), or BACE (1µM BACE Inhibitor IV)had no effect on stellation or migration, that is, the in-hibitors did not mimic the effect of profens thus pre-cluding that these acted inhibitingα-secretase, COX2,or BACE (n = 2, Supplementary Fig. 5). Likewise,inhibition of PPAR with 20µM GW9662 did not re-verse the actions of ibuprofen (n = 2, SupplementaryFig. 6), nor the PPAR agonist pioglitazone (10–30µM)had any effect. Finally, inhibition of PS1 with 2µMDAPT had no effect on stellation ormigration, nor itinterfered with the stellation and accelerated migrationcaused by ibuprofen (n = 2, Supplementary Fig. 5).This indicates that PS1 is not involved in the profeneffects, whether these are modulators or inhibitors ofthe enzyme.
NSAIDs other than ibuprofen have shown to bepreventive in epidemiological studies and, interest-ingly, the effect appears independent on their capac-ity to decrease Aβ42/Aβ40 ratios by modulatingγ-secretase [37]. Here we tested indomethacin, sulin-
M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes 1145
dac sulfide, and diclofenac, allγ-secretase modulators,and naproxen, which have no effect onγ-secretase.NSAIDs were tested within the range of purported sec-retase inhibitory concentrations (25–250µM (Table 1).All of them produced stellation and, with the exceptionof naproxen, they appeared more potent than ibuprofen.Figure 3B shows the minimum and maximal effects ob-served. Both aγ-secretase modulator (indomethacin)and naproxen accelerated migration in a scratch-woundassay (Fig. 3C). Cells in moving fronts displayed elon-gated fronts suggesting increased polarity (Fig. 3C).
Overall, the data indicate that the regulation of cy-toskeleton dynamics by profens or NSAIDs was medi-ated by a target other that COX2 or secretases.
RhoA was a likely candidate to mediate stellationsince extensive evidence shows that the formation andmaintenance of stress fibers in cells in culture is mediat-ed by the activation of myosin light chain kinase (ML-CK) by RhoAvia ROCK [38]. Lysophosphatidic acid(LPA), a well characterized RhoA activator widely usedto facilitate the appraisal of putative RhoA inhibitorymolecules [39,40], prevented the profen-elicited dis-organization of the actin cytoskeleton and the ensu-ing stellation (Fig. 4A). This suggests that profens andLPA play antagonistic roles on the RhoA-dependentsignaling leading to stress fiber organization. To fur-ther localize the site of action of profens along the path-way, we measured the contents of GTP-bound RhoAby GLISA. LPA increased RhoA-GTP loading as ex-pected [40], and the three profens counteracted the in-crease (Fig. 4B). This result implies that profens reg-ulate RhoA-dependent signaling acting directly on, orupstream to, RhoA-GTP formation.
To further implicate RhoA inhibition in the effectof profens on astrocyte morphology we tested the ef-fect of CA-RhoA by introducing the encoding con-struct in the cells with an adenovirus. The viral infec-tion per se(Ad-GFP) caused a moderate disorganiza-tion of stress fibers (Fig. 5). Overexpression of CA-RhoA enhanced stress-fiber formation in control cells,which adopted a more polygonal shape, and preventedcompletely the stellation caused by all profens (Fig. 5).These findings provide additional proof that inhibitionof RhoA-dependent pathways was necessary for theprofen-mediated stellation to occur. Reports indicatethat RhoA inhibition hastens migration [24], as con-firmed here with the ROCK inhibitor Y27632 (Fig. 8A,B). RhoA inhibition, however, cannot account for theeffect of profens on migration because this would on-ly explain the acceleration caused by ibuprofen, butnot the deceleration caused by CHF5074, or the mixedeffects of R-flurbiprofen.
Role of Cdc42/Rac1/PAK
Cdc42 and Rac1 can antagonize RhoA by inhibit-ing MLCK via PAK [41]. In addition Cdc42 and Racactivation are involved in directed cell migration [26].We thus sought to determine whether profens activatedCdc42, Rac1 and the effector PAK, as well as the re-versal actions on stellation and migration of the over-expression of DN or CA forms, as appropriate, or theeffect of pharmacological inhibitors.
Overexpression of DN-Cdc42 completed abrogatedthe profen-mediated stellation (Fig. 5A), suggestingthat Cdc42 activation was involved in this effect. Inter-estingly, stress-fiber disorganization appeared to pro-ceed in the presence of DN-Cdc42 indicating that, un-like RhoA, Cdc42 regulates yet uncharacterized mech-anisms of process extension during stellation. Paradox-ically, Cdc42-GTP contents were increased by ibupro-fen and R-flurbiprofen but decreased by CHF5074(Fig. 5C), despite the comparable effects of the three onstellation. This suggests that, in the case of CHF5074,actions on PAK or RhoA along with remaining levelsof active Cdc42 permitted stellation.
Rac1 was modulated by profens like Cdc42, asjudged by changes in Rac1-GTP loading. Ibuprofen andR-flurbiprofen increased the activity whereas CHF5074was inhibitory (Fig. 6B). Infection of astrocytes withadenoviruses containing DN-Rac1 (N17Rac) or CA-Rac1 (V17Rac1) caused extreme disarray in thecells that precluded further experimentation (data notshown). The only tool left was the pharmacologicalinhibitor NSC23766 [42], which had no effect on theprofen-mediated stellation (Fig. 6A), nor it reversedsignificantly the ibuprofen-elicited acceleration in mi-gration (Fig. 6C).
The novel PAK1/2/3 inhibitor IPA3 [43] largely pre-vented the disorganization of the actin cytoskeletoncaused by profens (Fig. 7A), and blocked migrationcompletely (Fig. 8B). Cells at the migrating front pre-sented blunted shapes, indicating that PAK inhibitionhad completely prevented the formation of protrudingedges (Fig. 8A). Altogether, these findings reveal akey role of PAK in process formation in astrocytes,and prompted us to examine the level of phospho-rylated and presumably active forms of the enzymewithin 15 min–24 h. No increase of PAK phospho-rylated in threonine 423/402 was detected (data notshown). A robust phosphorylation of PAK in serineS139/141/144 (pPAKSer141) was present in controls.All profens tended to increase pPAKSer141 althoughonly R-flurbiprofen caused a statistically significant in-
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Fig. 6. Role of Rac1 on stellation and migration. A) The Rac1 inhibitor NSC23766 did not reverse stellation. Cells were incubated with 100µMNSC23766 prior to administering profens, which were left for 3 h. The cells were processed for detection of GFAP (red) and F-actin (green).NSC23766 appeared to cause F-actin accumulation in clumps despite the overall unchanged stellation. B) Ibuprofen and R-flurbiprofen at250µM increased Rac1-GTP contents whereas CHF5074 (30µM) caused a decrease. Data are expressed as the means± SEM of 3 independentdeterminations. C) NSC23766 did not reverse the acceleration elicited by ibuprofen (250µM). Data are the means± SEM of 3 independentdeterminations. Statistical differences versus controls∗p < 0.05,∗ ∗ p < 0.01, ANOVA, Newman-Keuls post-hoc.
M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes 1147
Fig. 7. PAK inhibition prevented the profen-induced stellation. A) Effect of the PAK inhibitor IPA3. Astrocytes were incubated for 3 hwith 250 µM ibuprofen or R-flurbiprofen or 30µM CHF5074 in the presence or absence of 25µM IPA3, and stained for GFAP or F-actin.IPA3 enhanced stress-fiber formation in control cells and prevented the stellation caused by profens. Representative of at least 3 independentdeterminations. B) pPAK and total PAK expression. Cells were incubated with profens for 15–60 min or 3–24 h and processed for westernblot analysis of pPAK 1/2/3 (S139/141/144) and total PAK. A robust constitutive expression of pPAK was detected, and there was no significantincrease by profens within 15-60 min, whereas at later times only R-flurbiprofen caused a statistically significant increase at 6 h. Total PAK didnot change. The values are the means± SEM of 5 determinations;∗p < 0.05, ANOVA analysis, Newman-Keuls post-hoc; C: 25µM IPA3inhited flurbiprofen-elicited increase in pPAK, as revealed by western blot. Representative ofn = 2.
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Fig. 8. Regulation of migration by PAK, ERK1/2, and ROCK. A) Migration fronts in cells treated with inhibitors of PAK (25µM IPA3), ERK1/2(50µM PD98059), and ROCK (10µM Y27632). IPA3 and PD98059 prevented the formation of leading edges, while Y276132 caused a strikingnetwork of very long protrusions. The experiments with IPA3 were performed at 12 h due to the short-lived nature of the inhibitor [43]. B)Quantification of migration rates in the presence of inhibitors and 250µM ibuprofen (IBU). IPA3 completely abolished migration, PD98059retarded migration and reversed the acceleration caused by ibuprofen, whereas Y27632 mimicked the acceleration caused by the profen, whichdid not accelerate migration further in the presence of the ROCK inhibitor. The values are the means± SEM of 3 (IPA3), or 6 (PD98059, Y27632)independent experiments. Significant differences versus untreated (*) and IBU-treated cultures (#);∗p < 0.05,∗∗, ##p < 0.01, and ###p<0.001,ANOVA analysis, Newman-Keuls post-hoc. C) Vanadate (100µM) prevented the delayed migration caused by of 30µM CHF5074 when assayed24 h post-scratch. The values are the means± SEM of 5 independent experiments. versus untreated∗∗∗p < 0.001 and CHF5074-treated cultures#p < 0.05. ANOVA analysis, Newman-Keuls post-hoc.
M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes 1149
crease (∼50%) at 6 h (Fig. 7B). IPA3 inhibited thisincrease thus confirming the specificity of the inhibitor(Fig. 7C).
Role of ERK
We also examined ERK1/2 because recent evidenceindicates that it regulates cell polarity [44] and becausea protein-kinase screening in our laboratory had re-vealed ERK1/2 activation by profens. Ibuprofen andR-flurbiprofen increased ERK1/2 phosphorylation ina time-dependent manner but with a different profile(Fig. 9A). While R-flurbiprofen produced a rapid in-crease of ERK1/2 activation – detectable at 5 min –that returned to basal levels 30 min thereafter, ibupro-fen caused a more delayed but sustained ERK1/2 ac-tivation. The effect was dependent on concentration(Fig. 9A, bottom). A second, more robust wave ofERK1/2 activation was detected at 6–9 h after the addi-tion of ibuprofen and R-flurbiprofen (Fig. 9B). Again,the effect of R-flurbiprofen appeared more acute buttransient, and the effect of ibuprofen was more sus-tained.
Unlike the other profens, CHF5074 tended to de-crease ERK1/2 activation within 20 min, and onlyproduced a slight yet significant increase at 30 min(Fig. 9A, top). CHF5074 also caused the delayed pERKincrease at 6 h, but it was very small compared to thatcaused by the other two profens (Fig. 9B).
We next examined the implication of ERK1/2 in thestellation and migration by using the ERK1/2 inhibitorPD980549. The drug had no effect on the stellationcaused by profens (Supplementary Fig. 7) thus pre-cluding a role on the stress-fiber disorganization. Bycontrast, PD980549 reduced the emission of organizedprotrusions in the moving front (Fig. 8A), and very sig-nificantly retarded wound closure (Fig. 8B). PD98059also prevented the acceleration caused by ibuprofen(Fig. 8B). Overall, these data suggest that ERK1/2may govern directional movement in astrocytes and,hence, that the different profiles of ERK1/2 activationamong profens might have contributed to the differingeffects on polarity and migration. If this is the case,we reasoned that enhancing ERK1/2 activation couldimprove motion in CHF5074-treated astrocytes. SinceERK1/2 activators acting directly on the kinases do notexist, we tried to maintain ERK1/2 activation with thephosphatase inhibitor vanadate. As shown in Fig. 8C,vanadate did accelerate migration in CHF5074-treatedcells, thus supporting that the smaller ERK1/2 acti-
vation caused by CHF5074, as compared to the otherprofens, contributed to the impaired migration.
Finally, the comparable profiles of Cdc42 andERK1/2 modulation by profens prompted us to testwhether the two enzymes were related. We exam-ined if DN-Cdc42 inhibited ERK1/2, or if PD98059inhibited Cdc42-GTP loading by using ibuprofen as aclear-cut activator of both enzymes. We found that theibuprofen-elicited increase in pERK was not affectedby DN-Cdc42 overexpression (data not shown), where-as the increase in Cdc42-GTP contents was partiallyinhibited by PD98059 (Fig. 10). This suggests thatERK1/2 controls Cdc42 activation.
DISCUSSION
Astrocytes, in addition to regulating brain homeosta-sis and neurotransmission, play a key role in the protec-tive responses launched in the brain by insults of dele-terious nature, including bacterial infection, trauma, oraccumulation of Aβ plaques in AD. The main findingof this study is that ibuprofen and ibuprofen derivativesthat are actively investigated in AD therapeutics regu-late cytoskeletondynamics in astrocytes in a manner in-dependent of secretases, COX, PPARγ, and dependenton RhoGTPases, PAK, and ERK. That PPARγ was notinvolved is at variance with a recent study reporting thatPPARγ mediates the inhibition of RhoA by ibuprofenin neurons [45]. Thus, different Rho-dependent signal-ing may exist in astrocytes and neurons. We assayedstellation and migration because they uncover differentaspects of cytoskeleton modulation and Rho-GTPaseinterplays. Stellation is the result of two steps: i) dis-ruption of stress fibers, a network of actomyosin bun-dles that attach cells to substrates and causes cell bodyretraction, and ii) emission of processes that do requirethe support of a newly assembled cytoskeleton. Migra-tion, in turn, involves the emission of a unique leadingedge, and requires cyclic episodes of actin remodelingand adhesion/deadhesion to the substrate.
The three profens induced stellation in astrocytesconcomitant to stress-fiber disruption. Evidence showsthat stress-fiber homeostasis in cells in culture is con-trolled by RhoGTPases. RhoA, via ROCK/MLCK,promotes stress-fiber assembly [21,39], while Cdc42and Rac1via PAK may antagonize RhoA by inhibit-ing MLCK [41]. That RhoA-dependent pathways con-tributed to the profen-mediated stellation is supportedby three pieces of evidence: i) the preventive effect ofLPA, ii) the preventive effect of CA-RhoA, and by iii)
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Fig. 9. Regulation of ERK1/2 activation by profens. A) Concentration- and time-response curves at short times; B) Responses at long times.Cells were incubated with profens at the indicated times and concentrations, and processed for western blot analysis of pERK and total ERK. Thedata are the means± SEM of 5–9 determinations, except for the effect of CHF5074 at short times that was performed 3 times.∗p < 0.05;∗ ∗p <
0.01, ANOVA analysis, Newman-Keuls post-hoc. At short times ibuprofen and R-flurbiprofen but not CHF5074 stimulated ERK1/2. There wasa second wave of activation by 6 h that was the least pronounced with CHF5074; C) Blot showing together short and long term increases in ERKby ibuprofen.
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Fig. 10. ERK1/2 regulates Cdc42. Cells were treated with ibuprofenplus/minus the ERK1/2 inhibitor PD9850 (50µM), and Cdc42-GTPloading measured by GLISA. The ibuprofen-elicited Cdc42 activa-tion partially depended on ERK1/2. Values are the means± SEMof 3 independent determinations.∗∗p < 0.01 compared to baseline,and #p < 0.05 compared to the effect in the absence of PD9850,ANOVA analysis, Newman-Keuls post-hoc.
