1. TUJUAN PRAKTIKUM

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui pentingnya sterilisasi dan hal-hal yang dapat mempengaruhi sterilisasi, mengetahui proses sterilisasi dengan menggunakan alat otoklaf, dan mengetahui cara penggunaan otoklaf, mengetahui berbagai macam jenis media, mengetahui perbedaan dari media padat dan cair, mengetahui cara pembuatan medium, mengetahui komposisi medium, serta mengetahui bentuk-bentuk medium.

2. TINJAUAN PUSTAKAMedium ialah bahan yang biasa digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme, baik terletak di atas maupun terletak di dalamnya. Di dalam membutan medium sebaiknya mengunakan aquades. Setiap mikrorganisme memiliki kebutuhan dasar untuk hidup, yang meliputi air, karbon, energi, mineral, dan faktor tumbuh. Faktor tumbuh merupakan komponen esensial yang tidak bisa disintesis sendiri oleh suatu organisme dari dasar sumber karbon dan nitrogennya. Komponen-komponen tersebut adalah asam-asam amino atau vitamin. Selain itu, semua mikroorganisme memerlukan beberapa unsur logam seperti natrium, kalium, kalsium, magnesium, mangan, besi, seng, tembaga, fosfor, dan kobalt. Keasaman (pH) medium juga merupakan salah satu faktor yang sangat penting bagi pertumbuhan mikroorganisme. Sebagian besar mikroorganisme tumbuh baik pada pH sekitar pH 7 atau pH netral. (Hadioetomo, 1993, 44-45:163).

Dilihat dari sumber karbon yang digunakan, organisme dibagi menjadi dua kelompok. Organisme mensisntesis semua komponen selnya dari karbondioksida (CO2) disebut autotrof. Sedangkan organisme yang membutuhkan satu atau lebih senyawa organik sebagai sumber karbonnya disebut heterotrof. Sumber nitrogen bagi organisme autotrof adalah senyawa organik, apabila bagi heterotrof, sumber nitrogen dapat berupa asam amino atau senyawa-senyawa protein intermediate layaknya peptide, proteosa, dan peptone. (Hadioetomo, 1993, 45:163).

Medium-medium buatan manusia dapat dibagi menjadi 5 yakni :1. Medium Cair2. Medium Kental (Padat)3. Medium yang diperkaya4. Medium kering5. Medium yang sintetik(Dwidjoseputro, 1994, 38-40:214)

Berdasarkan dari konsistensinya medium dapat diciptakan bermacam-macam bentuk bergantung dari kebutuhannya :1. Medium cair, berguna untuk berbagai keperluan, seperti misalnya untuk pembiakan organisme dalam jumlah besar, fermentasi, dan berbagai uji-uji lainnya. Contoh dari medium cair adalah Nutrient Broth dan Glucose Broth.2. Medium padat, biasa digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan, sehingga organisme yang diinginkan membentuk koloni yang dapat diamati morfologinya, dihitung, dan diisolasi. Contohnya adalah Nutrient Agar, Plate Count Agar, Potato Dextrose Agar.3. Medium setengah padat, digunakan untuk menguji ada atau tidaknya motilitas dan kemampuan organisme untuk berfermentasi. Medium setengah padat biasanya mengandung gelatin atau agar-agar, tetapi dalam konsentrasi yang lebih kecil jika dibandingkan dengan medium padat.(Suriawiria, 2005, 75:172)

Tipe medium terdiri dari 3 jenis, yaitu :1.Medium serbaguna, yaitu medium yang paling umum digunakan dalam bakteriologi. Contohnya adalah kaldu nutrien.2.Medium selektif, yaitu medium yang mengandung zat-zat kimia tertentu yang dapat menghambat tumbuhnya satu kelompok bakteri atau lebih tanpa menghambat pertumbuhan organisme yang diinginkan.3.Medium diferensial, yaitu medium yang mengandung zat-zat kimia tertentu yang memungkinkan untuk membedakan berbagai jenis bakteri (Hadioetomo, 1993, 46:163).

Media yang dipakai dalam praktikum ada 6 macam yaitu Potato Dextrose Agar (PDA), Malt Extract Agar (MEA), Lactose Broth (LB), De Man, Rogosa and Shape (MRS), Nutrient Agar (NA), Pepton Glucose Yeast (PGY). Dan tiap-tiap media memiliki fungsi yang berbeda satu sama lain.

Potato Dextrose Agar (PDA) adalah medium yang menunjang untuk pertumbuhan berbagai jenis jamur karena PDA memiliki nutrisi yang sangat sesuai untuk menumbuhkan jamur dan mempercepat pertumbuhannya. (Stemets, 2007).

