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MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Vicente MedinaReus 2012
La observación directa es el primer paso en la investigación pero… ¿se ve lo que se mira?
“El ciego se entera mejor de las cosas del mundo, los ojos son una ilusión embustera”
José Mª del Valle Inclán
10-3 m 103 m
MICROSCOPIO TELESCOPIO
ConceptoMicroscopía óptica y electrónicaConstrucción (partes) de un ME
Microscopía y resoluciónTipos de ME: TEM y SEM
Interacción de los e- con la materiaAplicaciones
Preparación de muestras al TEMContraste. Sombreado
Fijación, Deshidratación, IinfiltraciónUltramicrotomíaImágenes TEM
Preparación de muestras al SEMVaporización
Imágenes SEMMicroanálisis Rayos-X
Combinación TEM y SEMOtras microscopías
electronesen lugar
de fotoneso
luz visible
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, basándose en los estudios de Louis-Victor de Broglie sobre las propiedades ondulatorias de los electrones
MET de la UdL
MICROSCOPIO ÓPTICO MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS ENTRE M. ÓPTICA Y M. ELECTRÓNICA
observación
lentes
formaciónImagen
objetivos
condensador
Fuente de “iluminación”
espécimen(muestra)
Los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible por lo que permiten mostrar estructuras mucho más pequeñas
Las partes principales de un microscopio electrónico de transmisión TEM son:
CAÑÓN DE ELECTRONES, que emite los electronesque chocan o atraviesan el espécimen (dependiendoque tipo de microscopio electrónico es),creando una imagen aumentada.
LENTES MAGNÉTICAS para crear campos quedirigen y enfocan el haz de electrones, ya que laslentes convencionales utilizadas en losmicroscopios ópticos no funcionan con loselectrones.
SISTEMA DE VACÍO es una parte muy importante delmicroscopio electrónico. Debido a que los electronespueden ser desviados por las moléculas del aire,se debe hacer un vacío casi total en el interior deun microscopio de estas características.
PLACA FOTOGRÁFICA o pantalla fluorescente quese coloca detrás del objeto a visualizar para registrarla imagen aumentada.
SISTEMA DE REGISTRO que muestra la imagen queProducen los electrones, que suele ser un ordenador
CONSTRUCCIÓN DEL TEM
Los electrones se producen generalmente en un filamento, normalmente de tungsteno, parecido al de una bombilla, mediante un proceso conocido como emisión termoiónica o bien mediante emisión de campo.
Los electrones emitidos se aceleran entonces con ayuda de un potencial eléctrico (medido en V, o voltios) y se focalizan mediante lentes electrostáticas o electromagnéticas.
RESOLUCIÓNMINIMA DISTANCIA ENTRE DOS PUNTOS DE UNA MUESTRA
PARA QUE PUEDAN SER DISTINGUIDOS COMO TALES
Poder de resolución (R) R = 0.61 λ / n sen α
λ = longitud de onda de iluminación n = índice de refracciónα = semiángulo de apertura del haz incidente λ = h / mV
h = constante de Planckm = masa de e-
V = velocidad de e-
Ej.: para V = 60.000 V; λ = 0.05 nm, la R es de 0.2 nm
TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS
Transmission electron microscope (TEM) Scanning electron microscope (SEM)
TRANSMISIÓN
e-
e-
e-
e-
BARRIDO O RASTREO
Interacción de los e- con la materia
Aceria ficus en el envés de una hoja de higuera
Microanálisis de un mineral
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE
BARRIDO
PRESTACIONES O POSIBILIDADES
Preparación y observación de muestras para TEM
IMAGEN DE TEM de alta resolución de un límite de grano de inclinación en aluminio
Rejillas de cobre, oro, platino
Soporte muestras
Portaobjetos
CONTRASTE (TINCIÓN) DE SOLUCIONES O PURIFICADOS
Contraste positivo
Contraste negativo
Contraste negativo + positivo
TINCIÓN SENCILLA: acetato de uranilo, ácido fosfotúngstico, heptamolibdato amónico, citrato de plomo
Tobamovirus Geminivirus Potyvirus
Fotografía electrónica (TEM, tinción negativa con acetato de uranilo) del viroide del tubérculo fusiforme de la patata (flechas) comparada con el DNA de doble cadena de un
virus bacteriófago (bacteriófago T7) (T. Koller y M. Sogo)
Microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa
SOMBREADO DE SOLUCIONES O PURIFICADOS
Microscopía electrónica de transmisión con sombreadoVaporización de un metal pesado sobre en ángulo) la
muestraEl materialevaporado
sigue una línea rectaen alto vacío
Muestra
Vapor de metal
Superficie del espécimencubierta por el metal
Sombra
Sombra 1
Sombra 2
Ángulo 1
Ángulo 2
Bomba vacío
Superficie del virión Cubierta con metal
Sombraángulo 1
Sombraángulo 2
FASES DEL PROCESODE PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA TEM
• FIJACIÓN
• DESHIDRATACIÓN
• INFILTRACIÓN
• POLIMERIZACIÓN
• SECCIONADO
• CONTRASTE
FIJACIÓN
¿Objetivo?Preservar la estructura de la materia viva sin alterarla
¿Cómo?Mediante entrecruzamientos/ligamientos transversales de lípidos y