GLISA data showing that profens can reduce RhoA-GTP formation. Of note, only CHF5074 had an effecton RhoA-GTP loading. It is worth stressing that de-creases of basal RhoA-GTP contents have seldom beenreported. For example, studies reporting that ibupro-fen promotes regeneration via RhoA in spinal cord in-jury do not show direct decreases in basal RhoA bythe profen [17,18,45]. Rather, additional activation aswith LPA appears necessary to put on display that agiven factor down-regulates RhoA [17,46,47]. Perhapsthe GLISA is not sensitive enough to detect small butfunctionally relevant decreases in RhoA-GTP contents.
The role of Cdc42 in the stellation caused by profenswas complex. On the one hand, inhibition of Cdc42with DN-Cdc42 completely prevented the effect of thethree profens, indicating a strict need for active Cdc42for stress-fiber disassembly to occur. However, amongprofens, only ibuprofen and R-flurbiprofen activatedCdc42, while CHF5074 caused inhibition. We postu-late that actions of CHF5074 on other targets (RhoAand PAK) leading to stress-fiber disassembly may havecompensated the lack of activation of Cdc42.
The negative results with the Rac1 inhibitor NSC23766 do not support that Rac1 counteracts RhoA in astro-cytes as shown elsewhere. Still, profens caused clear-cut changes in Rac1 activation. Of note, aside fromits role as a cytoskeleton regulatory protein, Rac1 is acomponent of NADPH oxidase [48]. Thus, it is tempt-
ing to speculate that profens may regulate oxidativestress in astrocytes via Rac1.
Unexpectedly, profen-elicited stellation appeareddependenton PAK activation, as judged by the inhibito-ry effect of IPA3 and the increase in pPAK. That thelatter was not robust could be attributed to the alreadyhigh basal levels, or perhaps profens may also regulatePAK by modulating its access to downstream targets.Finally, despite numerous reports supporting a Cdc42-to-PAK link [41,43,49], DN-Cdc42 overexpression didnot alter pPAKser contents nor did IPA3 affect Cdc42activation as judged by GLISA (data not shown), in-dicating that PAK is not directly upstream nor down-stream Cdc42 in astrocytes. Overall, the data suggeststhat profens induce stellation by inhibiting RhoA whileindependently stimulating Cdc42 and PAK (Fig. 11A).Recent reports support a life of PAK dependent on PIXand independent of Rho-GTPases [49].
Migration requires a highly orchestrated regulationof polarity, direction sensing and movement. There issome consensus that Cdc42 or Rac1 account for theformation of the leading edge, while RhoA regulatesthe adhesion/deadhesion of the rear end by controllingthe actomyosin-fiber contraction and the formation offocal adhesions (FA) [26]. The turnover of FA cor-relates directly with FA kinase activity, and inverselywith the activation of RhoA, which is inhibited by FAK(Fig. 11) [50]. The different effects of profens on mi-gration came unexpected in view of evidence that in-hibition of RhoA-dependent pathways, common to thethree drugs, accelerates migration in astrocytes [24,25].Moreover, the profen that appeared to inhibit RhoA themost, CHF5074, produced the greatest deceleration.Loss of polarity appeared to be the cause, as judged bythe severe disarray of astrocyte processes at the mov-ing front. Cells produced multiple processes indicat-ing defective formation of a single, leading protrusionproperly directed towards the chemotactic cues. Thisis exactly the same phenotype resulting from overex-pressing DN mutants of Cdc42 [26,51]. Therefore, theloss of polarity caused by CHF5074 could be attributedto the detected decrease in Cdc42 activation, and theenhanced polarity by ibuprofen and R-flurbiprofen tothe increased activation of this Rho-GTPase.
ERK1/2 appeared to intervene in the paradoxical ef-fects of profens on migration, taken together the follow-ing evidence. First, ERK1/2 inhibition arrested cellsindicating a key role of the kinase in astrocyte direc-tional movement. Second, ERK1/2 activation was low-er or less sustained with the ibuprofen derivatives thanwith ibuprofen itself, that is, there was a correlation
1152 M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes
Fig. 11. Model of profen actions. A) Stellation, showing signaling pathways and targets of the tools used (DN-Cdc42, CA-RhoA or IPA3) (left),and targets of profens (right). Regarding stellation, profens may lead to stress fiber (SF) disassembly by targeting RhoA, Cdc42 and PAK, allwhich converge into myosin light chain kinase (MLCK). B) Migration. During migration Rho-GTPase-dependent signaling is compartmentalizedin the front and rear ends of the cells. Polarity is mediated by ERK1/2/Cdc42, while motion requires cycles of attachment and detachment to thesubstrate regulated by RhoA/ focal adhesion kinase (FAK) dependent signaling. When depicted in blue, FAK or RhoA are active, and when inred inactive. Profens may act in two steps: 1) inhibition of RhoA, thus promoting movement, and/or 2) activation of ERK1/2, thus promotingpolarity and further enhancing movement via FAK. Establishment of polarity and migration may require above-threshold actions on all the stepsregulated by ERK1/2, so that the differing effects of profens on ERK1/2 may underlie different effects on polarity and motion.
between the length of ERK1/2 activation and the mi-gration rates. Third, ERK1/2 inhibition prevented theacceleration caused by ibuprofen. Last, maintenanceof ERK1/2 activation with vanadate restored migrationin CHF5074-treated cells.
That ERK1/2 activated Cdc42, at least partially, issupported by: i) the correlative regulation of both en-zymes by profens. When examined at short times,
ibuprofen and R-flurbiprofen increased Cdc42-GTPand pERK contents, whereas CHF5074 tended to in-hibit both; and ii) the inhibition of ibuprofen-elicitedCdc42 activation by the ERK1/2 inhibitor PD98059. Itis not clear why R-flurbiprofen did not accelerate as-trocyte migration despite the apparent increase in po-larity in the moving front. Recent evidence indicatesthat aside from regulating polarity, ERK1/2 may pro-
M.P. Lichtenstein et al. / Profens Target Rho-GTPases in Astrocytes 1153
mote movement by the activation of FAK [52]. Wespeculate that the increase in ERK1/2 by R-flurbiprofenmay be sufficient to enhance the formation of leadingedges, but insufficient to accelerate the turnover of fo-cal adhesions. Overall, it appears that migration maybe exquisitely regulated by ERK1/2 activity gradientsacting on both polarity and motion. Schematic repre-sentations of possible targets of profens, their impli-cation in effects on astrocyte stellation and migrationtogether with the tools utilized in the study are shownin Fig. 11. In summary, for stellation (Fig. 11A) weposit that profens induce cytoskeleton disarrangementby concerted actions on RhoA, Cdc42 and PAK, allwhich converge into inhibiting MLCK. A key idea inmigration (Fig. 11B) is that differences among profensmay result from the extent of ERK1/2 activation actingon compartmentalized Rho-GTPase-signaling govern-ing polarity and motion. We do acknowledge, however,that the model requires further testing because a limi-tation of the study is that measurements in whole cellextracts do not inform on compartmentalized actionsof Rho-GTPases.
The field of neuroinflammation in AD has taken sev-eral unexpected turns from the Rotterdam epidemio-logical study reporting in 2001 a 80% decrease in therisk of developing AD in long-term users of NSAIDs,to the ensuing failure of some NSAIDs and deriva-tives like R-flurbiprofen in Phase III clinical trials,and now back to a possible redemption of NSAIDs inview of the highly protective effects of naproxen re-ported in ADAPT. Two may have been the confound-ing factors: wrong timing of administration in clin-ical trials, and wrong assumptions on molecular andcellular targets. The view is emerging that disease-modifying drugs, including NSAIDs, will be effica-cious only if administered preventivelybefore neurode-generation is irreparable. The molecular and func-tional targets of NSAIDs, in turn, have been arguablythe most elusive question in anti-inflammatory thera-peutics in AD. Naproxen is not aγ-secretase modula-tor [15] suggesting that the protective effects revealedby ADAPT areγ-secretase-independent. These dataconfirm epidemiological analyses showing no greaterprotective effects byγ-secretase-modulating NSAIDsthan by other NSAIDs [37]. The attention hence shiftsto alternative targets. The recent report that ibupro-fen promotes axon growth by inhibiting RhoA [17,18] points to Rho-GTPases as therapeutic targets ofNSAIDs. Rho-GTPases, as cytoskeleton modulatoryenzymes, control cellular responses requiring fine co-ordination of position changes, be these at large (i.e.
cellular migration) or small scale (i.e., receptor dockingat membranes).
Reactive astrocytes are a hallmark of AD where theycharacteristically cluster around plaques. Evidencepoints to Aβ as a major activator of astrocytes [53]. Thepotential role of astrocytes in AD pathogenesis embod-ies the characteristic neuroprotective and detrimentalduality attributed to microglia and inflammatory cas-cades at large. On the one hand, reactive astrocytesmay neglect supportive functions to neurons includingcontrol of glucose homeostasis, production of glutha-tione, or glutamate uptake [54]. On the other hand,astrocytes can phagocytose Aβ [55], and release cy-tokines like IL6 [56] or chemokines like MCP1 [57] thatstimulate recruitment of local or blood-borne phago-cytes, which contribute to Aβ clearance. At least threeof these detrimental or protective phenomena are reg-ulated by Rho-GTPases, and hence arise as potentialtargets of profens: migration to plaques, transloca-tion of glutamate transporters to the membrane [58],and Aβ phagocytosis [59]. Here, we have shown thatprofens regulate cytoskeleton dynamics in astrocytesvia Rho-GTPases. Current research is aimed at deter-mining whether profens modulate astrocyte migrationin vivo, Aβ clearance, or reverse via RhoA inhibitionthe decrease in astrocyte glutamate transporters report-ed in AD [60,61]. The endeavor of further clarifyingNSAID targets is justified by a meta-analysis of epi-demiological data indicating a 58% reduction of ADincidence by NSAIDs [62]. If this figure is translatedinto patient numbers, NSAID-based therapeutics maystill be a worth pursuing strategy to decrease the socio-economical burdens of AD.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors thank Dr. Bruno P. Imbimbo from ChiesiFarmaceutici (Parma, Italy) for providing CHF5074and GLISA kits, and the culture technician CristinaGutierrez at UAB for her excellent job in astrocyte cul-ture preparations. The study was supported by grants0601030 and 0601031 from the Marato-TV3 Founda-tion (Barcelona, Catalunya) to EG and AG respectively.
Authors’ disclosures available online (http://www.j-alz.com/disclosures/view.php?id=584).
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RESULTADOS
SUPPLEMENTARY FIGURE LEGEND
Supplementary Figures 1-4 Time and dose response of profen-elicited stellation
under phase contrast. Astrocytes were incubated with ibuprofen (100-500 μM), R-
flurbirprofen (100-500 µM), or CHF5074 (10-30 μM) for 0.5-3 h as indicated on the
figures. Profens caused a time and dose dependent soma retraction and process
emission. Scale bar, 25 µm.
Supplementary Figure 5. Lack of effect of COX and secretase inhibitors. Cells
were incubated with 10 μM NS398 (COX2 inhibitor), 25 μM TAPI (α-secretase
inhibitor), 2 μM DAPT (γ−secretase inhibitor) or 1 μM BACE inhibitor IV for 30 min, and
then incubated with 250 μM R-flurbiprofen for 3 additional hours. Cells were then
immunostained for GFAP.
Supplementary Figure. 6. Ibuprofen-mediated stellation is PPARγ independent. Cells were incubated with 20 μM GW9226 (PPARγ receptor antagonist) before adding
250 μM ibuprofen, or pioglitazone (30-100 μM).Cells were immunostained with GFAP.
Supplementary Figure 7. Lack of effect of ERK inhibitor in the stellation. Cells
were incubated with 50 μM PD98059 (ERK inhibitor) prior adding 250 μM R-
flurbiprofen. Cells wereimmunostained with GFAP.
132
Discusión
DISCUSIÓN
1. Inflamación cerebral como diana terapéutica en enfermedades neurodegenerativas
El campo de la neuroinflamación se encuentra en constante evolución por el gran
esfuerzo de investigación que se le está dedicando. El concepto de que la inflamación
es un proceso dañino en el curso de las patologías del SNC está empezando a
cambiar y actualmente se considera que, a no ser que el proceso inflamatorio se
instaure de manera crónica, la inflamación resulta beneficiosa ya que puede estar
participando en procesos de regeneración y/o de mejora funcional. Los efectos
perjudiciales de los astrocitos, cuya reactividad va muy a menudo asociada a todo tipo
de patologías del SNC, han sido cuestionados en experimentos en los que se ha
observado un empeoramiento funcional tras eliminar químicamente los astrocitos
reactivos (Faulkner et al., 2004b), sugiriendo que pueden desarrollar funciones
neuroprotectoras y participar en procesos reparación. Los astrocitos juegan un papel
en el desarrollo y evolución de patologías de distinto tipo, ya sean de origen traumático
como la lesión de espina dorsal, de origen isquémico o en enfermedades
neurodegenerativas. En el caso particular de la AD, los astrocitos expresan toda la
maquinaria necesaria para el procesamiento del APP, y en condiciones inflamatorias
incrementan la producción de Aβ (Lee et al., 2008;Nagele et al., 2004). Son capaces
de migrar alrededor de las placas donde participan en la cascada inflamatoria.
Además, en estadíos avanzados de la AD, los astrocitos reactivos pierden algunas de
las funciones que desempeñan en el control de la homeostasis cerebral, como la
recaptación de glutamato o la síntesis de glutatión, negligiendo su función de soporte a
la actividad neuronal (revisado en (Steele and Robinson, 2010;Fuller et al., 2010)).
Una nueva visión de la reactividad astrocitaria en la que la activación glial resulta
beneficiosa en diferentes aspectos empieza a ser aceptada. La expresión de ciertos
genes inflamatorios durante la reactividad astrocitaria, como la MCP1 provoca la
atracción y diferenciación de precursores neurales a los sitios lesionados (Yan et al.,
2007). Recientemente, la migración astrocitaria está siendo considerada como una
parte esencial del proceso inflamatorio, ya que moléculas inflamatorias como la MMP9
o la NOS2 participan en este proceso (Hsieh et al., 2010;Wang et al., 2010) y puede
resultar beneficiosa ya que la presencia de astrocitos alrededor de los focos
lesionados limita el daño al tejido circundante por su capacidad de encapsular las
células inflamatorias infiltradas (Renault-Mihara et al., 2008). Todo esto convierte a los
astrocitos en dianas terapéuticas relevantes en el estudio de los fenómenos
141
DISCUSIÓN
inflamatorios asociados a las patologías del SNC que cursan con un componente
inflamatorio.
FGF2 participa en la regulación de la reacción inflamatoria astrocitaria. Otros
dogmas en el campo de la neuroinflamación han sido revisados y moléculas ya
conocidas van adquiriendo nuevas funciones, a menudo inesperadas. Algunas
interleuquinas con un claro papel pro-inflamatorio como la IL-1 han sido implicadas
también en fenómenos de regeneración ya que regulan la diferenciación de
precursores neurales (Wang et al., 2007). Otra interleuquina, la IL-6, es también un
potente agente diferenciador para los astrocitos (Nakanishi et al., 2007). En vista de
estas observaciones, es interesante preguntarse si otras moléculas cuya expresión se
ve aumentada durante la inflamación, como son las neurotrofinas, participan también
en la evolución de este proceso. El FGF2 en particular aumenta su expresión en
astrocitos reactivos alrededor de las placas de Aβ (Stopa et al., 1990a), pero también
en situaciones traumáticas (Chadashvili and Peterson, 2006). El papel de las
neurotrofinas y factores de crecimiento en la neuroinflamación es poco claro y
nosotros hemos mostrado en el trabajo 1 que el FGF2, además de las funciones
neurotróficas que se le atribuyen, es un regulador clave en el desarrollo de procesos
de activación astrocitaria. Hemos observado que el FGF2 ejerce un efecto
inmunomodulador a dos niveles, controlando la expresión de genes inflamatorios y la
motilidad de los astrocitos, dos procesos que como hemos mostrado están
relacionados. Nuestros resultados son relevantes en el conocimiento de los procesos
moleculares que tienen lugar durante la activación glial, y muestran nuevas funciones
del FGF2 en los astrocitos.