Malt Extract Agar (MEA) adalah medium pertumbuhan yang sangat baik untuk jamur terutama jamur yang diisolasi dari kayu, jamur tanah dan Basidiomycetes. Komposisi penyusun MEA terdiri dari : pepton dari soymeal (sari kedelai) sebanyak 3,0 gr/liter, ekstrak dari malt (gandum) sebanyak 5,0 gr/liter, dan agar sebanyak 15,0 gr/liter. Kandungan agar inilah yang menyebabkan MEA berwujud padat. (Stemets, 2007).

Lactose Broth (LB) adalah media yang biasa digunakan untuk melihat pertumbuhan mikroba yang di dalam pertumbuhan melibatkan gas. Karena media ini membuat kita dapat melihat keberadaan gas yang dihasilkan oleh koliform (Bartam, 1996). LB yang di dalamnya harus diletakkan tabung durham dapat digunakan untuk mendeteksi kerusakan mikroba laktosa. Dalam analisis bakteriologis air kaldu, LB terutama digunakan untuk mendeteksi bakteri koliform. Komposisi penyusun LB antara lain: natrium klorida sebanyak 5 g/ liter, ekstrak daging sebesar 3 g/ liter, laktosa sebesar 10 g/ liter, pepton dari daging sebesar 10 g/ liter, dan juga bromocresol ungu sebanyak 0,02 g/ liter (Merck, et al., 1998, 70: 133).

De Man, Rogosa and Shape (MRS) adalah salah satu media yang biasanya digunakan untuk penanaman atau pengayaan dan isolasi dari semua lactobacillus dari semua jenis spesimen. Komposisi penyusun MRS agar antara lain: pepton 10 g/ liter, ekstrak daging 5 g/ liter, ekstrak yeast 5 g/ liter, d (+) glukosa 20 g/ liter, di-kalium hydrogen 2 g/liter, fosfat sorbitan polioksietilena 1 g/ liter, monooleat di-amonium hidrogen sitrat 2 g/ liter, natrium asetat 5 g/liter, magnesium sulfat 0,1 g/liter, mangan sulfat 0,05 g/liter, agar-agar 12 g/liter. Sedangkan komposisi penyusun MRS broth yaitu, pepton 10 g/ liter, ekstrak daging 5 g/ liter, ekstrak yeast 5 g/ liter, d (+) glukosa 20 g/ liter, di-kalium hydrogen 2 g/liter, fosfat sorbitan polioksietilena 1 g/ liter, monooleat di-amonium hidrogen sitrat 2 g/ liter, natrium asetat 5 g/liter, magnesium sulfat 0,1 g/liter, mangan sulfat 0,05 g/liter. Perbedaan MRS agar dan MRS broth terletak pada kandungan agar di dalam kedua media tersebut. MRS agar memiliki kandungan agar, sedangkan MRS broth tidak memiliki kandungan agar (Merck, et al., 1998, 90-91: 133).

Nutrient Agar (NA) adalah media yang paling baik jika digunakan untuk media pertumbuhan khamir dan bakteri. NA memiliki kemampuan untuk menghambat bergerombolnya koloni dari mikroba yang diinokulasi ke dalamnya sehingga memungkinkan untuk mengisolasi koloni individu dari bahan yang mengandung spesies Proteus. NA juga dapat digunakan untuk mengisolasi bakteri koliform. Komposisi penyusun NA antara lain: pepton dari daging sebesar 10 g/ liter, ekstrak daging dengan komposisi 3 g/ liter, natrium klorida sebesar 5 g/ liter, pril sebesar 1 g/ liter dan juga tersusun atas agar sebesar 15 g/ liter. (Merck, et al., 1998, 73: 133).

Pepton Glucose YeastPada media yang mengandung pepton (PGY) yang biasa digunakan untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel khamir. Karena adanya dekstrosa yang terkandung dalam media ini, PGY dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroba, terutama sel khamir. (Stemets, 2007)

Dilihat dari fungsi fisiologis dan masing-masing komponen yang terdapat di dalam media, maka susunan media mempunyai kesamaan isi, yaitu:1. Kandungan air2. Kandungan nitrogen, berasal dari protein, asam amino dan senyawa lain yang mengandung nitrogen.3. Kandungan sumber energi atau unsur C, baik yang berasal dari karbohidrat, lemak, protein, dan senyawa-senyawa lain.4. Ion-ion sebagai unsur mikro maupun unsur makro.5. Faktor pertumbuhan, umumnya vitamin dan asam amino.Berdasarkan persyaratan tersebut, media dapat berbentuk:a. Media alami yaitu media yang terbentuk oleh bahan-bahan alami seperti kentang, tepung, daging, telur, ikan, umbi-umbian lainnya dan sebagainya. Media alami yang paling banyak dipergunakan adalah dalam bentuk kultur jaringan tanaman ataupun hewan. Contoh media alami yang paling banyak dan paling sering digunakan adalah telur untuk media pertumbuhan dan perkembangbiakan virus.b. Media sintetik yaitu media yang terbentuk oleh senyawa kimia layaknya media untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri Clostridium.c. Media semi sintetik yaitu media yang terbentuk oleh campuran bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintetik misalnya kaldu nutrisi, toge agar, wortel agar. (Suriawiria, 2005, 76:172)

Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti mematikan semua organisme yang terdapat pada suatu benda atau didalam suatu benda dengan tidak merusak media yang ingin disterilisasikan. Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan atau disterilkan oleh panas (kalor), gas-gas seperti formaldehyde, etilenoksida, atau betapriolakton, maupun oleh bermacam-macam larutan kimia. Selain itu juga dapat disterilkan menggunakan sinar Ultraviolet (UV) atau sinar gamma. Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi. (Irianto, 2006, 75, 256)

Sterilisasi ialah proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada suatu benda atau di dalam suatu benda dengan tidak merusak media yang ingin disterilisasikan. Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu 1. Penggunaan panasDalam penggunaan panas dibagi menjadi 2 jenis metode yang bisa digunakan yaitu :

a. Sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basahDisebut sterilisasi basah karena panas yang digunakan bersama-sama dengan uap air. Sterilisasi basah dilakukan di dalam autoklaf atau sterilisator uap yang mudah diangkat (portable) dengan menggunakan uap air jenuh bertekanan pada suhu 121C selama 15 menit (Hadioetomo, 1993, 55:163).

Autoklaf seringkali dioperasikan di tekanan uap 15 lb/in2. Apabila medium berukuran besar yang ingin disterilkan, maka waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi akan lebih panjang, karena panas juga memerlukan waktu untuk membuatnya menembus bahan yang akan disterilisasi tersebut. (Volk & Wheeler, 1993, 39:396).

Panas lembab sangat efektif walaupun dilakukan pada situasi suhu yang tidak begitu tinggi, karena uap air berkondensasi pada bahan-bahan yang ingin disterilkan. Dilepaskan panas sebanyak 686 kalori/gram pada suhu 121C. Bahan-bahan yang biasanya disterilisasi dengan metode ini adalah medium biakan yang umum seperti misalnya: air suling, peralatan laboratorium, biakan yang akan dibuang, media yang tercemar, dan bahan-bahan dari karet.

4 hal utama yang penting untuk diperhatikan dalam menggunakan autoklaf adalah1. sterilisasi bergantung uap, oleh karena itu udara harus dikosongkan dari ruang sterilisator2. semua bagian bahan yang ingin disterilkan harus dikenai oleh uap.3. bahan-bahan yang memiliki pori atau yang berbentuk cair harus permeable terhadap uap,4. suhu yang terukur oleh termometer harus mencapai 121C dan dilakukan selama 15 menit.(Hadioetomo, 1993, 56:163).

b. Sterilisasi panas kering atau sterilisasi keringDiberi nama sterilisasi kering karena prosesnya tanpa dipengaruhi oleh faktor kelembaban. Biasanya menggunakan suhu oven sebesar 160-175C selama 10 menit untuk dapat mematikan mikroorganisme-mikroorganisme yang ada. Sterilisasi panas kering dapat diterapkan pada bahan manapun dengan catatan tidak menjadi rusak, menyala, hangus, atau menguap pada suhu tinggi tersebut. Bahan yang biasanya disterilkan melalui metode ini adalah antara lain barang pecah belah, seperti pipet, tabung reaksi, cawan petri dari kaca, botol sampel. (Hadioetomo, 1993, 57:163).

Dalam melakukan sterlisasi, cawan petri biasanya ditempatkan dalam kaleng atau dibungkus dengan kertas, serta tabung uji dan botol disumbat dengan menggunakan kapas atau penutup lain yang bertujuan untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme dalam yang ada di dalam atmosfir. (Volk & Wheeler, 1993, 39:396).

2. Penggunaan bahan kimiaSterilisasi dengan gas atau radiasi. Beberapa bahan kimia yang biasanya digunakan untuk sterilisasi gas adalah antara lain: etilena oksida, asam perasetat, folmaldehida, dan glutaraldehida alkalin, sedangkan sterilisasi dengan radiasi dapat menggunakan sinar gamma (sinar ultraviolet/UV kadang-kadang digunakan tetapi tidak begitu baik, karena daya tembusnya lebih lemah daripada sinar gamma).

3. Penyaringan (filtrasi)

Sterilisasi dilakukan pada suhu kamar. Dengan cara ini larutan atau suspensi maupun bahan lainnya yang ingin disterilisasi dibebaskan dari semua organisme hidup dengan cara melewatkan bahan tersebut saringan dengan ukuran pori-pori yang sangat kecil (0,45 atau 0,22) sehingga bakteri dan sel-sel yang lebih besar tertahan di atasnya, sedangkan filtratnya ditampung di dalam wadah yang sudah steril.(Hadioetomo, 1993, 55-58:163).