proteínas principalmente
FACTORESpH
osmolaridadconstitución iónica
temperaturatiempo de fijación
tamaño de la muestraMedio
FIJADORES TAMPONESTetróxido de osmioTetróxido de rutenioAldehídos: formaldehído
glutaraldehidoAcroleínaPermanganato potásicoPermanganato sódico
FosfatoCacodilato
Veronal acetatoColidina
• Características que deben reunir los medios de infiltración
– Uniformidad en la polimerización– Soluble en los agentes deshidratantes– Baja viscosidad como monómero– Poca variabilidad en volumen durante la polimerización
– Fácil de seccionar– Estable ante el haz de electrones
– Químicamente inerte– Permita el contrastado en reacciones histoquímicas y tratamientos enzimáticos
• Tipos de resinas
– Resinas EPOXI (Araldita, Spurr, etc)• Alta viscosidad general• Mantienen mejor la estructura (contracción <2%)
• Más difíciles de cortar• Polimerización reversible
– Resinas poliéster• Alta viscosidad general• Mantienen bien la estructura (contracción <2%)
• Más blandas
• Solamente miscibles en acetona
– Metacrilatos• Se contraen durante la polimerización (<20%)• Miscibles en alcohol y acetona
– Otras: ACRÍLICAS (Lowicryl, RL White)
INFILTRACIÓN
ULTRAMICROTOMO
Cuchillas de vidrio p diamanteRejillas de cobre (estándar), o de oro/platino para inmunomarcaje
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA ANALÍTICADIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
Virus de la gripe aviar A H5N1Célula de mamífero
IMÁGENES COLOREADAS AL TEM(falso color)
Salmonella typhimurium
Lettuce infectious yellows virusLettuce infectious yellows virus (LIYV) (LIYV)Tian, T, Rubio, L, Yeh, HH, Crawford, B, Falk, BW. 1999. Lettuce infectious yellows virus: in vitro acquisition analysis using partially purified virions and the whitefly Bemisia tabaci. J Gen Virol 1999 80: 1111-1117
Agranovsky, A.A., Lesemann, D.E., Maiss, E., Hull, R., Atabekov, J.G. 1995"Rattlesnake" structure of a filamentous plant RNA virus built of two capsid proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. March 28; 92(7): 2470–2473.
CP
CPCPm
CPm
Beet yellows virus (BYV)
INMUNOMARCAJE
COMBINACIÓN DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN Y LAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICAS
BASADAS EN LA REACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
INMUNOMARCAJE CON ORO COLOIDAL
Marcaje de la proteína LAMP-1 en la membrana de un cuerpo multivesicular de una célula HepG2
Marcaje de residuos de manosa 6-fosfato en el interior d lisosomas de los linfoblastos
Preparación y observación de muestras para SEM
Granos de polen
“Sputtering”
Ojo de Drosophila melanogaster
CRIO-SCANNINGHaz vascular de hoja de maíz
Bemisia tabaci (GENNADIUS)
Cicadulina mbila NAUDE
Brocosomas: gránulos de naturaleza proteica secretados
por los tubos de Malpigio de los cicadélidos
A. Célula.B. TEM-criofractura de la mezcla BHPB/C6H12 (2 %). Barra = 100 nm
CRIOFRACTURA
Congelar en propano
Cuchilla deacero
Línea de fractura
Réplica
Hielo
Hielo
Fuente de carbono o platino (ángulo)
IMÁGENES SEM COLOREADAS(falso color)
BSE Si Fe
NiP Ti
Combinación de imágenes: electrones retrodispersados (BSE) y análisis de rayos X
en mineralogía
SCANNING TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE (STEM)
A. Vista general de un STEM. B. Hemoglobina liofilizada de una lombriz de tierra con partículas de TMV. C. Detalle de B. D. Virus bacteriófago. E. IGL de C.
A B C
D E
Micrografías de células de Candidatus M, bavaricum (Mbav).
A. Al SEM por detección simultánea electrones secundarios (azul) y retrodispersados (rojo). Las cadenas de magnetita son visibles.
B-D. Al TEM de secciones ultrafinas células congeladas mediante alta presión o criosubstituidas (CM: membrana citoplásmatica, OM: membrana exterior, PG: peptidoglicanos, OL1: parte interior de la capa exterior, OL2: parte exterior de la capa exterior; los asteriscos señalan los pliegues o pailas del espacio periplasmático.
E. Sección FIB (“focused ion bean”) mostrando la red de extensión de los pliegues.
F y G. TEM y SEM de células congeladas por alta presión y criofracturadas. Los círculos señalan los cristales de marnetita (margetosomas)
COMBINACIÓNDE
TÉCNICAS
A. Óxido de metal sobre Si B. Plankton del Atlántico Norte
SEMde
emisión fría
A B
SEMmicroanálisis
• Cristales de W-Si-O.
• B. SiO2 sobre un monocristal de Si
A B
MEy
ARTE
Hebras de resina epoxi enlazadas a una esfera de poliestireno de 2,5 micrómetros.
Nanoestructuras de óxido de zinc sobre una capa de óxido de indio (la técnica es espectacular).
Espermatozoides en la superficie de un óvulo
Nitruro de wurtzita e indio cristalizado
MICROSCOPIODE BARRIDO
DEEFECTO TUNEL
(STM)
Lámina de oro
Nanotubo de carbono
MICROSCOPIADE FUERZAATÓMICA
(AFM)
MICROSCOPIA LÁSER CONFOCAL