Los AINES son capaces de regular aspectos importantes de la reactividad astrocitaria. El estudio de los mecanismos celulares y moleculares que conducen a la
aparición y evolución de la AD constituye uno de los temas centrales de la
neurociencia actual. La AD es una patología para la que no existe tratamiento, y
teniendo en cuenta el impacto socio-económico que supone en nuestra sociedad cada
vez más envejecida, la búsqueda de fármacos capaces de modificar su curso y
mejorar la calidad de vida de las personas afectadas y sus familiares, representa un
reto para numerosos científicos. El uso de fármacos que inhiben los receptores de
NMDA, uno de los pocos tratamientos aprobados para la AD, como la memantina
consigue disminuir la muerte neuronal por excitotoxicidad (Volbracht et al., 2006) que
se produce en la evolución de la AD y mejora de manera transitoria algunos de los
síntomas cognitivos, aunque su empleo no consiga frenar el avance de esta
142
DISCUSIÓN
enfermedad. Evidencias recientes muestran que los enfermos de AD, pasan por una
larga fase asintomática que puede durar años, durante la cual se van acumulando los
cambios celulares y moleculares, como son la aparición de las placas de Aβ y ovillos
neurofibrilares así como la activación glial, que conducen luego a los síntomas de la
patología (revisado en (Jack, Jr. et al., 2010). Esto hace pensar que la falta de éxito de
la mayoría de tratamientos que se han ensayado para la AD podría deberse a que han
sido administrados demasiado tarde en la evolución de la patología, cuando los daños
acumulados son difícilmente reparables (Imbimbo et al., 2010), coincidiendo
temporalmente con la aparición de los primero síntomas. Siguiendo esta lógica, parece
razonable pensar que una buena estrategia para modificar el curso de la AD sería
iniciar el tratamiento antes de que aparezcan los primeros signos de la patología con la
intención de evitar la acumulación de daños irreversibles en el SNC modificando así el
curso de la AD, como proponemos en (Lichtenstein et al., 2010)
Hemos centrado nuestro estudio en los AINEs porque representan unos excelentes
candidatos para esta estrategia preventiva. A pesar de los datos negativos obtenidos
en ensayos clínicos con pacientes ya afectados, numerosos estudios epidemiológicos
han asociado el uso crónico de algunos AINEs con un reducción promedio del 50% del
riesgo de padecer la enfermedad (Szekely et al., 2004), aunque se desconoce el
mecanismo de acción. Los AINEs, a pesar de los problemas gástricos que puede
producir su uso prolongado, son fármacos seguros, en el sentido de que han sido
ampliamente usadas para multitud de indicaciones sin presentar efectos secundarios
notables. Además, son fármacos que actúan a través de distintas dianas y su
estructura puede ser modificada para alterar la afinidad que presente respecto a ellas
(Imbimbo et al., 2007). Hemos mostrado en el trabajo 2 que el tratamiento con AINEs
produce cambios morfológicos en astrocitos en cultivo, asociados a una regulación de
la motilidad celular a través de la modulación de la vía Rho GTPasas/PAK/ERK. Estos
nuevos efectos de estos fármacos podrían representar uno de los mecanismos a
través de los cuales los AINEs reducen la aparición de la AD.
143
DISCUSIÓN
2. Nuevo papel de las cascadas de kinasas en la señalización inflamatoria La expresión de las citoquinas y otros genes considerados proinflamatorios puede ser
regulado a dos niveles, a nivel transcripcional y post-transcripcional (Clark et al.,
2009;Ferreiro et al., 2010) y representa uno de los síntomas de la reactividad
astrocitaria. Algunas rutas de señalización como calcineurina-NFAT, JAK/STAT o NF-
kB son bien conocidas en este proceso pero en los últimos años un número creciente
de vías de transducción de señales han sido implicadas en la reactividad astrocitaria y
en la expresión de genes inflamatorios. Entre ellas, se encuentran las MAPK que
participan en la respuesta de las células frente a una gran cantidad de estímulos
inflamatorios, lo que ha suscitado un interés en su estudio como posibles dianas
antiinflamatorias (Munoz and Ammit, 2010). Las MAPK son mediadores clave en la
respuesta transcripcional de organismos eucariotas frente a señales extracelulares.
Controlan la expresión de genes a través de la fosforilación y regulación de diversos
factores de trancripción, proteínas co-reguladores y proteínas presentes en la
cromatina (Whitmarsh, 2007). Un buen ejemplo de esta regulación es la fosforilación
por parte de JNK de c-Jun, que conlleva una mayor actividad trancripcional del
complejo AP-1 en los promotores de algunos genes inflamatorios como MMP9 (Wang
et al., 2009a)..
Por otra parte, otras kinasas más conocidas por su papel regulador de procesos
morfológicos como la formación de especializaciones de membrana o la migración
celular como es el caso de PAK y FAK , han sido implicadas recientemente en
fenómenos de activación glial y de expresión de genes inflamatorios, evidencia que
hemos corroborado en nuestro trabajo,
2.1 Señalización inflamatoria por FGF2 El tratamiento con FGF2 produce en astrocitos la modulación de algunos genes
inflamatorios. Hemos detectado en respuesta a FGF2 la inducción de MCP1 de
manera dosis dependiente monitorizando su expresión por PCR en tiempo real y
Western Blot así como su concentración extracelular por ELISA. Además, hemos
detectado por WB que la presencia de FGF2 induce la expresión de COX2 en
astrocitos. Por otro lado hemos observado que FGF2 producen la inhibición de la
expresión de ICAM1 inducida por LPS a nivel de ARN (RT-PCR) y proteína (ELISA).
144
DISCUSIÓN
Hemos identificado que los efectos inmunomoduladores de FGF2 están mediados por
la actividad de ERK, JNK y FAK.
FGFR2 inicia la señalización por FGF2 en astrocitos. Nuestros datos indican que la
señalización por FGF2 se inicia en astrocitos a través de la activación del receptor
FGFR2. La comparación por Western Blot de la expresión de los FGFR1-3 en
astrocitos respecto a diferentes líneas celulares muestra que el FGFR2 es el de
expresión mayoritaria en nuestros cultivos. Además, la reducción de su expresión
mediante shRNA produce una disminución significativa en la activación de las kinasas
ERK y JNK y en la producción de MCP1 (datos no mostrados) en respuesta a FGF2.
Estos datos coinciden con observaciones in vivo que muestran que la expresión de
FGFR2 se localiza principalmente en astrocitos y aumenta como consecuencia de
lesiones (Chadashvili and Peterson, 2006). Adicionalmente hemos observado que la
expresión de este receptor disminuye en respuesta al tratamiento con el factor
desapareciendo totalmente alrededor de las 12 horas y volviendo al nivel basal a las
24 horas de tratamiento. Este efecto probablemente constituya un mecanismo de las
células para controlar la señalización por FGF2 y evita la sobre-estimulación.
A pesar de que varios estudios atribuyen funciones nucleares a los FGFRs y que
hemos detectado pequeñas cantidades de FGFR2 en el núcleo de astrocitos en
condiciones basales, no hemos observado que el FGFR2 se transloque al núcleo en
respuesta a FGF2 como ha sido descrito para el FGFR1 (Reilly et al., 2004;Maher,
1996). Puede que este efecto sea exclusivo del FGFR1. En cuanto a la señalización
por FGFR2, poco se conoce sobre las vías de señalización activadas por este
receptor, aunque el hecho de que los dominios intracelulares de los 4 receptores
presenten una alta homología sugiere que todos ellos puedan señalizar a través de
vías similares.
ERK, JNK y FAK median los efectos de FGF2 sobre la expresión de genes inflamatorios. Hemos mostrado que la actividad de ERK, JNK y FAK median los
efectos del FGF2 sobre la modulación de genes inflamatorios: inducción de COX2 y
MCP1 e inhibición de la ICAM1. Existen evidencias en la literatura que implican las
kinasas en las que hemos centrado nuestro trabajo en la regulación de estos genes.
ERK está involucrada en la expresión de COX2 en respuesta a IL-1 (Fukushima et al.,
2005), mientras que JNK, junto con ERK, participa también en la inducción de este gen
en respuesta a ADN bacteriano (Yeo et al., 2003). Ambas MAPK promueven la
expresión de MCP1 en astrocitos tras el tratamiento con agentes inflamatorios como el
145
DISCUSIÓN
TNFα y IL-1 (Thompson and Van Eldik, 2009). La activación de FAK tras la interacción
de β-integrinas con sus ligandos resulta en la inhibición de ICAM1 (Yasuda et al.,
2001), y esta kinasa participa también en la inducción de MCP1 en células
mesangiales (Kanegae et al., 2005). Es importante destacar que la MAPK p38 no
participa en los efectos observados del FGF2 a pesar de tener un papel clave en la
inducción de muchos genes inflamatorios como la MCP1 (Thompson and Van Eldik,
2009), juzgado por la ausencia de fosforilación de esta kinasa por Western Blot en
respuesta a FGF2 y la falta de efecto de su inhibidor farmacológico sobre la síntesis y
liberación de MCP1 (datos nuestros no mostrados).
Activación jerárquica de kinasas en respuesta a FGF2. En muchos casos, es
necesaria la coordinación de múltiples vías de MAPK para conseguir un aumento en la
expresión de genes proinflamatorios. Por ejemplo, en algunos contextos se consigue
una potente expresión de TNFα cuando las cuatro vías de MAPK (ERK1/2, JNK, p38 y
ERK5), están activadas (Zu 2000). En concordancia con estos resultados hemos
demostrado que existe una complicada red de interacciones entre ERK, JNK y FAK,
que resultan en la amplificación de los efectos del FGF2 sobre la regulación de genes
inflamatorios. En un primer lugar las MAPK ERK y JNK son activadas en cuestión de
minutos en respuesta a FGF2, participando en la inducción temprana (4-6h) de MCP1
y COX2 (a un nivel notablemente inferior en el caso de la ERK) que hemos detectado
por distintos métodos bioquímicos. Más tarde en la vía de señalización del FGF2,
alrededor de a las 4h, se produce la activación de FAK que también participa en la
expresión de estos genes. El examen de la jerarquía de activación mediante del uso
de inhibidores farmacológicos, revela que existe una regulación recíproca de ERK-
JNK, y FAK-JNK mientras que FAK es capaz de estimular ERK pero no al contrario.
Atendiendo al curso temporal de su fosforilación, más tardío y duradero, FAK podría
ejercer una función de mantenimiento en la señalización inmunoreguladora de FGF2,
participando en la regulación de MCP1 e ICAM1 a través de ERK/JNK, y de manera
relativamente independiente a la ERK, pero dependiente de JNK a la expresión de la
COX2. Es interesante destacar la especificidad de las kinasas en la regulación de los
genes, siendo la inducción de COX2 en gran parte independiente de ERK, a pesar de
lo descrito en otros trabajos (Fukushima et al., 2005).
146
DISCUSIÓN
Figura 1. Representación esquemática de las vías de señalización implicadas en losefector inmunoreguladores del FGF2 en astrocitos
En la bibliografía se encuentran precedentes para el cross-talk de kinasas que
describimos. JNK es capaz de fosforilar a Raf (la MAPKKK de la vía ERK), mientras
que MEK (la MAPKK de ERK) puede fosforilar a JNK en oocitos de Xenopus,
resultando en un loop de retroalimentación positivo (Adler et al., 2005). La síntesis de
algunas interleuquinas dependientes de ERK y JNK requiere de la actividad de FAK
(Neff et al., 2003). El hecho que la activación de estas kinasas sea dependiente de las
demás no excluye que cada una de ellas sea esencial en la señalización de FGF2 y
este observación se corrobora en el estudio de la expresión de MCP1, en la que es
necesario inhibir ERK y JNK simultáneamente para bloquear totalmente la síntesis de
esta quimiocina en respuesta a FGF2.
Efecto de FGF2 sobre la expresión de genes en respuesta a LPS. Para simular las
condiciones inflamatorias en las que la expresión de FGF2 se ve incrementada en el
cerebro, hemos utilizado el LPS, un bien conocido inductor de genes inflamatorios en
todo tipo de células. El LPS señaliza a través del receptor TLR4, que también puede
ser activado por ligandos endógenos que se originan como resultado de trauma o
lesión (Gorina et al., 2011). Así, el estudio de la señalización por TLR4 es
fisiológicamente relevante, ya que participan en la respuesta innata de los astrocitos
frente a infecciones cerebrales de origen bacteriano, pero también frente a
147
DISCUSIÓN
enfermedades neurodegenerativas y otros desórdenes neurológicos como la isquemia
y su modulación por FGF2 no había sido estudiada hasta ahora.
Es importante remarcar que la dosis de LPS escogida, 10 ng/ml, es relativamente baja
en comparación con la que usan otros autores, pudiendo llegar a encontrar en la
literatura trabajos donde es necesario 1µg/ml (100 veces superior) de LPS para
observar una respuesta (Lin et al., 2011). El tratamiento con LPS produce de manera
rápida (30min) una activación robusta y duradera del factor de transcripción NF-κB
para el cual se hallan secuencias consenso específicas en los promotores de los
genes de COX2, MCP1, ICAM1 y en la mayoría de genes inflamatorios. Estas
observaciones indican que: 1) los astrocitos son muy sensibles al LPS, posiblemente
debido a que expresan constitutivamente altos niveles de TLR4 (Bowman et al.,
2003b) y 2) el tratamiento con LPS es un buen control positivo en nuestro modelo ya
que produce la expresión de MCP1, COX2 en mayores niveles que el FGF2 además
de inducir ICAM1.
El cotratamiento de FGF2 y LPS produce un efecto sumatorio. El tratamiento de
nuestros cultivos con FGF2 y LPS simultáneamente resulta en 1) un aumento
significativo en los niveles de expresión de MCP1 y COX2, respecto a los niveles que
se alcanzan con FGF2 o LPS por separado, y 2) la inhibición total de la inducción de
ICAM producida por LPS. En ocasiones el cotratamiento con varios agentes
inmunoreguladores, provoca un efecto sinérgico en la inducción de genes alcanzando
niveles superiores a la suma de los que provocan cada uno por separado (Spooren et
al., 2010). Este no es el caso de FGF2 y LPS que producen un efecto aditivo en el
control de MCP1 y COX2, un hecho que podría explicarse por la participación de vías
de señalización paralelas activadas por LPS como la de NF-κB sobre la señalización
de FGF2.