18

19

3. MATERI DAN METODE3.1. Materi3.1.1. Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah Rak dan tabung reaksi, tabung durham, cawan petri steril, timbangan analitik, bunsen, korek api, otoklaf, kapas, hot plate, pengaduk magnet (stirrer), gelas piala, sendok (plastik untuk MgSO4.7H2O dan KH2PO4, logam untuk bahan lain), plastik bening, karet gelang, serbet, masker, tatakan untuk membuat agar miring, label, kertas buram, beaker glass, gelas ukur, sarung tangan, dan lap.

3.1.2. BahanBahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah aquades steril, alkohol, NA (Nutrient Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), PGY (Pepton Glucose Yeast), LB (Lactose Broth), MRS (De Man, Rogosa, and Sharpe), glukosa, pepton, ekstrak yeast, MgSO4.7H2O, dan KH2PO4.

3.2. Metode3.2.1. Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)Pertama 3,6 gram NA ditimbang dengan neraca analitik, kemudian dimasukkan ke gelas piala (beaker glass) yang sudah diisi 180 ml aquades lalu di diaduk rata. Setelah itu, pengaduk magnet (stirrer) dimasukkan kedalam larutan tersebut. Kemudian larutan tersebut dipanaskan menggunakan hot plate dan pemanasan dihentikan apabila seluruh agar sudah larut (ketika larutan sudah menjadi semakin berwarna bening). Kemudian larutan dimasukkan ke dalam 5 tabung reaksi masing-masingnya 5 ml, 3 tabung reaksi masing-masing 10 ml untuk membuat agar miring dan dimasukkan ke dalam 12 tabung reaksi masing-masing 10 ml untuk membuat agar cawan. Kemudian tabung-tabung reaksi tadi ditutupi dengan kapas agar tetap steril. Cawan petri disiapkan, dibalik, dan dibungkus dengan kertas buram dan dimasukkan ke dalam plastik. Tabung-tabung reaksi dan cawan petri dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 1210C (15 lb) selama 15 menit untuk proses sterilisasi. Setelah proses sterilisasi selesai, tabung reaksi dan cawan diambil. 5 Tabung reaksi yang masing-masing berisikan 5 ml media dan 3 tabung reaksi yang berisian 10 ml media ditaruh dalam posisi miring pada tatakan sehingga terbentuk medium agar miring setelah memadat. Sedangkan 12 tabung reaksi yang berisi 10 ml medium dituangkan ke dalam cawan petri secara aseptis dan didiamkan sampai memadat. Setelah memadat, medium diamati lalu digambar dan diberi keterangan wujud dan warnanya.

3.2.2. Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)Mula-mula 1.36 gram PDA ditimbang dan dimasukkan gelas piala yang sudah diisi oleh 35 ml aquades. Kemudian larutan tersebut dicampur rata dan pengaduk magnet (stirrer) dimasukkan. Setelah itu, larutan dipanaskan menggunakan hot plate dan pemanasan harus dihentikan setelah seluruh agar larut (ketika larutan sudah menjadi semakin berwarna bening). Lalu, larutan dimasukkan ke dalam 5 tabung reaksi dengan masing-masing 5 ml. Setelah itu, tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan menggunakan kapas agar larutan di dalamnya tetap dalam kondisi steril, serta dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat dengan karet gelas untuk disterilisasi dengan menggunakan otoklaf pada suhu 1210C (15 lb) selama 15 menit. Setelah selesai disterilisasi, 5 tabung reaksi tersebut yang masing-masingnya berisi 5 ml media diletakkan pada tatakan untuk membuat agar miring saat larutan tersebut memadat. Setelah memadat semuanya, warna dan wujud agar tersebut diamati dan digambar serta diberi keterangan wujud dan warnanya.

3.2.3. Pembuatan Media Malt Extract Agar (MEA)Pertama kali, 1,2 gram MEA ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam gelas piala yang sudah diisi 25 ml aquades. Setelah larutan tersebut dicampour dan diaduk rata lalu pengaduk magnet (stirrer) dimasukkan. Kemudian larutan tersebut dipanaskan menggunakan hot plate dan pemanasan harus dihentikan setelah seluruh agar larut (ketika larutan sudah menjadi semakin berwarna bening). Kemudian larutan tersebut dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi yang masing-masing tabungnya berisikan 5 ml larutan. Kemudian tabung reaksi tersebut ditutup dengan menggunakan kapas di mulut tabungnya agar larutan yang ada di dalamnya tetap dalam keadaan steril dan dibungkus dengan plastik bening dan diikat dengan menggunakan karet gelang untuk kemudian disterilisasi pada suhu 1210C (15 lb) selama 15 menit. Kemudian setelah sterilisasi selesai, 3 tabung reaksi yang berisikan 5 ml media tersebut diletakkan pada tatakan untuk membuat agar miring saat memadat. Setelah semuanya memadat, warna dan wujud agar tersebut diamati untuk kemudian digambar serta diberi keterangan wujud dan warna agar tersebut.