Efecto inhibidor de FGF2 sobre la expresión de ICAM. El efecto inhibidor del FGF2
0sobre la expresión de ICAM debe producirse a nivel trancripcional o regulando la
estabilidad del mensajero, dado que se observa ya una disminución de la cantidad de
ARN mensajero inducido por el tratamiento con LPS. En este caso el LPS nos permite
estudiar el papel del FGF2 sobre genes que no induce per se. Sobre el control de
ICAM, FGF2 parece actuar de manera similar a otros factores de crecimiento, como el
TGF-β con un claro efecto represor sobre la expresión de moléculas de adhesión
intercelular como ICAM y VCAM (Shrikant et al., 1996a). Un hecho curioso en la
regulación de ICAM es que las mismas vías que son necesarias para su inducción por
148
DISCUSIÓN
LPS son también las responsables de su inhibición. Hemos mostrado por ensayos de
Western Blot que la señalización por FGF2 provoca la fosforilación de la kinasas ERK,
JNK y FAK de una manera robusta y sostenida en el tiempo. El LPS activa también
ERK y JNK pero de una manera mucho más leve y transitoria, y FAK participa también
en la inducción de ICAM ya que en presencia de su inhibidor, como también ocurre
con el PD98 y el SP60, los niveles de ICAM se reducen. Este dato aparentemente
contradictorio podría tener su origen precisamente en el patrón diferencial de
activación de las kinasas, siendo necesaria su activación prolongada para observar los
efectos represores de FGF2 sobre la expresión de ICAM. La inhibición parcial de ICAM
con los inhibidores farmacológicos de las kinasas en respuesta a LPS revela que otras
vías están implicadas en la señalización de LPS. El pool de ICAM remanente podría
ser regulado por el factor de transcripción NF-κB, que hemos visto que se activa de
manera duradera (hasta las 48h) por LPS, y que puede ser activado por vías
independientes de las MAPK y la FAK en respuesta a la activación del TLR4, como es
la vía de IRAK/TRAF/IKK (O'Neill, 2002).
El efecto de FGF2 es independiente de NF-kB. A diferencia del LPS, FGF2 no
promueve la translocación nuclear de NF-κB, contrariamente a lo que se ha propuesto
en otros trabajos (Vandermoere et al., 2005), ni modifica su activación en respuesta a
LPS. Por lo tanto, los efectos inmunoreguladores de FGF2 en astrocitos son
independientes de este factor de transcripción. Aunque disponemos de datos
preliminares mostrando que el factor de transcripción CREB es fosforilado
probablemente por efecto de ERK (datos no mostrados) en respuesta a FGF2, no
hemos examinado en detalle qué papel desenvuelve en la regulación de genes
inflamatorios. Poco se conoce de su función en la inflamación, pero existen estudios
mostrando efectos positivos (Spooren et al., 2010), como negativos sobre la expresión
de genes inflamatorios (Galea and Feinstein, 1999b;Wen et al., 2010). Resultaría
interesante indagar en la participación de CREB en los efectos del FGF2, así como
determinar la posible participación de otros factores de transcripción activados por
FGF2, como Stat3 (Deo et al., 2002), AP1 (Kim et al., 2003) o ATF4 (Malabanan et al.,
2008).
2.2 Regulación de las kinasas PAK y ERK por los profenos Nuestro estudio ha determinado que distintos AINES, entre ellos algunos profenos
como el ibuprofeno, R-flurbiprofeno y CHF5074, además del naproxeno, la
indometacina, el diclofenca y el sulindac sulfato producen de manera dosis-
149
DISCUSIÓN
dependiente la estelación de astrocitos. Ésta se caracterizada por la desorganización
del citoesqueleto de actina asociado a la pérdida de fibras de estrés y por la emisión
de procesos ricos en GFAP.
PAK es activada por los profenos y participan en la estelación. Las kinasas de la
familia PAK han sido tradicionalmente consideradas como efectoras de las GTPasas
Rac1 y cdc42, y su activación participa en el control del citoesqueleto y la transducción
de señales extracelulares (Szczepanowska, 2009). En el SNC se conoce que
participan en numerosos procesos fisiológicos neuronales como son la migración de
precursores neurales, el establecimiento de la polaridad y la morfología y la formación
de las espinas dendríticas, participando en la transmisión sináptica normal (revisado
en (Nikolic, 2008)). Algunos trabajos empiezan a atribuir al mal funcionamiento e
incorrecta localización de las RhoGTPasas (Huesa et al., 2010) y de PAK (Ma et al.,
2008;Salminen et al., 2008) un papel en la AD, lo cual hace fisiológicamente relevante
su estudio en nuestro trabajo. Su papel en la morfología astrocitaria no había sido
caracterizado hasta ahora, y la reciente generación del IPA3, un inhibidor específico
para esta kinasa (Deacon et al., 2008) nos ha permitido identificar algunas de sus
funciones en astrocitos. Hemos mostrado que la inhibición de PAK en nuestros cultivos
mediante el tratamiento con IPA3, previene la estelación inducida por los AINES
sugiriendo que la actividad de PAK es necesaria para que este fenómeno tenga lugar.
En esta línea de evidencias, hemos observado que el tratamiento con AINES produce
un ligero, pero estadísticamente significativo aumento en los niveles de fosforilación de
PAK en Ser144, pero no en Thr423 que es el residuo que se suele usar como
marcador de la activación de esta kinasa denotando que sus mecanismos de
activación son diversos y poco caracterizados. Los estudios de WB revelan que, ya en
condiciones basales, se detectan altos niveles de PAK fosforilada sugiriendo que juega
un papel en la fisiología astrocitaria, lo cual hemos puesto de manifiesto observando
los cambios que produce el IPA3 sobre la morfología astrocitaria. En efecto, hemos
mostrado que en presencia de este inhibidor, los astrocitos presentan un mayor
número de fibras de estrés y éstas muestran un aspecto más robusto y desarrollado.
Estos resultados sugieren que en condiciones basales PAK ejerce una regulación
negativa sobre la formación de las fibras de estrés probablemente regulando
negativamente la actividad de la MLCK, kinasa capaz de regular la formación y
estabilidad de las fibras de estrés, como ha sido descrito (Wirth et al., 2003).
150
DISCUSIÓN
Figura 2. Representación esquemática de las vías de señalización implicadas en laestelación astrocitaria producida por los profenos
La activación de PAK en respuesta a los AINES es independiente de las Rho-GTPasas. El mecanismo de activación de la PAK puede producirse por distintos
mecanismos, siendo el mejo establecido el que se produce por su interacción con las
GTPasas Rac y cdc42 activadas (Szczepanowska, 2009). La unión transitoria de Rac
o cdc42-GTP produce en PAK cambios conformacionales que liberan su dominio
catalítico de interacciones inhibitorias, permitiendo su autofosforilación y dimerización
necesarias para su correcta actividad (Lei et al., 2005). En nuestro modelo, los niveles
de fosforilación de PAK no se ven afectados por la inhibición farmacológica de Rac1,
ni por la sobreexpresión del mutante dominante negativo de cdc42 (datos no
mostrados). Tampoco el aumento producido por el tratamiento con profenos sugiriendo
que estos regulan la actividad de esta kinasa por mecanismos independientes de las
GTPasas. En esta línea, algunos autores han mostrado que PAK puede ser activada
por la interacción con la proteína β-Pix (Lucanic and Cheng, 2008) y si los AINES
regulan la PAK a través de este mecanismo queda por determinar.
ERK es activada por los profenos. Otro hallazgo importante de esta tesis, es que el
tratamiento con profenos produce en nuestros cultivos la fosforilación de la kinasa
ERK. Este descubrimiento es relevante por el gran número de procesos en los que
interviene esta kinasa, como son la activación de factores de transcripción y la
subsecuente expresión de genes aunque nosotros hayamos centrado nuestro interés
en su participación en la migración. Es importante destacar que la activación de ERK
parece ser específica de la vía de señalización de los profenos, ya que otras MAPK,
151
DISCUSIÓN
como JNK o p38, o Akt no son fosforiladas en respuesta a estos fármacos (datos no
mostrados). Hemos determinado también que la fosforilación de ERK es dependiente
de dosis, que se produce de manera muy temprana (en cuestión de minutos) y que es
duradera en el tiempo (hasta las 24h). Aunque los tres profenos que hemos estudiado
con más profundidad son capaces de provocar la activación de esta kinasa, lo hacen
con un patrón distinto, siendo el más potente el ibuprofeno. Resultaría sumamente
interesante estudiar si a través de la fosforilación de ERK los AINES son capaces de
promover la transcripción génica, con la intención de identificar genes mediadores del
efecto protector de estos fármacos sobre la aparición de la AD.
La activación de ERK no participa directamente en la estelación astrocitaria.
Curiosamente la activación de ERK no media los efectos de los profenos sobre la
estelación astrocitaria, ya que esta no se ve modificada por la presencia de PD98,
inhibidor de ERK, a pesar de lo descrito en la literatura (Heffron and Mandell, 2005).
Estos datos están en consonancia con el hecho de que la activación de ERK ocurre de
manera independiente a la actividad de la GTPasas que sí participan en la estelacion.
En efecto ERK es fosforilada a pesar de interferir en la actividad de las Rho-GTPasas
ya sea mediante aproximación farmacológica o por sobreexpresión de mutantes
dominantes negativos o constitutivamente activos (datos no mostrados). A pesar de
esto, hemos observado que sí existe una regulación en el sentido contrario, ya que
ERK parece estar regulando la actividad de cdc42, dado que la presencia de PD98
inhibe la activación de esta GTPasa, juzgada por su unión a GTP, en respuesta a
ibuprofeno. La asociación funcional de ERK y cdc42 ha sido descrita en algunos
artículos (Szczur et al., 2006), y está relacionada con la adquisición de la polaridad
celular como la que hemos observado en astrocitos tratados con alguno de los
profenos en el scratch wound assay.
152
DISCUSIÓN
3. Nuevo papel de las RhoGTPasas en la señalización inflamatoria 3.1 Dianas de los AINES en astrocitos
Con la intención de acotar las dianas de los profenos en el efecto de la estelación
hemos utilizado un abordaje farmacológico. Hemos observado que este efecto se
produce por la modulación que ejercen los AINES sobre algunas RhoA-GTPasas de
manera independiente a otras dianas conocidas de estos fármacos.
La estelación producida por los AINES es independiente de COX2, las secretasas y PPARγ. Para empezar, la estelación no es dependiente de COX2, la
diana mejor establecida de los AINES, ya que no se reproduce con NS398, el inhibidor
farmacológico para esta enzima. Es importante remarcar este hecho ya que los
ensayos clínicos que se han llevado a cabo con el celecoxib (inhibidor específico de
COX2) no han dado resultados positivos (Lyketsos et al., 2007), por lo tanto nuestros
resultados apoyan la teoría de que el efecto protector de los AINEs es independiente
de la inhibición de la COX2. Además como hemos mostrado en esta tesis, COX2 no se
expresa en condiciones basales, pero puede ser inducida por el tratamiento con LPS o
FGF2.
Por otro lado se ha propuesto que los AINEs pueden modular la producción del Aβ a
través de la regulación de las secretasas de dos maneras: 1) reprimiendo a nivel
transcripcional la expresión de la β-secretasa (Sastre et al., 2006), y 2) incidiendo en el
cociente de producción de Aβ40/Aβ42 a través de la modulación de la actividad de la
γ-secretasa (Weggen et al., 2001;Morihara et al., 2002) o a través de la interacción
directa con APP (Leuchtenberger et al., 2009). El control sobre las secretasas podría
explicar la capacidad de los profenos de reducir el número y la superficie de placas en
algunos modelos animales de AD (Heneka et al., 2005). A pesar de estas evidencias y
que nuestros cultivos de astrocitos expresan las α-, β- y γ-secretasas, el efecto de los
profenos es independiente de su actividad ya que no se reproduce con inhibidores
farmacológicos de las tres secretasas. Además, el naproxeno, uno de los pocos AINEs
que no altera la actividad de la γ-secretasa (Weggen et al., 2001;Takahashi et al.,
2003), se comporta de manera muy similar a los demás en cuanto a estelación y
aceleración de la migración, reforzando la idea de que las secretasas no intervienen
en los efectos que hemos estudiado en astrocitos.
153
DISCUSIÓN
Asimismo el pioglitazone, un ligando sintético de los receptores nucleares PPARγ no
reproduce los efectos de los AINEs a pesar de que algunos de ellos, como el
ibuprofeno son capaces de inducir la actividad trancripcional PPARγ-dependiente
(Lehmann et al., 1997). La independencia de la expresión génica para la estelación
producida por los AINEs se corrobora por el hecho de que no se revierten en
presencia de inhibidores de la transcripción génica, ni de la traducción proteica,
además de ser un efecto observable al cabo de minutos después del tratamiento.
De todos estos resultados podemos concluir que los efectos observados en astrocitos
en cultivo tras el tratamiento con AINES, estelación y migración, no están mediados
por su posible acción sobre la COX2, las secretasas o los PPARγ. Esto no excluye que
los AINES actuando sobre estas dianas puedan tener otros efectos sobre los
astrocitos.
3.2 Modulación de las Rho-GTPasa por los AINEs En los estudios bioquímicos hemos reducido la lista de AINES, ciñéndonos a ensayar
los efectos de los profenos, ibuprofeno, R-Flurbiprofeno y CHF5074, por razones
prácticas y porque al inicio de este estudio eran los fármacos más prometedores en
ensayos clínicos de AD. El hecho de que los demás AINEs produzcan un efecto
parecido a los profenos, sobre la estelación y migración astrocitarias (naproxeno e
indometacina) nos permite especular que desencadenan la activación de las mismas
vías de señalización.
Los profenos regulan negativamente RhoA. Hemos observado que la estelación
astrocitaria producida por los profenos es dependiente de la modulación negativa de la
RhoA, ya que el efecto se revierte cuando los astrocitos expresan una forma
constitutivamente activa de esta proteína, o por el cotratamiento con un conocido
activador de las vías dependientes de RhoA como es el LPA (Ramakers and
Moolenaar, 1998). Además el estudio del estado de activación de la RhoA, inferido por
su unión a GTP mediante G-LISA, revela que los profenos son capaces de reducir el
aumento de Rho-GTP producido por LPA. Hemos escogido esta estrategia porque,
como en muchos otros trabajos (Dill et al., 2010;Fu et al., 2007b), no hemos sido
capaces, a excepción del CHF5074, de detectar alteraciones sobre los niveles basales
de Rho-GTP. El aumento en la unión a GTP producida por LPA nos ha permitido
observar el efecto negativo de los profenos sobre la activación de RhoA. Posibles
explicaciones para estas observaciones son que las técnicas utilizadas para estudiar el
154
DISCUSIÓN
estado de activación de esta proteína, como los pull-downs o incluso el G-LISA, no
sean suficientemente sensibles para detectar pequeños cambios en la unión a GTP
que son funcionalmente relevantes para la modificación de la morfología celular. Otra
posibilidad sería que la modulación de los profenos se produzca, además, a nivel del
acceso que tiene la RhoA a su efectores. Resulta curioso que el CHF5074, cuya
estructura había sido diseñada para aumentar su especificidad hacia las secretasas,
en base a la estructura del R-Flurbiprofeno (Imbimbo et al., 2007), sea también el
profeno con mayor capacidad de inhibir a la Rho. Estas observaciones podrían abogar
por una modulación de la RhoA por parte de los profenos dependiente de su acción
sobre las secretasas, que fue descrita en un solo trabajo (Zhou et al., 2003) pero que
no ha podido ser reproducida en trabajos posteriores (Leuchtenberger et al., 2006). El
abordaje utilizado mediante el tratamiento con LPA y el uso de mutantes
constitutivamente activos de la RhoA, nos permite afirmar que, en general, los AINES
regulan negativamente las vías dependientes de la RhoA, aunque desconocemos a
qué nivel.
RhoA como diana terapéutica en astrocitos. Nuestos resultados concuerdan con un
número creciente de publicaciones que muestran que la RhoA es inhibida por algunos
AINEs como el ibuprofeno. En estos estudios se ha estudiado la capacidad del
ibuprofeno de inhibir RhoA en neuronas, promoviendo la regeneración axonal en
lesiones de espina dorsal (Wang et al., 2009c) o en condiciones no permisivas para el
crecimiento de los axones (Fu et al., 2007b). Por lo tanto nuestros resultados
demuestran que el tratamiento con AINES además de tener efectos sobre las
neuronas puede afectar algunas funciones astrocitarias que deben de tenerse en
cuenta. Se ha propuesto que el mecanismo de acción de los profenos sobre la
inhibición de la RhoA podría pasar por la activación de los PPARγ (Dill et al., 2010)
aunque los autores no explican con detalle de que manera un receptor nuclear puede
incidir, por efectos no genómicos, sobre la actividad de la RhoA. En nuestro modelo, la
estelación no es dependiente de los PPARγ, ya que no se reproduce con un ligando
de estos receptores como el pioglitazone, ni se revierte en presencia de un inhibidor
farmacológico de estos receptores. La diana sobre la que actúan los AINEs para
modular la actividad de las Rho-GTPasas queda por lo tanto por determinar y el
conocimiento de ésta sería de vital importancia para el diseño de nuevos fármacos y
estrategias para el tratamiento de la AD.
Los profenos modulan Rac1 y cdc42. Adicionalmente a la regulación de la RhoA,
hemos mostrado en este trabajo que los profenos son capaces de modular la actividad
155
DISCUSIÓN
de otras GTPasas involucradas en el control del citoesqueleto como son la Rac1 y la
cdc42. Estos resultados muestran por primera vez que algunos AINES pueden incidir
en la actividad de estas GTPasas. Hemos observado por G-LISA que el tratamiento
con ibuprofeno y R-Flurbiprofeno resulta en una activación estadísticamente
significativa de estas dos GTPasas, mientras que el CHF5074 ejerce una regulación
negativa sobre ellas. La inhibición de la cdc42 mediante la sobreexpresión adenoviral
de una mutante dominante negativo revela que esta GTPasa participa en el fenómeno
de estelación inducido por los profenos, mientras que la presencia del inhibidor
farmacológico de la Rac1, no revierte el efecto de los profenos. A pesar de esto, la
observación detallada de los cultivos muestra que la inhibición de la Rac1 produce una
reducción en el número y la longitud de los procesos emitidos por los astrocitos
tratados con profenos (datos nuestros no mostrados), por lo que Rac1 activada por el
ibuprofeno y R-Flurbiprofeno podría estar participando en la generación y ramificación
de los procesos astrocitarios durante la estelación. Los datos aparentemente
contradictorios obtenidos con CHF5074 sobre la regulación de la Rac1 y la cdc42 en
comparación con el ibuprofeno y el R-flurbiprofeno, pueden ser explicados por la
posible existencia de mecanismos compensatorios. La fuerte inhibición del CHF5074
sobre la RhoA, o la activación de la PAK podrían sobrellevar la falta de activación de
Rac1 y cdc42 y permitir la desintegración de las fibras de estrés necesaria para la
emisión de procesos.
4. Nuevo papel de la migración en la respuesta inflamatoria Para estudiar los fenómenos de migración astrocitaria in vitro hemos escogido el
modelo del scratch wound assay. Este ensayo altamente reproducible y fácilmente
cuantificable permite estudiar simultáneamente procesos como la adquisición de un
fenotipo polarizado y la migración celular (Etienne-Manneville, 2006). A diferencia de
otras técnicas no es necesaria la generación de un gradiente quimiotáctico para que
las células migren, ya que la simple eliminación de las interacciones célula-célula a
través de la formación de un espacio libre de células, permite a los astrocitos migrar.
Las características de este ensayo nos han permitido estudiar los diferentes efectos de
algunos AINES sobre la migración astrocitaria.
La migración astrocitaria es parte de la respuesta inflamatoria. Es una
consideración reciente la de incluir a la migración astrocitaria como parte de la
reacción infamatoria post-traumática o en el desarrollo de enfermedades
neurodegenerativas. En esta línea, en los últimos años un número creciente de
156
DISCUSIÓN
mediadores considerados inflamatorios han sido implicados en fenómenos de
migración de células gliales, entre ellos MMP-9, TGF-β, NOS2, endotelina, COX2 o
S100β (Bianchi et al., 2011;Hsieh et al., 2010;Wang et al., 2010). La MMP-9 parece
ser el punto de convergencia de muchos los factores pro-migratorios, posiblemente por
su función proteolítica sobre numerosos componentes de la matriz extracelular que
permite el avance de los astrocitos a través de los tejidos. Aunque se conoce que el
FGF2 induce la expresión de las metaloproteinasas MMP-2 y MMP-9 en la migración
de células de músculo liso vascular (Kenagy et al., 1997), la participación de la MMP9
en los efectos del FGF2 en astrocitos queda por determinar. Nosotros añadimos a
esta lista de mediadores inflamatorios que participan en la migración astrocitaria, el
FGF2, MCP1 y COX2.
4.1 FGF2 promueve la migración astrocitaria MCP1 participa en los efectos promigratorios de FGF2. MCP1 es bien conocida
por ser un potente reclutador de macrófagos que migran a los tejidos dañados en
respuesta a esta quimiocina (Rollins, 1996;Bell et al., 1996). En el SNC, la producción
de MCP1 se induce de manera rápida en diversas condiciones inflamatorias y está
asociada a la infiltración de macrófagos provenientes del torrente sanguíneo y a la
activación microglial (Semple et al., 2010a). Los ratones transgénicos que
sobreexpresan esta quimicocina en el SNC muestran una robusta acumulación de
macrófagos en el cerebro (Fuentes et al., 1995), mientras que los KO muestran un
reducción en la infiltración leucocitaria tras la isquemia o trauma (Hughes et al.,
2002;Semple et al., 2010a). A pesar de que se considera que la principal fuente de
MCP1 en el SNC son los astrocitos (Rezaie et al., 2002), poco se conoce sobre el
posible papel autocrino de MCP1 sobre los astrocitos. Estudios recientes ha
demostrado que la deficiencia en MCP1 resulta en una reacción inflamatoria
exacerbada y con un patrón temporal retrasado, tanto en modelos murinos de trauma,
donde se observan mayores niveles de marcadores inflamatorios como IL-1β, IL-6, G-
CSF o CCL3 (Semple et al., 2010a) como en cultivos de astrocitos provenientes del
ratón MCP1 -/- que presentan una mayor producción de IL-6 o TNFα frente a diversos
estímulos inflamatorios como LPS o IL-1β (Semple et al., 2010b). Queda por
determinar si en nuestro modelo la liberación de MCP1 produce efectos similares a los
descritos, siendo responsable de la inhibición de ICAM1.
Nosotros mostramos que MCP1 participa en el fenotipo promigratorio que adquieren
los astrocitos tratados con FGF2, en consonancia con otros estudios que ponen de
manifiesto la capacidad de MCP1 de inducir quimiotaxis en astrocitos (Quinones et al.,
157
DISCUSIÓN
2008;Wyss-Coray et al., 2003b). Asimismo, ejerce funciones neuroprotectoras
(Madrigal et al., 2009b) y participa en el reclutamiento de precursores neurales (Yan et
al., 2007). De todos estos resultados se puede inferir que MCP1 expresado por los
astrocitos en condiciones patológicas es un factor clave en el control de la expresión
de genes inflamatorios y fenómenos de regeneración y que puede resultar una diana
interesante en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.
El mecanismo de acción de MCP1, y las vías de señalización que participan en su
efecto no están bien caracterizados. Se conoce que señaliza principalmente a través
del receptor CCR2, pero algunas evidencias señalan que en su respuesta podrían
participar otros receptores todavía no conocidos (Quinones et al., 2008). No hemos
caracterizado la presencia de CCR2 en nuestros cultivos, pero su presencia, aunque
algo controvertida, se ha detectado en astrocitos humanos (Andjelkovic et al., 2002) y
de ratón (Quinones et al., 2008). La activación del CCR2 conlleva la activación de la
kinasa Akt y el factor de trancripción NF-κB (Quinones et al., 2008) en astrocitos. En
leucocitos se ha descubierto que la trasmigración endotelial inducida por MCP1 se
debe principalmente a los mediadores lipídicos que se producen tras la activación del
receptor CCR2, entre ellos los leucotrienos y el PAK (Reichel et al., 2009). RhoA y
PKC han sido implicadas en la respuesta del endotelio a MCP1 (Stamatovic et al.,
2006;Ashida et al., 2001); así la regulación de la RhoA y las demás Rho-GTPasas
podría también mediar los efectos de MCP1 en la migración astrocitaria.
COX2 participa en los efectos promigratorios de FGF2. COX2 es una isoforma
inducible de las cicloxigenasas cuya expresión se encuentra aumentada en la mayoría
de procesos patológicos del SNC. Su expresión está asociada a la producción de
diversas prostaglandinas, muchas de las cuáles se desconoce su función. La
prostaglandina que se ha sido mejor estudiada es la prostaglanida E2, que es
considerada como un mediador citotóxico de la neuroinflamación (Huang et al., 2005).
Sin embargo decubrimientos recientes denotan que los efectos de la prostaglandina
E2 pueden ser dependientes del contexto, promoviendo la muerte neuronal en algunos
casos y mostrando una acción neuroprotectora en otros (Gendron et al., 2005). Existen
cuatro receptores de prostaglandinas distintos, todos ellos de membrana y asociados a
proteínas G. En astrocitos se ha localizado in vivo la presencia de los receptores EP2
y EP3 (Bilak et al., 2004) e in vitro el EP2 (Hutchinson et al., 2009). La activación del
receptor EP2 en respuesta al tratamiento con activadores farmacológicos específicos o
con prostaglandina E2, resulta en astrocitos en la síntesis y secreción de la
neurotrofina BDNF (Hutchinson et al., 2009), que en muchos modelos de muerte
158
DISCUSIÓN
neuronal tiene un claro papel neuroprotector. Los astrocitos responden al glutamato
sináptico mediante oscilaciones de la concentración de calcio intracelular. Éstas
provocan la liberación de pulsos de prostaglandinas, entre ellas la E2, que
desempeñan funciones importantes en el acoplamiento neurovascular (Zonta et al.,
2003) y la gliotransmisión (Domercq et al., 2006). En los últimos años se están
haciendo esfuerzos para identificar nuevas funciones de las prostaglandinas en el
campo de la neurociencia pero también del cáncer.
Numerosas evidencias de estudios moleculares, animales y en humanos apoyan la
hipótesis de que la sobreexpresión de COX2 y el incremento en la producción de
prostaglandinas desarrollan un papel importante en la carcinogénesis. En efecto la
sobreexpresión de COX2 se observa en la mayoría de lesiones pre-neoplásicas y se
intensifica durante la progresión del cáncer y en la formación de metástasis. Por el
contrario el tratamiento con AINES o inhibidores específicos de la COX2 parecen tener
efectos beneficiosos tanto a nivel preventivo como terapéutico (revisado en (Harris,
2007)). En la misma línea de evidencia, la sobreexpresión de COX2, o el tratamiento
con prostaglandina E2 exógena son capaces de aumentar la migración de células
cancerosas, a través de un mecanismo que involucra al receptor de prostaglandinas
EP1 (Yang et al., 2010). Hemos mostrado en este trabajo que la actividad de la COX2
es necesaria en la aceleración de la migración en astrocitos producida por el FGF2,
apoyando los resultados del trabajo de (Chiu et al., 2010), en el que los autores
observan que un aumento en la expresión de la COX2 es necesario para la migración
astrocitaria inducida por TPA. No conocemos a través de que prostaglandinas en
particular ni a través de qué receptor EP media sus acciones la COX2 inducida por
FGF2 en nuestro modelo, y la señalización a través del eje
prostaglandinas/receptores EP debe ser explorado en profundidad en fenómenos de
activación glial, analizando exactamente cuáles son las prostaglandinas y los
receptores implicados
ICAM no participa en los efectos promigratorios de FGF2. Nuestros resultados
muestran que, a pesar de que el FGF2 es capaz de reducir la expresión de ICAM1
inducida por estímulos inflamatorios como el LPS, la activación de ICAM1 con
anticuerpos específicos (Etienne-Manneville et al., 1999), que reproducen la
interacción que se produce con su receptores Mac1 y LFA1, no interviene en la
migración astrocitaria en nuestro modelo. Estos datos no están en concordancia con
otros estudios que muestran que ICAM participa en la migración de células de
condrosarcoma (Fong et al., 2011) y es bien conocido su papel en la migración de
linfocitos sobre monocapes endoteliales (Adamson et al., 1999) y en la migración
159
DISCUSIÓN
transedotelial (Etienne-Manneville et al., 2000). Puede que el efecto de ICAM sobre la
migración sea específico del tipo celular, o que el hecho de que ICAM participe en la
supervivencia de células cancerosas (Gallicchio et al., 2008) enmascare los resultados
obtenidos en el campo del cáncer. Además, puede que no se reproduzcan en nuestro
modelo todas las complejas interacciones con otros tipos celulares y con la matriz
extracelular que se dan in vivo. La presencia del receptor Mac-1 en microglía sugiere
que las interacciones astrocito-microglía podrían producirse, por lo menos en parte, a
través de ICAM. Por lo tanto no podemos descartar que la reducción en los niveles de
ICAM producida por el tratamiento con FGF2, esté regulando in vivo, de manera
indirecta, a través de la interacción con otras células, la migración astrocitaria.
LPS no induce migración astrocitaria A pesar de que el LPS es capaz de inducir la
expresión de genes inflamatorios como MCP1 y COX2 en mayor grado y de manera
más sostenida que el FGF2, el primero no parece tener efecto sobre la migración
astrocitaria (resultados nuestros no publicados). Estos resultados aparentemente
contradictorios podrían tener su origen precisamente en el distinto patrón de expresión
que muestran MCP1 y COX2 en respuesta a FGF2 o LPS, o, probablemente a otros
fenómenos asociados. Hemos mostrado en el trabajo 2 que las Rho-GTPasas
participan en la migración astrocitaria. Se conoce que el FGF2 es capaz de modular la
actividad de estas proteínas, en particular tiene un efecto inhibidor sobre la Rho y
activador sobre la Rac1 y la cdc42. Estos cambios aceleran y promueven la migración
de células endoteliales de córnea (Lee and Kay, 2006b), y podrían estar asociados a
los drásticos cambio morfológicos producidos por el FGF2 en astrocitos ((Heffron and
Mandell, 2005) y nuestros resultados) y relacionados con el establecimiento de la
polaridad celular. El LPS, en cambio, es capaz de activar la RhoA durante la expresión
de genes inflamatorios (Polk et al., 2007;Shimizu et al., 2007) y podría causar una
mayor estabilidad de las fibras de estrés, la desintegración de las cuales es necesaria
para la formación y el alargamiento del proceso guía y el retraimiento de la parte
trasera de la célula durante procesos de migración. Por otro lado la regulación
diferencial de los dos factores sobre la expresión de la ICAM1 podría explicar las
diferencias en la migración. El incremento de ICAM1 en la membrana de astrocitos,
producido por LPS, podría estar favoreciendo la interacción con otras células, como la
microglía, que expresa el receptor de ICAM 1, LFA-1. La interacción de estas dos
proteínas promueve también la activación de RhoA, que como hemos visto resulta en
un retraso en la migración.