3.2.4. Pembuatan Media Pepton Glucose Yeast (PGY)Mula-mula 0.6 gram glukosa, 0,03 gram pepton, 0,03 gram ekstrak yeast, 0,012 gram MgSO4.7H2O, 0,03 gram KH2PO4 ditimbang dengan menggunakan neraca analitik. Kemudian bahan-bahan tersebut dimasukkan ke dalam gelas piala yang berisikan 15 ml aquades. Setelah campuran tersebut diaduk hingga rata kemudian larutan tersebut dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi yang masing-masing tabung reaksinya berisikan 5 ml untuk membuat agar tegak. Setelah itu, tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan menggunakan kapas agar larutan yang ada di dalamnya tetap steril dan dibungkus dengan plastik bening dan diikat dengan karet gelang untuk kemudian disterilisasi pada suhu 1210C (15 lb) selama 15 menit. Kemudian 3 tabung reaksi yang beriisi media tersebut dibiarkan sampai agarnya memadat. Setelah semua agar tersebut memadat, warna dan wujud dari agar tersebut diamati untuk kemudian digambar serta diberi keterangan wujud dan warna dari agar tersebut.

3.2.5. Pembuatan Media De Man Rogosa and Sharpe (MRS)2,73 gram MRS ditimbang menggunakan neraca analitik, dan dilarutkan dalam 40 ml aquades dalam gelas piala. Kemudian larutan diaduk hingga rata sebelum pengaduk magnet (stirrer) dimasukkan dalam gelas piala. Setelah itu, larutan dipanaskan dengan menggunakan hot plate dan pemanasan dihentikan saat seluruh agar larut (ketika larutan sudah menjadi semakin berwarna bening). Lalu, larutan dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi masing-masingnya 10 ml. Tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar larutan yang ada di dalamnya tetap dalam keadaan steril steril, dan dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang. Setelah itu, larutan disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 1210C (15 lb) selama 15 menit. Setelah proses sterilisasi berakhir, 3 tabung reaksi yang masing-masingnya berisi 10 ml media dibiarkan sampai agarnya memadat. Setelah agar memadat diamati warna serta wujud agar yang terbentuk untuk kemudian digambar serta diberi keterangan wujud dan warnanya.

3.2.6.Pembuatan Media Lactose Broth (LB)7,15 gram LB ditimbang dan kemudian dilarutkan ke dalam gelas piala berisi 550 ml aquades dan diaduk hingga tebentuk larutan yang homogen. Setelah itu, Larutan yang telah homogen tersebut dimasukkan ke dalam 54 tabung reaksi masing-masing 10 ml untuk membuat agar tegak. Lalu, tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar tetap larutan yang ada di dalamnya tetap dalam keadaan yang steril, dan dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang untuk kemudian disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 1210C (15lb) selama 15 menit. Setelah proses selama 15 menit tersebut sterilisasi berakhir, tabung reaksi diambil, kemudian pada tiap-tiap tabung reaksi tersebut dimasukkan tabung durham dengan catatan tanpa adanya sedikitpun udara pada durham tersebut. Sebanyak 10 tabung reaksi yang berisi media tersebut dibiarkan hingga agar memadat dan warna serta wujud agar diamati untuk kemudian digambar serta diberi keterangan wujud dan warnanya.4. HASIL PENGAMATAN

Hasil pengamatan pembuatan media dapat dilihat pada tabel 1.KelompokMediaGambarKeterangan

A1PDA

Warna: kuning beningWujud : padat

A2MEA

Warna: kuning keorangeanWujud : padat

A3 LB

durham

Warna: kuning beningWujud : cair

A4

MRS

Warna: coklat kekuninganWujud : padat

A5

NA

Warna: kuningWujud : padat

Warna: kuningWujud : padat

A6PGY

Warna: kuning beningWujud : cair

Dari tabel diatas dapat diketahui bahwa agar yang terbentuk dari media Potato Dextrose Agar (PDA) menghasilkan berwarna kuning bening dan berwujud padat. Sedangkan agar yang dibuat dari media Malt Extract Agar (MEA) menghasilkan warna kuning keorangean dan berwujud padat. Agar yang terbentuk dari media Lactose Broth (LB) berwarna kuning bening dan berwujud cair. Sedangkan agar yang terbuat dari media MRS berwarna coklat kekuningan dan berwujud padat. Agar yang terbuat dari media Nutrient Agar (NA) berwarna kuning dan berwujud padat. Dan agar yang terbuat dari Pepton Glucose Yeast (PGY) berwarna kuning bening dan berwujud cair.