160
DISCUSIÓN
EL hecho de que la actividad de la COX2 sea necesaria para el efecto acelerador del
FGF2 en el scracth wound assay, no es contradictorio con la mayor capacidad
migratoria que muestran los astrocitos tratados con un antinflamatorio no esteroideo
como el ibuprofeno. Las COX son uno de los targets más bien establecidos de los
AINEs, que son capaces de inhibir estos enzimas reduciendo la producción de
prostaglandinas. La generación del espacio libre de células en nuestro modelo no va
asociado con la inducción de la expresión de la COX2, por lo tanto este enzima no
parece ser esencial para la migración en condiciones control. En este trabajo hemos
mostrado que el FGF2 induce su expresión y que al inhibir su actividad, se disminuye
el efecto acelerador proporcionado por el factor. Ya que ni la generación de la herida,
ni el tratamiento con ibuprofeno inducen la expresión de COX2, los efectos positivos
del ibuprofeno sobre la migración astrocitaria parecen ser independientes de la
inhibición de la COX2 lo que representa otra evidencia de que existen dianas
adicionales para los AINEs, y que ibuprofeno y FGF2 promueven las migración por
mecanismos distintos.
Posible papel de las kinasas activadas por FGF2 en la migración. Es interesante
preguntarse a qué nivel participan las kinasas activadas por el FGF2 en el fenotipo
promigratorio, es decir si participan per se en los cambios morfológicos necesarios
para que las células migren o si su contribución es únicamente la expresión de genes
inflamatorios, como la MCP1 o la COX2, que, como hemos mostrado, son partícipes
en el cierre de la herida. Se conoce que la ERK está implicada en el establecimiento
de la polaridad celular y que FAK es el principal regulador de la estabilidad de las
adhesiones focales, la dinámica de las cuales es un proceso clave en el avance de las
células.
Poco se conocía del papel de JNK en la migración astrocitaria hasta que en durante la
elaboración de esta trabajo aparecieron dos estudios implicando a esta kinasa (Hsieh
et al., 2010;Wang et al., 2010). No queda claro si la participación de la JNK es directa
o bien mediada por la inducción de MMP9. En otros tipos celulares el rol de JNK en
procesos de migración está mejor establecido; en células epiteliales se observa JNK
fosforilada únicamente en las células que forman la primera línea de avance del frente
de migración (Altan and Fenteany, 2004), y tiene un papel claro en macrófagos (Iijima
et al., 2005;Guma et al., 2011), o en células tumorales (Zhang et al., 2010b;Mishra et
al., 2010) en fibroblastos en respuesta a FGF2 (Kanazawa et al., 2010) o en microglía
en respuesta a la activación del receptor RAGE (Bianchi et al., 2011).
161
DISCUSIÓN
Desde el punto de vista mecanístico JNK participa en la migración regulando
diferentes procesos, ya que se ha establecido que participa en la formación de
lamelipodios de manera independiente a la expresión de genes (Altan and Fenteany,
2004), y que se localiza un pool de JNK fosforilada en las adhesiones focales (Almeida
et al., 2000), donde puede regular la migración por fosforilación de algunos sustratos
como la paxilina (Huang et al., 2003). También participa en la desintegración de la
uniones adherentes a través de la fosforilación de la β-catenina, pudiendo regular
también la uniones célula-célula que se establecen durante la migración celular (Lee et
al., 2009).
De todos estos datos bibliográficos y del hecho que la inhibición de la migración
astrocitaria es menor con el inhibidor de la COX2 (NS398) o el anticuerpo bloquante
de la MCP1 que con los inhibidores de ERK, JNK y FAK, se deduce que las tres
kinasas juegan probablemente un papel per se en la migración, de manera adicional a
la expresión de COX2 y MCP1. Así, el efecto autocrino del FGF2 sobre los astrocitos
que resulta en la estimulación de la migración por parte del FGF2, debería tenerse en
cuenta además de los efectos tróficos que ejerce sobre las neuronas a la hora de
considerar el mecanismo regenerador del factor en casos de daño cerebral.
4.2 Los profenos en la migración astrocitaria Una vez caracterizadas las vías involucradas en la estelación astrocitaria hemos
centrado nuestro interés en encontrar repercusiones funcionales para los efectos de
los profenos. Como la migración es un proceso necesario para la acumulación de
astrocitos reactivos alrededor de las placa durante la AD, hemos considerado que era
fisiológicamente relevante el estudio de la modulación de la motilidad astrocitaria por
parte de lo profenos. La presencia de astrocitos alrededor de las placas tiene todavía
un significado funcional controvertido. Algunos autores sugieren que los astrocitos son
capaces de fagocitar el Aβ presente en las placas (Wyss-Coray et al., 2003a). Otros
ponen en evidencia que los astrocitos reactivos participan en el daño neuronal
presente durante la AD por mecanismos dependientes del estrés oxidativo o por la
liberación de citoquinas neurotóxicas. Esta controversia podría deberse, entre otros
factores, al estadío en el que se hayan realizado las observaciones, ya que los
astrocitos pierdan su función protectora en los estadíos más avanzados de la patología
(Fuller et al., 2010). Estas observaciones deberían reevaluarse atendiendo al nuevo
modelo de progresión temporal de la AD (Jack, Jr. et al., 2010), en el que la migración
temprana de astrocitos a los primeros focos donde empiezan a formarse nuevas
162
DISCUSIÓN
placas podría ser beneficioso y podría representar uno de los mecanismos a través de
los cuáles los AINES son beneficiosos frenando la apararición de la AD.
Hemos determinado que las proteínas moduladas por los AINES implicadas en la
regulación de la motilidad astrocitaria en el scratch wound assay son RhoA, PAK y la
vía ERK/cdc42. En las primeras fases de la migración, es imprescindible que las
células adopten un fenotipo polarizado para desplazarse en la dirección correcta
(Osmani et al., 2006). La adopción de un fenotipo polarizado es un proceso complejo
que requiere el correcto posicionamiento de algunos orgánulos como el centro
organizador de microtúbulos o el retículo endoplasmático-Golgi y la formación de
especializaciones de la membrana plasmática como los filopodios que emiten los
astrocitos y que representan el frente de migración de estas células (Etienne-
Manneville, 2008). Estos cambios se consiguen a través de vías de señalización
específicas, que pasan por la activación de ERK y cdc42 (Etienne-Manneville, 2004).
La activación de cdc42 está asociada con la adopción de un fenotipo polarizado. En nuestros experimentos, las células control se polarizan en las primeras horas
después de la generación de la zona libre de células, pero en menor grado que las
células tratadas con AINES como el ibuprofeno, el R-flurbiprofeno, el naproxeno o la
indometacina. El CHF5074 representa una excepción en este grupo de fármacos,
porque a pesar de que los astrocitos tratados con este profeno emiten filopodios, estos
son más numerosos y finos, y no se colocan perpendicularmente a la zona libre de
células como es el caso de los demás profenos. Estas observaciones, que revelan un
defecto en la polarización en respuesta a CHF5074, casan con el hecho de que este
fármaco muestra un efecto inhibidor sobre la cdc42, mientras que el ibuprofeno y el R-
flurbiprofeno aumentan su actividad. De esta manera la activación de la cdc42 en
astrocitos en respuesta a los AINES parece estar relacionada con la polaridad.
Desafortunadamente no hemos conseguido determinar si la inhibición de esta
GTPasa, mediante la sobreexpresión del mutante dominante negativo de cdc42,
revierte los efectos de los profenos sobre la polaridad astrocitaria, ya que la infección
adenoviral necesaria para la sobreexpresión del mutante parece tener efectos per se
sobre la migración. Tanto la infección con virus que contienen el vector control, como
los mutante cdc42DN, estimulan la migración respecto a las células no infectadas
(datos no mostrados) lo que dificulta la correcta interpretación de los resultados.
ERK y polaridad. Por otro lado las diferencias observadas entre los tres profenos en
la migración correlacionan con el patrón de activación de ERK. Así, el ibuprofeno, que
163
DISCUSIÓN
de los tres profenos ensayados es el que estimula ERK en mayor grado y de una
manera más duradera, es también aquél que permite un más rápido cierre del área
libre de células. Contrariamente, el CHF5074 que resulta en una inhibición de la
migración, es también aquél que activa la vía de ERK en menor grado. Este efecto
inhibitorio sobre la migración puede ser revertido por un inhibidor de fosfatasas como
el ortovanadato, sugiriendo que los defectos en la activación de ERK por parte del
CHF5074 son responsables de los efectos de este fármaco sobre la migración de los
astrocitos. Tampoco podemos descartar la participación de ERK en la inducción de
algún gen, la identidad del cual queda por determinar, que resulte en un efecto
promotor de la migración y que su expresión sea específica de los profenos que
estimulan en mayor grado la vía de ERK. Paralelamente, hemos mostrado también
que ERK participa en la activación de cdc42, lo que concuerde con todo lo discutido
hasta ahora sobre la polarización y motilidad.
Figura 3. Representación esquemática de las vías de señalización implicadas en laaceleración de la migración astrocitaria producida por los profenos.
Rho y PAK participan en la aceleración de la migración por parte de los AINES. Paralelamente, las actividades del eje Rho-ROCK y de PAK ejercen efectos opuestos
sobre la migración astrocitaria. RhoA y su kinasa efectora ROCK parecen estar
reprimiendo la emisión de procesos y la desintegración de las fibras de estrés
necearios para permitir el avance de las células. En apoyo a esta idea, el inhibidor de
ROCK provoca una aceleración en la migración, simulando el efecto del los profenos,
lo que sugiere que la inhibición de la actividad de la Rho mediada por estos fármacos
participa en su modulación sobre la motilidad. Por otro lado, el tratamiento con IPA3
provoca el efecto contrario, bloqueo de la emisión de procesos y prevención de la
164
DISCUSIÓN
adquisición del fenotipo polarizado mediado por el ibuprofeno, concomitante a un
enlentecimiento en la migración. Estos resultados sugieren que la inhibición de las vías
dependientes de Rho junto con la activación de PAK es necesarias para que tenga
lugar el efecto de los profenos sobre la migración astrocitaria.
5. Conclusiones, valor terapéutico y perspectivas 5.1 FGF2 Nuestros resultados ponen de manifiesto que FGF2 ejerce un papel autocrino sobre
los astrocitos. Ya que en el SNC este tipo celular es la fuente mayoritaria de esta
neurotrofina, y los niveles de FGF2 aumentan en numerosas situaciones patológicas,
el conocimiento de los efectos de FGF2 sobre los astrocitos representa un avance
importante en el entendimiento de los procesos moleculares que tienen lugar durante
la activación glial. Mostramos por primera vez que FGF2 ejerce un efecto
inmunomodulador sobre los astrocitos controlando la expresión de genes inflamatorios
como MCP1, COX2 o ICAM1, concomitante a la promoción de la migración. Por lo
tanto hemos puesto de manifiesto que los factores de crecimiento y otras
neurotrofinas, además de las interleuquinas y quimiocinas, juegan un papel importante
en la inflamación en el SNC, aspecto a tener en cuenta en el estudio de enfermedades
neurodegenerativas. En esta línea, resultaría interesante estudiar los efectos de FGF2
en modelos murinos de enfermedades como la AD o PD, cruzando animales que
sobrexpresan FGF2 específicamente en astrocitos con cepas diseñadas para
reproducir los síntomas de estas patologías y ver cómo afecta los mayores niveles de
FGF2 en el desarrollo de estas patologías.
Por otro lado, nuestras observaciones relacionan la expresión de genes inflamatorios
como MCP1 y COX2 con la migración y representan una evidencia más de que la
migración astrocitaria debe ser considerada como una parte de la respuesta
inflamatoria como está siendo propuesto recientemente por algunos autores. Este
aspecto debe ser incluido en la revisión del modelo inflamatorio que tiene lugar
durante el transcurso de enfermedades neurodegenerativas.
5.2 AINES Hemos mostrado que el tratamiento con AINES produce en astrocitos cambios
morfológicos asociados a la modulación de su motilidad. Esto se produce de manera
165
DISCUSIÓN
independiente a las dianas establecidas de los AINES, como son la COX2, las
secretesas y los PPARγ, y es dependiente del nuevo eje Rho-GTPasas/PAK/ERK que
nosotros hemos identificado.
Nuestro estudio ha desentrañado algunos de los posibles mecanismos moleculares y
celulares del efecto preventivo de los AINES sobre la aparición de la AD. Debería
tenerse en cuenta que los AINEs son fármacos que modulan múltiples dianas, cada
una de las cuales participa en diferentes aspectos de la evolución de la AD. El
componente anti-inflamatorio podría venir dado por la inhibición de la COX2
acompañada de la activación de los receptores PPARγ, potentes represores de la
expresión de genes inflamatorios, mientras que la modulación de las secretasas
reduciría la producción de Aβ disminuyendo la presencia de placas amiloides.
Nosotros añadimos a esta hipotética visión del efecto protector de los AINEs la
regulación de la motilidad astrocitaria a través de la modulación del eje Rho-
GTPasas/PAK/ERK, la cual deberían de tenerse en cuenta en el diseño de nuevos
fármacos o estrategias ideados para prevenir o modificar el curso de esta patología. La
administración de algunos AINES como el ibuprofeno en las fases asintomáticas de la
AD, podría estar promoviendo que los astrocitos migren de manera más pronunciada a
los focos donde se están generando las incipientes placas de amiloide, retrasando o
evitando su formación.
Dada su capacidad de modular la motilidad astrocitaria, el uso de AINES podría
revelarse útil en otras patologías o situaciones traumáticas como la sección de espina
dorsal, en la que estos fármacos promueven el crecimiento axonal de las neuronas a
través de la modulación de la RhoA. El control sobre la migración astocitaria podría
resultar adicionalmente en un regulación sobre la formación o composición de la
cicatriz glial resultando en mejorías funcionales. Estos aspectos deberían ser
examinados con detenimiento por el gran potencial que representan.
Teniendo en cuenta que algunos AINES pueden activar los receptores nucleares
PPARγ, y la vía de las ERK, que es capaz de fosforilar y activar numeroso factores de
transcripción, no es descabellado pensar que estos fármacos pueden promover la
transcripción de genes. El estudio del patrón de expresión génica en respuesta a
AINES mediante la técnica de microarrays en modelos animales de AD se presenta
como una atractiva estrategia para la identificación de putativos genes
neuroprotectores, el conocimiento de los cuales supondría un gran avance en el
estudio de la AD.
166
DISCUSIÓN
167
Conclusiones
168
CONCLUSIONES
Durante el desarrollo de esta tesis doctoral se ha llegado a las siguientes conclusiones:
Trabajo 1
1.1 FGF2 ejerce un efecto inmunomodulador sobre la expresión de genes inflamatorios en astrocitos:
-El tratamiento con FGF2 produce la expresión de MCP1 y COX2
- El co-tratamiento con FGF2 y LPS produce un efecto sumatorio en la expresión de MCP1 y COX2.
-FGF2 inhibe la expresión de ICAM1 inducida por LPS.
1.2 Los efectos inmunomoduladores de FGF2 son dependientes de
- La activación del FGFR2
- Las vías de señalización de ERK, JNK y FAK e independiente del factor de transcripción NF-κB
- Las quinasas que median los efectos de FGF2 muestran una activación jerárquica, existiendo una regulación recíproca de ERK-JNK, y FAK-JNK mientras que FAK es capaz de estimular ERK pero no al contrario.
1.3 FGF2 produce una aceleración en la migración astrocitaria dependiente de MCP1, COX2 y FAK/ERK/JNK.
Trabajo 2
2.1 El tratamiento con AINEs provoca de manera dosis dependiente la estelación astrocitaria.
2.2 Ibuprofeno, naproxeno e indometacina aceleran la migración astrociataria, mientras que el R-Flurbiprofeno no tiene efecto y el CHF5074 la retrasa. Este efecto diferencial sobre la migración astrocitaria está relacionado con la adopción de un fenotipo polarizado a través del grado de activación del eje ERK/cdc42.
2.3 Los efectos de los profenos están mediados por su modulación sobre las Rho-GTPasas y las kinasas ERK y PAK y de manera independiente de de COX2, las secretasas y los PPARγ:
-Ibuprofeno, R-Flurbiprofeno y CHF5074 regulan a la baja las vías dependientes de RhoA.
-Ibuprofeno y R-Flurbiprofeno activan Rac1 y cdc42, mientras que el CHF5074 las inhibe.
169
CONCLUSIONES
-La activación de las vías de señalización dependientes de ERK y PAK por parte de los profenos participa en la modulación de la migración astrocitaria.
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Otras publicaciones
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Frontiers in Aging Neuroscience www.frontiersin.org October 2010 | Volume 2 | Article 142 | 1
AGING NEUROSCIENCEPersPective Article
published: 25 October 2010doi: 10.3389/fnagi.2010.00142
III clinical trials. In this review we will argue that wrong timing of drug administration, incomplete knowledge, and biased assump-tions about of the role of neuroinflammation in neurodegeneration may have led to the current impasse. Revision of anti-inflammatory treatments in the light of the dynamic model of AD progression will thus provide new research and clinical directions.
EpidEmiological data and clinical trialsThe epidemiological studies and clinical trials that, in striking number – over 40 –, have been developed to examine the benefits of NSAID in AD have been thoroughly described elsewhere (Imbimbo et al., 2010). The results are paradoxical: while the epidemiological data points to a reduced incidence of AD in NSAID users, most of the ensuing clinical trials in AD or mild cognitive impairment (MCI) have shown no effect or even detrimental effects. These results have casted serious doubts on epidemiological analyses and, therefore, on NSAID-based therapeutics for AD after the initial hype in the 90s. In hindsight, among the several explanations put forth to explain the discrepancy between epidemiological data and clinical trials – including wrong choice of NSAID or dosage in clinical trials, recall bias in epidemiological studies, or that arthritis, not NSAIDs, is the
introductionA group of leading Alzheimer’s disease (AD) experts have recently integrated available information about the five best characterized biomarkers into a dynamic model of disease evolution overtime (Jack et al., 2010). This groundbreaking contribution provides a framework to select individuals for clinical trials, and decide upon outcome measurements. According to the model, AD progresses in a continuum where stages can be defined by biomarkers. There is a damaging phase wherein amyloid β(Aβ) and hyperphosphorylated tau accumulate (phase 1), followed by a phase of synaptic and meta-bolic alterations (phase 2), which leads to a final stage when clinical symptoms – cognitive impairment and brain atrophy – are detected (phase 3). This model fairly recapitulates the emerging view that there is a clinically silent phase in AD that can last up 20 years before dementia is manifest. Henceforth, any therapy for AD will need to be contrasted with this paradigm. This is the case of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). The field of neuroinflamma-tion in AD has taken several unexpected turns from the Rotterdam epidemiological study reporting, in 2001, a 80% decrease in the risk of developing AD in long-term users of NSAIDs, to the ensuing failure of some NSAIDs and derivatives like R-flurbiprofen in phase
Staging anti-inflammatory therapy in Alzheimer’s disease
Mathieu P. Lichtenstein1, Paulina Carriba1, Roser Masgrau1, Aurora Pujol2,3 and Elena Galea1,2*1 Institut de Neurociències, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, Spain2 Institut Catalá de Recerca i Estudis Avançats, Barcelona, Spain3 Institut d’Investigació Biomèdica de Bellvitge, Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spain
The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in Alzheimer’s disease (AD) is controversial because conclusions from numerous epidemiological studies reporting delayed onset of AD in NSAID users have not been corroborated in clinical trials. The purpose of this personal view is to revise the case for NSAIDs in AD therapeutics in light of: (i) the last report from the only primary prevention trial in AD, ADAPT, which, although incomplete, points to significant protection in long-term naproxen users, and (ii) the recently proposed dynamic model of AD evolution. The model contends that there is a clinical silent phase in AD that can last up to 20 years, the duration depending on life style habits, genetic factors, or cognitive reserve. The failure of many purported disease-modifying drugs in AD clinical trials is forcing the view that treatments will only be efficacious if administered pre-clinically. Here we will argue that NSAIDs failed in clinical trials because they are disease-modifying drugs, and they should be administered in early stages of the disease. A complete prevention trial in cognitively normal individuals is thus called for. Further, the shift of anti-inflammatory treatment to early stages uncovers a knowledge void about the targets of NSAIDs in asymptomatic individuals. AD researchers have mostly relied on post-mortem analysis of Aβ plaque-laden brains from demented patients or animal models, thus drawing conclusions about AD pathogenesis based on late symptoms. We will discuss evidence in support that defective, not excessive, inflammation underlies AD pathogenesis, that NSAIDs are multifunctional drugs acting on inflammatory and non-inflammatory targets, and that astrocytes and microglia may play differing roles in disease progression, with an emphasis of ApoEε4 as a key, undervalued target of NSAIDs. According to a meta-analysis of epidemiological data, NSAIDs afford an average protection of 58%. If this figure is true, and translated into patient numbers, NSAID treatment may revive as a worth pursuing strategy to significantly reduce the socio-economical burden imposed by AD.
Keywords: ibuprofen, naproxen, astrocytes, ApoE, microglia, biomarkers
Edited by:Paul G. Luiten, University of Groningen, Netherlands Antilles
Reviewed by:Ana I. Duarte, University of Coimbra, PortugalJose G. Castaño, Universidad Autónoma de Madrid, Spain
*Correspondence:Elena Galea, Institute of Neurociències, Edifici M, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra, Barcelona, Spain. e-mail: [email protected]
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Lichtenstein et al. NSAIDs for Alzheimer
protective factor – a research group in Baltimore may have got it right. They argued that, since protection was only observed after sustained uptake well before the onset of AD, NSAIDs were preven-tive and would not work in clinical trials with patients. To test this idea, they launched in 2000 a primary prevention trial, the ADAPT trial, to test the effect of naproxen (a dual cycloxygenase type 1, COX1 and 2, COX2 inhibitor) and celecoxib (a selective COX2 inhibitor) in healthy volunteers, 70-years-old in average. Unfortunately, the ADAPT trial was cancelled after 2 years and a half over concerns of cardiovascular damage by COX2 inhibitors, although the group have kept reporting the progression of AD incidence overtime. At the time of cancellation, no protection was observed by NSAID, and even the cohort taking naproxen appeared to fare worse than the placebo group. However, 2 years later (i.e., 4 years after the start of the treat-ment) the data indicated (70% protection in naproxen users (Hayden et al., 2007). That is, naproxen conferred protection to people in the path to have dementia if they were at least 4 years shy of developing clinical signs. The evidence supports that NSAIDs need to be taken during preclinical phases of AD, and would validate the conclusions of epidemiological data. It is worth stressing that numerous clinical trials for AD with purported disease-modifying drugs have spectacu-larly failed in the last years (Sabbagh, 2009). These sobering results have prompted the view that disease- modifying drugs, including NSAIDs, will be efficacious only if administered preventively before neurodegeneration is well advanced. According to a meta-analysis of epidemiological data (Szekely et al., 2004), NSAIDs reduce AD incidence by an average of 58%. If this figure is translated into patient numbers, anti-inflammatory treatment arises as a worth pursuing strategy to significantly reduce the socio- economical burden caused by AD. But first, a complete prevention trial is necessary. The ADAPT trial illustrates the difficulties of primary prevention trial design, including selecting individuals on their way toward AD, tracking disease progression, and deciding upon most efficient treatment drugs and protocols. Considering that the average onset of AD is 65- to 70-years-old, and that NSAIDs work only if taken 4 years before the disease is clinically detected, participants in the prevention trial should be 60- to 65-years-old. Are currently available cognitive, neuroimaging, and blood tests valid to include individuals in the trial, and to measure outcomes? The experience accumulated by the Alzheimer’s Disease Cooperative Study (ADCS) dictates that Aβ42 contents in cerebrospinal fluid (CSF) can be used for subject selec-tion ((193 pg/ml, cut-off value), while fluorodeoxyglucose (FDG) contents and hippocampal volume are appropriate surrogate markers for disease progression (Aisen, 2010; Jack et al., 2010). The former can be traced by positron emission tomography (PET), while the latter is routinely assessed with magnetic resonance (MRI). Importantly, participants should carry the allele ε4 of apolipoprotein E (ApoEε4) because, according to epidemiological data, NSAIDs are effective only in this subpopulation (In’t Veld et al., 2001; Yip et al., 2005; Hayden et al., 2007; Szekely et al., 2008), which brings up the next question about the target of NSAIDs.
molEcular, cEllular, and functional targEts of nsaidsThe quest for the underpinnings of NSAID-mediated protec-tion is confounded by two factors. One, the realization that AD progresses in stages implies that NSAID actions may differ with
the stage of disease progression. Two, NSAIDs may be multifunc-tional drugs targeting non-inflammatory molecules aside from cyclooxygenases (COXs).
In the model of AD progression, asymptomatic phases 1 and 2 are the target zones for preventive therapy (Figure 1), and presum-ably where NSAIDs are acting upon according to epidemiological data. Decreased CSF-Aβ42 defines phase 1, while increased CSF-tau, decreased PET-FDG, and decrease of hippocampal volume are signs of neuronal injury and dysfunction in phase 2 (Jack et al., 2010). The “inflammation” associated to these preclinical phases is not well characterized. In general, “neuroinflammation” has grown to be a too wide term encompassing a body of standard reactions against tissue damage or infection, with little consideration for specifics of disease, stage of disease progression, brain area, or cell type. In AD, researchers have mostly relied on post-mortem brains from demented patients, plaque-laden transgenic models, or cell cultures. The use of these materials has imposed a biased view of inflammation in AD pathogenesis, based on observations pertaining phase 3, which place microglia-derived neurotoxins as culprit of the disease (see below). A single study illustrates this misconception. Jacobsen et al. (2006) have reported dendrite dam-age, memory deficits and behavioral alterations in a transgenic-mouse model of AD months before Aβ plaques appear. Glial cells, the holders of the innate immune system, could not account for this early damage because reactive astrocytes and microglia were visible later, in parallel with plaque deposition. Whether a subtle earlier glia response went unnoticed, or if a second wave of dam-age followed the plaque-associated canonical inflammation was not determined. In order to understand the modus operandi of NSAIDs it is necessary to: (i) define stages 1–3 in animal models, and (ii) focus on asymptomatic or early stages in disease progres-sion in mice and humans. Specifically, we have to clarify the role of glial cells on: (i) mitochondrial damage, production of reactive oxygen species (ROS), and oxidative lesions to proteins or nucleic acids, (ii) metabolic impairment, as defined by PET-FDG, and (iii) decreases in hippocampal volume, all preclinical or early signs of damage in humans (Fox et al., 1999; Nunomura et al., 2001; Petrie et al., 2009; Martinez et al., 2010). In AD transgenic mice, oxidative damage to lipids occurs before Aβ deposition (Pratico et al., 2001), and an interplay exists between Aβ production and oxidative dam-age (Tamagno et al., 2002; Lustbader et al., 2004). Whether glial cells reinforce or attenuate these cascades, and if astrocytes and microglia have different roles, remain unknown.
The possible multifunctional nature of NSAIDs is supported by cumulative evidence showing that the drugs, other than COX, can target γ-secretase (Weggen et al., 2003), Rho-GTPases (Fu et al., 2007), and peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) (Nicolakakis et al., 2008). The γ-secretase mediates production of Aβ, while Rho-GTPases regulate several phenomena relevant to AD including axon growth (Fu et al., 2007), tau phosphorylation (Sayas et al., 1999), and astrocyte motility (Lichtenstein et al., 2010). Finally, PPARs are powerful modulators of inflammation (Pascual et al., 2005), oxidative stress (Nunomura et al., 2001; Kang et al., 2005), and Aβ production via BACE (Sastre et al., 2006).
The real molecular target of NSAIDs has been arguably the most elusive question in anti-inflammatory therapeutics in AD. In the early 90s it was thought that NSAIDs prevented via COX2
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Lichtenstein et al. NSAIDs for Alzheimer
the detrimental effects of chronic microglia activation. The failure of clinical trials with COX2 inhibitors and corticosteroids, together with the fortuitous finding that some NSAIDs modulated γ-secretase, thereby decreasing the production of Aβ42, prompted researchers and companies to modify the chemical structure of NSAIDs to increase specificity and potency toward γ-secretase. R-flurbiprofen was born (Kukar et al., 2007) but failed in Phase III clinical trial (Green et al., 2009), probably because, as we believe now, disease-modifying drugs are only effective pre-clinically. Of note, naproxen is not a γ-secretase modulator (Takahashi et al., 2003), suggest-ing that the protective effects revealed by the recent ADAPT trial follow-up are γ-secretase-independent. Whether NSAIDs act on PPAR receptors and/or Rho-GTPases in vivo is unknown, but it is desirable that they did, in view of the large number of possible beneficial actions (Table 1). Efforts to streamline NSAID specificity may thus render therapeutically weaker drugs, and should await further characterization of NSAID targets. Finally, COX1 should be redeemed back for now as a possible target in view of recent evidence indicating robust protective effects of triflusal in a AD mouse model (Choi et al., 2009; Coma et al., 2010).
thE rolE of apoEξ4The startling conclusion from the epidemiological data that NSAIDs are protective exclusively in ApoEε4 carriers (In’t Veld et al., 2001; Yip et al., 2005; Hayden et al., 2007; Szekely et al., 2008) places the lipoprotein as a possible target of NSAIDs. Although inheritance of ApoEε4 allele is the strongest known risk factor for the development of sporadic AD (Ertekin-Taner, 2010), the mechanisms underlying this correlation are not well understood. ApoEε4 carriers actually experience memory loss beginning in their fifties (Caselli et al.,
2009), strongly indicating that ApoEε4-related damage is an early event in disease progression. ApoE controls cholesterol homeosta-sis. Most of the evidence indicates that ApoE promotes the clearance and/or degradation of Aβ via the physical interaction between the two proteins, and that ApoEε4 performs this function worse than ApoEε3 or ApoEε2 (Kim et al., 2009), thereby contributing to Aβ accumulation in the brain. Moreover, ApoE is immunomodulatory (Pocivavsek et al., 2009), and the allele matters: ApoEε4 is associ-ated to greater production of pro-inflammatory cytokines than ApoEε3 in mice challenged with lipopolysaccharide (Vitek et al., 2009). This indicates that apoEε4 protein may alter inflammation partly by dose effects (i.e., a net decrease in ApoE production), and partly by being qualitatively different than ApoEε3.
FigurE 1 | integration of NSAiD actions in the dynamic model of AD evolution. Adapted from Jack et al. (2010). Dysfunctional astrocytes would exert a primary role in early disease events by promoting Aβ accumulation, and by affecting neurovascular coupling, metabolic homeostasis, or synaptic plasticity. Microglia activation would be secondary to Aβ accumulation and neuronal
damage. NSAID effects would depend on the stage of disease progression. Initially, the drugs would be beneficial by counteracting ApoEε4-mediated detrimental effects, whereas in advanced stages NSAID may offer no protection, or become detrimental by further blocking faulty microglia/myeloid cell attempts at Aβ clearance and tissue repair.
Table 1 | Possible targets of NSAiDs.