5. PEMBAHASAN 5.1. Pembuatan MediaDalam praktikum ini dibuat 2 jenis media yang berbeda, yakni media padat dan media cair. Media padat yang digunakan pada praktikum ini adalah media NA (Nutrient Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), MEA (Malt Extract Agar), dan MRS (De Man Rogosa and Sharpe). Sedangkan media cair yang digunakan dalam praktikum ini adalah Sedangkan media cair yang dibuat adalah media PGY (Pepton Glucose Yeast) dan LB (Lactose Broth).

Pada pembuatan media padat, digunakan media NA (Nutrient Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), MEA (Malt Extract Agar), dan MRS (De Man Rogosa and Sharpe). Dari masing-masing media ini dalam pembuatannya langsung dilarutkan dengan aquades karena media NA, PDA, MEA, dan MRS terdapat dalam bentuk kering / bubuk sehingga tinggal dilarutkan dengan aquades. Media padat dilarutkan di dalam aquades karena bagi organisme bersel tunggal, air sangat penting karena air sendiri adalah merupakan komponen utama protoplasma dari organisme tersebut (sekitar 80%) serta merupakan jalur untuk masuknya nutrient ke dalam sel maupun proses keluarnya zat-zat yang tidak dibutuhkan dari dalam sel untuk dibuang. Air sendiri juga merupakan hal yang diperlukan dalam reaksi-reaksi enzimatik di dalam sel, maka dari itu air sangat penting bagi organisme yang akan ditumbuhkan nantinya. Dalam pembuatan media padat dapat dikatakan lebih efisien dibandingkan dengan pembuatan media cair, karena selain terdapat dalam bentuk bubuk atau kering juga tidak akan ada endapan karena telah dilakukan proses freeze dryer saat pembuatannya sehingga tidak ada lagi padatan tak terlarut. Tetapi di dalam pembuatan media padat harus melalui proses pemanasan (NA, PDA, MEA, MRS) dan pengadukan yang bertujuan melarutkan agar yang ada di dalam bahan untuk nantinya dapat memadat kembali, sedangkan pengadukan dilakukan dengan menggunakan alat yang disebut stirrer. Hadioetomo (1993, 48-49 : 163) mengatakan, pada pembuatan media padat, media cair yang dipanaskan harus diaduk secara terus menerus dengan menggunakan stirrer. Tujuannya adalah untuk mencegah hangusnya atau meluapnya medium. Pada pembuatan media padat pada cawan petri, medium yang akan dituangkan dalam tabung reaksi hartus dilakukan secara aseptis, yang berguna untuk mencegah adanya kontaminasi dari mikroorganisme lain yang tidak diinginkan dan mempertahankan mikroorganisme yang diinginkan tetap dalam biakan murni (terdiri dari satu spesies tunggal). Menurut Hadioetomo (1993, 46 : 163), media padat tersusun dari nutrien yang dilarutkan dalam air dan ditambah dengan agensia penjedalan (gelling agent) yang digunakan untuk memadatkan media. Agensia penjedalan yang paling banyak dipakai untuk membuat media pertumbuhan adalah agar.

Setelah itu medium kemudian dicairkan dan kemudian dipanaskan kembali segera dipindahkan ke dalam tabung reaksi sebelum medium tersebut memadat. Lalu mulut tabung ditutup dengan kapas dan tabung reaksi dibungkus dengan plastik dan diikat dengan menggunakan karet gelang untuk kemudian disterilisasi. Hal ini digunakan untuk mencegah adanya mikroorganisme yang tidak diinginkan ikut tumbuh dalam medium yang dibuat. Sterilisasi biasanya dilakukan pada suhu 1210C (15 lb) dalam kurun waktu 15 menit. (Hadioetomo, 1993, 46 : 163).

Dalam percobaan untuk media NA dibuat dalam bentuk agar miring, dan agar cawan. Sedangkan media PDA dibuat dalam bentuk agar miring. Untuk PGY dan MRS dibuat hanya dalam bentuk agar tengak. LB dibuat agar tegak dan diberi tabung durham dalam tabung reaksinya. Dan media MEA dibuat hanya dalam bentuk agar miring. Tujuan dari pembuatan agar tegak adalah untuk mengamati kebutuhan gas dari mikroorganisme yang ingin diamati di mana media agar tegak digunakan untuk melihat munculnya gelembung gas, yang menjadi indikator positif dari munculnya mikroorganisme sehingga mikroorganisme yang diamati di dalam agar ini tidak butuh terlalu banyak. Hal ini didukung oleh luas penampang agar yang sempit sehingga penyerapan nutrisi bagi mikroorganisme yang ditumbuhkan terbatas dan pertumbuhannya lambat. Sedangkan pembuatan agar miring bertujuan untuk mendapatkan luas penampang yang luas sehingga mikroba yang ditumbuhkan jumlahnya banyak dan persebarannya lebih merata karena penyerapan nutrisi untuk mikroba menjadi lebih luas dan dapat diamati bentuk morfologinya dari beberapa bagian. Untuk media agar miring, tabung reaksi yang berisi media cair diletakkan dalam posisi miring, sampai memadat (Irianto, 2006, 124, 256).