Molecular target Functional target references
PPAR Inflammation (via NFkB) Pascual et al. (2005)
Oxidative stress Nunomura et al. (2001),
Kang et al. (2005)
Apoptosis Fuenzalida et al. (2007)
Cerebrovascular protection Nicolakakis et al. (2008)
BACE Sastre et al. (2006)
Rho-GTPases Axon growth Fu et al. (2007)
Tau phosphorylation Sayas et al. (1999)
Astrocyte motility Lichtenstein et al. (2010)
COX Microglia modulation Choi et al. (2009)
ApoE Astrocyte dysfunction Zhong et al. (2009)
γ-Secretase Reduction of Ab42 Weggen et al. (2003)
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Lichtenstein et al. NSAIDs for Alzheimer
reports that chronic overexpression of IL-1( in the hippocampus of APP/PS1 transgenic animals results in decreased plaque burden and insoluble Aβ peptide, with no alterations in A( processing or APP expression (Shaftel et al., 2007). The increased number of peri-plaque microglia points to increased Aβ phagocytosis as the underlying mechanism, consistent with the observation that micro-glia expresses phagocytic markers (Jimenez et al., 2008). Thus, there is a basis to support that microglia are phagocytes, but the following points have to be made.
(i) Resident microglia has little phagocytic capacity toward Aβ according to animal models (Simard et al., 2006; Majumdar et al., 2008; Grathwohl et al., 2009). The phagocytic potential can be enhanced or restored with inflammatory agents such as IL-1β (Shaftel et al., 2007), lipopolysaccharide (Herber et al., 2004), or granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) (Sanchez-Ramos et al., 2009). That is, “classic” inflammation activates the “alternative” phenotype. It follows that inhibition of the former may cause inhibition of the latter. A proportion of brain phagocytes are blood or bone-marrow derived mono-cytes, which infiltrate the brain and cluster around Aβ plaques (Malm et al., 2005; Simard et al., 2006; Butovsky et al., 2007; Town et al., 2008). Interestingly, monocyte recruitment depends on the chemoattractant MCP-1 (El et al., 2007), pointing to a cross-talk between cerebral and peripheral immune systems.
(ii) Ultrastructural analysis of post-mortem brains from AD patients reveals no sign of Aβ fibers in the lysosomal system of peri-plaque microglia (Wisniewski et al., 1992), despite the fact that they express the phagocyte marker human leukocyte anti-gen type DR (HLA-DR) (McGeer et al., 1987). This suggests defective activation. Currently, researchers are pursuing various means to activate Aβ phagocytosis in brain by resident or infil-trated cells. Strategies include immunotherapy (Schenk et al., 2004), or infusion of Aβ-specific T-cells (Ethell et al., 2006).
(iii) Microglia or myeloid cells can also contribute to Aβ removal through the release of proteolytic enzymes (Jiang et al., 2008), or the component system element C3 (Wyss-Coray et al., 2002). Activation of the complement system would thus have a protective rather than the allegedly detrimental role in AD.
Overall, it appears that the inflammatory activation of microglia detected in clinical stages of AD, or in plaque-laden transgenic-mouse brains, is destined, however inefficiently, to remove Aβ and to promote repair implicating the peripheral immune system.
conclusions and pErspEctivEs of anti-inflammatory trEatmEnt in alzhEimEr’s disEasESurveillance, coordinated recruitment of immune cells, removal of damaging elements, and tissue repair, that is, the set of sequential reactions known as “inflammation”, are functions of the innate immune system in the brain, as elsewhere. We postulate that a defec-tive rather than an excessive inflammatory response contributes to AD pathogenesis. Our view has three core ideas (Figure 1):
(i) One is that ApoEε4 plays a key role in early disease pathogenesis by damaging astrocytes, the principal holders of the lipopro-tein. Consequences of astrocyte dysfunction would be: (a) Aβ
Surprisingly, despite this evidence, ApoEε4 has not been at the center stage of AD therapeutics. The principal cells that secrete ApoE in the brain are astrocytes and, to a lesser extent, microglia. A recent structural analysis of ApoE isoforms has revealed that domain inter-action and protein misfolding – caused by a difference in a single amino acid – distinguish ApoEε4 from ApoEε3 and ApoEε2 (Zhong et al., 2009). The introduction of an ApoEε4-like domain interaction in mice results in endoplasmic reticulum (ER) stress in astrocytes, associated to severe cognitive deficits (Zhong et al., 2009). This indi-cates that astrocyte dysfunction affecting neurovascular coupling, synaptic plasticity, metabolic homeostasis – all phenomena con-trolled by astrocytes –, along with impaired clearance of Aβ and altered inflammation, may underlie ApoEε4-related damage in AD. Conversion of ApoEε4 into ApoEε3 by disrupting the domain inter-action with small molecules is currently being pursued as a therapeu-tic approach (Ye et al., 2005). It is tempting to speculate that some NSAIDs may act as domain-interaction disruptors, and/or reverse early astrocyte alterations associated to ApoEε4 expression.
thE rolE of microgliaThe clustering of microglia around plaques in post-mortem AD brains (Haga et al., 1989) has contributed to three central tenets in the field of neuroinflammation and AD. One is that micro-glia, challenged by Aβ, release neurotoxic factors like ROS, reac-tive nitrogen species, and elements of the complement system, as well as inflammatory mediators including interleukin-1β (IL-1β), monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), which engage other cells, includ-ing astrocytes and vascular cells, in a complex interplay of signal-ing loops that amplify the inflammatory reaction, and cause great damage to neurons. The second tenet is that pathology arises when microglia is chronically activated, either due to persistence of the inducers, or a failure in the resolution mechanisms. And the third tenet is that microglia contributes to removal of Aβ plaques by phagocytosis. The terms “classic” and “alternative” have been coined to define the pro-inflammatory versus the phagocytic status of microglia activation, the latter being associated to production of growth factors (De et al., 2003). Careful perusal of the evidence offers, however, the following, alternative angles to these tenets.
While a wealth of data from brains from diseased individu-als and mouse models demonstrates that microglia express pro-inflammatory mediators, data is scant in support that these cause disease; information is also lacking about the dynamic interplay of functional microglia phenotypes overtime. The noxious role of microglia is largely based on: (i) immunohistochemical correla-tions (Griffin et al., 1995; Arends et al., 2000; Vehmas et al., 2003); and (ii) in vitro findings, cultures being a pathological condition because the mechanical stress implicit in the isolation procedure renders microglia overly reactive (Streit, 2010). Moreover, cultures are prepared from postnatal microglia, which may not recapitulate the decline of microglial functions in aging (Sastre and Gentleman, 2010). Alternatively, mitochondrial alterations and oxidative dam-age, the early signs of damage in AD, may be directly caused by soluble Aβ (Tamagno et al., 2002; Lustbader et al., 2004), and/or be secondary to vascular, metabolic, and synaptic alterations caused by ApoEε4-harboring dysfunctional astrocytes. As to the notion that sustained inflammation is detrimental, a recent study
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Lichtenstein et al. NSAIDs for Alzheimer
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In summary, the motto for NSAID therapeutics in AD should be “the earlier the better”. In order to test these ideas necessary efforts are: (i) a prevention trial with a non-selective NSAID in ApoEε4 carriers, (ii) to define the dynamic evolution of inflammation in AD with an emphasis on preclinical stages; (iii) to define the par-ticulars of microglia and astrocytes, e.g., regulation and role of “classic” and “alternative” phenotypes (in both glia types); (iv) to define the biological role of ApoE in glia, and (v) to characterize the molecular targets of NSAIDs and their effect on different glia phenotypes.
The slow progression of AD, while complicating our under-standing of the disease, gives opportunities for intervention. The duration of the clinically silent phases seems to be influenced by genetic and lifestyle factors, and by cognitive reserve, an indication of brain resiliency. Future research will clarify whether routinary protocols for AD prevention should include NSAIDs.
build-up due to impaired clearance/degradation, (b) alterations of functions depending on astrocytes (neurovascular coupling, metabolic homeostasis, and synaptic activity), which will be fur-ther impaired by excess Aβ, and (c) impaired release of growth factors (e.g., fibroblast growth factor type 2), cytokines (e.g., IL-6) or chemokines (e.g., MCP-1), thus hindering neuronal protection and the full completion of inflammatory cascades.
(ii) The second idea is that microglia becomes progressively acti-vated overtime, although sub-optimally, in response to fibril-lar Aβ accumulation and, in later stages of the disease, due to signals released by dying cells.
(iii) NSAID actions depend on the stage of disease progression. Early administration of NSAIDs would delay disease pro-gression by multitargeted actions on ApoEε4, Aβ production, oxidative damage, tau hyperphosphorylation, or synaptic plasticity (Table 1). Available knowledge is incomplete to understand how NSAIDs may regulate overtime the complex spectrum of microglia phenotypes, but we posit that late administration of NSAIDs in the course of the disease – as in clinical trials – may interfere with the cross-talk between
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Conflict of Interest Statement: The authors declare that the research was conducted in the absence of any com-mercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.
Received: 30 July 2010; accepted: 16 September 2010; published online: 25 October 2010.Citation: Lichtenstein MP, Carriba P, Masgrau R, Pujol A and Galea E (2010) Staging anti-inflammatory therapy in Alzheimer’s disease. Front. Ag. Neurosci. 2:142. doi: 10.3389/fnagi.2010.00142Copyright © 2010 Lichtenstein, Carriba, Masgrau, Pujol and Galea. This is an open-access article subject to an exclusive license agreement between the authors and the Frontiers Research Foundation, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original authors and source are credited.
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Agraïments
Aquesta tesi no hagués estat possible sense l’ajuda, els consells i el recolzament de moltes persones. Tantes, com totes les persones que formen part del Departament de Bioquímica i dels diferents laboratoris pels que el meu grup ha anat passant.
De ben segur que no imaginava, aquell dia de setembre fa quasi set anys sortint de l’IBB després de l’entrevista amb la Elena, que tal nit com aquesta em trobaria valorant l’experiència d’haver fet una tesi doctoral i adonant‐me de com he canviat tant a nivell personal com científic i del munt de coses que he après. Moltes d’aquests coses les hi dec a l’Elena. Recordo que aquell dia vam estar parlant sobre els astròcits, uns cèl∙lules que a penes havia sentit nomenar durant la carrera, que expressaven factors de creixements nuclears i que els neurotransmissors eren antiinflamatoris... Estic content, passat el desconcert inicial per la novetat que representava per mi tot allò, d’haver triat fer la tesi amb tu. D’ençà, el temps ha passat i són molts el aspectes, crec, en els que he millorat. Des de com planificar un experiment, fins a com funciona un laboratori. Aprendre a perseverar, i no tenir por d’anar a contracorrent. Gràcies per permetre’m conèixer el món de la neurociència i per alimentar i educar la meva curiositat i interès científic.
Tot va començar al laboratori de Neuroquímica de l’IBB on vaig tenir la sort de conèixer a la Judit, companya de penes i alegries durant tota la meva estada a la UAB. De tu he après que els reptes per molts durs que semblin, són superables. Em quedo amb el teu enfoc alegre de la vida i la teva personalitat inquieta. Estic content, que malgrat l’època dura que ens va tocar passar al principi, les coses s’hagin arreglat pels dos, però.... ara no t’adormis i posa’t a escriure ja!! Agraïments també per a la Paula i la Marian i records per a tota la gent maca que he conegut a l’IBB.
Després del primer any de tesi,el grup va créixer amb l’arribada de la Gema i poc després, vaig “aterrisar” al laboratori dels Pepe’s, del departament de bioquímica de medicina. Un departament enorme ple de gent ben avinguda al que em van facilitar l’entrada la Vidi i l’Ana, antigues companyes de carrera, que junt amb la Montse, han sigut també companyes de tesi. Ana, Vidi, no sabeu com us he trobat a faltar en aquesta darrera etapa de la tesi, les pauses per posar‐nos al dia, la companyia fins a altes hores de la nit, l’estirada d’orelles per fer‐me sortir del laboratori quan ja n’hi havia prou, els `vaaaaa’ que sempre funcionaven... Les dues, en ser les primeres, m’heu guiat en la dura experiència de ser doctor i m’heu fet costat sempre que ho he necessitat. D’aquesta primera etapa al departament agrair als Pepe’s la bona acollida que em van donar al seu despatx i laboratori. Alfredo, Bruna, Nahuai, Rut quants records i anècdotes!! Us dec gairebé tot el que he après sobre els westerns i les múltiples virgueries possibles per aprofitar al màxim les membranes! Quantes hores a cultius amb vosaltres!
El grup va seguir creixent amb l’arribada de la Paulina i la Sílvia i, de nou, ens vam mudar al pis d’abaix, cosa que vam viure al principi de manera traumàtica, però a la que ens vam anar
acostumant amb l’arribada de la màquina de gel, el destil∙lador d’aigua i l’aire acondicionat. Gema, Sílvia, Paulina gràcies per la sensació de grup que vaig tenir treballant amb vosaltres. Espero poder seguir compartint amb vosaltres aquestes trobades que fem de tant en tant. Al nouvinguts: Luis, Ruben, Patricia, Roger, gràcies per animar la última etapa de la meva tesi. Ànims pel que us queda!
Una de les novetats del descens a les ‘mazmorres’ van ser el veïns. Malgrat les parets de paper (us recordo: se sent tot), els Saura’s i la Tina han sigut els millors veïns possibles i han creat molt bon ambient del pis d’abaix. Sergi, Judit quantes hores passades fora, comentant i fumant, heu viscut molts moments ‘en directe’ de la meva tesi i sempre m’heu donat bons consells. Elsa, Jorge, Arnaldo, Judit, Marta, Rocío, Ester, Lluís i un llarg etc... sou genials, allà on treballi a partir d’ara vull tenir uns veïns com vosaltres. També gràcies pel ‘tràfic il∙lícit’ de material i l’assessorament informàtic.
Mar i Cris. Sort en té l’INc de poder comptar amb vosaltres. Els vostres consells sempre han ajudat a millorar la meva feina. Cris, gràcies pels infinits cultius i per fer treballar a la sala de cultius fos sempre un plaer. Espero que aconsegueixis tot allò que et proposis perquè t’ho mereixes. Mar em quedo amb la teva tranquil∙litat i les ganes que poses en tot allò que fas. A tu també et desitjo que acabis las tesi aviat!
A tots els companys i ex‐companys de departament: Arantza, Mireia, Tatiana, Gerard, Santi, Roger, David, Albert, Miki, Marta, Laura, Daniel, Anna, Victòria, Naty, Eli, Noe, Àlex, Irene, Guillem, Arnau, Susana, Elisabet, als de secretaria i segur que em deixo algú us agraeixo haver fet la meva estada agradable al departament, facilitar‐me les coses i recolzar‐me.
Tot hagués estat diferent si no hagués format part de la Bandsambant, quants pobles i ciutats hem visitat junts, quantes hores passades amb el tambor. El nostre groove ha estat la banda sonora d’aquesta tesi, i la vostra companyia ha estat de ben segur el millor antídot quan la frustració no em deixava avançar. A tots una abraçada i el desig de que el que fem no s’acabi mai.
A tot els meus amics, Martí, Ferran, Maria, Anna B., Núria, Anna P, Neus, Ricard, Roser, Vidi, Ana, fa mes de 10 anys que en coneixem i sempre hi heu estat! Gràcies per tot, consells, bons moments, ànims. Espero poder seguir veient com ens fems grans junts. Jordi, malgrat la distància, sempre has estat molt present, quantes vegades m’he preguntat, que faria ell en aquesta situació? No canviïs, i espero poder tenir‐te a prop de nou aviat!
A en Paco per fer‐me costat, per entendre i suportar els meus horaris especials.
A la meva mare i a tota la meva família per estar amb mi i convèncer‐me de que tot el que estava fent realment valia la pena i que les coses ben fetes s’aconsegueixen amb paciència i esforç.