Media agar miring dibuat denngan cara agar yang telah dicairkan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang dimiringkan. Kegunaan media agar miring ini adalah untuk memperoleh luas permukaan yang lebih besar guna pertumbuhan bakteri dan kegunaan dari pembuatan media miring sendiri adalah untuk memperluas permukaan media sehingga mikroorganisme yang tumbuh pada media ini semakin banyak dan jumlahnya tersebar sesuai dengan luas permukaan media agar miring sehingga lebih mudah untuk diamati sifat morfologi dari mikrorganisme yang telah membentuk suatu koloni tersebut dan dapat diamati dari berbagai bagian (atas, pinggir, dan tonjolannya). Mikroorganisme kemudian akan ditumbuhkan pada permukaan agar padat baik agar tegak atau agar miring dengan menggunakan jarum ose yang telah disterilisasi (dibakar dengan menggunakan bunsen hingga berpijar atau berwarna kemerahan) dengan cara digoreskan pada permukaan agar media. Tujuan jarum ose tersebut di sterilisasi terlebih dahulu adalah untuk mencegah kontaminasi dari mikroorganisme lain yang dapat mengganggu pembentukan suatu kultur murni yang diinginkan.

5.2. Fungsi MediumPotato Dextrose Agar biasa digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang. Dan dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu produk makanan, karena PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah yang cukup yaitu terdiri dari 20% ektrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir, tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri.

Menurut komposisinya, MEA, dan NA merupakan media-media dari jenis media kompleks, karena nutriennya banyak dan konsentrasinya tinggi, akan tetapi macam dan konsentrasi nutriennya tidak diketahui. Dan dikarenakan MEA merupakan medium yang bersifat asam, maka medium ini biasa digunakan untuk menumbuhkan yeast dan kapang dan merupakan medium yang kurang baik untuk menumbuhkan bakteri karena sifat asam ini akan menghambat pertumbuhan bakteri (Stemets, 2007). Sedangkan NA adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif (mikroorganisme heterotrof). NA merupakan salah satu media yang seringkali digunakan di dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dan air, sewage, dan produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme di dalam kultur murni.

Di dalam praktikum ini, LB ini dibuat dengan cara melarutkan 7,15 gram LB dalam 550 ml aquades pada gelas piala. Walaupun tampak sangat sederhana, sebenarnya LB sendiri disusun atas enzim pemecah gelatin sebanyak 5 gram, ekstrak daging sapi sebanyak 3 gram, dan laktosa sebanyak 5 gram. Dengan adanya komponen ekstrak daging sapi pada komposisinya, maka LB dapat disimpulkan bahwa LB sama seperti NA dan PDA termasuk media semi sintetik.

Pada media LB, terdapat suatu tabung kecil yang disebut tabung Durham. tabung durham adalah tabung kecil yang di dalam penggunaannya, posisinya dibalik dan berisi media dan tidak diperbolehkan adanya sedikit pun gelembung udara di dalamnya. Tujuannya diberi dalam tabung durham dalam pembuatan medium LB adalah untuk menvisualisasikan produksi gas pada media (Bartam, 1996). Sehingga apabila bakteri menghasilkan gas sebagai hasil reaksi yang dilakukan oleh bakteri tersebut, gas yang dihasilkan akan terkumpul pada tabung durham dan akan muncul sebagai gelembung setelah inkubasi dilakukan. LB berdasarkan fungsinya termasuk media untuk karakterisasi bakteri. LB adalah media nonselektif yang memberikan lingkungan bagi bakteri dengan terus menyulpai nutrisi bagi bakteri yang ditumbuhkan terutama untuk bakteri Salmonella. Begitu juga dengan media MRS, medium ini juga lebih sering digunakan untuk pertumbuhan bakteri daripada pertumbuhan yeast dan kapang. Hal ini dikarenakan MRS sendiri memiliki kondisi yang cocok dan membuat bakteri tumbuh dalam keadaan optimal sehingga sangat menunjang pertumbuhan dari bakteri itu sendiri.

Pepton Glucose Yeast Extract (PGY) merupakan media sintesis, karena terbuat dari bahan kimia murni dengan konsentrasi yang terukur dan dilarutkan dalam air murni. Hal ini dapat dilihat dari bahan-bahan yang digunakan untuk membuat media tersebut selama percobaan, PGY dibuat dengan campuran berbagai bahan kimia yang merupakan sintetis yang meliputi 0,06 gram glukosa, 0,03 gram pepton, 0,03 gram ekstrak yeast, 0,012 gram MgSO4.7H2O, 0,03 gram KH2PO4 yang kemudian juga dilarutkan dalam aquades steril, yang membuat PGY termasuk dalam media sintetis. PGY (Pepton Glucose Yeast) biasa digunakan untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel khamir (Stemets, 2007). Karena adanya dekstrosa yang terkandung dalam media ini, PGY dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroba, terutama sel khamir. Konsisitensi medium dapat dibuat bermacam-macam bergantung kepada keperluannya. Misalnya PGY dapat digunakan untuk berbagai macam kebutuhan layaknya pembiakan organisme dalam jumlah besar, penelaahan fermentasi, dan berbagai macam uji lainnya. Selain baik digunakan untuk menumbuhkan sel khamir media PGY juga biasa digunakan untuk membiakkan yeast. Selain itu, PGY juga dapat digunakan dalam pembuatan media karena PGY mengandung nutrient-nutrient yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroorganisme khususnya sebagai media. Dalam PGY terdapat kandungan pepton yang merupakan protein yang mengalami degradasi sebagian, sehingga dapat sebagai sumber karbon, nitrogen dan zat anorganik tertentu yang dapat digunakan untuk pertumbuhan bakteri.Hadioetomo (1993, 44-45 : 163) mengatakan pembiakan mikroorganisme memerlukan media yang diantaranya mengandung zat hara serta lingkungan yang menunjang pertumbuhan yang bagi mikroorganisme itu sendiri. Zat hara dimanfaatkan untuk pertumbuhan, sintesis sel, keperluan energi dalam metabolisme dan pergerakan. Pada umumnya, media biakan mengandung air, sumber energi, zat hara sebagai sumber karbon, nitrogen, sulfur, sulfat, oksigen, hidrogen serta trace element. Apabila media biakan yang akan digunakan tidak disterilkan dan didiamkan selama beberapa hari maka mikroorganisme akan tumbuh dan menyebabkan kekeruhan media. Pada praktikum ini didapatkan hasil media yang bening, meskipun pada kelompok A4 (MRS) berwarna coklat kekuningan tetapi secara keseluruhan masih terlihat bening tidak terlalu keruh larutannya. Hal itu menandakan bahwa media yang kami sterilisasi tidak terkontaminasi mikroorganisme karena masih berwarna bening.

6. KESIMPULAN

Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan semua mikroorganisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi basah biasa dilakukan dengan alat yang disebut autoclave atau sterilisator uap, karena lebih cepat, relatif aman, lebih teliti, dan lebih efisien. Cawan petri dibungkus dengan kertas dan tabung reaksi disumbat dengan kapas, tujuannya untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh mikroorganisme dalam atmosfer. Pemindahan media dari tabung reaksi ke cawan petri harus dilakukan secara aseptis, untuk mencegah terjadinya kontaminasi mikroorganisme lain. Tujuan pembuatan media agar miring adalah untuk mendapatkan permukaan media yang lebih luas sehingga mikroorganisme yang tumbuh pada media ini semakin banyak dan jumlahnya tersebar sesuai dengan luas permukaan media agar miring. Agar tegak biasanya digunakan dalam studi tentang kebutuhan gas dari mikroorganisme. Media padat yang dimasukkan dalam cawan petri bertujuan untuk menyediakan area permukaan yang lebih luas untuk isolasi dan mempelajari mikroorganisme. Media cair ini dapat digunakan untuk pembiakan mikroorganisme dalam jumlah besar, penelaah fermentasi, dan berbagai macam uji. Media padat dipakai untuk mengamati penampilan/morfologi koloni dan mengisolasikan biakan murni.

Semarang, 17 Mei 2011Asisten Dosen : Natalia Gunawan

Alvin Arienata Hartanto 10.70.00907. DAFTAR PUSTAKA

Bartram, Jammie & Balance, Richard., (1996). Water Quality Monitoring - A Practical Guide to the Design and Implementation of Freshwater Quality Studies and Monitoring Programmes. http://www.who.int/water_sanitation_health/resourcesquality/wqmchap10.pdf.

Dwidjoseputro. (1994). Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

Hadioetomo, R. S., 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia Pustaka. Jakarta.

Irianto, K. (2006). Mikrobiologi : Menguak Dunia Mikroorganisme Jilid I. CV. Yrama Widya. Bandung.

Merck, E. & Darmstadt. (1998).Handbook of microbiology 1st supplement. Federal Republic Germany. Germany.

Stemets, Paul. 2007. Culture Media For Fungi.http://www.shroomery.org/9468/Culture-Media-for-Fungi. Diakses tanggal 17 Mei 2011.

Suriawiria, Unus. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti. Jakarta.

Volk, W.A. & M.F. Wheeler. (1993). Mikrobiologi Dasar. Erlangga. Jakarta.

8. LAMPIRAN8.1. Laporan Sementara